Summary
Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.
Abstract
Este protocolo é um guia prático para o N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Numerosos estudos recentes têm validado a utilidade desse método para melhorar a preservação neuronal e viabilidade de fatia de cérebro global. A implementação desta técnica por adotantes tem facilitado investigações detalhadas sobre funções cerebrais usando diversas aplicações experimentais e abrangendo uma vasta gama de idades animais, regiões do cérebro e tipos de células. Passos são descritos para a realização da técnica de fatia de cérebro protetora de recuperação usando um otimizado NMDG artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) formulação de mídia e melhorado procedimento confiantemente obter fatias de cérebro saudável para eletrofisiologia de braçadeira do remendo. Com esta abordagem atualizada, observa-se uma melhoria substancial na velocidade e confiabilidade de gigaohm selar formação durante a braçadeira de remendo alvo gravação experiências, mantendo excelente preservação neuronal, facilitando, assim, um desafio aplicações experimentais. Resultados representativos são fornecidos de grampo multi neurônio remendo gravação experimentos a ensaiar conectividade sináptica em fatias de cérebro neocortical preparados a partir de ratos transgênicos adultos jovens e maduros espécimes adultos de neurocirurgia humanos. Além disso, o método de recuperação protetora NMDG otimizado de corte de cérebro é compatível com animais jovens e adultos, portanto, resolvendo uma limitação da metodologia original. Em resumo, uma formulação única mídia e cérebro procedimento de corte podem ser implementados através de diversas espécies e idades para alcançar excelente preservação viabilidade e tecido.
Introduction
A preparação de fatia cerebral aguda é um sistema de modelo experimental essencial em neurociência. Para cerca de metade de um século, esta plataforma permitiu dinâmicos estudos funcionais do cérebro vivo em uma ampla variedade de espécies animais e regiões anatômicas do cérebro. Se o aplicativo pretendido é bioquímica, morfologia, imagem latente funcional ou eletrofisiologia, é de extrema importância para garantir a integridade ideal e a viabilidade do tecido cortado. É por este motivo que a preparação de fatia do cérebro de roedor juvenil altamente resiliente (i.e., mais jovem do que o pós-Natal dia 30 para ratos) tem sido a mais preferida para a data. A dificuldade na obtenção de cérebro suficientemente saudável fatias do adulto maduro e envelhecimento animais provou para ser um desafio formidável para a maioria e impôs severas limitações para estudar a arquitetura funcional do cérebro maduro. Isto é particularmente verdadeiro para braçadeira do remendo de gravação, uma técnica que exige excelente preservação morfológica e funcional e é indispensável para a caracterização detalhadas propriedades intrínsecas e sinápticas dos neurônios único identificados. Há várias décadas, a grande maioria dos electrophysiologists de braçadeira do remendo têm contado com um método de 'corte de proteção' usando sacarose-substituídos baixa at+ aCSF1 fatias de cérebro saudável de juvenil e para um bem menor na preparação extensão, animais jovens e adultos. Este método é baseado na premissa de que a passivo influxo at+ e entrada de água posterior e célula inchaço durante a etapa de corte fatia é o insulto predominante que leva a pobre sobrevivência dos neurônios, particularmente para aqueles neurônios localizado na camadas superficiais que são mais propensos a sustentar o trauma direto do movimento da lâmina. No entanto, o método de proteção de corte ainda deixa muito a desejar para a preparação de fatia de cérebro de animais adultos maduros independentemente a formulação particular aCSF implementado.
Uma solução simples mas eficaz para este problema tem sido descrito2,3,4,5,6 e denominou o método de fatia do cérebro 'proteção recuperação'. A versão original deste método usa um aCSF NMDG-substituídos, como NMDG foi identificado como o mais versátil e eficaz, entre vários outros candidatos de sódio íon substitutos (incluindo a sacarose, glicerol, colina e Tris). A formulação de mídia foi reforçada pela adição de HEPES resistir edema de fatia do cérebro e fornecer mais forte pH buffer7, bem como a adição de suplementos para neutralizar os efeitos nocivos do estresse oxidativo (tabela 1). Determinou-se empiricamente que uma incubação de recuperação inicial intervir Na baixa+, baixa Ca2 +, e alta Mg2 + NMDG aCSF imediatamente após o corte de tecido do cérebro de um adulto foi necessária e suficiente para melhorado neuronal preservação sob uma grande variedade de regiões do cérebro, tipos de células e animais idades3,5,6.
Notavelmente, encarnações anteriores de que agora é chamado o método de proteção de recuperação podem ser encontradas na literatura1,8,9,10,11,12, 13, apesar de todo o potencial para amadurecer adulto e envelhecimento do cérebro animal fatia e patch braçadeira gravação não foi reconhecido ou demonstrado nestas obras anteriores. Além disso, variações processuais matizadas continuam a surgir para apoiar aplicações específicas experimental4,14,15,16. O corpo coletivo de trabalho desses numerosos grupos de investigação transmite confiança elevada na robustez do método recuperação protetora para preservação de tecido melhorada. O método de recuperação protetora NMDG agora foi amplamente adotado e implementado em inúmeros estudos publicados utilizando preparações de fatia do cérebro de um animal adulto. Estes estudos de fatia aguda abrangem neocortical3,17,18, hipocampo15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, mesencéfalo25,26,,27,28,29e rombencéfalo30,31,32, 33 , regiões de 34 e uma variedade de tipos de neurotransmissor e neuromodelador incluindo glutamatérgico4,30, gabaérgica18,20,31,35 ,36, dopaminergic24,29,37,38, colinérgicos14,37,38, 39, noradrenérgico40e serotoninérgico27,28 neurotransmissão. O método também é apropriado para controle de optogenetic de atividade neuronal em fatias derivados animais transgénicos3,39 ou seguindo na vivo injeções viral17,27, 28,40,41,42,43, como bem como Ca2 + imagem latente funcional da atividade neuronal2,44 ,,45,46. Análises de curto prazo plasticidade4,,47,48 e diversas formas de plasticidade a longo prazo16,35,48 foram relatou. Um estudo recente aplicado o método de recuperação proteção NMDG para facilitar a extensa e sistemática de sondagem de conectividade sináptica no córtex visual em fatias de cérebro de rato adulto maduro usando o octopatch gravar configuração49 — um poderoso demonstração da utilidade e robustez deste método. O método de recuperação proteção nem tem sido aplicado com sucesso em contextos experimentais anteriormente imprevistos, tais como, melhor preservação da vasculatura e pericitos em adultos cérebro cortical fatias50, braçadeira do remendo de gravação de transplantadas as populações interneurônio 1 – 1,5 ano de idade a doença de Alzheimer do mouse modelos20e um cérebro de um adulto fatia do receptor de tráfico ensaio51.
O protocolo seguinte descreve procedimentos passo a passo para implementar um método de recuperação protetora NMDG otimizado de preparação de fatia do cérebro para melhorar a viabilidade das fatias cerebral aguda. Os princípios para melhor preservação neuronal são discutidos, bem como demonstração dos benefícios claros desta metodologia para braçadeira de remendo de neurônio multi complexo gravação experimentos em fatias de cérebro de rato transgénico adulto jovem e adulto maduro fatias de cérebro humano neurocirúrgicos. O protocolo seguinte foi validado para ratos de 21 dias de idade para mais de um anos de idade, bem como quanto a espécimes humanos neurocirúrgicos, derivados de pacientes adultos.
Protocol
Procedimentos envolvendo ratos transgênicos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) no Instituto Allen para a ciência do cérebro. Masculinos e femininos C57BL/6 ratos (faixa 10-30 g de peso) foram utilizados nesses experimentos. Alguns resultados representativos descrevem dados coletados de fatias do cérebro humano vivo. Obtiveram-se amostras de tecido neocortical durante neurocirurgias para remoção do tumor. Foi necessário remover o sobrejacente tecido neocortical para obter acessar para o tecido doente. Foi obtido consentimento paciente informado em todos os casos para o uso de tecido neurocirúrgico para fins de investigação no âmbito de um protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional do sueco Medical Center.
1. preparação de meios e reagentes (tabela 1)
Nota: Soluções devem ser constituídas em água purificada que é livre de metais e outras impurezas. É recomendável que soluções ser feita recentemente no dia do experimento, embora soluções não utilizadas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 semana, se desejado. 1 L de cada formulação acima é suficiente para os procedimentos de corte de 1 – 2. ACSF todas as soluções devem ser saturadas com carbogênio (95% O25% CO2) antes da utilização para assegurar buffer pH estável e oxigenação adequada. O pH das soluções deve ser ajustado para 7.3-7.4 e osmolalidade medida e ajustada para 300-310 mOsmol/kg.
- Preparar aCSF NMDG-HEPES (em mM): 92 NMDG, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, tioureia 2, at-ascorbato de 5, 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH de 7,3, 0,5 CaCl2·2H2O e 3 at-piruvato –7.4 com 17 mL + /-0,5 mL de ácido clorídrico 5 M.
Nota: Esta etapa de titulação idealmente deve ser realizada antes da adição de cátions divalentes, para evitar a precipitação; no entanto, a precipitação pode ser revertida após o ajuste do pH para faixa fisiológica. - Preparar o HEPES segurando aCSF (em mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, 2 tioureia, 5 at-ascorbato, 3 at-piruvato e CaCl 22·2H2O 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH de 7,3 – 7,4 com algumas gotas de concentrado 10 N NaOH.
- Preparar a gravação aCSF (em mM): NaCl 124, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, glicose 12,5, 5 HEPES, CaCl 22·2H2O e 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH de 7,3 7,4 com algumas gotas de concentrado 10 N NaOH.
- Preparar at+ espiga-em solução (M 2): 580 mg de NaCl dissolvidos em 5 mL de aCSF de NMDG-HEPES preparado na hora. Esta é a solução suficiente para a preparação da fatia de um cérebro.
- Prepare a agarose 2% para ser usado para a incorporação de tecido. Dissolver 2 g de agarose tipo 1B (ver Tabela de materiais) em 100 mL de 1X PBS e microondas até ferver apenas. Agitar o frasco para misturar, em seguida, despeje a mistura em um pratos de Petri estéril de 10 cm e deixar solidificar. Guarde a placa de agarose em um saco plástico selado a 4 ° C até o uso.
- Prepare o anestésico injetável, solução estoque de trabalho. Misturar 2,5 g de 2, 2,2-tribromoetanol com 5ml de 2-metil-2-butanol e então gradualmente dissolver em 200 mL de PBS, pH 7.0 – 7.3. Filtrar a solução estoque com um filtro de 0,22 µm antes de usar e armazenar a 4 ° C, protegido da luz.
Nota: Consulte o uso de animais respectivos Comitê diretrizes e regras para determinar o procedimento de expiração e eliminação para o anestésico solução estoque de trabalho.
2. instalação de estação de corte
- Configurar a estação de corte com a máquina de cortador de tecido e instrumentos cirúrgicos (consulte Tabela de materiais). Para calibrar a máquina do cortador, anexar uma lâmina de cerâmica do injector de zircônio para o braço de lâmina com cola rápida-adesivo, em seguida, insira o suporte de amostra e alinhe a ponta da lâmina à borda espécime titular, deixando um pequeno intervalo para assegurar que a lâmina não raspar o metal.
Nota: Se a extremidade da lâmina não estiver fisicamente danificada pode ser reutilizado por muitas semanas ou mesmo meses sem substituição. Vários modelos de cortador de tecido estão comercialmente disponíveis, muitos dos quais podem proporcionar excelente desempenho quando calibrado de forma otimizada. O instrumento ideal deve ter deflexão mínima do eixo z, ou medido diretamente e sintonizado ou empiricamente observados. - Configurar um copo de 250 mL, repleto com 200 mL de NMDG-HEPES aCSF e pre-chill no gelo constante carbogenation (aplicada através de um difusor de gás pedra imergido na mídia) para > 10 min.
Nota: Esta solução será usada para perfusão transcardial e para encher o reservatório de máquina de corte durante o corte. - Preparar a câmara de recuperação fatia cerebral inicial preenchida com 150 mL de NMDG-HEPES aCSF (manter constante carbogenation) e coloque a câmara em um banho de água aquecida mantido 32 e 34 ° c.
Nota: Uma fatia câmara após o projeto de Edwards e Konnerth (1992),52 é recomendado para esta etapa. Estas câmaras podem ser feitas com itens de laboratório prontamente disponível (copo de 250 mL, nylon mesh compensação, tubo cónico de 50 mL, prato redondo plástico 35 mm). Deve ter cuidado para garantir que a fatia de rede permanece livre de ar bolhas, particularmente aqueles que continuamente produzido pelas pedras de bolha de gás carbogen como estes podem causar fatias flutuar acima e tornar-se danificado. A compensação deve ser submersa cerca de 1 cm abaixo da superfície líquida. - Configurar uma fatia do cérebro segurando a câmara; recomenda-se um projeto com vários poços independentes em um reservatório maior (ver Tabela de materiais). Encha o reservatório com 450 mL de HEPES aCSF e quente a temperatura ambiente sob constante carbogenation até o uso.
Nota: As fatias do cérebro serão transferidas da câmara de recuperação inicial para esta câmara para armazenamento a longo prazo antes da gravação eletrofisiológica. Deve ter cuidado para garantir que os restos de compensação fatia livre de bolhas de ar em todos os momentos. - Prepare-se para a incorporação de tecido derretido agarose. Use a extremidade aberta de um frasco de 50 mL cônica como um cortador de biscoito para cortar um bloco de agarose 2% do prato previamente preparado. Vagamente tampar o frasco de Erlenmeyer, em seguida, até a agarose é só derreter no microondas por 10 a 30 s. Não sobreaquecer.
- Despeje o agarose derretido em tubos de 1,5 mL. Manter o agarose no estado fundido, usando um thermomixer definido para 42 ° C, com agitação vigorosa. Com cuidado, certifique-se de que a agarose derretido não solidificam prematuramente.
- Coloque o acessório refrigeração bloco para a segmentação de dados no gelo para pre-esfriar neste momento.
3. Transcardial perfusão
Nota: O procedimento de perfusão transcardial é um passo importante quando se trabalha com animais adultos e é importante para alcançar uma refrigeração rápida do cérebro e retardou o metabolismo através de infusão de cérebro do baixo at+, baixo Ca2 +/ alta Mg2 + aCSF solução. A perfusão transcardial também serve para limpar as células vermelhas do sangue da vasculatura cerebral, que reduz a autofluorescência que pode interferir com a visualização e direcionamento de populações de células fluorescente etiquetadas em linhas transgénicas. Não é aconselhável omitir a perfusão transcardial.
- Anestesiar profundamente ratos por injeção intraperitoneal de solução anestésica trabalho (250 mg / kg: 0,2 mL de 1,25% anestésica trabalhando solução por peso corporal de 10 g, consulte a Tabela de materiais). Depois de ~ 2-3 min, verificar profundidade suficiente de anestesia por avaliar o reflexo da pitada de dedo do pé. Se necessário, injetar um volume adicional de estoque de trabalho anestésica e reavaliar o reflexo de pitada de dedo do pé após outro 2-3 min.
- Carrega uma seringa de 30 mL com 25 mL de carbogenated NMDG-HEPES aCSF do copo 250ml pre-refrigerados (2 – 4 ° C é o ideal, em oposição a solução piegas ou congelada). Anexe uma agulha de calibre 25 5/8.
- Com o mouse sobre as costas, prender as dianteiras e as patas traseiras para a estabilidade. Um vidro de 15 cm de Petri cheia de silicone endurecido obras bem como a base.
- Usando um bisturi, faça uma incisão lateral para abrir a cavidade torácica no nível do diafragma. Use tesoura bem para cortar a caixa torácica em qualquer lado tendo o cuidado de evitar recorte o coração e os pulmões.
- Pino de volta parte central da caixa torácica para expor o coração. Insira a agulha da seringa de 30 mL no ventrículo esquerdo e corte o átrio direito com uma tesoura bem para permitir que o sangue sair o coração.
- Pressione o êmbolo da seringa utilizando manual pressão constante e perfundir o animal com a aCSF NMDG-HEPES refrigerado a uma taxa de ~ 10 mL/min.
Nota: Se a perfusão for bem-sucedida o fígado vai mudar de cor de vermelho para amarelo-pálido e em alguns casos claros de fluidos podem ser observados saindo pelas narinas no final do procedimento.
4. dissecção e cortar o cérebro
- Decapitar o animal. Use um bisturi para abrir a pele na cabeça e expor a tampa do crânio.
- Corte super fino uso tesoura para cortar a pele sobre a tampa do crânio e fazer pequenas incisões lateralmente em ambos os lados com o caudal ventral/base do crânio. Faça cortes superficiais adicionais, começando com o aspecto de caudal/dorsal do crânio se movendo na direção rostral acima da linha média dorsal, tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente. Faça um final ' t ' corte perpendicular à linha média ao nível dos bulbos olfatórios.
Nota: Deve ter cuidado para garantir que nenhum dano está feito para a região ou regiões do cérebro de interesse. Em particular, em nenhum momento deveria haver qualquer força compressiva aplicada para o próprio cérebro. - Use a pinça de ponta redonda para agarrar o crânio, começando com o aspecto de rostral-medial e casca de volta na direção caudal-lateral. Repita para ambos os lados de crack abra e retire as metades dorsais da PAC para expor o cérebro o crânio. Suavemente retire-lhes o cérebro intacto para o copo de pre-refrigerado aCSF NMDG-HEPES. Permitir que o cérebro esfriar uniformemente por ~ 1 min.
- Utilize a espátula grande para levantar o cérebro fora o copo e o prato de Petri coberto com papel de filtro. Aparar e bloquear o cérebro de acordo com o ângulo preferencial de fatiar e desejado a região do cérebro de interesse. Trabalhe rapidamente para evitar a privação prolongada de oxigênio durante a manipulação.
Nota: Muitos ângulos de corte são possíveis. O ângulo exato de método e fatiar bloqueio dependerá a região do cérebro exata, tipo de célula e circuito para ser estudado. - Fixe o bloco do cérebro para o suporte de amostra usando colagem adesiva. Retire a parte interna do porta-amostra suficiente para retirar o bloco de cérebro totalmente dentro. Despeje o agarose fundido diretamente o titular até o bloco do cérebro está totalmente coberto de agarose. Fixar o acessório pre-refrigeração refrigeração bloco em torno do suporte de amostra para ~ 10 s até a agarose solidificou.
- Insira o suporte de amostra no receptáculo na máquina do cortador e verificar o alinhamento adequado. Encher o reservatório com restantes previamente refrigerada, oxigenado NMDG-HEPES aCSF desde o copo de 250 mL e mover uma pedra de bolha no reservatório para a duração do corte para garantir a oxigenação adequada.
- Ajuste o micrômetro para começar a avançar a amostra do cérebro de agarose-incorporado. Inicie o cortador e empiricamente, ajustar a frequência de velocidade e oscilação de avanço para o nível desejado.
Nota: Ambas as configurações devem estar na faixa de baixa. Para melhores resultados, um único passe do braço da lâmina devem tomar aproximadamente 20 s e a oscilação deve produzir um zumbido muito suave e gentil com nenhum zumbido evidente. - Continue avançando e cortar o tecido em 300 µm incrementos (ou outra espessura preferencial) até a região do cérebro de interesse é totalmente seccionado; o tempo total do procedimento de corte deve ser menos de 15 min.
5. procedimento de recuperação protetora de NMDG otimizado
- Passo de recuperação inicial NMDG (passo crítico): após a conclusão do procedimento de corte, coletar todas as fatias usando um corte plástico Pasteur tubo t e transferi-los para uma câmara de recuperação inicial pré-aquecido (34 ° C) com 150 mL de NMDG-HEPES aCSF. Transferir todas as fatias em sucessão curta e iniciar um timer, assim como todas as fatias são movidas para a câmara de recuperação.
- Consulte a tabela 2 para determinar o ideal at+ espiga-em horário de acordo com a idade de rato.
Nota: Este procedimento é um método prático para alcançar uma taxa controlada de reintrodução do at+ para a câmara de fatia do cérebro e é otimizado para um específico fatia câmara geometria e reservatório volume cerebral e tipo (ver Tabela de materiais). - Executar o gradual nd+ pico-no procedimento, adicionando os volumes indicados de at+ espiga-em solução no indicado vezes. Adicione a solução de pico-no at+ diretamente na chaminé borbulhador da câmara de recuperação inicial para facilitar a mistura rápida.
- Transferi todas as fatias para a HEPES aCSF longo prazo exploração câmara mantida à temperatura ambiente. Permitir que fatias recuperar por uma 1h adicional na HEPES segurando a câmara antes de iniciar os experimentos de gravação de braçadeira de remendo.
6. Patch Clamp gravação
Nota: Os procedimentos básicos a seguir apenas fornecem algumas considerações práticas e não se destinam a representar protocolos detalhados para gravações de braçadeira do remendo, como estes podem ser encontrados em outros lugares53,,54. Um equipamento de eletrofisiologia do grampo de remendo é necessário para esta aplicação. Isso geralmente será composto de um microscópio vertical equipado com ótica de contraste (IR-DIC) interferência diferencial infravermelha e um sistema de iluminação de fluorescência, um amplificador de braçadeira do remendo e digitador de dados, motorizado micromanipulador e microscópio plataforma, tabela de isolamento de vibração, gaiola de Faraday e sistema de aquecimento e perfusão de solução. A câmara de amostra e a plataforma devem ser projetadas para a gravação de fatia submerso. Para gravações de braçadeira do remendo multi neurônio, um equipamento equipado com vários amplificadores, fases cabeça e Micromanipuladores de alta qualidade é necessário. Além disso, para obter melhores resultados, um equipamento equipado com um filtro passa-banda 900 nm IR e componentes ópticos correspondentes é altamente recomendado para garantir a visualização adequada de células localizadas > 50 µm no fundo as fatias de cérebro. Alinhamento adequado para iluminação de Kӧhler também é importante para visualização clara.
- Preparar a solução da pipeta intracelular (em mM): 130 K-gluconato, 4 KCl 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 fosfocreatina-at2, 4 MgATP, 0,3 ND2-GTP e 13,4 biocytin. Ajuste o pH a 7,35 com 1m KOH e a osmolalidade para 285-290 mOsmol/kg usando sacarose conforme necessário.
- Prepare-se eletrodos de braçadeira do remendo dos capilares de vidro de borosilicato de paredes espessas; o eletrodo de braçadeira do remendo ideal tem uma inclinação relativamente curta e atarracada com um ~ 3 – 6 MOhm cheia de resistência de ponta no banho.
- Certifique-se de que os fios do eléctrodo de prata são corretamente chlorided para garantir gravações estáveis. Fazer isto (típico), submergindo o último fio de 3 a 4 mm da prata na alvejante líquido por aproximadamente 30 min ou até que o fio fica preto.
- Estabelece perfusão de solução usando uma bomba peristáltica definida como 3-4 mL/min. circular carbogenated aCSF através da câmara de gravação, tendo o cuidado de combinar o influxo e efluxo de gravação para evitar o estouro.
- Transferir uma fatia do cérebro único na câmara de gravação de submersão e fixe no lugar usando uma âncora de fatia em forma de U com nylon atravessar cadeias de caracteres. Identifica a região do cérebro de destino usando um objectivo de ar 4 X antes de mudar para um objectivo de poder mais elevado (por exemplo, objectivos de imersão de água alta abertura numérica 40 X ou 60 X).
- Identifica visualmente uma célula-alvo saudável. A aparência da membrana neuronal na soma, como visualizado pela microscopia de IR-DIC, é usada para julgar a adequação de uma célula de candidato para a gravação de braçadeira do remendo.
Nota: Os neurônios saudáveis normalmente apresentam as seguintes características: encolhidos nem inchado somata, contraste suave das bordas da membrana e aparência de membrana Lisa. Além disso, a maioria das células saudáveis está localizada > 30 µm no fundo a fatia, como neurônios superficiais são susceptíveis de ser danificado com cortada dendríticas processos. Os neurônios que apresentam um aspecto enrugado, claramente visíveis núcleos ou aparência de 'ovo frito' ou bordas de membrana muito escuro ou alto contraste devem ser evitados. - Costas-preencher o patch pipetar com ~ 5 µ l de solução intracelular e carregá-lo no eléctrodo. Mover a pipeta para o banho de gravação acima a fatia do cérebro e aplique uma leve pressão positiva para limpar qualquer obstrução na ponta. Zero o deslocamento de pipeta e monitorar a resistência de ponta usando uma função de teste de membrana.
- Mova a ponta da pipeta em contacto com o corpo celular de neurônio alvo; forma uma pequena covinha na superfície da membrana, devido uma ligeira pressão positiva.
- Tão logo uma covinha de membrana é observada, rapidamente remover a pressão positiva e aplique sucção suave para facilitar a formação de selo. Uma vez que aumenta a resistência a pipeta para > 100 MOhm, ativar um comando de exploração a um nível que corresponde a membrana descanso antecipada potencial para o tipo de célula alvo (-70 mV é um bom ponto de partida).
- Uma vez que a resistência de ponta atinge gigaohm ≥ 1, tenta invadir a célula por romper a membrana debaixo da pipeta de remendo usando breves episódios de sucção afiada; o recurso 'zap' pode ser utilizado para facilitar a invasão, conforme necessário.
Nota: Um exploração potencial de -70 mV é sugerido para os experimentos de grampo de tensão em neurônios corticais. Os neurônios saudáveis terá um vazamento atual não mais negativo do que pA-100 para a duração do experimento, mas isto é em parte dependente do tipo de célula. Um neurônio seria excluído da análise do potencial de membrana de repouso foi despolarizado mais de -50 mV, ou se a resistência de acesso alterado por mais de 20%. -
Uma vez obtida uma gravação de braçadeira do remendo de células inteiras estável, alvo neurônios adicionais para gravação, repetindo as etapas 6.6 – 6.10. Tome cuidado para evitar perturbações mecânicas que resultariam em perder a primeira gravação.
- Selecione o primeiro neurônio para garantir uma probabilidade razoável de encontrar neurônios synaptically acoplados neurônios adicionais dentro de 100 µm.
Nota: Pode ser útil em alguns casos para identificar vários neurônios de candidato na frente e a pré-carga e pre-posicionar todas as pipetas nas proximidades para as várias células alvo antes de estabelecer a primeira gravação de braçadeira do remendo.
- Selecione o primeiro neurônio para garantir uma probabilidade razoável de encontrar neurônios synaptically acoplados neurônios adicionais dentro de 100 µm.
Representative Results
Esta seção fornece resultados representativos para a preparação de fatia do cérebro de rotina e remendo braçadeira eletrofisiologia experimentos usando o método de recuperação proteção otimizado NMDG (ou seja, recuperação de protetores de NMDG combinado com gradual nd+ pico-no procedimento). Preservação de primeira, morfológica dos neurônios foi avaliada em várias regiões do cérebro de fatias de cérebro preparadas com ou sem implementar o método de recuperação proteção otimizado do NMDG (Figura 1). Ratos adultos de três meses de idade foram selecionados para estas experiências, e usamos a microscopia IR-DIC para determinar a saúde de neurônio baseada a forma e a aparência geral do somata e dendritos proximais. Observe a aparência picnóticos enrugado, da maioria dos neurônios nas imagens representativas de fatias de cérebro preparadas sem o método de recuperação protetora (todas as imagens foram obtidas 1 – 2 h após a preparação da fatia). Essas fatias de controle foram preparadas usando aCSF NMDG para transcardial de perfusão e etapas de corte, mas inicialmente foram recuperadas em alta Na+-contendo HEPES aCSF. Em contraste, as imagens representativas do rodelas preparadas usando o método de recuperação proteção otimizado NMDG revelam os neurônios com morfologias melhoradas (mais suave, mais completa, menos aparência plissada) que são apropriados para braçadeira do remendo (Figura de gravação 1). observou-se a preservação neuronal melhorada através de várias regiões do cérebro incluindo neocortical camadas II/III e V, subiculum e dorsal geniculado (dLGN).
Em seguida, o método de recuperação proteção otimizado NMDG foi comparado com o original método de proteção de recuperação NMDG (ou seja, sem o gradual nd+ pico-no procedimento). O tempo médio para formação de selo gigaohm na braçadeira do remendo tentativas de gravação foi reduzido drasticamente e significativamente (9,9 s versus 33,3 s, * *p < 0.005, emparelhados t-teste) quando o gradual nd+ pico-no procedimento foi aplicado juntamente com a etapa de recuperação protetora de NMDG (Figura 2). A membrana mais rápida e mais confiável da selagem vezes grandemente melhorada a taxa de transferência da braçadeira do remendo gravação em fatias do cérebro de um adulto jovem. O ideal at+ pico-no horário foi posteriormente modificado de acordo com a idade do animal (tabela 2) e foi benéfico para todas as idades testadas (3 semanas para ratos 1 anos de idade). O perfil de elevação de concentração de íon sódio gradual ao longo do curso do pico-no procedimento é fornecido (Figura 3) para acompanhar os horários mostrados na tabela 2.
Como parte do Allen Institute célula tipos de programa (http://celltypes.brain-map.org/) um esforço de grande escala em andamento é sistematicamente para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas intrínsecas dos neurônios individuais no adulto jovem (dia pós-natal 40-80) fatias de visual cortical cerebral de rato derivados de linhagens transgênicas com expressão de marcador fluorescente tipo específico de célula em populações neuronais geneticamente definida (camada cortical e linhas específicas de motorista Cre cruzaram para uma fluorescente de Cre-dependente do tipo de célula repórter linha55). A Figura 4 mostra traços de exemplo de padrões de fuzilamento gravados do Parvalbumin (Pvalb)-expressando interneurônios (FS) corticais rápido-cravação (ratos Pvalb-IRES-Cre/Ai14) em resposta a uma série de 1 s atual injeção etapas que cobrem a gama dinâmica de neurônio disparar. O F-eu curva para um dataset de 22 interneurônios corticais do FS é exibido à direita. Semelhante alvejado foram realizados experimentos de gravação de braçadeira de remendo para caracterizar 23 Rorb-expressando excitatórios neurônios na camada IV de ratos Rorb-IRES-Cre/Ai14 (Figura 4). Tipos de neurônio saudável diversos incluindo interneurônios FS e neurônios piramidais em camadas e regiões corticais podem rotineiramente e confiantemente ser direcionados para braçadeira do remendo gravação pelo menos 6-8 h após otimizado de preparação fatia usando este protocolo.
Além de medir propriedades intrínsecas neuronais, conectividade sináptica foi sondada entre vários neurônios simultaneamente gravados de tipos definidos no visuais microcircuitos corticais. A braçadeira do remendo do neurônio multi técnica de gravação é excepcionalmente exigente, como inúmeros neurônios saudáveis candidato de tipos definidos devem estar presentes dentro de um campo relativamente pequeno da fatia cerebral para garantir uma chance razoável de obter alta qualidade gravações simultâneas e identificando conexões sinápticas de bona fide . A Figura 5 mostra a gravação emparelhada de dois interneurônios tdTomato + FS no córtex visual do cérebro fatias derivado de adultos jovens Pvalb-IRES-Cre/Ai14 ratos. Uma forte conexão sináptica inibitória unidirecional foi detectado (gravada com solução de cloreto de alta pipeta interno). Gravações de exemplo e protocolos para medir propriedades de plasticidade sináptica a curto prazo são apresentados. Surtos de estimulação de trem de alta frequência (10 pulsos de cada 10, 50 e 100 Hz) foram seguidos por pulsos de teste de recuperação único em vários intervalos de tempo (1, 2 ou 4 s) para medir o curso do tempo de recuperação da depressão sináptica.
Excelente sucesso também foi obtido por neurônios neocortical humanos em fatias de cérebro maduro adultos ex vivo . Neurocirúrgicos espécimes são obtidos de pacientes submetidos a cirurgias agendadas para remoção do tumor em hospitais locais. Os procedimentos para a preparação de fatia de coleção e cérebro tecido humano neurocirúrgicos diferem dos procedimentos de fatia de cérebro de rato em alguns aspectos práticos. Em breve, o tecido neocortical ressecado (distal ao site da patologia) é coletado da sala de cirurgia e imerso em oxigenado gelada NMDG-HEPES aCSF e transportado com refrigeração contínua e oxigenação da sala de operação para o laboratório dentro de 30 minutos ou menos. As fatias do cérebro são preparadas usando o procedimento de recuperação protetora de NMDG e permitiu a recuperação por um tempo prolongado de aproximadamente 3 h antes de iniciar as gravações de braçadeira do remendo. A Figura 6 mostra uma bem sucedida emparelhado gravação experimento e um bem sucedido remendo quádruplo braçadeira gravação de humano ex vivo fatias cérebro preparado desta forma da região do córtex frontal. A gravação emparelhada demonstra unidirecional entrada sináptica excitatória de um neurônio cortical piramidal para um interneurônio cortical (gravado como correntes pós-sináptico excitatórias). No patch quad experimentar dois excitatórios e dois neurônios inibitórios foram gravados simultaneamente, e três conexões sinápticas inibitórias foram detectadas (gravado como potenciais pós-sinápticos inibitórios) fora doze conexões totais sondadas. Assim, esta metodologia de fatia do cérebro otimizado permite confiança sucesso experimental em mais desafiadoras do cérebro fatia de aplicações, incluindo experimentos de grampo multi neurônio remendo para estudar a conectividade de circuito em agudamente ressecado cérebro humano adulto maduro tecido.
Figura 1: Melhorado preservação neuronal com o método de recuperação protetora NMDG otimizado de preparação de fatia cerebral. Imagens de representante IR-DIC foram adquiridas de regiões do cérebro diversificada em fatias agudas de um mouse de três meses de idade. Controlar o método de corte protetora NMDG sem um passo de recuperação protetora (painéis esquerdos) contra o método de recuperação proteção otimizado NMDG (painéis de direito). (A) camada V do neocórtex, (B) camada II/III de neocórtex, subiculum (C) e (D) dorsal geniculado (dLGN). Barras de escala em todos os painéis são 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação na braçadeira do remendo experimentos usando o método de recuperação proteção NMDG com at+ pico-no procedimento de gravação do selo acelerado velocidade e maior confiabilidade de gigaohm. Trama (A) de formação de selo gigaohm vezes para recuperação NMDG sozinha (preto com pontos de dados, n = 19) versus recuperação NMDG mais at+ pico-no procedimento (pontos de dados vermelho, n = 23). Todas as células gravadas foram piramidais neurônios na camada II/III ou V do córtex visual. Note que o tempo máximo é limitado a 100 s para contabilizar as células que nunca formaram gigaohm selos. Emparelhado o t-teste, * *p < 0.005. (B) parcela do potencial de membrana (RMP) para os neurônios piramidais camada V a descansar (pontos de dados laranja, n = 10/11), os neurônios piramidais II/III (verde pontos de dados, n = 9/10), ou interneurônios corticais de Pvalb + FS (azul de pontos de dados, n = 22/23). Círculos sólidos denotam a condição de recuperação NMDG e abrir círculos NMDG recuperação mais nd+ pico-no procedimento. Cada ponto de dados representa um neurônio e ambos a média e + /-SEM são exibidos. Não há diferenças significativas no RMPs, comparando as condições de preparação de fatia cerebral para todos os três tipos de células (emparelhado t-teste). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Perfil de elevação de concentração de íon sódio gradual ao longo do curso do procedimento de pico-no. (A) parcela de pico-em NaCl concentração versus tempo. (B) parcela da concentração de NaCl extracelular total versus tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Propriedades eletrofisiológicas intrínsecas tipos de células corticais geneticamente definida. (A) exemplo vestígios de disparo neuronal em resposta às etapas de injeção atual para Pvalb + corticais interneurônios selecionada de FS (painel esquerdo). tdTomato + neurônios foram alvo de gravações em fatias de cérebro de ratos Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Dados de resumo para disparar o relacionamento atual taxa de injeção (F-eu curva) são mostrados à direita (n = 22). (B) exemplo vestígios de disparo neuronal em resposta às etapas de injeção atual para Rorb-expressando camada cortical IV excitatórios neurônios (painel esquerdo). tdTomato + neurônios foram alvo de gravações em fatias de cérebro de ratos Rorb-IRES-Cre/Ai14. Dados de resumo para disparar o relacionamento atual taxa de injeção (F-eu curva) são mostrados à direita (n = 23). Cada linha fina colorida representa o F-eu curva para um único neurônio; Considerando que, as linhas pretas espessas representa a média para cada grupo de + /-SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Curto prazo plasticidade em synaptically conectado Pvalb-expressando cortical FS interneurônios. Contraste de interferência diferencial (A) e de epifluorescência foram usados para alvo tdTomato positivo, Pvalb-expressando interneurônios FS do córtex visual primário do mouse. Uma cor codificada diagrama esquemático conectividade demonstrando uma conexão sináptica unilateral entre os dois interneurônios. (B) esquema dos protocolos de estimulação utilizada para avaliar a dinâmica a curto prazo dos neurônios synaptically conectados. Trens de 10 potenciais de ação (10, 50 e 100 Hz) são evocados no neurônio pré-sináptica, seguido de um único potencial de ação (impulso de ensaio de recuperação, RTP) entregado com atraso de tempo diferentes (1, 2 e 4 s) depois que o trem foi encerrado. Cada RTP são cor codificada para maior clareza. (C) média vestígios de correspondentes unilaterais inibitórios pós-sinápticos potenciais (uIPSPs) na célula #2, em resposta aos comboios de potenciais de ação evocados na célula #1. Baixo-relevo cinza expandiu-se escala de tempo para mostrar a delineação de trem de uIPSP. (D) Normalized uIPSP amplitudes são plotadas em função da sua posição durante os trens em diferentes frequências. Depressão líquido é outro lado tudo entradas taxas com uma substancial recuperação de uIPSP em 4 s. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Gravações de grampo multi neurônio remendo em adultos humanos neurocirúrgicos cérebro fatias. (A) de imagens de baixa e alta ampliação IR-DIC indicando a localização e a identidade dos neurônios gravados (top painéis). Um neurônio piramidal (asterisco preto) e a vizinho interneurônio (asterisco vermelho) foram gravados simultaneamente. Cor de exemplo codificado vestígios de uma conexão sináptica excitatória unidirecional (ESPC) da célula piramidal para interneurônio (medido como EPSCs no grampo de tensão) e o correspondente mapa de conexão física (painéis de fundo). (B) gravação de braçadeira de remendo quádruplo experimento em uma fatia do cérebro neurocirúrgicos humano adulto do córtex pré-frontal dorsolateral. Dois neurônios pyramidal e dois interneurônios são registrados simultaneamente, permitindo a sondagem sequencial de doze possíveis conexões sinápticas. Um trem de potenciais evocados de ação na célula #3 (traços verdes) levou à detecção de potenciais pós-sinápticos inibitórios (IPSPs) em cada um dos outros três gravados simultaneamente neurônios (três regiões in a box, painéis superiores). As respostas gravadas de cada neurônio individual são cor codificada para maior clareza. O mapa de conexão física é exibido no painel inferior. Observe os traços cruas mostrados em (B) representam as médias das varreduras de pelo menos 20 dados brutos consecutivos. Putativa identificação do tipo de célula baseou-se na forma de soma, análise da morfologia pela tintura fluorescente enchimento durante as gravações e propriedades intrínsecas eletrofisiológicas, incluindo os padrões de fuzilamento em resposta à atual passos de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| NMDG-HEPES aCSF | HEPES exploração aCSF | Gravação aCSF | |||||||
| Componente de | mM | MW | g/litro | mM | MW | g/litro | mM | MW | g/litro |
| NMDG | 92 | 195.22 | 17.96 | ||||||
| HCl | 92 | 36.46 | * | ||||||
| NaCl | 92 | 58.44 | 5,38 | 124 | 58.44 | 7.25 | |||
| KCl | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 138,00 | 0.17 | 1.2 | 138,00 | 0.17 | 1.2 | 138,00 | 0.17 |
| NaHCO3 | 30 | 84.01 | 2,52 | 30 | 84.01 | 2,52 | 24 | 84.01 | 2.02 |
| HEPES | 20 | 238.31 | 4,77 | 20 | 238.31 | 4,77 | 5 | 238.31 | 1.19 |
| Glicose | 25 | 180.20 | 4.51 | 25 | 180.20 | 4.51 | 12.5 | 180.20 | 2.25 |
| ascorbato de sódio | 5 | 198,00 | 0,99 | 5 | 198,00 | 0,99 | 0 | 198,00 | 0,00 |
| Tioureia | 2 | 76.12 | 0.15 | 2 | 76.12 | 0.15 | 0 | 76.12 | 0,00 |
| piruvato de sódio | 3 | 110.04 | 0,33 | 3 | 110.04 | 0,33 | 0 | 110.04 | 0,00 |
| MgSO4.7h2, O | 10 | 246.48 | 5 mL | 2 | 246.48 | 1 mL | 2 | 246.48 | 1 mL (estoque de 2M) |
| CaCl2.2h2, O | 0,5 | 147.01 | 0,25 mL | 2 | 147.01 | 1 mL | 2 | 147.01 | 1 mL (estoque de 2M) |
| * titula-pH da NMDG-HEPES aCSF para 7.3-7.4 usando HCl concentrado | |||||||||
| Todas as soluções devem ser no intervalo 300-310 mOsm/Kg | |||||||||
Tabela 1: Formulações Media.
| Idade do animal | |||||
| Tempo (min) * | < 1 mês | 1-3 meses | 3-6 meses | 6-12 meses | + de 12 meses |
| 0 | 250 Μ l | 250 Μ l | |||
| 1 | |||||
| 2 | 250 Μ l | ||||
| 3 | |||||
| 4 | 500 Μ l | ||||
| 5 | 250 Μ l | 250 Μ l | |||
| 6 | 1000 Μ l | ||||
| 7 | |||||
| 8 | 2000 Μ l | ||||
| 9 | |||||
| 10 | transferência | 500 Μ l | 250 Μ l | 250 Μ l | |
| 11 | |||||
| 12 | |||||
| 13 | |||||
| 14 | |||||
| 15 | 1000 Μ l | 500 Μ l | 250 Μ l | 250 Μ l | |
| 16 | |||||
| 17 | |||||
| 18 | |||||
| 19 | |||||
| 20 | 2000 Μ l | 1000 Μ l | 500 Μ l | 250 Μ l | |
| 21 | |||||
| 22 | |||||
| 23 | |||||
| 24 | |||||
| 25 | transferência | 2000 Μ l | 1000 Μ l | 500 Μ l | |
| 26 | |||||
| 27 | |||||
| 28 | |||||
| 29 | |||||
| 30 | transferência | 2.000 Μ l | 1.000 Μ l | ||
| 31 | |||||
| 32 | |||||
| 33 | |||||
| 34 | |||||
| 35 | transferência | 2.000 Μ l | |||
| 36 | |||||
| 37 | |||||
| 38 | |||||
| 39 | |||||
| 40 | transferência | ||||
| * Tempo zero é que as fatias de momento são transferidas para a câmara de recuperação inicial | |||||
Tabela 2: Horário recomendado para at gradual + pico-no procedimento de acordo com a idade de rato.
Discussion
At + Spike-em melhora formação Gigaohm selo e Patch Clamp gravação de sucesso
A versão inicial do método NMDG protetora de recuperação foi projetada especificamente para animais adultos e envelhecimento2,5. Alguns pioneiros também têm procurado aplicar esta metodologia a corte juvenil cérebro animal (ou seja, ratos < 30 dias de idade). No entanto, tem-se observado que em contraste com proeminente visualmente-confirmado neuronal preservação com o método de recuperação protetora de NMDG nesta faixa de idade, formação de selo gigaohm pode frequentemente empata, levando a braçadeira do remendo falha tentativas de gravação. Uma hipótese é que NMDG cações são mais prontamente preso em fatias de cérebro juvenil em relação as fatias do cérebro de um adulto e podem impedir a formação de selo; no entanto, selos gigaohm prontamente podem formar enquanto fatias do cérebro juvenil são totalmente submerso em NMDG aCSF (dados não mostrados), assim indicando que NMDG aCSF por si é não impedir gigaohm selo formação.
A transição rápida de solução de baixo-para-alto at+ após a conclusão da etapa de recuperação inicial cérebro fatia provoca danos nas membranas neuronais e perturba o processo de formação do selo. Isso é intuitivo, dado que a transição de baixo-para-alto at+, frio-quente a temperatura e elevação dramática do Ca2 + para2 + relação Mg coletivamente levam a um forte ressurgimento do espontânea atividade sináptica. Esta fase de rebote inibitório no cérebro procedimento de corte é provável espelhar a lesão de reperfusão após um insulto isquêmico. Assim, ainda mais mitigar danos de membrana neuronal na fase inicial de recuperação que incorporou-se um gradual nd+ espiga-em procedimento em que a elevação da concentração do at+ na câmara de incubação NMDG protetora de recuperação é lentamente e reproducibly elevados com timing preciso. Como o procedimento de recuperação proteção original, a dissociação temporal de at+ elevação de temperatura e elevação de Ca2 +/ mg2 + relação é benéfica. Mas além disso, o at+ pico-no procedimento leva a pequenos aumentos incrementais na concentração extracelular de at+ sobre os primeiros pontos de tempo e grandes aumentos para os pontos de tempo final, proporcionando, assim, o tecido cerebral um oportunidade para melhor acomodar para o aumento dos níveis de at+ . Este procedimento é que uma alternativa ao exchange solução gradual controlada por uma bomba de perfusão ou gravidade linhas de gotejamento que levam a constantes aumentos nos níveis de at+ e exigem atenção para tanto a entrada e a saída para evitar o estouro da câmara de fatia. Notavelmente, neste at+ espiga-em procedimento a osmolalidade da solução na câmara de fatia gradualmente sobe ao longo de vários minutos antes das fatias são retornadas à solução osmolalidade normal, mas isso não afetou negativamente a saúde de fatia ou braçadeira do remendo gravação de sucesso. Uma solução de corte de alta pressão osmótica anteriormente foi usada para preparações de fatia do mesencéfalo para melhor preservar os neurônios de dopamina para remendo braçadeira gravações57,58, demonstrando assim que este temporário hiperosmolaridade pode ser benéfica em alguns contextos.
Implementando um processo otimizado, combinando o método de recuperação proteção NMDG e gradual at+ pico-no passo a utilidade desta metodologia de fatia do cérebro foi estendido para cobrir juvenil com idades animais adultas maduras. Este protocolo atualizado agora é adequado para uma vasta gama de idades animais usando uma única formulação ideal de aCSF NMDG e procedimento. Se necessário, o at+ pico-no procedimento pode ser aplicado com um atraso progressivamente mais longo e/ou curso de tempo mais lento para melhorar a viabilidade das fatias de cérebro de animais mais velhos, e nós fornecemos um guia básico de horários de pico-no recomendado de acordo a animal idade (ver tabela 2). Enquanto nós fornecemos uma estrutura básica apropriada para uma ampla gama de aplicações, etapas avançadas adicionais podem ser exploradas para realçar ainda mais a viabilidade e a longevidade de fatias de cérebro de animais adultos e do envelhecimento. Por exemplo, estratégias de restauração de glutationa são particularmente eficazes neste sentido e podem ser implementadas conforme descrito em outro lugar2,6.
Melhorar o Throughput para desafiar as experiências
A análise da conectividade sináptica por gravação de braçadeira do remendo é uma aplicação exigente que requer excelente preservação da estrutura neuronal e função a fim de alcançar uma alta confiabilidade de sucesso. Como o número de neurônios para ser gravado simultaneamente aumenta linearmente, o nível de dificuldade técnica sobe supralinearmente. Existem numerosos modos de falha, e uma das causas mais frequentes de falhas é a incapacidade de selos de forma adequada gigaohm em uma ou mais das células alvo. Isto pode dramaticamente lento progresso, particularmente quando três ou mais neurônios devem ser registrados simultaneamente. Consistente com o achado de mais rápido gigaohm selo tempo de formação com o método de recuperação proteção otimizado NMDG, houve uma melhora acentuada na taxa de sucesso e taxa de transferência de gravação de braçadeira do remendo do neurônio multi experimentos com ambos os adultos transgênicos fatias de cérebro de rato e fatias de cérebro neurocirúrgicos humano adulto. A maior eficiência é quase certamente atribuível a ambos gigaohm selo formação mais rápida e confiável e a preservação neuronal melhorada das fatias com este protocolo. Embora este protocolo enfoca os benefícios explicitamente para braçadeira de remendo, aplicações de gravação, ganhos semelhantes são antecipados para outras aplicações desafiadoras experimentais onde a viabilidade de fatia do cérebro é primordial.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Allen para a ciência do cérebro. Os autores desejam agradecer os fundadores de Instituto de Allen, Paul G. Allen e Jody Allen, por sua visão, encorajamento e apoio. Agradecemos também a equipe de suporte técnico do Instituto Allen para realização de genotipagem, criação e cuidados com animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
| Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
| Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
| Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
| Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
| Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
| Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
| nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
| Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
| 35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
| Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
| Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
| Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
| Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
| Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
| Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
| Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
| KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
| Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
| Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
| Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
| Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
| Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
| 10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
| 30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
| 1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
| 25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
| Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |
References
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