Abstract
Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, in erster Linie verantwortlich für die Erfassung, Verarbeitung und Antigenen auf Antigen-präsentierenden Molekülen präsentiert T-Zellen vermittelte Immunität zu initiieren. Dendritische Zellen können in mehrere phänotypisch und funktionell heterogenen Untergruppen getrennt werden. Drei wichtige Untergruppen von Milz- dendritischen Zellen sind plasmazytoiden, CD8a Pos und CD8a Neg Zellen. Die plasmazytoiden DCs sind natürliche Produzenten von Typ I Interferon und sind wichtig für die anti-virale T-Zell-Immunität. Die CD8a Neg DC Teilmenge wird für MHC - Klasse - II - Antigen - Präsentation spezialisiert und ist in Priming CD4 - T - Zellen zentral beteiligt. Die CD8a Pos DCs sind in erster Linie verantwortlich für die Kreuzpräsentation von exogenen Antigenen und CD8 T - Zellen - Priming. Die CD8a Pos DCs nachgewiesen wurden bei der Präsentation von Glycolipid - Antigenen durch CD1d Moleküle an eine spezialisierte T cel am effizientestenl Bevölkerung als unveränderliche natürliche Killer-T (iNKT) Zellen bekannt. Verabreichung von Flt-3-Ligand erhöht die Frequenz der Migration der dendritischen Zellvorläuferzellen aus Knochenmark, letztendlich in Expansion der dendritischen Zellen in peripheren lymphoiden Organen in murinen Modellen resultiert. Wir haben dieses Modell angepasst für eine große Anzahl von funktionellen dendritischen Zellen zu reinigen , die Verwendung in der Zellübertragung Experimente in vivo Fähigkeits verschiedener DC Untergruppen zu vergleichen.
Introduction
Dendritische Zellen (DC) wurden vor fast vierzig Jahren entdeckt , als die "große stel (griechisch Dendron) Zelle" 1 in lymphatischen Organen. Viele Studien haben gezeigt , dass DCs die einzigen Antigen - präsentierende Zellen sind , die effektiv naiver T - Zellen zu stimulieren 2. Eine wichtige Funktion dieser Zellen ist die Aufnahme und Präsentation von Antigenen und deren effiziente Verarbeitung und Laden derselben auf Antigen-präsentierenden Molekülen. In der Milz der Maus können DCs in plasmazytoiden und konventionelle Subsets getrennt werden. Die plasmazytoiden DCs zeichnen sich durch niedrige Expression von CD11c und ein hohes Maß an B220 und Gr-1 aus. Sie sind auch positiv für die Oberflächenmarker mPDCA1 und absondern Typ I in Reaktion auf maut Interferon like Rezeptor 9 (TLR9) Liganden. Die herkömmlichen DCs sind hoch für CD11c und MHC-Klasse-II-Expression. Sie können auf der Grundlage der Oberflächenexpression von phänotypischen Markern wie CD4, CD8a, DEC205, CD in drei verschiedene Untergruppen aufgeteilt werden,11b und dendritischen Zellen hemmenden Rezeptor 2 (DCIR2, anerkannt durch den 33D1 - Antikörper) Proteine 3,4. Die CD8a Pos DCs sind auch als CDC1 bekannt ist , sind positiv für DEC205, aber negativ für myeloische Marker wie CD11b und 33D1. Die CD8a Neg DCs, auch cdc2 genannt, sind positiv für 33D1, CD11b und CD4 aber es fehlt DEC205. Die doppelt negative Untergruppe (dh negativ für beide CD4 und CD8a) ist relativ selten, und ist negativ für DEC205 und 33D1. Es ist die am wenigsten charakterisierten Teilmenge und kann eine weniger differenzierte Form von CD8a Neg DC sein.
Phänotypischen Unterschiede in den verschiedenen Teilmengen DC auch auf ihre in vivo - Funktionen erweitern. Die CD8a Neg DCs sind stark phagozytierenden und werden gedacht , exogene Antigen zu präsentieren hauptsächlich über MHC - Klasse - II an CD4 - T - Zellen 3. Im Gegensatz dazu sind die CD8a Pos DCs Fach zur Präsentation von löslichem Protein - Antigen auf MHC - Klasse Iin einem Mechanismus Kreuzpräsentation genannt. Das Ergebnis der Kreuzpräsentation hängt von der Aktivierungsstatus dieser DCs 5, und kann entweder zur Expansion von zytotoxischen T - Zellen (CTL) oder die Entwicklung von regulatorischen T - Zellen 6 2,7 führen. Targeting von Antigen an CD8a Pos DCs unter Verwendung von Anti-DEC205-Antikörper-vermittelte Abgabe resultiert im Wesentlichen in der Streichung von T - Zellen 8, während Präsentation von infizierten apoptotischen Zellen abgeleiteten Antigenen induziert eine starke CTL - Antwort 9.
Zusätzlich zur Erkennung von Peptidantigenen, hat das Immunsystem von Säugetieren entwickelt Lipid und Glycolipid-Antigene zu erkennen. Diese Antigene werden von CD1-Molekülen präsentiert werden, welche MHC-Klasse-I-like Zelloberflächenproteine, die in mehreren verwandten Formen in verschiedenen Säugetieren existieren. Bei Mäusen, die so genannte eine einzige Art von hochkonservierten CD1 - Molekül ist CD1d verantwortlich für die Präsentation von Glycolipid - Antigenen 10. Der Bürgermeister Population von T-Zellen, die CD1d / Glykolipid Komplexe erkennen ist invariant NKT-Zellen (iNKT Zellen) genannt. Diese Zellen exprimieren ein semi-invariant T - Zell - Rezeptor (TCR) einer invariant TCR & agr; Kette zusammengesetzt , die mit TCR & bgr; Ketten gekoppelt ist , die 11 Vielfalt begrenzt haben. Im Gegensatz zu herkömmlichen T - Zellen , die aktiviert Effektor - T - Zellen zu vermehren und zu differenzieren müssen zu werden, existieren iNKT Zellen als Effektor Bevölkerung und beginnen schnell nach Glykolipid Verwaltung 12 reagiert. Identifizierung von physiologisch relevanten präsentierenden Zellen Lipid-Antigen ist ein aktives Forschungsgebiet, und mehrere verschiedene Zelltypen, wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen und DCs wurden vorgeschlagen, um diese Funktion auszuführen. Es wurde jedoch gezeigt , dass die CD8a Pos Teilmenge von DCs die primäre Zelle ist vermittelnde Aufnahme und Präsentation von Antigenen auf Lipid Maus iNKT Zellen 13 und Glycolipid - vermittelten cross-Priming von CD8 - T - Zellen 14.
ove_content "> Um die Effizienz der Antigen-Präsentation durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen zu vergleichen, ein einfacher Ansatz ist, verschiedene Arten von gereinigten APCs gepulst mit äquivalenten Mengen an Antigen in naiven hosts. Cell Transfer Experimente dieses Typs übertragen werden häufig für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Allerdings Durchführen eines Transferstudien mit ex vivo Antigen behandelt DCs ist eine Herausforderung, da diese Zellen so selten Populationen in lymphatischen Organen bestehen , wo sie machen weniger als 2% der gesamten Zellen 15. daher ist es notwendig , die Entwicklung dieser Zellen in Spendertiere zu verbessern die Effizienz der Isolation Protokolle zu erhöhen.Es ist bekannt , dass die gemeinsame lymphoiden und myeloiden Vorläufern gemeinsamen, die zur Erzeugung von pDC, CD8 Pos und CD8 Neg DC Subsets express fms-verwandte Rezeptor - Tyrosinkinase 3 (Flt-3) erforderlich sind. Bei der In - vivo - Flt-3 - Ligand (Flt-3L) Verwaltung, emigratIon von Flt-3 - Vorläuferzellen aus dem Knochenmark exprimiert , wird erhöht, 16 in der erhöhten Aussaat von peripheren lymphatischen Organen und den Ausbau ihrer reifen DC Nachkommen zur Folge hat . Die Expression von Flt-3 wird während der Verpflichtung zur B, T oder NK-Zell-Differenzierungswege verloren. Daher ist nur eine minimale Veränderungen in diesen Zellen auf Flt-3L Verabreichung beobachtet. Ähnliche Expansion in DC - Populationen in Mäusen beobachtet tragenden Tumoren , die durch Implantation eines B16-Melanomzelllinie sekretierenden murinen Flt-3L, die für die Bereitstellung anhalt systemische Spiegel von Flt-3L 17,18 , ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Verfügung stellt. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir ein Protokoll basiert auf der Implantation von B16-Melanomzellen sezer Flt-3L entwickelt, um die Expansion aller normalen DC Untergruppen in der Milz der Maus zu stimulieren und somit erheblich die Ausbeuten dieser Zellen zu erhöhen, die für die nachfolgenden Experimenten isoliert werden kann . Wir finden immer wieder, dass innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach subkutaner imPlantage des Tumors Flt-3 sezernierenden, Mäuse entwickeln Splenomegalie mit deutlichen Anreicherung von DCs 40 zu bilden - 60% der gesamten Milz-Zellen. Aus diesen Milzen können verschiedene DC Untergruppen mit hoher Reinheit unter Verwendung von handelsüblichen Zellreinigung Kits isoliert werden, die Teilmenge spezifischen phänotypischen Marker verwenden.
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Protocol
Tierversuche werden in Übereinstimmung mit genehmigten Richtlinien der institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss (IACUC) durchgeführt. Alle Verfahren erfordern Sterilität sind in einem Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt.
1. Die Implantation von B16.Flt3L Melanom bei Mäusen
- Kultur der Flt-3 exprimierenden B16 - Melanomzelllinie in T25 - Gewebekulturkolben in einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in komplettem DMEM - Medium mit 10% CO 2 bei 37 ° C. Wachsen, bis die Zellen erreichen ~ 90% Konfluenz (~ 20 h).
- Ernte der Zellen durch Trypsin-Verdau. Absaugen Zellkulturmedien und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit PBS. 5 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Cold 20 ml komplettes DMEM-Medium (4 ° C) fötalem Kälberserum (FCS), enthaltend die Protease-Verdauung zu quenchen. Heben Sie die Zellen aus, indem Sie leicht durch sanftes Auf- und Abpipettieren gefolgt tippen.
- Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300xg für 10 min bei 4 ° C. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zelllebensfähigkeit Zähler. Resuspendieren zu einer Dichte von 10 8 Zellen / ml in PBS.
- Implantat - Mäuse (C57BL / 6 oder ein anderes histokompatiblen Stamm) mit Tumorzellen durch subkutane Injektion , wie beschrieben von Machholz et al. 19 an der Basis des Halses mit 100 ul Zellsuspension (10 7 Zellen).
- Lassen Sie den Tumor bis greifbar oder sichtbar zu wachsen (2 bis 10 mm im Durchmesser, in der Regel 7 bis 12 Tage), bevor die Tiere für Organentnahmen zu opfern.
2. Herstellung von Splenic Einzelzellsuspension von Tumor-tragenden Mäusen
- Anesthetize Mäuse mit einer Überdosis von Isofluran (Flussrate von Isofluran auf> 5% einstellen und weiterhin Anschläge Exposition mindestens 2 Minuten nach der Atmung). Opfere die Flt-3-Melanomtumoren tragenden Mäusen durch Genickbruch gemäß gültiger Richtlinien für Sterbehilfe.
- Disinfect die Haut mit 70% Ethanol und Ernte Milz unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer sterilen Schere 20.
- Legen Sie die Milz in eine sterile Petrischale für den Transport zur Biosicherheit Schrank. Führen Sie alle Schritte von hier auf unter sterilen Bedingungen.
- Übertragen Milz auf eine frische Petrischale und waschen mit RPMI-Medium. Schneiden Sie die Milz in kleine (~ 0,2 cm 2) Stücke mit einem Skalpell. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit 10 ml Kollagenase / DNase-Lösung.
- Gießen Sie die teilweise verdaute Suspension von Milzgewebe auf eine 70 um Zelle Sieb. Komprimieren der verbleibenden Gewebefragmente durch die Maschen des Siebs eine 5 ml Spritzenkolben verwendet.
- Waschen Sie den Netzfilter mit 10 ml frischem Medium und entsorgen Sie den Filter. Zentrifugiere die Suspension bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren.
- Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 2 ml Puffer RBC-Lyse. Inkubieren bei RT foder 10 min. Quench den Puffer RBC-Lyse von 10 ml komplettem RPMI-Medium hinzugefügt wird.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in geeigneten Volumen Zelldichte von 10 8 Zellen / ml in Zellsortierungspuffer (beispielsweise MACS) , enthaltend 20 ug / ml Fc-block - Antikörper (2.4G2) zu erreichen.
3. Reinigung von Plasmazytoide DCs, CD8a Pos DCs und CD8a Neg DCs von Splenic Einzelzellsuspension
Hinweis: Isolierung der splenic DC Untergruppen von Einzelzellsuspension ist ein mehrstufiges Verfahren , wie in 1 dargestellt Führen alle Schritte unter Verwendung von vorgekühlten Puffer und einem Eiswasserbad Temperatur bei 4 zu halten - 8 ° C.. Alle Reagenzienvolumina in dem folgenden Abschnitt des Protokolls für eine anfängliche Eingabe von 200 ul splenic Zellsuspension bei 10 8 Zellen / ml) berechnet. Dies kann skaliert werden odernach Bedarf auf nach unten durch das Volumen der Zellsuspension Ändern (immer bei einer Dichte von 1 × 10 8 Zellen / ml) und andere Reagenzien proportional in dem Anfangsschritt (3.1.1 und 3.2.1). Stellen Sie Reagenzvolumina in allen späteren Schritten entsprechend. Wenn beginnend mit 100 & mgr; l von Milz- Zellsuspension zum Beispiel bei 1 x 10 8 / ml, verwenden Sie die Hälfte der angegebenen Reagenzienvolumina in allen Schritten.
- Isolierung von Plasmazytoide DCs (PDC)
- In 300 ul Biotin-markierte Antikörper-Cocktail in der plasmazytoiden DC-Extraktions-Kit zu 200 ul splenic Zellsuspension zur Verfügung gestellt.
- Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen Sie das Röhrchen alle 3 min zu halten Zellen suspendiert und zu maximieren Antikörperbindung.
- Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen.
- Resuspendieren der Zellein 500 ul Zellsortierpuffer pelletieren. In 300 ul Anti-Biotin-Antikörper-konjugierten Perlen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 und 3.1.3.
- Überstand verwerfen und Zellpellet in 2 ml Zellsortierungspuffer. Führen Sie alle Schritte von diesem Zeitpunkt an bei RT mit vorgekühlten Puffer.
- Legen Sie eine frische magnetische activated cell sorting LS Spalte im magnetischen stehen. Waschen und equilibrieren Säule mit 5 ml Zellsortierpuffer.
- Pipette die Zellsuspension auf die Säule, Aufbringen sie sanft in die Mitte der Oberfläche des Säulenbettes. Sammeln Sie die Strömung durch.
- Die Säule wird mit 10 ml Zellsortierungspuffer. Sammeln Sie diese Strömung durch und verbinden sich mit dem Strom durch von Schritt 3.1.7. Die pDCs werden in dieser Spalte Fluss durch (FT1) angereichert.
- Pelletierung der Zellen von FT1 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, Resuspendieren in 2 ml Zellsortierungspuffer und die Zellen durch eine frische LS Säule passierendurch die Schritte 3.1.6 Wiederholung - 3.1.8. Diese Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Spalten ergibt eine verbesserte Reinheit der isolierten Zellen.
- Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 2 ml komplettem RPMI. Auf Eis, bis sie benötigt.
- Isolierung von CD8a Pos und CD8a Neg DCs
Hinweis: Der erste Schritt in diesem Verfahren ist Depletion von B, pDC, T und NK-Zellen.- Beginnend mit der ganzen Milz - Zellsuspension (1 ml von 10 ml 8 Zellen / in Schritt 2.8), 100 & mgr; l Biotin-konjugiertem Antikörper - Cocktail im Kit Pos DC Isolations CD8a vorgesehen.
- Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen das Röhrchen sanft alle 3 min Bindung von Biotin-markiertem Antikörper an ihre Zielzellen zu maximieren.
- Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. absaugen Supernatant ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen.
- Zugabe von 150 ul Zellsortierpuffer und 100 ul anti-Biotin versehen Kügelchen in der CD8a Pos DC - Extraktions - Kit. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min.
- 10 ml Zellpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Die Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und eine neue LS-Säule übergehen nach dem Verfahren in den Schritten 3.1.6 bis 3.1.8.
- Sammeln Sie die unbeschriftete Fluss durch 2 (FT2) und die Spalte Retentat verwerfen. Diese unmarkierten Fraktion wird für CD8a Pos und CD8a Neg DCs angereichert.
- Pelletieren Sie die Zellen in FT2 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und mit 200 & mgr; l anti-CD8a konjugierten magnetischen Kügelchen im Kit Pos DC Isolation CD8a zur Verfügung gestellt.
- Vertreteressen Schritte 3.2.2 bis 3.2.6. Der Fluß durch die Säule wird für CD8a Neg DCs angereichert und CD8a Pos DCs abgereichert. Dies wird Fluss durch 3 (FT3) markiert.
- Um die CD8a Pos DCs in der Säule zurückgehalten, entfernen Sie die Säule aus dem Magneten eluieren, 5 ml Zellsortierpuffer und spülen Sie die Spaltenmatrix mit den Kolben mit dem LS - Säule zur Verfügung gestellt.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand und resuspendieren in 1 ml Zellsortierpuffer. Um die Reinheit zu erhöhen, laufen wieder die eluierten Zellen durch eine frische LS-Säule durch die Schritte 3.1.6 bis 3.1.8: Wiederholung, mit Ausnahme der Strömung durch verwerfen und sammeln beibehalten Zellen wie in 3.2.11.
- Um die CD8a Neg DCs aus der FT3 Suspension reinigen, pelletieren Sie die FT3 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 & mgr; l Zellsortierungspuffer.
- 100 l anti-CD11c magmagnetischen Perlen. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min.
- 10 ml Zellsortierungspuffer und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 bis 3.1.8. Die CD8a Neg DCs sind positiv mit CD11c beads ausgewählt und an die Säule gebunden. Die Strömung kann durch verworfen werden.
- Eluieren in der Säule zurückgehalten Zellen als 3.2.11 in Schritt beschrieben , die das gereinigte CD8a Neg DCs zu sammeln.
4. Pulsing APCs mit Antigenen und Zelltransfer
- Zählen Sie die lebenden Zellen nach der Reinigung Trypanblauausschluß 21 zu unterscheiden lebenden und toten Zellen.
- Inkubieren der Zellen mit dem Antigen der Wahl. Verwenden Sie Analoga von Glycolipid - Antigen genannt alpha-Galactosyl - Ceramid (αGalCer) bei 100 nM Konzentration 13. Typischerweise Platte 10 6 lebensfähigen Zellen / Vertiefung in komplettem RPMI - Medium unter Verwendung von Ultra-Low - attachment U-Boden-96-Well-Platten Zellanhaftung zu minimieren. Inkubieren der Zellen in einem 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 1 - 4 Stunden.
- Ernten Sie die Zellen durch mehrere Male sanft Pipettieren. Verwenden Sie weite Bohrung Pipettenspitzen Zellschäden durch Scherkräfte zu minimieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und bündeln diese Wäschen Zellernte zu maximieren.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung in gewünschte Dichte in PBS. Typischerweise injizieren 1 Million Zellen in 200 ul pro Empfängertier. Halten Sie die Zellen auf Eis zu maximieren Lebensfähigkeit vor der Verabreichung in Wirtstiere.
- Injizieren Zellen intravenös in Mäuse entweder durch den seitlichen Schwanz vergeblich oder dem retroorbitalen Venenplexus 19. Verwenden Sie eine 27 G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze und injizieren ein maximales Volumen von 0,1 ml pro Maus.
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Representative Results
Die Ergebnisse dieses Verfahrens beruht auf der Expansion des DC Untergruppen durch murine Flt-3L durch die implantierten Melanomzellen exprimiert wird. Der B16.Flt3L Tumor wurde aus einer C57BL / 6-Maus abgeleitet und sollte mit diesem Stamm Hintergrund, um in Tiere implantiert werden Versagen des Tumors zu vermeiden wegen Ablehnung zu etablieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, genetisch veränderte Mäuse verwenden DCs mit bekannten Defekten in Signalwege oder Rezeptoren von Interesse abzuleiten. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass der Tumor mit unterschiedlichen Kinetik bei solchen Tieren entwickeln können, so ist es wichtig, das Tumorwachstum basierend auf Aussehen und Palpation an der Impfstelle zu überwachen. Unserer Erfahrung nach, wenn der Tumor tastbar ist, zeigen die B16.Flt3L tumortragenden Mäuse konsequent eine deutliche Erhöhung der Milz- Zellularität , die mit Expansion aller DC - Untergruppen korreliert (2A). Wir sehen in der Regel eine 2- bis 3-fach increase in der Anzahl der Gesamt Splenozyten von B16.Flt3L Melanom-tragenden Mäusen im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Der Anstieg in der Anzahl von DC in Teil trägt zur scheinbaren Verringerung der Häufigkeit von B-Zellen, während es zu keiner Veränderung in der absoluten Zahl der B-Zellen wenig. Interessant ist, während eine große Ausdehnung (~ 15- bis 20-fachen Anstieg in der absoluten Zahlen) für konventionelle DCs in diesen Mäusen beobachtet wird, gibt es nur eine geringfügige Erhöhung (ca. 4-fach) in der Teilmenge plasmazytoiden DC beobachtet.
Die Gating - Strategie verschiedene DC Untergruppen zu identifizieren , ist in 2A gezeigt und beruht auf der Expression von B220, CD11b, CD11c und CD8a als Teilmenge spezifischen phänotypischen Markern (2B). Wir untersuchten auch DEC205, CD11b und mPDCA1 Ausdruck auf diesen Untergruppen , wie in 2B gezeigt. Dies zeigt das erwartete Muster, mit mPDCA nur auf dem PDC-Teilmenge, während Dezember 205 ist in hohem Maße von CD8a Pos DCs exprimiert und CD11b wird am deutlichsten auf CD8a Neg DCs nachgewiesen. Wir analysierten auch die Veränderungen in der Zell Frequenzen für jede der Untermengen in jeder Stufe des Protokolls gereinigt hier beschrieben (zusammengefasst in Figur 2C mit detaillierten Beispielen der durchflusszytometrischen Daten in Abbildung 3). Die Isolierung der splenic DC Untergruppen in diesem Verfahren beschrieben wird , ist ein mehrstufiges Verfahren (Figur 1). Reinigung von plasmazytoiden DCs stützt sich auf die negative Selektion, diese Zellen nach Erschöpfung aller unerwünschten Populationen wie B, T, NK-Zellen und konventionellen DCs zu bereichern. Reinigung des CD8a Pos DCs und CD8a Neg DCs ist durch positive Selektion dieser Zellen nach der Abreicherung von T, B und NK - Zellen durchgeführt. Die hohe Reinheit jeder der DC Untergruppen erhalten unter Verwendung dieses Verfahrens (typischerweise ~ 95%) ist ebenfalls in 3 dargestellt.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> auf den Experimenten Je durchgeführt werden, können diese Zellen mit einem gewünschten Antigen hergestellt und in histokompatibles murine Wirte für immunologische Untersuchungen gepulst werden Darüber hinaus können diese Zellen auch für in - vivo - Studien von stimulierenden oder regulatorischen Aktivitäten von physiologischen DC Untergruppen verwendet werden. Die Zellausbeuten für die gereinigten DC Teilmengen pro 2 x 10 7 gesamt Splenozyten sind etwa eine Million pDCs, 2 Millionen CD8a Pos DCs und 4 Millionen CD8a Neg DCs.
Abbildung 1. Isolierung von DCs. Eine schematische Darstellung der verschiedenen Schritte des Protokolls für die Isolierung von verschiedenen Untergruppen von DCs darstellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. >
Abbildung 2. Analyse der Splenic DC Subsets in Mäusen mit B16.Flt3L Tumoren. Zu pDCs (R1) entspricht, CD8a Pos DCs (R5) und CD8a Neg DCs (R6). B) Die Expression von mPDCA1, 33D1, DEC205 und CD11b auf verschiedenen Untergruppen A) Gating - Strategie illustriert die Zellpopulationen zu identifizieren. Die enthaltenen Zellen in Gate - R4 (einer Untergruppe von Lymphozyten, negativ für B220, CD11c, CD11b). Werden als Kontrollpopulation fehlt , die Expression dieser Marker C) Relative Anreicherung von DC und Lymphozyten - Teilmengen aus den Milzen von Mäusen am Tag isoliert verwendet 14 nach der Inokulation von B16.Flt3L Melanomzellen wird in der linken Grundstück als schwarze Balken, während die Frequenz dieser Zellpopulationen in naiven Mäusen gezeigt als weiße Balken dargestellt. Die rechte Plot zeigt die gleichen Daten wie Zellzahlen.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Analyse von Splenic DC Subsets während der Anreicherung Protokoll. A) Anreicherung von plasmazytoiden DCs (B220 hoch und CD11c niedrig, R1) von 10% in der Ausgangspopulation von Splenozyten von B16.Flt3L Tumor Mäuse zu ~ 95% Reinheit in der Spalte fließen durch 1. Hinweis tragen , die aus dieser Säule eluiert Retentat Zellen aus dieser Population abgereichert. B) Anreicherung von herkömmlichen DCs (in CD11c hoch, Mischung aus CD8a positiv und negativ) von ~ 33% in der Milz von B16.Flt3L Melanom-tragenden Mäusen am Tag 10 nach der Tumorimplantation auf ~ 78% in die Strömung durch 2 -Fraktion. In der Spalte Retentat 2 Plots erscheinen die CD11c positive Bevölkerungs parti seinally abgereichert, auf die Entfernung von beträchtlichen Zahl von DCs bei der negativen Selektion entsprechenden T, B und NK-Zellen abzureichern. Eine weitere Fraktionierung der Strömung durch 2 -Suspension unter Verwendung einer positiven Selektion für anti-CD8 - Bindungs Ausbeuten> 95% Reinheit CD8a Pos DCs. Die Strömung durch daraus wurde dann zu einer positiven Selektion unterzogen für die Bindung von Anti-CD11c, wodurch man eine Bevölkerung von> 95% rein CD8a Neg DCs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dendritische Zellen werden akzeptiert die wichtigsten professionellen Antigen zu sein Zellen beteiligt in der Priming von T-Zell-Antworten zu präsentieren. Ihre Hauptfunktion ist es, die Gewebe-Mikroumgebung Umfrage durch die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen für die Präsentation an T-Zellen. Um die Funktion von spezifischen DC Untergruppen zu untersuchen, müssen diese in ausreichender Zahl isoliert werden, um einen Ansatz, der ihren normalen Phänotyp und Funktionen beibehält. Die meisten Protokolle basieren auf der Isolierung von spezifischen DC Teilmenge von naiven Mäusen. Da diese Zellen selten sind, sind die Isolationsverfahren nicht effizient und liefern geringe Anzahl von Zellen. Zum Beispiel wird eine Ausbeute Milz nur etwa 0,5 bis 1.000.000 CD8 pos DCs, während die meisten Experimente mit Transfer - Studien durchgeführt zumindest diese Anzahl von Zellen pro Tier verwendet werden . Somit ist eine große Einschränkung der existierenden Verfahren die Unfähigkeit, ohne Verwendung einer sehr großen Anzahl von Spendermäusen und erhebliche Mengen ausreichende Zellzahlen zu isolieren,von Reagenzien. Unser Verfahren überwindet diese Probleme im Wesentlichen durch Mäuse implantiert mit einem Flt-3L sezernierenden Tumor mit stark die DCs zu erweitern, so dass die Reinigung von viel größerer Zahl der drei allgemein anerkannten DC Teilmenge eine Reihe von immunomagnetischer Reinigungsschritte verwendet wird. Das hier beschriebene Protokoll ist daher eine wesentliche Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren in Bezug auf die Erträge um mindestens ein vielfaches.
Einige Einschränkungen gibt es für die Isolierung Protokoll hier beschrieben. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass das Verfahren zur Isolierung dieser Zellen verwendet versehentlich ihren Phänotyp verändern können. DCs sind außerordentlich empfindlich auf Endotoxinkontamination und mechanische Reize, die auf Veränderungen in ihrem Phänotyp und Funktion führen kann. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die Abhängigkeit von Flt-3L Sekretion DC Untergruppen zu erweitern. Daraus ergibt sich der Mangel an Expansion in Gewebe resident DC Untergruppen, welche die Flt-3-Rezeptor nicht exprimieren.
Dasunter Verwendung von Zellanreicherung im Handel erhältlichen Reagenzien beschriebenen Protokoll stützt sich hier auf. Das Kit für die Isolierung von Zellreinigung kommt mit einem Protokoll, das die empfohlenen Mengen an Reagenzien enthält, verwendet werden. Die Zellzusammensetzung der Tumor tragenden Mäusen dramatisch verschieden von der naiven Mäusen (2C), und somit haben wir die Mengen der Reagenzien in unserer Technik zu erreichen , um ein optimales Zell Reinheit verwendet modifiziert. Die DCs sind adhärente Zellen und kann an die Säulenmatrix unspezifisch befestigen. Äquilibrierung des Säulenbettes mit Puffer EDTA minimiert Zelladhärenz enthalten, und die Verwendung von Serienpassage über zwei aufeinanderfolgende Spalten verbessert die Zelle weiterhin Reinheit.
DCs sind stark anhaftenden Zellen und in vivo sind in der Regel eng mit der extrazellulären Gewebematrix verbunden. Um die Ausbeute zu erhöhen, ist es sehr wichtig, das Milzgewebe mit Kollagenase und DNase für ausreichend tim zu verdauene eine maximale Anzahl dieser Zellen zu extrahieren. Es ist auch wichtig, um sicher zu sein, dass die Milzgewebe Fragmente werden in der Kollagenase / DNase I-Lösung vollständig eingetaucht, während der Verdauung unterzogen. Ein weiteres wichtiges Merkmal der galvanischen Trennung ist streng Sterilität und Endotoxin freien Bedingungen während des Isolationsverfahrens zu halten, da diese Zellen sehr Endotoxin ansprechen. Verwenden Sie frisch zubereiteten Reagenzien aus Endotoxin-freie Bestände und Filter alle Reagenzien vor Gebrauch zu sterilisieren. Alle Zellisolierung Puffer und Medien sollten mit FCS ergänzt werden, die zertifiziert ist frei von nachweisbarem Endotoxin zu sein. Diese Zellen sind auch sehr empfindlich auf mechanische Reize und wiederholte mechanische Stimulation kann die Reifung Zustand dieser Zellen zu verändern. Obwohl eine gewisse mechanische Kraft benötigt wird, um das Gewebe durch ein Zellsieb nach Kollagenaseverdau zu zwingen, sollte dies so schonend wie möglich durchgeführt werden. Zusätzlich heftiges Pipettieren der Zellen sollten so weit wie possibl vermiedene, und weite Bohrung Pipettenspitzen sollten Scherkräfte verwendet werden, zu minimieren.
Der adoptive Transfer-Modell ist für die Untersuchung der Antigenpräsentation und T-Zell-Priming durch spezifische Teilmengen von DCs nützlich. Es hat sich jedoch auch in anderen Studien gezeigt, dass der Antigen-Übertragung kann von Antigen gepulsten DCs um DCs endogene auftreten. So kann Präsentation durch endogene DCs reflektieren die adaptive Immunantwort durch Antigen gepulst Zellen initiiert die "eingefangen" Antigen-präsentierenden und nicht, dass der übertragenen APC. Diese Art der Übertragung ist exponentiell, wenn die isolierten DC Vorbereitungen tote oder sterbende Zellen enthalten erhöht. Es ist daher wichtig, die Gleichstromisolierung und Übertragungsprotokoll so schnell wie möglich durchzuführen, unter Verwendung von sterilen Bedingungen mit vorgekühlten Puffer Überleben der Zelle zu verbessern. Wir wählten eine relativ kurze Antigen pulsierend Zeitraum von 4 h aus diesem Grund mit der Inkubation in geringen Bindungszellkulturplatten, die Zellanheftung zu minimieren, währenddieser Schritt. Darüber hinaus kann verlängert Kulturbedingungen die Reifung Status von kultivierten DCs zu verändern, und kann das Ergebnis der Adoptivtransferexperimente 22 beeinflussen.
Zusammengefasst ist der Biologie dendritischer Zellen ein sehr aktives Gebiet der Forschung und Entwicklung eines zuverlässigen Methode DCs zu erzeugen , die getreu ihrem in vivo phänotypische und funktionelle Divergenz stellt eine immense Chance spiegeln diese Zellen zu studieren. Dies wird besonders wichtig für Studien mit Chemikalien, die DC-Funktionen modulieren, können aber nicht systemisch in Tiermodellen verabreicht werden. Die Behandlung der isolierten DC Untergruppen von Interesse ex vivo mit diesen Chemikalien ist eine praktische und machbare Ansatz, der die mechanistischen Details der Antigenpräsentation Wege aufzuklären helfen können.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH / NIAID Zuschuss AI45889 zu SAP Flow-Zytometrie unterstützten Studien wurden unter Verwendung von Kernanlagen durch die Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) und Zentrum für AIDS-Forschung (NIH / NIAID AI51519) unterstützt FACS durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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