Abstract
Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles principalement responsable de l'acquisition, le traitement et la présentation des antigènes sur des molécules présentatrices d'antigènes pour déclencher une immunité des lymphocytes T à médiation. Les cellules dendritiques peuvent être séparés en plusieurs sous-ensembles phénotypiquement et fonctionnellement hétérogènes. Trois sous - ensembles importants de cellules dendritiques spléniques sont plasmacytoïdes, les cellules CD8a Pos et CD8a Neg. Les CD plasmacytoïdes sont des producteurs naturels de l'interféron de type I, et sont importants pour l'immunité anti-viral de cellule T. Le sous - ensemble CD8a Neg DC est spécialisé pour le CMH de classe II présentation de l' antigène et est impliqué dans le centre de l' amorçage des cellules T CD4. Le CD8a Pos PED sont principalement responsables de la présentation croisée des antigènes exogènes et CD8 T amorçage cellulaire. Les CD8a Pos PED ont été démontrés pour être plus efficace lors de la présentation des antigènes glycolipidiques par des molécules CD1d à un T cel spécialisél population connue sous le nom tueuses naturelles invariant cellules T (iNKT). L'administration du ligand de Flt-3 augmente la fréquence de migration des précurseurs de cellules dendritiques provenant de la moelle osseuse, entraînant finalement l'expansion des cellules dendritiques dans les organes lymphoïdes périphériques dans des modèles murins. Nous avons adapté le modèle pour purifier un grand nombre de cellules dendritiques fonctionnelles pour une utilisation dans des expériences de transfert de cellules pour comparer aptitude in vivo des différents sous - ensembles à courant continu.
Introduction
Les cellules dendritiques (DC) ont été découverts il y a près de quarante ans que la "grande étoilées (grec dendron) cellule" trouvé dans les organes lymphoïdes 1. De nombreuses études ont montré que les DC sont les seules cellules présentatrices de l' antigène qui peut stimuler efficacement les lymphocytes T naïfs 2. Une fonction majeure de ces cellules est l'absorption et la présentation des antigènes et de leur traitement efficace et le chargement de ces molécules sur présentatrices d'antigène. Dans la rate de la souris, les CD peuvent être séparés en plasmacytoïdes et des sous-ensembles classiques. Les CD plasmacytoïdes sont caractérisés par une faible expression de CD11c et des niveaux élevés de B220 et Gr-1. Ils sont également positifs pour le marqueur mPDCA1 de surface et sécrètent interféron de type I en réponse à péage comme récepteur 9 (TLR9) ligands. Les CD classiques sont élevés pour CD11c et classe l'expression du CMH II. Ils peuvent être divisés en trois sous-ensembles distincts basés sur l'expression de surface des marqueurs phénotypiques tels que CD4, CD8a, DEC205, CD11b et cellules dendritiques récepteur inhibiteur 2 (DCIR2, reconnu par l'anticorps 33D1) protéines 3,4. Les CD8a Pos DC sont également connus comme CDC1, sont positifs pour DEC205, mais négatif pour les marqueurs myéloïdes tels que CD11b et 33D1. Le CD8a Neg DC, aussi appelé cdc2, sont positifs pour 33D1, CD11b et CD4 mais manquent DEC205. Le sous - ensemble double négation (ie, négatif à la fois CD4 et CD8a) est relativement rare, et est négative pour DEC205 et 33D1. Il est le sous - ensemble moins caractérisée et peut - être une forme moins différenciée de CD8a Neg DC.
Les différences phénotypiques dans les différents sous - ensembles DC étendent aussi leurs fonctions in vivo. Le CD8a Neg DC sont très phagocytaire et sont pensés pour présenter l' antigène exogène principalement par le CMH de classe II à des cellules T CD4 3. En revanche, les CD8a Pos DCs sont spécialisés pour la présentation d' un antigène protéique soluble dans le CMH de classe Idans un mécanisme appelé présentation croisée. Le résultat de la présentation croisée dépend de l'état d'activation de ces PED 5, et peut conduire soit à l' expansion des cellules T cytotoxiques (CTL) ou le développement de cellules T régulatrices 6 2,7. Le ciblage de l' antigène à CD8a Pos DC en utilisant les résultats de la livraison anti-DEC205-anticorps médiée en grande partie dans la suppression des cellules T 8, alors que la présentation des antigènes dérivés de cellules apoptotiques infectées induit une réponse CTL forte 9.
En plus de la reconnaissance des antigènes peptidiques, le système immunitaire des mammifères a évolué pour reconnaître les antigènes de lipides et glycolipides. Ces antigènes sont présentés par des molécules CD1, qui sont du CMH de classe de protéines de surface cellulaire I-like qui existent dans de multiples formes liées à divers mammifères. Chez la souris, un seul type de molécule CD1 hautement conservée appelée CD1 est responsable de la présentation des antigènes glycolipidiques 10. Le principal une population de cellules T qui reconnaissent des complexes CD1d / glycolipides est appelé cellules NKT invariantes (cellules iNKT). Ces cellules expriment un récepteur de cellules T invariantes demi-(TCR) composé d'une chaîne TCRa invariante qui est associée à des chaînes qui ont TCRβ diversité 11 limitées. Contrairement aux cellules T conventionnelles qui doivent proliférer et se différencier en cellules T effectrices activées, les cellules iNKT existent sous la forme d' une population effectrice et commencer à intervenir rapidement après l' administration de 12 glycolipides. L'identification des cellules présentatrices d'antigène lipidique physiologiquement pertinente est un domaine actif de recherche, ainsi que plusieurs types de cellules distinctes telles que des cellules B, les macrophages et les DC ont été proposées pour effectuer cette fonction. Cependant, il a été démontré que le sous - ensemble Pos CD8a de DC est la cellule primaire médiation absorption et la présentation des antigènes aux cellules lipidiques iNKT de souris 13 et des glycolipides à médiation par contre-amorçage des cellules T CD8 14.
ove_content "> Pour comparer l'efficacité de la présentation de l'antigène par différentes cellules présentant l'antigène, une approche directe consiste à transférer différents types de TTB purifiées puisées avec des quantités équivalentes de l'antigène dans des hôtes naïfs. expériences de transfert de cellules de ce type sont souvent effectuées pour des études immunologiques. Cependant, la réalisation d' études de transfert avec des DC antigène ex vivo traité est difficile, étant donné que ces cellules existent populations comme rares dans les organes lymphoïdes où ils représentent moins de 2% des cellules totales 15. Il est donc nécessaire de renforcer le développement de ces cellules chez les animaux donneurs d'augmenter l'efficacité des protocoles d'isolement.Il est connu que le lymphoïde commun et progéniteurs myéloïdes communs, qui sont nécessaires pour la production de pDC, CD8 Pos et des sous - ensembles CD8 Neg DC, express liés fms-récepteur tyrosine kinase 3 (Flt-3). Une fois in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) l' administration, emigration de Flt-3 exprimant des cellules progénitrices de la moelle osseuse est augmentée, ce qui entraîne une augmentation de l'ensemencement des organes lymphoïdes périphériques et l'expansion de leur descendance 16 dendritiques matures. L'expression de Flt-3 est perdue lors de l'engagement du B, T ou NK voies de différenciation cellulaire. Par conséquent, seules des modifications minimes sont observées dans ces cellules lors de l'administration Flt-3L. Expansion similaire dans les populations DC est observée chez les souris portant des tumeurs générées par l' implantation d'une lignée de cellules B16-mélanome sécrétant murin Flt-3L, qui fournit une méthode simple et économique pour fournir des niveaux systémiques soutenus de Flt-3L 17,18. En utilisant cette approche, nous avons mis au point un protocole basé sur l'implantation de cellules B16-mélanome sécrétant Flt-3L pour stimuler l'expansion de tous les sous-ensembles DC normaux dans la rate de la souris, ce qui augmente considérablement les rendements de ces cellules qui peuvent être isolées pour des expériences ultérieures . Nous constatons régulièrement que dans les 10 - 14 jours après im sous-cutanéela plantation de la tumeur sécrétant Flt-3, les souris développent une splénomégalie avec un enrichissement notable de DCs pour constituer 40-60% des cellules de rate totales. A partir de ces rates, différents sous-ensembles DC peuvent être isolés avec une grande pureté en utilisant le standard disponibles dans le commerce des kits de purification de cellules qui emploient des marqueurs phénotypiques spécifiques sous-ensemble.
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Protocol
Les expérimentations animales sont réalisées conformément aux lignes directrices approuvées de la protection des animaux et de l'utilisation comité institutionnel (IACUC). Toutes les procédures nécessitant la stérilité sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique.
1. Implantation de B16.Flt3L mélanome chez la souris
- La culture de la lignée exprimant Flt-3 B16 de mélanome de cellules dans des fioles T25 pour culture de tissus , à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet DMEM avec 10% de CO2 à 37 ° C. Cultivez jusqu'à ce que les cellules atteignent ~ 90% de confluence (~ 20 h).
- Récolter les cellules par digestion à la trypsine. Aspirer le milieu de culture cellulaire et laver les cellules adhérentes avec du PBS. Ajouter 5 ml de trypsine à 0,05% et on incube pendant 5 minutes à 37 ° C. Ajouter à froid 20 ml de milieu DMEM complet (4 ° C) contenant du sérum de veau fœtal (FCS) pour étancher la digestion par la protéase. Soulevez les cellules off par tapotant légèrement suivie par pipetage de haut en bas.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 300xg pendant 10 min à 4 ° C. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou un compteur de viabilité cellulaire automatisée. Remettre en suspension à une densité de 10 8 cellules / ml dans du PBS.
- Implant (souris C57BL / 6 ou d'une autre souche histocompatible) avec des cellules tumorales par injection sous - cutanée comme décrit par Machholz et al. , 19 à la base du cou , avec 100 ul de suspension cellulaire (10 7 cellules).
- Laisser la tumeur de croître jusqu'à ce que palpable ou visible (2 - 10 mm de diamètre, habituellement 7 - 12 jours) avant de sacrifier des animaux pour le prélèvement d'organes.
2. Préparation de splénique simple suspension cellulaire de souris porteuses de tumeurs
- Anesthetize souris avec une surdose d'isoflurane (ajuster le débit de l'isoflurane à> 5% et continuer l'exposition au moins 2 minutes après l'arrêt respiratoire). Sacrifiez le mélanome tumeur souris Flt-3 de palier par dislocation cervicale selon les directives institutionnelles pour l'euthanasie.
- Disinfect la peau avec 70% d' éthanol et la récolte de la rate en utilisant une technique aseptique à l'aide de ciseaux stériles 20.
- Placez la rate dans une boîte de Pétri stérile pour le transport vers l'enceinte de sécurité biologique. Effectuez toutes les étapes à partir de maintenant dans des conditions stériles.
- Transférer la rate dans une boîte de Petri frais et laver avec du milieu RPMI. Couper la rate en petits morceaux (~ 0,2 cm 2) à l' aide d' un scalpel. Incuber pendant 30 min à 37 ° C avec 10 ml de solution de collagénase / DNase.
- Verser la suspension partiellement digérés du tissu splénique sur un tamis cellulaire de 70 pm. Comprimer les fragments de tissus restants à travers les mailles du tamis au moyen d'un piston de la seringue de 5 ml.
- Laver le filtre à tamis avec 10 ml de milieu frais et jeter le filtre. Centrifuger la suspension à 300 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de tampon de lyse RBC. Incuber à température ambiante fou 10 min. Étancher le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 10 ml de milieu RPMI complet.
- Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans un volume approprié pour obtenir une densité cellulaire de 10 8 cellules / ml dans un tampon de tri cellulaire (par exemple MACS) contenant 20 pg / ml d'anticorps Fc-bloc (2.4G2).
3. Purification de plasmacytoïdes DC, CD8a Pos DC et CD8a Neg DC de splénique simple suspension cellulaire
Remarque: L' isolement des sous - ensembles DC spléniques de suspension cellulaire unique est une procédure en plusieurs étapes comme illustré sur la Figure 1 Effectuez toutes les étapes en utilisant un tampon de pré-refroidi et un bain d'eau glacée pour maintenir la température à 4-8 ° C.. Tous les volumes de réactifs dans la section suivante du protocole sont calculés pour une entrée initiale de 200 pi de suspension de cellules spléniques à 10 8 cellules / ml). Ceci peut être agrandie ouvers le bas en fonction de votre besoin en modifiant le volume de la suspension cellulaire (toujours à une densité de 1 X 10 8 cellules / ml) et d' autres réactifs proportionnellement à l'étape initiale (3.1.1 et 3.2.1). Ajustez les volumes de réactifs dans toutes les étapes ultérieures en conséquence. Par exemple, si à partir de 100 pi de suspension de cellules spléniques à 1 x 10 8 / ml, utiliser la moitié des volumes de réactifs indiqués dans toutes les étapes.
- Isolement des plasmacytoïdes DC (pDC)
- Ajouter 300 pl de cocktail d'anticorps marqué à la biotine fourni dans le kit d'isolation DC plasmacytoïdes à 200 ul de suspension de cellules spléniques.
- Bien mélanger et incuber dans un bain d'eau glacée pendant 15 min. Appuyez sur le tube toutes les 3 min pour maintenir les cellules en suspension, et de maximiser la liaison de l'anticorps.
- Ajouter 12 ml de tampon de tri et de cellules sédimenter les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant pour éliminer les anticorps biotinylés non liés.
- Remettre en suspension la cellulele culot dans 500 pl de tampon de tri cellulaire. Ajouter 300 ul de billes d'anticorps anti-biotine conjugué. Répétez l'étape 3.1.2 et 3.1.3.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de tampon de tri cellulaire. Effectuez toutes les étapes de ce point à la température ambiante à l'aide de tampons pré-refroidi.
- Placez un champ magnétique cellules fraîches activé tri colonne LS dans le support magnétique. Laver et équilibrer la colonne avec 5 ml de tampon de tri cellulaire.
- Introduire à la pipette la suspension de cellules dans la colonne, en l'appliquant doucement vers le centre de la surface du lit de la colonne. Recueillir l'écoulement à travers.
- Laver la colonne avec 10 ml de tampon de tri cellulaire. Recueillir ce flux à travers et se combiner avec l'écoulement à travers l'étape 3.1.7. Les pDC sont enrichis dans ce flux de colonne à travers (FT1).
- Pellet les cellules de FT1 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, remettre en suspension dans 2 ml cellule tampon de tri et de passer les cellules à travers une colonne de LS fraisen répétant les étapes 3.1.6 - 3.1.8. Cette utilisation de deux colonnes séquentielles donne une pureté accrue des cellules isolées.
- cellules à granules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, et remettre en suspension avec 2 ml RPMI complet. Placez sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
- Isolement de CD8a Pos et CD8a Neg DC
Remarque: La première étape de cette procédure est la déplétion des cellules B, pDC, T et NK.- A partir de l'ensemble de la suspension de cellules de rate (1 ml de 10 8 cellules / ml obtenues à l' étape 2.8), ajouter 100 pi de cocktail d'anticorps conjugué à la biotine fournie dans le kit d'isolation CD8a Pos DC.
- Bien mélanger et incuber dans un bain d'eau glacée pendant 15 min. Appuyez sur le tube doucement toutes les 3 min pour maximiser la liaison des anticorps marqués à la biotine à leurs cellules cibles.
- Ajouter 12 ml cellule tampon tri et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer supernatant pour éliminer les anticorps biotinylés non liés.
- Ajouter 150 ul de tampon de tri de cellules et de 100 ul de billes anti-biotine fournies dans le kit d'isolation CD8a Pos CC. Bien mélanger et incuber dans un bain d'eau glacée pendant 15 min.
- Ajouter 10 ml cellule tampon tri et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspendre les cellules dans un tampon de tri 1 ml de cellules et passer sur une colonne de LS frais selon la procédure des étapes 3.1.6 à travers 3.1.8.
- Recueillir l'écoulement non marqué à 2 (FT2) et jeter le rétentat de colonne. Cette fraction non marquée est enrichie en CD8a Pos et CD8a Neg DC.
- Pellet les cellules FT2 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans un tampon de tri 1 ml de cellules et ajouter 200 ul d'anti - CD8a-billes magnétiques conjuguées fournies dans le kit d'isolation CD8a Pos CC.
- Représentantmanger étapes 3.2.2 à travers 3.2.6. Le débit à travers de la colonne est enrichi pour CD8a Neg PED et appauvri pour CD8a Pos PED. Ceci est étiqueté écoulement à travers 3 (FT3).
- Pour éluer la CD8a Pos DCs retenue dans la colonne, retirer la colonne de l'aimant, ajouter 5 ml de tampon de tri de cellules et purger la matrice de la colonne à l' aide du piston fourni avec la colonne LS.
- Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un tampon de tri 1 ml de cellules. Pour augmenter la pureté, exécutez les cellules éluées à nouveau à travers une colonne de LS frais en répétant les étapes 3.1.6 à 3.1.8, sauf jeter l'écoulement à travers et de recueillir des cellules retenues comme dans 3.2.11.
- Pour purifier le CD8a Nég DCs à partir de la suspension FT3, le culot FT3 par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 300 pi de tampon de tri cellulaire.
- Ajouter 100 pi d'anti-CD11c magperles nétiques. Bien mélanger et incuber dans un bain d'eau glacée pendant 15 min.
- Ajouter les cellules de tri 10 ml de cellules de tampon et de granulés par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Répétez les étapes 3.1.5 à travers 3.1.8. Le CD8a Neg DC sont positivement sélectionné avec des perles de CD11c et sont liés à la colonne. Le débit à travers peut être jeté.
- Eluer les cellules retenues dans la colonne comme décrit à l' étape 3.2.11 pour recueillir purifié CD8a Neg DC.
4. Pulsing TTB avec Antigènes et transfert de cellules
- Compter les cellules vivantes après purification en utilisant l' exclusion du bleu trypan 21 de distinguer les cellules vivantes et mortes.
- Incuber les cellules avec l'antigène de choix. Utilisez des analogues de l' antigène glycolipidique appelée alpha-galactosyl céramide (aGalCer) à 100 nM concentration 13. Typiquement, la plaque 10 6 cellules viables / puits dans un milieu RPMI complet utilisant ultra low-attachment à fond en U plaques à 96 puits pour réduire au minimum la fixation des cellules. Incuber les cellules dans une atmosphère de CO2 à 5% à 37 ° C pendant 1 à 4 heures.
- Récolte des cellules par pipetage plusieurs fois. Utilisez de larges conseils alésage de pipette pour réduire au minimum les dommages aux cellules des forces de cisaillement. Laver les puits avec du PBS et mettre en commun ces lavages pour maximiser la récolte des cellules.
- Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et la remise en suspension à une densité désirée dans du PBS. Typiquement, injecter 1 million de cellules dans 200 pi par animal receveur. Gardez les cellules sur la glace afin de maximiser la viabilité avant l'administration à des animaux hôtes.
- Injecter des cellules par voie intraveineuse à des souris , soit par la queue vain latérale ou le plexus veineux rétro-orbital 19. Utiliser une aiguille 27G sur une seringue de 1 ml et injecter un volume maximal de 0,1 ml par souris.
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Representative Results
Le résultat de cette procédure repose sur l'expansion des sous-ensembles DC par murin Flt-3L exprimé par les cellules de mélanome implantées. B16.Flt3L la tumeur est dérivé d'une souris C57BL / 6, et doivent être implantés dans les animaux avec cette souche de fond afin d'éviter l'échec de la tumeur à s'établir en raison du rejet. Dans certains cas, il peut être souhaitable d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour dériver les PED avec des défauts connus dans les voies ou les récepteurs d'intérêt de signalisation. Il est important de garder à l'esprit que la tumeur peut se développer avec des cinétiques différentes dans ces animaux, il est donc important de surveiller la croissance des tumeurs en fonction de l'apparence et la palpation au niveau du site d'inoculation. Dans notre expérience, une fois que la tumeur est palpable, la tumeur B16.Flt3L des souris porteuses montrent systématiquement une augmentation marquée de la cellularité splénique qui est en corrélation avec l' expansion de tous les sous - ensembles DC (Figure 2A). Nous voyons habituellement un 2 à 3 fois de plus ene dans le nombre total de splénocytes obtenus à partir de souris porteuses du mélanome B16.Flt3L par rapport à des animaux naïfs. L'augmentation du nombre de DC en partie contribue à la réduction apparente de la fréquence des cellules B, alors qu'il ya peu ou pas de changement dans le nombre absolu de cellules B. Fait intéressant, alors qu'une grande expansion (~ 15 à 20 fois plus dans les chiffres absolus) est observée pour les PED classiques chez ces souris, il n'y a qu'une augmentation modeste (environ 4 fois) observée dans le sous-ensemble DC plasmacytoïdes.
La stratégie de transmission sélective pour identifier les différents sous - ensembles à courant continu est représenté sur la figure 2A et est basée sur l'expression de B220, CD11b, CD11c et CD8a comme marqueurs phénotypiques spécifiques au sous - ensemble (figure 2B). Nous avons également étudié DEC205, et l' expression de CD11b mPDCA1 sur ces sous - ensembles comme le montre la figure 2B. Cela montre le motif attendu, avec mPDCA seulement sur le sous-ensemble pDC, alors que décembre 205 est exprimé fortement sur CD8a Pos DC et CD11b est détectée le plus en évidence sur CD8a Neg PED. Nous avons également analysé les altérations dans les fréquences cellulaires pour chacun des sous - ensembles purifiés à chaque étape du protocole décrit ici (résumé à la figure 2C, des exemples détaillés des données de cytométrie de flux de la figure 3). L'isolement des sous - ensembles DC spléniques décrits dans le présent procédé est un procédé en plusieurs étapes (Figure 1). Purification des CD plasmacytoïdes repose sur une sélection négative pour enrichir ces cellules après l'épuisement de toutes les populations indésirables comme B, T, les cellules NK et les CD classiques. Purification de la CD8a Pos DC, et CD8a Neg DC est réalisée par une sélection positive de ces cellules après l'épuisement des cellules T, B et NK. La pureté élevée de chacun des sous - ensembles à courant continu obtenue à l' aide de cette procédure (typiquement environ 95%) est également illustré sur la figure 3.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Selon les expériences à réaliser, ces cellules peuvent être puisées avec un antigène souhaité et transférés dans des hôtes murins histocompatibilité pour les études immunologiques En outre, ces cellules peuvent également être utilisés pour des études in vivo des activités stimulatrices ou réglementaires de sous - ensembles DC physiologiques. les rendements cellulaires pour les sous - ensembles DC purifiés par 2 x 10 7 splénocytes totaux sont environ un million de pDC, 2 millions de CD8a Pos DC et 4 millions de CD8a Neg PED.
Figure 1. Isolement des PED. Un schéma illustrant les différentes étapes du protocole pour l' isolement des différents sous - ensembles de DC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. >
Figure 2. Analyse des spléniques DC sous - ensembles chez les souris avec B16.Flt3L Tumeurs. A) la stratégie Gating est illustrée pour identifier les populations de cellules correspondant à pDC (R1), CD8a Pos DC (R5) et CD8a Neg DC (R6). B) Expression de mPDCA1, 33D1, DEC205 et CD11b sur différents sous - ensembles. Les cellules contenues dans la porte R4 (un sous - ensemble de lymphocytes, négatifs pour B220, CD11c, CD11b) sont utilisés en tant que population témoin sans l'expression de ces marqueurs c) l' enrichissement relatif des DC et des sous - ensembles de lymphocytes isolés à partir des rates de souris au jour. 14 après l'inoculation des cellules de mélanome B16.Flt3L est représenté sur la parcelle gauche comme des barres noires, tandis que la fréquence de ces populations cellulaires chez la souris naïve est représentée sous forme de barres blanches. Le graphique de droite affiche les mêmes données que le nombre de cellules.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse des spléniques DC Pendant Protocole d' enrichissement des sous - ensembles. A) Enrichissement des CD plasmacytoïdes (B220 haute et CD11c Bas, R1) de 10% dans la population à partir de splénocytes de B16.Flt3L souris porteuses de tumeurs à ~ 95% de pureté de la colonne couler à travers 1. Notez que rétentat cellules élues de cette colonne sont épuisés de cette population. B) enrichissement des CD classiques (en CD11c haut, mélange de CD8a positives et négatives) de ~ 33% dans les rates de B16.Flt3L mélanome chez des souris porteuses sur 10 jours après l' implantation de la tumeur à ~ 78% en l'écoulement à travers 2 fraction. Dans la colonne rétentat 2 parcelles, les populations positives de CD11c semblent être partiallié appauvri, ce qui correspond à la suppression d'un nombre important de DCs lors de la sélection négative pour appauvrir les cellules T, B et NK. En outre le fractionnement de l'écoulement à travers 2 suspension à l' aide de sélection positive pour les rendements de liaison anti-CD8> 95% pureté de CD8a Pos DC. Le débit à travers de cette a ensuite été soumis à une sélection positive pour la liaison des anticorps anti-CD11c, ce qui donne une population de> 95% pure CD8a Neg PED. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les cellules dendritiques sont acceptées comme le principal des cellules présentatrices d'antigène professionnelles impliquées dans l'amorçage de réponses des lymphocytes T. Leur fonction principale est de sonder le microenvironnement des tissus en prenant et le traitement des antigènes pour la présentation aux cellules T. Afin d'étudier la fonction de sous-ensembles DC spécifiques, ceux-ci doivent être isolés en nombre suffisant en utilisant une approche qui maintient leur phénotype et les fonctions normales. La plupart des protocoles reposent sur l'isolement du sous-ensemble spécifique à courant continu provenant de souris naïves. Étant donné que ces cellules sont rares, les procédures d'isolement ne sont pas efficaces et donnent de faibles nombres de cellules. Par exemple, on rate donnera seulement environ de 0,5 à 1.000.000 DC CD8 pos, alors que la plupart des expériences réalisées avec des études de transfert utilisent au moins ce nombre de cellules par animal. Ainsi, une limitation majeure des méthodes existantes est l'incapacité d'isoler le nombre de cellules suffisant sans utiliser un très grand nombre de souris donneuses et des volumes importantsdes réactifs. Notre méthode permet de surmonter sensiblement ces problèmes en utilisant des souris implantées avec une tumeur sécrétant Flt-3L d'élargir considérablement les pays en développement, permettant la purification de beaucoup plus grand nombre des trois sous-ensemble DC bien reconnu en utilisant une série d'étapes de purification immunomagnétique. Le protocole décrit ici fournit donc une amélioration majeure par rapport aux méthodes existantes en termes de rendement d'au moins plusieurs fois.
Quelques mises en garde existent pour le protocole d'isolement décrit ici. La principale limitation est que la procédure utilisée pour isoler ces cellules peuvent modifier par inadvertance leur phénotype. DC sont extrêmement sensibles à la contamination par des endotoxines et des stimuli mécaniques qui peuvent conduire à des changements dans leur phénotype et la fonction. Une autre limitation de cette technique est le recours à Flt-3L sécrétion pour développer des sous-ensembles DC. Cela se traduit par l'absence d'expansion résidentes du tissu sous-ensembles DC qui n'expriment le récepteur Flt-3.
leprotocole décrit ici repose sur l'enrichissement des cellules en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce. Le kit de purification pour l'isolement de cellules comprend un protocole qui contient les volumes de réactifs recommandés pour être utilisés. La composition cellulaire de souris porteuses de tumeurs est nettement différente de celle des souris naïves (figure 2C) et, par conséquent , nous avons modifié les quantités des réactifs utilisés dans notre technique afin d'obtenir une pureté optimale des cellules. Les DC sont des cellules adhérentes et peuvent se fixer à la matrice de la colonne de manière non spécifique. Équilibration du lit de la colonne avec un tampon contenant de l'EDTA minimise l'adhérence cellulaire et l'utilisation d'une série de passages successifs sur deux colonnes permet d'améliorer la pureté des cellules plus loin.
DCs sont des cellules fortement adhérents et in vivo sont généralement étroitement associée à la matrice extracellulaire des tissus. Afin d'augmenter le rendement, il est très important pour digérer le tissu splénique avec de la collagénase et l'ADNase pendant suffisamment teme pour extraire un nombre maximal de ces cellules. Il est également important d'être sûr que les fragments de tissus spléniques sont complètement immergés dans la solution de collagénase / DNase I tout en subissant la digestion. Une autre caractéristique essentielle de l'isolation en courant continu est de maintenir la stérilité des conditions strictes et sans endotoxine lors de la procédure d'isolement, étant donné que ces cellules sont très sensibles endotoxine. Utiliser des réactifs fraîchement préparés à partir des stocks sans endotoxine, et le filtre stériliser tous les réactifs avant utilisation. Tous les tampons d'isolement cellulaire et les médias devraient être complétées par FCS qui est certifié exempt d'endotoxine détectable. Ces cellules sont également très sensibles aux stimuli mécaniques et la stimulation mécanique répétée peut modifier l'état de ces cellules de maturation. Bien que certaines force mécanique est nécessaire pour forcer le tissu à travers un tamis cellulaire après digestion par la collagénase, cela devrait être fait aussi doucement que possible. En outre, le pipetage vigoureux des cellules doit être évitée autant que possible, et une large pipette d'alésage des conseils devraient être utilisés pour minimiser les forces de cisaillement.
Le modèle de transfert adoptif est utile pour l'étude de la présentation des antigènes et T amorçage de la cellule par des sous-ensembles spécifiques de pays en développement. Cependant, il a été démontré dans d'autres études qui transfèrent de l'antigène peut se produire à partir de l'antigène pulsée DC à DC endogènes. Ainsi, la réponse immunitaire adaptative initiée par les cellules de l'antigène pulsée peut refléter la présentation par les CD endogènes présentant l'antigène "capturé" et non celle de transférer APC. Ce type de transfert est augmenté de manière exponentielle si les préparations DC isolées contiennent des cellules mortes ou mourantes. Il est donc important de réaliser le protocole d'isolement et de transfert DC aussi rapidement que possible, en utilisant des conditions stériles avec des tampons pré-refroidi pour améliorer la survie des cellules. Nous avons choisi une période antigène pulsatoire relativement courte de 4 h pour cette raison, avec une incubation à basse des plaques de culture cellulaire de liaison pour minimiser la fixation des cellules au cours decette étape. En outre, l' état de la culture prolongée peut modifier le statut de maturation des CD de culture, et peut influencer les résultats des expériences de transfert adoptif 22.
En résumé, la biologie des cellules dendritiques est un domaine de recherche très actif, et le développement d'une méthode fiable pour générer des PED qui reflètent fidèlement leur phénotypique in vivo et la divergence fonctionnelle fournit une immense occasion d'étudier ces cellules. Cela devient particulièrement important pour les études impliquant des produits chimiques qui peuvent moduler les fonctions DC, mais ne peuvent pas être administrés par voie systémique dans des modèles animaux. Traiter les sous - ensembles DC isolés d'intérêt ex vivo avec ces produits chimiques est une approche pratique et réalisable qui peut aider à élucider les détails mécanistiques des voies de présentation de l' antigène.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NIAID subvention AI45889 à SAP cytométrie de flux des études ont été effectuées en utilisant FACS installations de base pris en charge par le Centre Einstein Cancer (NIH / NCI CA013330) et Centre de recherche sur le sida (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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