Summary
Denne protokol viser gennemførelsen af en optimeret N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse. En enkelt media formulering bruges til at pålideligt få sund hjerne skiver fra dyr af enhver alder og for forskellige eksperimentelle programmer.
Abstract
Denne protokol er en praktisk guide til N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse. Adskillige nyere undersøgelser har valideret nytten af denne metode til at styrke neuronal bevarelse og samlede hjerne skive levedygtighed. Gennemførelsen af denne teknik af tidlige adopters har lettet detaljerede undersøgelser af hjernefunktion ved hjælp af forskellige eksperimentelle programmer og spænder over en bred vifte af animalske aldre, hjerneregioner og celletyper. Trin er skitseret for udførelsen af den beskyttende opsving hjerne skive teknik bruger en optimeret NMDG kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) medier formulering og forbedret procedure til pålideligt få sund hjerne skiver for patch klemme Elektrofysiologi. Med denne opdaterede tilgang, en væsentlig forbedring er observeret i hastigheden og pålideligheden af gigaohm segl dannelse under målrettet patch klemme optagelse eksperimenter samtidig opretholde fremragende neuronal bevarelse, dermed at lette udfordrende eksperimentelle programmer. Repræsentative resultater er leveret fra flere neuron patch klemme optagelse eksperimenter til assay synaptisk forbindelse i neocortical hjerne skiver fremstillet af unge voksne Transgene mus og modne voksne menneskers neurokirurgiske prøver. Desuden optimeret NMDG beskyttende recovery metoden til hjernen udskæring er kompatibel med både unge og voksne dyr, således løse en begrænsning af den oprindelige metode. I Resumé, kan en enkelt media formulering og hjernen udskæring procedure gennemføres på tværs af forskellige arter og aldre at opnå fremragende levedygtighed og væv bevarelse.
Introduction
Akut hjernen skive forberedelse er et væsentlig eksperimentel modelsystem i neurovidenskab. For omtrent halvdelen af et århundrede, har denne platform aktiveret dynamisk funktionelle studier af living-hjernen på tværs af en bred vifte af anatomiske hjerneregioner og dyrearter. Om den tilsigtede anvendelse er biokemi, funktionel afbildning, morfologi eller Elektrofysiologi, er det af yderste vigtighed at sikre optimal integritet og levedygtigheden af de skivede væv. Det er derfor at robust juvenile gnaver hjernen skive forberedelse (dvs., yngre end postnatal dag 30 for mus) har været det mest foretrukne til dato. Vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelig sund hjerne skiver fra modne voksne og aldrende dyr har vist sig for at være en formidabel udfordring for de fleste og har indført strenge begrænsninger for at studere den funktionelle arkitektur af modne hjernen. Dette er især sandt for patch klemme optagelse, en teknik, der kræver fremragende morfologiske og funktionelt bevarelse og er uundværlig for kendetegner detaljerede iboende og synaptic egenskaber af identificerede enkelt neuroner. For de sidste mange årtier, har størstedelen af patch klemme electrophysiologists påberåbt sig en 'beskyttende skæring' metode ved hjælp af saccharose i stedet lave Na+ aCSF1 for at forberede sund hjerne skiver fra juvenile, og en langt mindre omfang, unge voksne dyr. Denne metode er baseret på den forudsætning, at passive Na+ tilstrømning og efterfølgende vand ind og celle hævelse under trinnet skive skæring er den fremherskende fornærmelse, der fører til dårlig overlevelse af neuroner, især for disse neuroner beliggende i den overfladiske lag, der er mest tilbøjelige til at opretholde direkte traumer fra bevægelsen blade. Men beskyttende klippe metode stadig lader meget tilbage at ønske for hjernen skive forberedelse fra modne voksne dyr uanset den særlige aCSF formulering gennemført.
En enkel, men effektiv løsning på dette problem har været beskrevet2,3,4,5,6 og kaldes "beskyttende nyttiggørelse" hjernen skive metode. Den oprindelige version af denne metode bruger et NMDG-substituerede aCSF, som NMDG blev udpeget som den mest alsidige og effektive blandt forskellige andre kandidat natrium ion erstatninger (herunder saccharose, glycerol, cholin og Tris). Medier formuleringen blev yderligere forbedret ved tilsætning af HEPES til at modstå skive hjerneødem og give stærkere pH buffer7, såvel som tilføjelsen af kosttilskud for at modvirke de skadelige virkninger af oxidativt stress (tabel 1). Det var empirisk fastslået, at en indledende genopretning-inkubation trin i lav Na+, lave Ca2 +, og høj Mg2 + NMDG aCSF straks efter voksen hjerne væv udskæring var både nødvendige og tilstrækkelige for forbedret neuronal bevarelse over en bred vifte af områder af hjernen, celletyper og animalske aldre3,5,6.
Navnlig kan tidligere inkarnationer af hvad er nu døbt den beskyttende genoprettelsesmetode findes i litteratur1,8,9,10,11,12, 13, selv om det fulde potentiale for modne voksne og aldrende dyr hjernen skive og patch klemme optagelse blev ikke genkendt eller demonstreret i disse tidligere værker. Derudover fortsat nuanceret proceduremæssige variationer at dukke op til støtte for særlige eksperimentelle programmer4,14,15,16. Den kollektive krop arbejde af disse mange forskergrupper formidler høj tillid i robusthed beskyttende recovery metoden til forbedret væv bevarelse. NMDG beskyttende genoprettelsesmetode har nu blevet bredt vedtaget og gennemført i talrige offentliggjort forskningsundersøgelser udnytte voksne dyrs hjerne skive præparater. Undersøgelserne akut skive span neocortical3,17,18, hippocampus15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, midthjernen25,26,27,28,29og baghjernen30,31,32, 33 , 34 regioner, og en bred vifte af neurotransmitter og neuromodulator typer, herunder glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminerge24,29,37,38, kolinerge14,37,38, 39, noradrenerge40og serotonerge27,28 neurotransmission. Metoden er også velegnet for optogenetic kontrol af neuronal aktivitet i skiver stammer fra transgene dyr3,39 eller efter i vivo viral injektioner17,27, 28,40,41,42,43, som godt som funktionelle Ca2 + billeddannelse af neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser af såvel kortsigtede plasticitet4,47,48 og forskellige former for langsigtet plasticitet16,35,48 har været rapporteret. En nylig undersøgelse anvendes metoden NMDG beskyttende recovery for at lette, omfattende og systematiske sondering af synaptisk forbindelse i den visuelle cortex i modne voksne mus hjernen skiver ved hjælp octopatch optage konfiguration49 — en kraftfuld demonstration af nytte og robusthed af denne metode. Den beskyttende genoprettelsesmetode er endda blevet anvendt med succes i tidligere uforudsete eksperimentelle sammenhænge, såsom forbedret bevarelse af kar og pericytes i voksne kortikale hjerne skiver50, patch klemme optagelse fra transplanteret interneuron populationer i 1-1,5 år gamle Alzheimers mus modeller20, og en voksen hjerne skive receptor menneskehandel assay51.
Følgende protokol beskriver trinvise procedurer for gennemførelsen af en optimeret NMDG beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse til forbedring af levedygtigheden af akut hjernen skiver. Principper for forbedret neuronal bevarelse er diskuteret, samt demonstration af de klare fordele ved denne metode for komplekse multi neuron patch klemme optagelse eksperimenter i både unge voksne Transgene mus hjernen skiver og moden voksen neurokirurgiske menneskehjerne skiver. Følgende protokol er blevet valideret for mus fra 21 dage gamle til mere end et år gamle, samt med hensyn til menneskelige neurokirurgiske prøver stammer fra voksne patienter.
Protocol
Procedurer, der involverer Transgene mus er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Allen Institute for hjernen videnskab. Både mandlige og kvindelige C57BL/6 mus (vægtområde 10-30 g) blev brugt i disse eksperimenter. Nogle af de repræsentative resultater beskriver data indsamlet fra levende menneskelige hjerne skiver. Neocortical væv prøver blev indhentet under neurosurgeries for tumor removal. Det var nødvendigt at fjerne den overliggende neocortical væv for at få adgang til den syge væv. Informeret patientsamtykke blev opnået i alle tilfælde for anvendelse af neurokirurgiske væv i forskningsøjemed under en protokol, der er godkendt af den institutionelle revision bestyrelse svensk Medical Center.
1. forberedelse af medier og reagenser (tabel 1)
Bemærk: Løsninger bør gøres op i renset vand, der er fri for spor metaller og andre urenheder. Det anbefales, at løsninger gøres frisk på dagen af forsøget, selv om ubrugte løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge, hvis det ønskes. 1 liter af hver formuleringen ovenfor er tilstrækkelig for 1 – 2 udskæring procedurer. Alle aCSF løsninger skal være mættet med carbogen (95% O2/5% CO2) før brug for at sikre stabil pH buffer og tilstrækkelig iltning. PH-værdien af alle løsninger bør tilpasses 7.3 7.4 og osmolalitet målt og justeret til 300-310 mOsmol/kg.
- Forberede NMDG-HEPES aCSF (i mM): 92 NMDG, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukose, 2 thiourinstof, 5 Na-Ascorbat, 3 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O og 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH til 7,3 –7.4 med 17 mL +/-0,5 mL 5 M saltsyre.
Bemærk: Denne titrering skridt bør ideelt udføres før tilsætning af divalent kationer til at undgå nedbør; dog kan nedbøren vendes ved tilpasning af pH-værdien til den fysiologiske interval. - Forberede HEPES holding aCSF (i mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukose, 2 thiourinstof, 5 Na-Ascorbat, 3 Na-pyruvat, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH til 7,3-7.4 med flere dråber koncentreret 10 N NaOH.
- Forberede optagelse aCSF (i mM): 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukose, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH til 7,3-7.4 med et par dråber koncentreret 10 N NaOH.
- Forberede Na+ spike-løsning (2 M): 580 mg af NaCl opløses i 5 mL frisk tilberedte NMDG-HEPES aCSF. Dette er nok løsning for en hjerne skive prep.
- Forberede 2% Agarosen anvendes til integrering af væv. Opløs 2 g af Agarosen type 1B (Se Tabel af materialer) i 100 mL 1 x PBS og mikroovn indtil bare kogende. Swirl for at blande, så hæld blandingen i en steril 10 cm petriskåle og lad den størkne. Gemme Agarosen plade i en forseglet plasticpose ved 4 ° C indtil brug.
- Forberede injicerbare bedøvelsesmiddel arbejder stamopløsning. Bland 2,5 g af 2,2,2-Tribromoethanol med 5 mL 2-methyl-2-butanol og derefter gradvist opløses i 200 mL PBS, pH 7,0-7,3. Filtrer stamopløsningen med et 0,22 µm filter før brug og opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
Bemærk: Kontakt respektive animalske brug Udvalget retningslinjer og regler for fastlæggelse af proceduren for narkose arbejder stamopløsning udløb og bortskaffelse.
2. opsætning af udskæring Station
- Oprettet den udskæring station med væv slicer maskine og kirurgiske instrumenter (Se Tabel af materialer). At kalibrere slicer maskine, vedhæfte en zirconium keramiske injektor klinge til blade arm ved hjælp af hurtig-klæbende lim, derefter indsætte præparatholderen og justere forkanten af blade til modellen indehaveren rand efterlader et lille hul for at sikre, at vingen ikke skraber metal.
Bemærk: Hvis klinge kant ikke er fysisk beskadiget det kan genbruges til mange uger eller endda måneder uden udskiftning. Forskellige væv slicer modeller er kommercielt tilgængelige, hvoraf mange kan levere fremragende ydelse når optimalt kalibreret. Det ideelle instrument bør have minimal z-aksen afbøjning, enten direkte målte og tunet eller empirisk observeret. - Oprette et 250 mL bægerglas fyldt med 200 mL af NMDG-HEPES aCSF og før chill på isen med konstant carbogenation (anbragt via en gas diffuser sten nedsænket i medierne) til > 10 min.
Bemærk: Denne løsning vil blive brugt til transcardial perfusion og fylde udskæring maskine reservoiret under skæring. - Oprettet den oprindelige hjernen skive opsving kammer fyldt med 150 mL af NMDG-HEPES aCSF (opretholde konstant carbogenation) og placere afdeling i en opvarmet vandbad vedligeholdes på 32 – 34 ° C.
Bemærk: En skive afdeling efter design af Edwards og Konnerth (1992)52 anbefales til dette trin. Disse kamre kan foretages med let tilgængelige laboratorium elementer (250 mL bægerglas, nylon mesh netting, 50 mL konisk tube, 35 mm plast runde parabol). Pleje skal træffes for at sikre, at udsnittet netting forbliver fri luft bobler, især dem, der løbende produceres af carbogen gas boble sten, da disse kan forårsage skiver til at flyde op og blive beskadiget. Netting bør være nedsænket ca 1 cm under overfladen, flydende. - Oprette en hjerne skive holding kammer; et design med flere uafhængige brønde i en større reservoir anbefales (Se Tabel af materialer). Fyld beholderen med 450 mL af HEPES aCSF og varme til stuetemperatur under konstant carbogenation indtil brug.
Bemærk: Hjernen skiver vil blive overført fra den oprindelige opsving kammer til salen til langtidsopbevaring før elektrofysiologiske optagelse. Skal sørges for at sikre, at skive netting forbliver fri for luftbobler på alle tidspunkter. - Forberede smeltet Agarosen væv indlejring. Brug den åbne ende af en 50 mL konisk hætteglas ligesom en cookie cutter til at skære ud af en blok af 2% Agarosen fra tidligere rede skålen. Løst cap konisk hætteglasset, så mikroovn til 10 – 30 s indtil Agarosen er bare smeltet. Ikke overophede.
- Hæld den smeltede Agarosen i 1,5 mL rør. Vedligeholde Agarosen i smeltet tilstand ved hjælp af en thermomixer sat til 42 ° C under kraftig omrystning. Omhyggeligt sørge for, at den smeltede Agarosen ikke størkne for tidligt.
- Placer tilbehøret nedkøling blok for udsnitsværktøj på is pre-afkøle på dette tidspunkt.
3. Transcardial Perfusion
Bemærk: Transcardial perfusion procedure er et vigtigt skridt, når du arbejder med voksne dyr og er vigtigt at opnå en hurtig nedkøling af hjernen og langsommere stofskifte via hjernen infusion af lav Na+, lav Ca2 +/ høj Mg2 + aCSF løsning. Transcardial perfusion tjener også til at klare røde blodlegemer fra hjernen Vaskulaturen, hvilket reducerer autofluorescence, der kan interferere med visualisering og målretning af fluorescently mærket cellepopulationer i transgene linjer. Det er ikke tilrådeligt at udelade transcardial perfusion.
- Dybt bedøver mus ved intraperitoneal injektion af bedøvelsesmiddel arbejder stamopløsning (250 mg / kg: 0,2 mL af 1,25% bedøvelsesmiddel arbejde stamopløsning pr. 10 g kropsvægt, se Tabel af materialer). Efter ~ 2-3 min, kontrollere tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at vurdere tå knivspids refleks. Hvis det er påkrævet, indsprøjtes en ekstra mængde bedøvelsesmiddel arbejder lager og revurdere tå knivspids refleks efter en anden 2-3 min.
- Indlæse en 30 mL sprøjte med 25 mL af carbogenated NMDG-HEPES aCSF fra pre kølet 250 mL bægerglas (2-4 ° C er optimal, i modsætning til sjappet eller frosne løsning). Vedhæfte en 25 5/8 gauge kanyle.
- Med musen på ryggen, pin ned forepaws og bagpoterne for stabilitet. En 15 cm glas petriskål fyldt med hærdet silikone fungerer godt som base.
- Ved hjælp af en skalpel, foretage en tværgående snit til at åbne brysthulen på niveau med mellemgulvet. Brug fine saks til at skære gennem brystkassen på enten side tager sig at undgå klipning hjerte og lunger.
- PIN tilbage center del af brystkassen til at eksponere hjertet. Indsætte nålen 30 mL sprøjte ind i venstre hjertekammer og skære den højre atrium med fine saks til at tillade blodet at afslutte hjertet.
- Trykkes sprøjte stemplet ved hjælp af manuel konstant pres og perfuse dyr med den kølede NMDG-HEPES aCSF med en sats på ~ 10 mL/min.
Bemærk: Hvis perfusion er vellykket leveren vil ændre farve fra mørkerød til bleg gul, og i nogle tilfælde klare væsker kan observeres spændende næsebor i slutningen af proceduren.
4. hjerne dissektion og udskæring
- Hug hovedet af dyret. Brug en skalpel til at åbne huden på hovedet og udsætte kalot.
- Brug fine super-cut saks til at skære væk huden over kalot og gøre små indsnit lateralt på enten side på den caudale/ventral bunden af kraniet. Foretage yderligere lavvandede nedskæringer startende fra den caudale/dorsale aspekt af kraniet i den rostralt retning op svinekroppens midterlinje pas på ikke for at skade den underliggende hjernen. Gøre en endelig 'T' skære vinkelret med midterlinjen på niveau med den olfaktoriske pære.
Bemærk: Pleje skal tages til at sikre, at ingen skade sker til hjernen region(er) af interesse. Især på intet tidspunkt bør der være nogen trykstyrke kraft, selve hjernen. - Bruge runde-spids pincet til at forstå kraniet startende fra den rostralt-mediale aspekt og skræl tilbage mod den caudale-lateral retning. Gentag til begge sider til at knække åbne og fjerne de dorsale halvdele af kalot at eksponere hjernen. Forsigtigt øse ud intakt hjernen i bægerglasset af pre kølet NMDG-HEPES aCSF. Tillad hjernen til ensartet cool ~ 1 minut.
- Brug den store spatel til at løfte hjernen ud af bægerglasset og på petriskålen dækket med filtrerpapir. Trim og blokere hjernen i henhold til den foretrukne vinkel af udskæring og ønskede hjernen region af interesse. Arbejde hurtigt for at undgå længerevarende iltmangel under håndteringen.
Bemærk: Mange udskæring vinkler er muligt. Den nøjagtige blokerende metode og udskæring vinkel vil afhænge af den nøjagtige hjernen regionen, celletype og kredsløb undersøges. - Anbringe den hjerne blok til præparatholderen ved hjælp af selvklæbende lim. Trække det inderste stykke præparatholderen nok til at trække hjernen blok fuldt inde. Hæld den smeltede Agarosen direkte ind i holderen, indtil hjernen blok er fuldt dækket i Agarosen. Klemme pre afkølede tilbehøret nedkøling blok omkring præparatholderen for ~ 10 s indtil Agarosen er størknet.
- Indsæt præparatholderen i beholderen på pålægsmaskine maskinen og kontroller korrekt justering. Fyld beholderen med resterende pre kølede, iltet NMDG-HEPES aCSF fra 250 mL baegerglas og flytte en boble sten i reservoiret for varigheden af udskæring for at sikre tilstrækkelig iltning.
- Justere mikrometer for at begynde at fremme Agarosen indstøbte hjernen modellen. Start udsnitsfilteret og empirisk justere advance hastighed og svingning frekvens til det ønskede niveau.
Bemærk: Begge indstillinger skal være i det lave område. For de bedste resultater, en enkelt pass af klinge arm skal tage ca 20 s og svingning, der skal producere en meget glat og blid summende støj med ingen åbenlys summende. - Fortsat fremme og udskæring væv i 300 µm-trin (eller andre foretrukne tykkelse) indtil regionen hjernen af interesse er fuldt sectioned; den samlede tid den udskæring procedure bør være mindre end 15 min.
5. optimeret NMDG beskyttende inddrivelsesproceduren
- Indledende NMDG recovery trin (kritiske trin): efter afslutningen af proceduren for skæring, indsamle op alle udsnittene ved hjælp af en cut-off plast Pasteur pipe t og overføre dem til en pre varmede (34 ° C) indledende opsving kammer fyldt med 150 mL NMDG-HEPES aCSF. Overføre alle skiver i korte træk og starter en timer, så snart alle skiver er flyttet ind i recovery kammeret.
- Se tabel 2 for at bestemme den optimale Na+ spike-i tidsplan mus alder.
Bemærk: Denne procedure er en praktisk metode til at opnå en kontrolleret hastighed af genindførelse af Na+ i hjernen skive afdeling og er optimeret til en bestemt hjerne skive afdeling geometri og reservoir produktmængde og -type (Se Tabel af materialer). - Udføre trinvis Na+ spike-in procedure ved at tilføje de angivne mængder af Na+ spike-løsning på de angivne tidspunkter. Tilføje Na+ spike-løsning direkte ind i Bobleflasken skorstenen indledende opsving kammer til at lette hurtig blanding.
- Overføre alle skiver til HEPES aCSF langsigtede bedrift afdeling vedligeholdes ved stuetemperatur. Tillad skiver til at gendanne til en yderligere 1 time i HEPES holder salen før indlede patch klemme optagelse eksperimenter.
6. Patch klemme optagelse
Bemærk: De følgende grundlæggende procedurer blot give nogle praktiske overvejelser og er ikke beregnet til at repræsentere detaljerede protokoller for patch klemme optagelser, som disse kan findes andetsteds53,54. En patch klemme Elektrofysiologi riggen er påkrævet for denne ansøgning. Dette vil normalt bestå af en opretstående mikroskop udstyret med infrarøde differential interferens kontrast (IR-DIC) optik og en fluorescens belysning system, en patch klemme forstærker og data digitizer, motoriseret micromanipulator og mikroskop platform, vibrationer isolation tabel, Faradays bur og løsning varme og perfusion system. Prøve kammer og platform skal være konstrueret til neddykket skive optagelse. For multi neuron patch klemme optagelser er en rig udstyret med flere forstærkere, hoved faser og høj kvalitet micromanipulators påkrævet. Derudover opnår de bedste resultater, en rig udstyret med en 900 nm IR band pass filter og matchende optiske komponenter kan varmt anbefales at sikre passende visualisering af celler beliggende > 50 µm dybt i hjernen skiver. Korrekt justering for Kӧhler belysning er også vigtigt for klar visualisering.
- Forberede intracellulære pipette løsning (i mM): 130 K-gluconat, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 fosforkreatin-Nielsen2, 4 MgATP, 0.3 Na2-GTP, og 13.4 biocytin. Justere pH til 7,35 med 1 M KOH og osmolalitet til 285-290 mOsmol/kg ved hjælp af saccharose, efter behov.
- Forberede patch klemme elektroder fra tykvæggede borsilikatglas kapillærerne; den ideelle patch klemme elektrode har en relativt kort og stumpet taper med en ~ 3 – 6 MOhm fyldt tip modstand i badet.
- Sikre, at sølv elektrode ledninger er korrekt chlorided for at sikre stabile optagelser. Gøre dette (typisk) af sænkes ned i sidste 3-4 mm af sølv wire i flydende blegemiddel i ca 30 min, eller indtil wiren bliver sort.
- Etablere løsning perfusion ved hjælp af en peristaltisk pumpe angivet til 3 – 4 mL/min. Circulate carbogenated optagelse aCSF gennem optagelse kammeret pasning til at matche tilstrømning og udstrømning for at undgå overløb.
- Overføre en enkelt hjerne skive i submersion optagelse kammer og sikkert på plads ved hjælp af en U-formet skive anker med nylon kors strygere. Identificere mål hjernen regionen ved hjælp af en 4 X luft mål før du skifter til en højere magt mål (f.eks.høj numerisk blænde 40 X eller 60 X vand fordybelse mål).
- Visuelt identificere en sund målcellen. Udseendet af neuronal membranen på soma, der som visualiseret ved IR-DIC mikroskopi, bruges til at bedømme egnetheden af en kandidat celle til patch klemme optagelse.
Bemærk: Sund neuroner typisk udviser følgende funktioner: skrumpet hverken hævede somata, blød kontrast af membran kanter og jævn membran udseende. Derudover flertal af sunde celler er placeret > 30 µm dybt i Skive, som overfladiske neuroner er tilbøjelige til at være beskadiget med afskåret dendritiske processer. Neuroner, der udviser en plisseret udseende, klart synlige kerner eller 'stegte æg' udseende eller meget mørke eller høj kontrast membran kanter undgås. - Back-fill patch afpipetteres med ~ 5 µL af intracellulære løsning og indlæse det på elektrode indehaveren. Flytte pipetten til optagelse badet over hjernen skive og anvende lys overtryk at rydde eventuelle blokeringer i spidsen. Nul pipette forskydning og overvåge tip modstand ved hjælp af en membran test funktion.
- Flytte pipette spidsen i kontakt med target neuron cellen kroppen; en lille dimple bør danne på membranen overflade på grund af den lette overtryk.
- Så snart en membran dimple er observeret, hurtigt fjerne de overtryk og anvende blide suge for at lette seal dannelse. Når pipette modstand stiger til > 100 MOhm, tænde en bedrift kommando til et niveau, der svarer til den forventede hvilende membran potentiale for målrettede celletype (-70 mV er et godt udgangspunkt).
- Når spidsen modstand når ≥ 1 gigaohm, forsøge at bryde ind i cellen ved at sprænges membran nedenunder patch pipette ved hjælp af korte anfald af skarpe suge; funktionen «zap» kan udnyttes til at lette indbrud efter behov.
Bemærk: En bedrift potentiale af -70 mV er foreslået for spænding klemme eksperimenter på kortikale neuroner. Sund neuroner vil have en lækage nuværende ikke mere negativ end-100 pA for varigheden af forsøget, men dette er delvis afhængig af celletype. Et neuron ønsker udelukket fra analyse, hvis den hvilende membran potentiale var mere depolarized end -50 mV, eller hvis adgang modstanden ændres med mere end 20%. -
Når et stabilt hele-celle patch klemme optagelse er opnået, målrette yderligere neuroner til optagelse ved at gentage trin 6.6 – 6.10. Sørge for at undgå mekaniske forstyrrelser, der ville resultere i at miste den første indspilning.
- Vælg yderligere neuroner i 100 µm fra den første neuron til at sikre en rimelig sandsynlighed for at finde synaptically kombineret neuroner.
Bemærk: Det kan være nyttigt i nogle tilfælde til at identificere flere kandidat neuroner op foran og til at pre-Load og pre-placere alle pipetter i nærheden til de forskellige målrettede celler før etablering af den første patch klemme indspilning.
- Vælg yderligere neuroner i 100 µm fra den første neuron til at sikre en rimelig sandsynlighed for at finde synaptically kombineret neuroner.
Representative Results
Dette afsnit indeholder repræsentative resultater for rutinemæssig hjernen skive forberedelse og patch klemme Elektrofysiologi eksperimenter ved hjælp af optimeret NMDG beskyttende recovery metoden (dvs, NMDG beskyttende recovery kombineret med gradvis Na+ Spike-in-proceduren). Første, morfologiske bevarelse af neuroner blev evalueret i forskellige områder af hjernen hjernen skiver udarbejdet med eller uden at implementere den optimerede NMDG beskyttende opsving metode (figur 1). Tre måneder gamle voksne mus blev valgt for disse forsøg, og vi brugte IR-DIC mikroskopi bestemme neuron sundhed baseret på form og generelle udseende af somata og proksimale dendritter. Bemærk den uudviklede, pyknotic udseende af de fleste neuroner i de repræsentative billeder af hjernen skiver forberedt uden den beskyttende genoprettelsesmetode (alle billeder blev opnået 1-2 h efter skive forberedelse). Disse kontrol skiver blev udarbejdet ved hjælp af NMDG aCSF for transcardial perfusion og udskæring skridt men blev først genoprettet i høj Na+-indeholder HEPES aCSF. I modsætning hertil afsløre de repræsentative billeder fra skiverne er udarbejdet ved hjælp af metoden optimeret NMDG beskyttende opsving neuroner med forbedret morfologier (glattere, fyldigere, mindre plisseret udseende), der er egnet til patch klemme optagelse (figur 1). forbedret neuronal bevarelsen blev observeret på tværs af flere områder af hjernen herunder neocortical lag II/III og V, subiculum og dorsale laterale geniculate kerne (dLGN).
Næste, optimeret NMDG beskyttende recovery metoden blev sammenlignet med den oprindelige NMDG beskyttende opsving metode (dvs.uden spike-in proceduren gradvis Na+ ). Den gennemsnitlige tid for gigaohm sæl dannelse i patch klemme optagelse forsøg var dramatisk og betydeligt reduceret (9,9 s versus 33,3 s, **p < 0,005, parret t-test) når den gradvise Na+ spike-in procedure blev anvendt sammen med NMDG beskyttende recovery trin (figur 2). Hurtigere og mere pålidelig membranen forsegling gange stærkt forbedret gennemløb af patch klemme optagelse i unge voksne hjerne skiver. Den optimale Na+ spike-i tidsplan blev yderligere ændret efter dyrenes alder (tabel 2) og var gavnligt for alle aldre testet (3 uger til 1 år gammel mus). Profil af gradvis natrium ion koncentration elevation i løbet af spike-in-procedure er fastsat (figur 3) til at ledsage de tidsplaner, der er vist i tabel 2.
Som en del af Allen Institute celle typer Program (http://celltypes.brain-map.org/) en storstilet indsats er undervejs til systematisk karakterisere de iboende elektrofysiologiske egenskaber af individuelle neuroner i unge voksne (postnatal dag 40-80) musen visuelle kortikale hjernen skiver afledt af transgene linjer med celle typespecifikke fluorescerende markør udtryk i genetisk defineret neuronal populationer (kortikale lag og celletype specifikke Cre driver linjer krydset til en Cre-afhængige fluorescerende reporter linje55). Figur 4 viser eksempel spor efter affyring mønstre optaget fra Parvalbumin (Pvalb)-at udtrykke kortikale fast-spiking (FS) interneurons (Pvalb-IRES-Cre/Ai14 mus) som svar på en række 1 s aktuelle injektion trin der dækker det dynamiske område af neuron fyring. F-jeg kurve for et datasæt af 22 kortikale FS interneurons er vist til højre. Lignende målrettet patch klemme optagelse eksperimenter blev udført for at karakterisere 23 Rorb-udtrykker excitatoriske neuroner i lag IV fra Rorb-IRES-Cre/Ai14 mus (figur 4). Forskellige sunde neuron typer herunder FS interneurons og pyramideformede neuroner på tværs af kortikale regioner og lag kan rutinemæssigt og pålideligt indskyde nemlig lappe klemme optagelse i mindst 6-8 timer efter skive forberedelse benytter indeværende optimeret protokol.
Ud over måling iboende neuronal egenskaber, var synaptic connectivity probed mellem flere samtidig indspillede neuroner bestemte typer i visuelle kortikale mikrokredsløb. Multi neuron patch klemme optagelse teknik er usædvanlig krævende, som mange sunde kandidat neuroner bestemte typer skal være til stede inden for et relativt lille område af hjernen skive for at sikre en rimelig chance for at opnå høj kvalitet samtidige optagelser og at identificere Bonafide synaptiske forbindelser. Figur 5 viser parret optagelse af to tdTomato + FS interneurons i den visuelle cortex i hjernen skiver afledt af unge voksne Pvalb-IRES-Cre/Ai14 mus. En stærk envejs hæmmende synaptisk forbindelse blev registreret (registreret med høje chlorid interne pipette løsning). Eksempel optagelser og protokoller til måling af egenskaber af kortsigtede synaptisk plasticitet præsenteres. Anfald af højfrekvente tog stimulation (10 impulser hver på 10, 50 og 100 Hz) blev efterfulgt af enkelt opsving testimpulser på forskellige tidsintervaller (1, 2 eller 4 s) til at måle tid løbet af genopretning fra synaptic depression.
Fremragende succes har også opnået for menneskelige neocortical neuroner i modne voksne ex vivo hjernen skiver. Neurokirurgiske enhederne er fremstillet af patienter, der gennemgår planlagte operationer til tumor fjernes ved lokale hospitaler. Procedurerne for menneskelige neurokirurgiske væv af websteder og hjernen skive forberedelse afviger fra mus hjernen skive procedurer i et par praktiske måder. Kort sagt, resektion neocortical væv (distalt for webstedet for patologi) er indsamlet fra operationsstuen og nedsænket i iskold iltet NMDG-HEPES aCSF og transporteres med kontinuerlig køling og iltning af operationsstuen til den laboratoriet inden 30 min eller mindre. Hjernen skiver er udarbejdet ved hjælp af NMDG beskyttende inddrivelsesproceduren og lov til at inddrive i længere tid på ca 3 h før indlede patch klemme optagelser. Figur 6 viser en vellykket parret optagelse eksperiment og en vellykket firedobbelt patch klemme optagelse eksperiment fra menneskelige ex vivo hjernen skiver forberedt på denne måde fra regionen frontale cortex. Den parrede optagelse viser envejs excitatoriske synaptic input fra en kortikale pyramideformet neuron på en kortikale interneuron (registreret som excitatoriske postsynaptiske strømninger). I quad patch eksperimentere to excitatoriske og to hæmmende neuroner blev optaget samtidig og tre hæmmende synaptiske forbindelser blev registreret (registreret som hæmmende postsynaptiske potentialer) ud af tolv samlede forbindelser probed. Således, denne optimerede hjernen skive metode giver pålidelige eksperimentelle succes i de mest udfordrende af hjernen skive applikationer, herunder multi neuron patch klemme eksperimenter til at studere kredsløb connectivity i akut resektion modne voksne menneskelige hjerne væv.
Figur 1: Forbedret neuronal bevarelse med optimeret NMDG beskyttende recovery metoden til hjernen skive forberedelse. Repræsentant IR-DIC billeder blev erhvervet fra forskellige hjerneregioner i akut skiver fra en tre måneder gammel mus. Kontrollere NMDG beskyttende klippe metode uden en beskyttende recovery trin (venstre paneler) versus optimeret NMDG beskyttende opsving metode (højre paneler). (A) lag V af neocortex, (B) Layer II/III af neocortex, (C) subiculum og (D) dorsale laterale geniculate kerne (dLGN). Skala barer i alle paneler er 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Accelereret hastighed og forbedret pålidelighed af gigaohm tætning dannelse i patch klemme optagelse eksperimenter ved hjælp af metoden NMDG beskyttende opsving med spike-i proceduren for Na+ . (A) Plot af gigaohm segl dannelse gange for NMDG recovery alene (sort datapunkter, n = 19) versus NMDG recovery plus Na+ spike-in procedure (rød datapunkter, n = 23). Alle optagne celler var pyramideformede neuroner i layer II/III eller V af visuelle cortex. Bemærk, at maksimal tid er et loft på 100 s redegøre for celler, der aldrig dannet gigaohm sæler. Parret t-test, **p < 0,005. (B) Plot af hvilende membran potentiale (RMP) for lag V pyramideformet neuroner (orange datapunkter, n = 10/11), II/III pyramideformet neuroner (grøn datapunkter, n = 9/10), eller kortikale Pvalb + FS interneurons (blå datapunkter, n = 23/22). Udfyldte cirkler betegne NMDG recovery tilstand og åbne cirkler NMDG recovery plus Na+ spike-in-procedure. Hvert datapunkt repræsenterer en neuron og både middelværdien og +/-SEM vises. Der er ingen væsentlige forskelle i Dorte sammenligner hjernen skive forberedelse betingelser for alle tre celle typer (parret t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Profil af gradvis natrium ion koncentration elevation under hele proceduren spike i. (A) Plot af spike-i NaCl koncentration versus tid. (B) Plot af samlede ekstracellulære NaCl koncentration versus tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Iboende elektrofysiologiske egenskaber af genetisk defineret kortikale celletyper. (A) eksempel spor af neuronal fyring i svar på aktuelle indsprøjtning skridt for Pvalb + kortikale FS interneurons (venstre panel). tdTomato + neuroner var målrettet til optagelser i hjernen udsnit fra Pvalb-IRES-Cre/Ai14 mus. Opsummerede data for fyring sats-aktuelle injektion forholdet (F-jeg kurve) er vist til højre (n = 22). (B) eksempel spor af neuronal fyring i svar på aktuelle indsprøjtning skridt for at udtrykke Rorb kortikale lag IV excitatoriske neuroner (venstre panel). tdTomato + neuroner var målrettet til optagelser i hjernen udsnit fra Rorb-IRES-Cre/Ai14 mus. Opsummerede data for fyring sats-aktuelle injektion forholdet (F-jeg kurve) er vist til højre (n = 23). Hver tynd farvet linje repræsenterer F-jeg kurve for en enkelt neuron; mens de tykke sorte linjer repræsenterer gennemsnittet for hver gruppe +/-SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kortsigtede plasticitet i synaptically tilsluttede Pvalb-udtrykker kortikale FS interneurons. (A) Differential interferens kontrast og epifluorescensmikroskop blev brugt til at målrette tdTomato-positive, Pvalb-udtrykker FS interneurons af musen primære visuelle cortex. Et farvekodede skematisk connectivity diagram viser en ensidig synaptisk forbindelse mellem de to interneurons. (B) skematisk af stimulation protokoller bruges til at vurdere kortsigtede dynamics synaptically tilsluttet neuroner. Tog af 10 handling potentialer (10, 50 og 100 Hz) er fremkaldt i det præsynaptiske neuron, efterfulgt af en enkelt handling potentiale (Recovery Test Pulse, RTP) leveres med forskellige tidsforsinkelse (1, 2 og 4 s) efter toget ophør. Hver RTP er farvekodede for klarhed. (C) gennemsnitlig spor af tilsvarende ensidige hæmmende post synaptiske potentialer (uIPSPs) i celle #2 i svar på togene af handling potentialer i celle #1. Grå indsatser har udvidet tidsskala for at vise afgrænsning af uIPSP tog. (D) normaliseret uIPSP amplituder afbildes som funktion af deres holdning under tog på forskellige frekvenser. Netto depression er klar på tværs af alle input satser med en betydelig bedring af uIPSP på 4 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Multi neuron patch klemme optagelser i voksent menneske neurokirurgiske hjerne skiver. (A) lav og høj forstørrelse IR-DIC billeder med angivelse af beliggenhed og identiteten af de registrerede neuroner (top paneler). En pyramide neuron (sort stjerne) og tilstødende interneuron (rød stjerne) blev optaget samtidigt. Eksempel farve-kodet spor af en envejs excitatoriske synaptisk forbindelse (ESPC) fra pyramideformet celler til interneuron (målt som EPSCs i spænding klemme) og tilsvarende fysiske forbindelse kort (bunden paneler). (B) firedobbelt patch klemme optagelse eksperiment i en voksen neurokirurgiske menneskehjerne skive dorsolateral præfrontale cortex. To pyramideformet neuroner og to interneurons er indspillede samtidigt, giver mulighed for sekventielle sondering af tolv mulige synaptiske forbindelser. Et tog af evoked handling potentialer i celle #3 (grønne spor) førte til påvisning af hæmmende post synaptiske potentialer (IPSPs) i hver af de andre tre samtidig indspillede neuroner (tre boxed regioner, top paneler). Svarene optaget fra hver enkelte neuron er farvekodede for klarhed. Den fysiske forbindelse kort er vist i det nederste panel. Bemærk de rå spor vises i (B) repræsenterer et gennemsnit af mindst 20 fortløbende rådata fejer. Formodede identifikation af celletype var baseret på soma form, analyse af morfologi af fluorescerende farvestof påfyldning under optagelser og iboende elektrofysiologiske egenskaber herunder affyring mønstre som svar på aktuelle indsprøjtning skridt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| NMDG-HEPES aCSF | HEPES bedrift aCSF | Optagelse aCSF | |||||||
| Komponent | mM | MW | g/Liter | mM | MW | g/Liter | mM | MW | g/Liter |
| NMDG | 92 | 195.22 | 17.96 | ||||||
| HCl | 92 | 36.46 | * | ||||||
| NaCl | 92 | 58.44 | 5.38 | 124 | 58.44 | 7,25 | |||
| KCl | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 138.00 | 0,17 | 1.2 | 138.00 | 0,17 | 1.2 | 138.00 | 0,17 |
| NaHCO3 | 30 | 84.01 | 2.52 | 30 | 84.01 | 2.52 | 24 | 84.01 | 2.02 |
| HEPES | 20 | 238.31 | 4,77 | 20 | 238.31 | 4,77 | 5 | 238.31 | 1.19 |
| Glukose | 25 | 180.20 | 4.51 | 25 | 180.20 | 4.51 | 12.5 | 180.20 | 2.25 |
| natrium Ascorbat | 5 | 198,00 | 0,99 | 5 | 198,00 | 0,99 | 0 | 198,00 | 0,00 |
| Thiourinstof | 2 | 76.12 | 0,15 | 2 | 76.12 | 0,15 | 0 | 76.12 | 0,00 |
| natrium pyruvat | 3 | 110.04 | 0,33 | 3 | 110.04 | 0,33 | 0 | 110.04 | 0,00 |
| MgSO4.7H2O | 10 | 246.48 | 5 mL | 2 | 246.48 | 1 mL | 2 | 246.48 | 1 mL (2M Stock) |
| CaCl2.2H2O | 0,5 | 147.01 | 0,25 mL | 2 | 147.01 | 1 mL | 2 | 147.01 | 1 mL (2M stock) |
| * titreres pH af NMDG-HEPES aCSF til 7,3-7.4 ved hjælp af koncentreret HCl | |||||||||
| Alle løsninger skal være i området 300-310 mOsm/Kg | |||||||||
Tabel 1: Media formuleringer.
| Dyrenes alder | |||||
| Tid (min) * | < 1 måned | 1-3 måneder | 3–6 måneder | 6-12 måneder | 12 + måneder |
| 0 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
| 1 | |||||
| 2 | 250 ΜL | ||||
| 3 | |||||
| 4 | 500 ΜL | ||||
| 5 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
| 6 | 1000 ΜL | ||||
| 7 | |||||
| 8 | 2000 ΜL | ||||
| 9 | |||||
| 10 | overførsel | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
| 11 | |||||
| 12 | |||||
| 13 | |||||
| 14 | |||||
| 15 | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
| 16 | |||||
| 17 | |||||
| 18 | |||||
| 19 | |||||
| 20 | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | |
| 21 | |||||
| 22 | |||||
| 23 | |||||
| 24 | |||||
| 25 | overførsel | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | |
| 26 | |||||
| 27 | |||||
| 28 | |||||
| 29 | |||||
| 30 | overførsel | 2.000 ΜL | 1.000 ΜL | ||
| 31 | |||||
| 32 | |||||
| 33 | |||||
| 34 | |||||
| 35 | overførsel | 2.000 ΜL | |||
| 36 | |||||
| 37 | |||||
| 38 | |||||
| 39 | |||||
| 40 | overførsel | ||||
| * Tid nul er øjeblik skiver overføres til indledende opsving kammer | |||||
Tabel 2: Anbefalet tidsplan for gradvis Na + spike-in procedure efter mus alder.
Discussion
Na + Spike-i forbedrer Gigaohm Seal dannelse og Patch klemme optagelse succes
Den oprindelige version af metoden NMDG beskyttende opsving var specialdesignet til voksne og aldrende dyr2,5. Nogle tidlige adopters har også forsøgt at anvende denne metode på unge dyrs hjerne udskæring (dvs., mus < 30 dage gammel). Det er blevet bemærket, at i modsætning til den udestående visuelt bekræftet neuronal bevarelse med metoden NMDG beskyttende opsving i denne aldersgruppe, gigaohm seal dannelse kan ofte stall, fører til mislykkede patch klemme optagelse forsøg. En hypotese er, at NMDG kationer er mere let fanget i juvenile hjernen skiver i forhold til voksne hjerne skiver og kan hindre seal dannelse; men gigaohm sæler kan let danne mens juvenile hjernen skiver er fuldt neddykket i NMDG aCSF (data ikke vist), således der viser at NMDG aCSF i sig selv er ikke hindrer gigaohm seal dannelse.
Den hurtige overgang fra lav til høj Na+ løsning ved afslutningen af det oprindelige hjerne skive recovery trin beskadiger neuronal membraner og perturbs seal dannelsen processen. Dette er intuitive, da overgangen fra lav til høj Na+, kold til varm temperatur og dramatisk udvidelse af Ca2 + Mg2 + forhold til kollektivt føre til en massiv genopblussen af spontan synaptic aktivitet. Denne hæmmende rebound fase i hjernen udskæring procedure er tilbøjelige til at spejle reperfusion skade efter en iskæmisk fornærmelse. Således, at yderligere afbøde neuronal membran skader i indledende opvågningsfasen en gradvis Na+ spike-in procedure er blevet indarbejdet i som udvidelse af Na+ koncentration i NMDG beskyttende genopretning-inkubation kammer er langsomt og reproducerbar forhøjet med præcis timing. Som i den oprindelige beskyttende inddrivelsesproceduren er tidsmæssige dissociation af Na+ højde fra temperatur og Ca2 +/Mg2 + forholdet højde gavnligt. Men derudover Na+ spike-in procedure fører til små mindre stigninger i ekstracellulær Na+ koncentration over tidlige tidspunkt punkter og store stigninger over de sene tid point, derved giver hjernevæv en mulighed for at bedre plads til de stigende vandstand i Na+ . Denne procedure er et alternativ til gradvis løsning exchange kontrolleres af en perfusion pumpe eller tyngdekraften drop linjer, som føre til løbende stigninger i Na+ niveauer og kræver opmærksomhed både tilgangen og udstrømning til undgå overløb for skive afdeling. Navnlig i dette Na+ stiger spike-in procedure osmolalitet af løsningen i Skive afdeling gradvist over en periode på flere minutter før skiver er vendt tilbage til normal osmolalitet løsning, men det ikke forringe skive sundhed eller patch klemme optagelse succes. En høj osmolalitet skæring løsning har tidligere været brugt i midthjernen skive præparater for at bedre bevare dopamin neuroner for patch klemme optagelser57,58, dermed demonstrere at dette midlertidige hyperosmolality kan være gavnlig i nogle sammenhænge.
Ved at gennemføre en optimeret procedure kombinerer NMDG beskyttende genoprettelsesmetode og gradvis Na+ er spike-i trin nytten af denne hjerne skive metode blevet udvidet til at omfatte unge gennem modne voksne dyrs aldre. Denne opdaterede protokol er nu egnet til en bred vifte af animalske aldre ved hjælp af en enkelt optimal NMDG aCSF formulering og procedure. Hvis det er nødvendigt, Na+ spike-in procedure kan anvendes med en gradvis længere forsinkelse og/eller langsommere tid naturligvis at øge rentabiliteten af hjernen skiver fra ældre dyr, og vi har givet en grundlæggende guide anbefalede spike-i tidsplanerne ifølge at dyr alder (Se tabel 2). Mens vi har givet en grundlæggende ramme, der er egnet til en bred vifte af applikationer, kan yderligere avancerede trin udforskes for yderligere forbedrer levedygtighed og levetiden af hjernen skiver fra voksne og aldrende dyr. For eksempel glutathion restaurering strategier er særligt effektiv i denne henseende og kan gennemføres som beskrevet andetsteds2,6.
Forbedre overførselshastighed for udfordrende eksperimenter
Analyse af synaptisk forbindelse af patch klemme optagelse er en krævende program, der kræver fremragende bevarelse af både neuronal struktur og funktion for at opnå en høj pålidelighed af succes. Da antallet af neuroner kan registreres samtidigt går op lineært, teknisk sværhedsgrad går op supra-lineært. Der er talrige fejlmodi, og en af de hyppigste årsager til fejl er manglende evne til at form passende gigaohm sæler på en eller flere af de målrettede celler. Dette kan dramatisk langsomme fremskridt, især når tre eller flere neuroner skal registreres samtidig. Overensstemmelse med konstateringen af hurtigere gigaohm forsegle dannelse tid med optimeret NMDG beskyttende recovery metoden, der var en markant forbedring i succesrate og gennemløb af multi neuron patch klemme optagelse eksperimenter med både voksen transgene musen hjernen skiver og voksen neurokirurgiske menneskehjerne skiver. Den forbedrede effektivitet er næsten helt sikkert tilskrives både hurtigere og mere pålidelig gigaohm seal dannelsen og forbedret neuronal bevarelsen af skiver med denne protokol. Selv om denne protokol fokuserer på fordelene udtrykkeligt for patch klemme optagelse programmer, forventes lignende gevinster for andre udfordrende eksperimentelle programmer hvor hjernen skive levedygtighed er altafgørende.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Allen Institute for hjernen videnskab. Forfatterne vil gerne takke Allen Institute stiftere, Paul G. Allen og Jody Allen, for deres vision, opmuntring og støtte. Vi takker også Allen Institute teknisk support personale til at udføre dyrs pleje, opdræt og genotypebestemmelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
| Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
| Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
| Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
| Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
| Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
| Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
| nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
| Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
| 35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
| Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
| Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
| Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
| Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
| Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
| Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
| Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
| KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
| Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
| Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
| Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
| Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
| Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
| 10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
| 30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
| 1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
| 25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
| Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |
References
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
- Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
- Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
- Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
- Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
- Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
- Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
- Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
- Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
- Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
- Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
- LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
- Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
- Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
- Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
- Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
- McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
- Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
- Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
- Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
- Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
- Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
- Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
- Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
- Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
- Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
- Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
- DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
- Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
- Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
- Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
- Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462 (2015).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
- Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
- Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).
