Summary
Denne protokollen demonstrerer gjennomføringen av en optimalisert N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser. En enkelt formulering brukes til å få pålitelig sunn hjernens skiver fra dyr i alle aldre og forskjellige eksperimentelle programmer.
Abstract
Denne protokollen er en praktisk guide til N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser. Mange studier har validert nytten av denne metoden for å forbedre neuronal bevaring og generelle hjernen stykke levedyktighet. Gjennomføringen av denne teknikken av tidlig adoptert har muliggjort detaljerte undersøkelser i hjernefunksjon bruker forskjellige eksperimentelle programmer og dekker en rekke dyr aldre og områder av hjernen celletyper. Fremgangsmåten er beskrevet for å gjennomføre beskyttende utvinning hjernen stykke teknikken bruker en optimalisert NMDG kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) media formulering og forbedret prosedyre å pålitelig få sunn hjernens sektorene for oppdateringen klemme elektrofysiologi. Med denne oppdatert en betydelig forbedring er observert i hastigheten og påliteligheten av gigaohm forsegle formasjon under målrettet oppdateringen klemme opptak eksperimenter samtidig opprettholde gode neuronal bevaring, dermed tilrettelegge utfordrende eksperimentell programmer. Representant resultatene er gitt flere Nevron oppdateringen klemme opptak eksperimenter til analysen synaptic tilkobling i neocortical hjernen skiver utarbeidet fra ung voksen transgene mus og moden voksen menneske neurosurgical prøver. Videre er optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden av hjernen slicing kompatibel med både unge og voksne dyr, derfor løse en begrensning av den opprinnelige metodikken. Oppsummert, kan en enkelt formulering og hjernen kutting prosedyren implementeres på tvers av ulike arter og aldre å oppnå gode levedyktighet og vev bevaring.
Introduction
Akutt hjernen stykke forberedelse er en viktig eksperimentell modellsystem i nevrovitenskap. Omtrent halvparten av et århundre, har denne plattformen aktivert dynamisk funksjonelle studier av levende hjernen over en rekke anatomiske hjernen regioner og dyrearter. Om det aktuelle programmet er biokjemi, funksjonell imaging, morfologi eller elektrofysiologi, er det av største betydning å sikre optimal integritet og levedyktigheten til skiver vevet. Det er derfor at svært fleksible juvenile gnager hjernen stykke utarbeidelse (dvs., yngre enn postnatal dag 30 for mus) har vært den mest foretrukne hittil. Problemer å skaffe tilstrekkelig sunn hjernens skiver fra moden voksen og eldre dyr har vist seg for å være en formidabel utfordring for de fleste og har pålagt alvorlige begrensninger for å studere funksjonelle arkitektur modne hjernen. Dette gjelder særlig for oppdateringen klemme opptak, en teknikk som krever gode morfologiske og funksjonelle bevaring og er uunnværlig for å karakterisere detaljerte indre og synaptic egenskaper identifiserte enkelt neurons. For de siste tiårene avhengig det store flertallet av oppdateringen klemme electrophysiologists "beskyttende cutting" metode bruker sukrose-substituert lav Na+ aCSF1 for å forberede sunn hjernens skiver fra juvenile, og i langt mindre grad, ung voksen dyr. Denne metoden er basert på premisset om at passiv Na+ strøm og påfølgende vann oppføringen og celle hevelse under det skive kutte steget er den dominerende fornærmelsen som fører til dårlig overlevelse av neurons, spesielt for disse nervecellene ligger i den overfladisk lag som er mest sannsynlig å opprettholde direkte traumer fra bladet bevegelsen. Men etterlater metoden beskyttende kutte fremdeles mye å være ønsket for hjernen stykke forberedelse fra modne voksen dyr uansett bestemt aCSF formulering implementert.
En enkel, men effektiv løsning på dette problemet har vært beskrevet2,3,4,5,6 og kalt "beskyttende recovery" hjernen skive metoden. Originalversjonen av denne metoden bruker en NMDG-substituert aCSF, som NMDG ble identifisert som den mest allsidige og effektiv blant ulike andre kandidat natrium ion erstatter (inkludert sukrose, glyserol, kolin og Tris). Media utformingen ble ytterligere forbedret med tillegg av HEPES å motstå hjernen stykke ødem og gi sterkere pH bufring7, samt tillegg av kosttilskudd for å motvirke de skadelige virkningene av oksidativt stress (tabell 1). Det var empirisk fastslått at en innledende utvinning inkubasjon trinn i lav Na+, lav Ca2 +, og høy Mg2 + NMDG aCSF umiddelbart etter voksen hjernen vev kutting var både nødvendig og tilstrekkelig for forbedret neuronal bevaring over et bredt spekter av hjernen regioner og celletyper dyr alderen3,5,6.
Spesielt, finnes tidligere inkarnasjoner av hva er nå kalt den beskyttende gjenopprettingsmetode i litteratur1,8,9,10,11,12, 13, selv om potensialet for modne voksen og aldring dyr hjernen skive og patch klemme innspillingen ble ikke gjenkjent, eller vist i disse tidligere arbeider. I tillegg fortsetter nyansert fremgangsmåter for variasjonene å støtte bestemte eksperimentelle programmer4,14,15,16. Kollektive kroppen arbeid av disse rekke forskningsgrupper formidler høy tilliten til robusthet av det beskyttende gjenopprettingsmetode for bedre vev bevaring. Metoden NMDG beskyttende utvinning er nå allment vedtatt og gjennomført inne mange publiserte studier utnytte voksen dyr hjernen stykke forberedelser. Disse akutt skive studiene span neocortical3,17,18, hippocampus15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, mellomhjernen,25,,26,,27,,28,,29og hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioner, og en rekke nevrotransmitter og neuromodulator typer, inkludert glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminergic24,29,37,38, cholinergic14,37,38, 39, noradrenergic40, og serotonergic27,28 neurotransmission. Metoden er også godt egnet for optogenetic kontroll av neuronal aktivitet i skiver avledet fra transgene dyr3,39 eller etter i vivo viral injeksjoner17,27, 28,40,41,42,43, som vel som funksjonell Ca2 + imaging neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser av både kortsiktige plastisitet4,47,48 og ulike former for langsiktig plastisitet16,35,48 har vært rapportert. En fersk studie brukt NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode for å lette omfattende og systematisk undersøkelser av synaptic tilkobling i hjernebarken i eldre voksen mus hjernen skiver med octopatch innspillingen konfigurasjon49 -en kraftig demonstrasjon av verktøyet og robusthet av denne metoden. Den beskyttende gjenopprettingsmetode har selv vært brukt med hell i tidligere uforutsette eksperimentelle sammenhenger, for eksempel, bedre bevaring av blodkar og pericytes i voksen kortikale hjernen skiver50, patch klemme opptak fra transplantert interneuron populasjoner i 1-1,5 år gamle Alzheimers musen modeller20og en voksen hjernen stykke reseptor menneskehandel analysen51.
Følgende protokollen beskriver trinnvise fremgangsmåter for å implementere en optimalisert NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode hjernen stykke forberedelser å forbedre levedyktigheten til akutt hjernen skiver. Prinsippene for forbedret neuronal bevaring er diskutert, samt demonstrasjon av de klare fordelene ved denne metoden for komplekse multi Nevron oppdateringen klemme innspillingen eksperimenter i både unge voksne transgene musen hjernen skiver og moden voksen neurosurgical hjernen skiver. Følgende protokollen er validert for mus fra 21 dager gammel til mer enn ett år, også for menneske neurosurgical prøver fra voksne pasienter.
Protocol
Prosedyrer som involverer transgene mus har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Allen Institute for hjernen vitenskap. Både mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus (vektklasser 10-30 g) ble brukt i disse eksperimentene. Noen av representant resultatene beskriver data innsamlet fra levende menneskelige hjerne skiver. Neocortical vevsprøver ble innhentet under neurosurgeries for svulst fjerning. Det var nødvendig å fjerne overliggende neocortical vev for å få tilgang til syke vev. Informert pasienten samtykke ble innhentet i alle tilfeller av bruk av neurosurgical vev for forskningsformål under en protokoll godkjent av institusjonelle gjennomgang styret svensk Medical Center.
1. forberedelse av Media og reagenser (tabell 1)
Merk: Løsninger bør gjøres i renset vann som uten spor metaller og andre urenheter. Det anbefales at løsninger gjøres fersk ved eksperimentet, selv om ubrukte løsninger kan lagres på 4 ° C i opptil 1 uke, om ønskelig. 1 L hver formulering ovenfor er tilstrekkelig for 1-2 kutting prosedyrer. Alle aCSF løsninger må være mettet med carbogen (95% O2/5% CO2) før bruk å sikre stabil pH bufring og tilstrekkelig oksygenering. PH i alle løsninger skal justeres til 7.3-7.4 og osmolality målt og justert til 300-310 mOsmol/kg.
- Forberede NMDG-HEPES aCSF (i mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukose, 2 thiourea, 5 Na-ascorbate, 3 Na-pyruvate, 0,5 CaCl2·2H2O og 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH til 7.3 –7.4 med 17 mL +/-0,5 mL 5 M saltsyre.
Merk: Dette trinnet titrering bør ideelt utføres før tilsetning av divalent kasjoner å unngå nedbør; men kan nedbøren reverseres ved justering av pH fysiologiske området. - Forberede HEPES holder aCSF (i mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukose, 2 thiourea, 5 Na-ascorbate, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3-7,4 med flere dråper konsentrert 10 N NaOH.
- Forbereder innspilling aCSF (i mM): 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12.5 glukose, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3-7,4 med noen dråper konsentrert 10 N NaOH.
- Forberede Na+ pigg i løsning (2 M): 580 mg av NaCl oppløst i 5 mL av ferskt tilberedte NMDG-HEPES aCSF. Dette er nok løsning for én hjerne skive prep.
- Forberede 2% agarose skal brukes for innebygging av vev. Oppløse 2 g agarose type 1B (se Tabell for materiale) i 100 mL 1 x PBS og mikrobølgeovn til bare koking. Virvel å blande, og Hell blandingen i et sterilt 10 cm Petri retter og tillate for å stivne. Lagre agarose platen i en forseglet plastpose på 4 ° C før bruk.
- Forberede injiserbare bedøvelse arbeider lagerløsning. Bland 2.5 g av 2,2,2-Tribromoethanol med 5 mL 2-metyl-2-butanol og deretter gradvis oppløses i 200 mL PBS, pH 7.0-7.3. Filtrere lager løsningen med filtere 0.22 µm før bruk og lagre på 4 ° C beskyttet mot lyset.
Merk: Se respektive dyr bruk komiteen retningslinjer og regler for å bestemme utløp og fjerning prosedyren for anesthetic arbeider lagerløsning.
2. oppsett av kutting stasjonen
- Definere kutting stasjonen med vev slicer maskinen og Kirurgiske instrumenter (se Tabell for materiale). Kalibrere slicer maskinen, knytte en zirkonium keramiske injektor blad til bladet armen med rask-selvklebende lim, deretter sette inn prøveholderen og justere forkanten av bladet til prøven holderen rim etterlot et lite gap slik bladet ikke skrape metallet.
Merk: Hvis blad kanten ikke er fysisk skadet det kan gjenbrukes for mange uker eller måneder uten erstatning. Ulike vev slicer modeller er kommersielt tilgjengelig, hvorav mange har utmerket ytelse når optimalt kalibrert. Ideell apparatet skal ha minimal z utslag, enten direkte målt og tilpasset eller empirisk observert. - Definere en 250 mL kanne fylt med 200 mL av NMDG-HEPES aCSF og pre chill på is med konstant carbogenation (anvendt via en gass diffuser stein midt i media) for > 10 min.
Merk: Denne løsningen vil bli brukt for transcardial perfusjon og fylle kutting maskin reservoaret under snitting. - Sette opp det første hjernen stykke utvinning kammeret fylt med 150 mL av NMDG-HEPES aCSF (opprettholde konstant carbogenation) og plassere i kammeret i et oppvarmet vannbad opprettholdt på 32-34 ° C.
Merk: En skive kammer etter design Edwards og Konnerth (1992)52 anbefales for dette trinnet. Disse rommene kan gjøres med tilgjengelige laboratorium elementer (250 mL kanne, nylon mesh netting, 50 mL konisk tube, 35 mm plast runde parabol). Hensyn må tas for å sikre at stykket netting fortsatt gratis luft bobler, spesielt de kontinuerlig produsert av carbogen gass bubble steinene som disse kan forårsake skiver å dupp opp og blir skadet. Nettingen bør være neddykket omtrent 1 cm under flytende overflaten. - Definere en hjerne skive holder kammer; en design med flere uavhengige brønner i et større reservoar anbefales (se Tabell for materiale). Fyll tanken med 450 mL av HEPES aCSF og varm til romtemperatur under konstant carbogenation før bruk.
Merk: Hjernen skiver skal overføres fra første utvinning kammer til denne kammer for langtidslagring før elektrofysiologiske innspillingen. Hensyn må tas for å sikre at skive netting restene fri for luftbobler hele tiden. - Forberede smeltet agarose vev innebygging. Bruk den åpne enden av 50 mL konisk ampuller som en cookie cutter for å skjære ut en blokk med 2% agarose fra tidligere utarbeidet parabolen. Løst cap konisk ampullen, så mikrobølgeovn 10-30 s inntil agarose er bare smeltet. Du trenger ikke overoppheting.
- Hell den smeltede agarose i 1,5 mL rør. Opprettholde agarose i smeltet staten bruker en thermomixer satt til 42 ° C med kraftig risting. Kontroller nøye at de smeltet agarose ikke stivne for tidlig.
- Plass tilbehøret chilling blokk for sliceren på is pre avkjøles på dette tidspunktet.
3. Transcardial perfusjon
Merk: Transcardial perfusjon prosedyren er et viktig skritt når du arbeider med voksen dyr og er viktig å oppnå rask nedkjøling av hjernen og redusert metabolisme via hjernen infusjon av lav Na+, lav Ca2 +/ høy Mg2 + aCSF løsning. Transcardial perfusjon fungerer også fjerne røde blod celler fra hjerne blodkar, noe som reduserer autofluorescence som kan forstyrre visualisering og målretting av fluorescently merket celle populasjoner i transgene linjer. Det er ikke tilrådelig å utelate transcardial perfusjon.
- Dypt bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av bedøvende fungerende lager løsning (250 mg / kg: 0,2 mL 1,25% bedøvende arbeider lagerløsning per 10 g kroppsvekt, se Tabellen for materiale). Etter ~ 2-3 min, kontrollere tilstrekkelig dybde av anestesi ved å vurdere tå knipe refleks. Hvis nødvendig, injisere en ekstra volum på bedøvende arbeider lager og revurdere tå knipe refleks etter en 2-3 minutter.
- Laste inn en 30 mL sprøyte med 25 mL av carbogenated NMDG-HEPES aCSF fra pre kjølt 250 mL begeret (2-4 ° C er optimal, i motsetning til slushy eller frosset løsning). Knytte en 25 5/8 gauge nål.
- Med musen på ryggen, feste ned forepaws og bakben paws for stabilitet. En 15 cm glass Petriskål fylt med herdet silikon fungerer godt som base.
- Bruke en skalpell, lage en lateral snitt åpne bryst hulrom på nivået av mellomgulvet. Bruke fine saks til å kutte gjennom ribbe buret på enten side å ta vare å unngå klipping hjertet og lungene.
- Feste tilbake sentrum del på ribbe buret å avsløre hjertet. Sett inn nålen av 30 mL i venstre ventrikkel og kuttet rett atrium med fine saks å la blodet å avslutte hjertet.
- Trykker sprøytestempelet bruker manuell konstant press og perfuse dyret med kjølt NMDG-HEPES aCSF med en hastighet på ~ 10 mL/min.
Merk: Hvis perfusjonen leveren endres i farge fra dyp rød til blek gul, og i noen tilfeller klare væsker kan observeres avslutter neseborene mot slutten av prosedyren.
4. hjernen disseksjon og Slicing
- Halshugge dyret. Bruk en skalpell åpne huden på hodet og utsette skallen cap.
- Bruk fint super cut saks til å klippe bort huden over skallen hetten og gjøre små incisions sidelengs på hver side på det caudal/ventrale base av skallen. Gjøre ytterligere grunne kutt fra caudal/dorsal aspekt av skallen går i rostral retning opp dorsal midtlinjen ta vare ikke for å skade den underliggende hjernen. Foreta en endelige 'T' kuttet vinkelrett til midtlinjen på nivået av olfactory pærene.
Merk: Hensyn må tas for å sikre at ingen skade er gjort til hjernen områdene rundt. Spesielt på noe tidspunkt skal det være noen kompresjons kraften til hjernen selv. - Bruk runde-tip tang til å forstå skallen fra rostral-mediale aspektet og skrelle tilbake i retning caudal-lateral. Gjenta for begge sider å sprekk åpen og fjerne dorsal halvdelene av skallen hetten å avsløre hjernen. Forsiktig scoop ut intakt hjernen i begeret av pre kjølt NMDG-HEPES aCSF. Tillat hjernen jevnt avkjøles i ~ 1 min.
- Bruke store spatula for å løfte hjernen ut av begeret og på Petriskål dekket med filter papir. Trim og blokkere hjernen i henhold til foretrukne vinkelen for kutting og ønsket hjernen regionen rundt. Arbeider raskt for å unngå langvarig oksygenmangel under behandling.
Merk: Mange kutting vinkler er mulig. Den nøyaktige blokkerende metoden og slicing vinkelen avhenger nøyaktig hjernen regionen, celle type og krets å bli undersøkt. - Påføre hjernen blokken til prøveholderen ved hjelp av lim lim. Trekke indre stykke prøveholderen nok å trekke hjernen blokken fullt innsiden. Hell den smeltede agarose direkte inn i holderen til hjernen blokken er helt dekket med agarose. Klemme pre-avkjølt tilbehøret chilling blokk rundt prøveholder for ~ 10 s til agarose har styrket.
- Prøveholderen inn receptacle på slicer maskinen og kontroller riktig justering. Fyll tanken med gjenværende pre kjølt, oksygenrikt NMDG-HEPES aCSF fra 250 mL begeret og flytte en boble stein i reservoaret for varigheten av utstyr for å sikre tilstrekkelig oksygenering.
- Justere mikrometer for å begynne å flytte agarose-innebygd hjernen prøven. Start sliceren og empirisk justere forhånd hastighet og svinging frekvensen til ønsket nivå.
Merk: Begge innstillingene bør være i lav rekkevidde. For best resultat, en enkelt passerer av bladet armen bør tar ca 20 s og oscillation skal produsere en veldig glatt og skånsom summing med ingen åpenbare summende. - Fortsette å fremme og slicing vevet i 300 µm-trinn (eller andre ønsket tykkelse) til hjernen regionen rundt er fullstendig delt; total tid for kutting prosedyren skal være mindre enn 15 minutter.
5. optimalisert NMDG beskyttende prosedyre
- Første NMDG utvinning trinn (avgjørende skritt): etter gjennomføring av snitting prosedyren, samler opp alle sektorene bruker en cut-off plast Pasteur rør t og overføre dem til et forvarmes (34 ° C) første utvinning kammer fylt med 150 mL NMDG-HEPES aCSF. Overføre alle sektorer i kort rekkefølge og starter en tidtaker som alle skiver flyttes inn i gjenvinning kammeret.
- Se tabell 2 for å bestemme optimale Na+ pigg i tidsplanen etter musen alder.
Merk: Denne fremgangsmåten er en praktisk metode for å oppnå en kontrollert hastighet av gjeninnføring av Na+ i hjernen stykke kammeret og er optimalisert for en bestemt hjernen stykke kammer geometri og reservoaret volum og type (se Tabell for materiale). - Utføre gradvis Na+ pigg-i prosedyren ved å legge de angitte mengder Na+ pigg i løsning på angitt tid. Legg Na+ pigg i løsningen direkte til bubbler skorsteinen av første utvinning kammer å lette rask miksing.
- Overføre alle skiver til HEPES aCSF langsiktige holder kammeret vedlikeholdes ved romtemperatur. Lar skiver å gjenopprette for en ekstra 1 h i HEPES holder kammeret før starte oppdateringen klemme opptak eksperimenter.
6. Patch klemme opptak
Merk: Følgende grunnleggende bare gi noen praktiske hensyn og er ikke ment å representere detaljert protokoller for oppdateringen klemme innspillinger, som dette kan bli funnet andre steder53,54. En patch klemme elektrofysiologi rigg kreves for dette programmet. Dette vil vanligvis være sammensatt av en oppreist mikroskop utstyrt med infrarød differensial interferens kontrast (IR-DIC) optikk og en fluorescens belysning system, en patch klemme forsterker og data digitaliseringsenhet, motorisert micromanipulator og mikroskopet plattform, vibrasjon isolasjon tabell, buret og løsningen oppvarming og perfusjon system. Eksempel kammer og plattform bør være utformet for neddykket skive opptak. Flere Nevron oppdateringen klemme innspillinger kreves en rigg utstyrt med flere forsterkere, hodet stadier og høykvalitets micromanipulators. I tillegg for best resultat, en rigg utstyrt med et 900 nm IR band pass filter og matchende optisk komponentene anbefales å sikre tilstrekkelig visualisering av celler lokalisert > 50 µm dypt i hjernen skiver. Riktig justering for Kӧhler belysning er også viktig for tydelig visualisering.
- Forberede intracellulær pipette løsning (mM): 130 K-Gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 0,3 EGTA, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP, og 13,4 biocytin. Justere pH til 7.35 med 1 M KOH og osmolality til 285-290 mOsmol/kg med sukrose etter behov.
- Forberede oppdateringen klemme elektroder fra tykke vegger Borosilikatglass kapillærene; ideell oppdateringen klemme elektroden har en relativt kort og butte taper med en ~ 3-6 MOhm fylt tips motstand i badekaret.
- Kontroller at sølv elektrode ledningene er riktig chlorided for å sikre stabil innspillinger. Gjør dette (typisk) av submerging siste 3-4 mm av sølv wire i flytende blekemiddel i ca 30 min eller til wire blir svart.
- Opprette løsning perfusjon bruker en peristaltiske pumpe satt til 3-4 mL/min. sirkulasjon carbogenated innspillingen aCSF gjennom opptak kammeret ta vare for å matche tilsig og utløp for å unngå overflyt.
- Overføre et enkelt hjernen stykke inn i neddykking opptak kammeret og sikre i stedet bruker en U-formet stykke anker med nylon krysse strenger. Identifisere mål hjernen regionen med et 4 X air mål før du bytter til en høyere makt-målsetting (f.ekshøy numeriske blenderåpning 40 X eller 60 X vann nedsenking mål).
- Visuelt Identifiser en sunn Målcelle. Utseendet til nevronale membranen på soma, brukes som visualisert ved IR-DIC mikroskopi, til å vurdere hensiktsmessigheten av en kandidat celle for oppdateringen klemme opptak.
Merk: Sunn neurons vanligvis viser følgende funksjoner: krympet verken hovne somata, myk kontrast av membran kanter og glatt membran utseende. Dessuten, fleste friske celler finnes > 30 µm dypt i sektoren, som overfladisk neurons er trolig bli skadet med kuttet dendrittiske prosesser. Neurons som viser en farget utseende, tydelig kjerner eller "stekt egg" utseende eller veldig mørk eller Høykontrast membran kantene bør unngås. - Tilbake-fyll oppdateringen Pipetter med ~ 5 µL intracellulær løsning og laste den opp elektrodeholderen. Flytt pipette i innspillingen badekaret over hjernen skive og bruke lett positive trykk å fjern eventuelle hindringer i spissen. Null pipette forskyvningen og overvåke tips motstanden funksjonen en membran-test.
- Flytt pipette spissen i kontakt med målet nevrons celle kroppen; en liten smilehull bør form på membran overflaten på grunn av et lett positive trykk.
- Så snart en membran smilehull er observert, raskt fjerne det positivt trykket og bruke skånsom for å lette segl formasjon. Når pipette motstanden øker til > 100 MOhm, slå en holder kommando til et nivå som samsvarer med den forventede hvile membranen potensial for målrettet celle type (-70 mV er et godt utgangspunkt).
- Når tips motstand når ≥1 gigaohm, forsøke å bryte inn i cellen av rupturing membranen under oppdateringen pipette med korte utbrudd av skarpe sugekraft; "zappe"-funksjonen kan benyttes for å lette innbrudd etter behov.
Merk: En holde potensialet i-70 mV er foreslått for spenning klemme eksperimenter på kortikale nevroner. Sunn neurons har en lekkasje gjeldende mer negativ enn-100 pA for varigheten av forsøket, men dette er delvis avhengig av hvilken celle. En Nevron vil bli ekskludert fra analyse hvis hvile membran potensialet var mer depolarized enn-50 mV, eller hvis tilgang motstanden endret av mer enn 20%. -
Når en stabil hele celle oppdateringen klemme innspilling er oppnådd, målrette flere neurons for opptak ved å gjenta trinn 6.6-6.10. Ta vare for å unngå mekaniske forstyrrelser som ville føre til å miste første innspilling.
- Velg flere nerveceller i 100 µm første Nevron å sikre en rimelig sannsynligheten for å finne synaptically-kombinert neurons.
Merk: Det kan være nyttig i noen tilfeller å identifisere flere kandidat neurons foran og å pre-belaste og pre plassere alle Pipetter i nærheten til forskjellige målrettede cellene før de kan opprette første oppdateringen klemme innspillingen.
- Velg flere nerveceller i 100 µm første Nevron å sikre en rimelig sannsynligheten for å finne synaptically-kombinert neurons.
Representative Results
Denne delen gir representant resultater for rutinemessig hjernen stykke forberedelse og patch klemme elektrofysiologi eksperimenter med optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden (dvs., NMDG beskyttende utvinning kombinert med gradvis Na+ Spike innsjekkingsprosedyren). Første, morfologiske bevaring av neurons ble evaluert i ulike hjernen regioner i hjernen skiver forberedt med eller uten implementere den optimaliserte NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode (figur 1). Tre måneden gamle voksen mus ble valgt for disse eksperimentene, og vi brukte IR-DIC mikroskopi for å bestemme Nevron helse basert på figuren og helhetsinntrykket av somata og proksimale dendrites. Merk innskrumpet, pyknotic utseendet på de fleste nerveceller i representant bilder av hjernen skiver forberedt uten den beskyttende gjenopprettingsmetode (alle bildene ble innhentet 1-2 h etter skive forberedelse). Disse kontroll skiver var forberedt NMDG aCSF for transcardial perfusjon og slicing trinnene men gjenvunnet først i høy Na+-som inneholder HEPES aCSF. Derimot viser representant bildene fra sektorene tilberedt med optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden neurons med forbedret morphologies (jevnere, fyldigere, mindre sammenvokste utseende) som er egnet for oppdateringen klemme opptak (figur 1). forbedret neuronal bevaring ble observert over flere hjernen områder inkludert neocortical lag II/III og V, subiculum og dorsal lateral geniculate kjernen (dLGN).
Neste, den optimaliserte NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode ble sammenlignet med den opprinnelige NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode (dvs.uten gradvis Na+ pigg-i prosedyren). Gjennomsnittlig tid for gigaohm tetning formasjonen i oppdateringen klemme opptak forsøk ble dramatisk og betydelig redusert (9,9 s versus 33,3 s, **p < 0.005, parvise t-test) når gradvis Na+ pigg-i prosedyren ble brukt sammen med NMDG beskyttende utvinning trinnet (figur 2). Raskere og mer pålitelig membranen tetting ganger sterkt forbedret gjennomstrømningen av oppdateringen klemme i ung voksen hjernen skiver. Optimal Na+ pigg i planen ble ytterligere endret etter dyr alder (tabell 2) og var gunstig for alle aldre testet (3 uker til 1 år gammel mus). Profilen til gradvis natrium ion konsentrasjon høyde i løpet av spike-i prosedyren tilbys (Figur 3) følge tidsplanen vist i tabell 2.
Som en del av Allen Institute cellen typer programmet (http://celltypes.brain-map.org/) en storskala innsats er underveis til systematisk karakterisere iboende elektrofysiologiske egenskaper for individuelle neurons i ung voksen (postnatal dag 40-80) musen visuelle kortikale hjernen skiver avledet fra transgene linjer med cellen spesifikk fluorescerende markør uttrykk genetisk brukerdefinert neuronal bestander (kortikale lag og celle type spesifikke grobunn driveren linjene krysset til en grobunn-avhengige lysstoffrør reporter linje55). Figur 4 viser eksempel spor avfyring mønstre innspilt fra Parvalbumin (Pvalb)-uttrykke kortikale rask-skyter (FS) interneurons (Pvalb-IRES-grobunn/Ai14 mus) som svar på en rekke 1 s gjeldende injeksjon fremgangsmåten som dekker dynamiske område Nevron avfyring. F-jeg kurve for dataset av 22 kortikale FS interneurons er vist til høyre. Lignende målrettet oppdateringen klemme opptak eksperimenter ble utført for å karakterisere 23 Rorb-uttrykke eksitatoriske nerveceller i lag IV fra Rorb-IRES-grobunn/Ai14 mus (Figur 4). Ulike sunn Nevron typer inkluderer FS interneurons og pyramidale nevroner i kortikale områder og lag kan rutinemessig og pålitelig målrettes for oppdateringen klemme opptak for minst 6-8 h etter skive forberedelse på dette optimalisert protokollen.
I tillegg til å måle iboende neuronal egenskaper, undersøkt synaptic tilkobling mellom flere samtidig opptak neurons definerte typer i visuelle kortikale microcircuits. Flere Nevron oppdateringen klemmen opptak teknikk krevende svært, som mange sunn kandidat nevroner i definerte typer må være tilstede i et relativt lite felt på hjernen sektoren for å sikre en rimelig mulighet for å få høy kvalitet samtidig opptak og identifisere bona fide synaptic tilkoblinger. Figur 5 viser sammenkoblede opptak av to tdTomato + FS interneurons i visuelle cortex av hjernen skiver avledet fra ung voksen Pvalb-IRES-grobunn/Ai14 mus. En sterk enveis hemmende synaptic tilkobling ble oppdaget (registrert med høy chloride interne pipette løsning). Eksempel innspillinger og protokoller for å måle egenskapene til kortsiktige synaptiske plastisitet presenteres. Utbrudd av høyfrekvente tog stimulering (10 pulser hver på 10, 50 og 100 Hz) ble fulgt av enkelt utvinning test pulser på ulike tidsintervaller (1, 2 eller 4 s) til å måle tid selvfølgelig utvinning fra synaptic depresjon.
Utmerket suksess har også blitt innhentet for menneskelig neocortical nerveceller i eldre voksen ex vivo hjernen skiver. Neurosurgical eksemplarer er Hentet fra pasienter som gjennomgår planlagte operasjoner for svulst fjerning lokale sykehus. Prosedyrene for menneskelig neurosurgical vev samling og hjernen stykke forberedelse varierer fra musen hjernen stykke prosedyrer i noen praktiske måter. I korte trekk resected neocortical vev (distale til området av patologi) er samlet inn fra operasjonsstuen og nedsenket i iskalde oksygenrikt NMDG-HEPES aCSF og fraktet med kontinuerlig chilling og oksygenering fra operasjonsstuen til den laboratoriet i 30 minutter eller mindre. Hjernen sektorene er tilberedt med NMDG beskyttende Gjenopprettingsprosedyren og lov til å komme over en lengre periode på ca 3 timer før du starter oppdateringen klemme innspillinger. Figur 6 viser en vellykket sammen eksperiment og en vellykket firemannsrom oppdateringen klemme opptak eksperiment fra menneskelige ex vivo hjernen skiver forberedt på denne måten fra regionen frontal cortex. Sammenkoblede innspillingen viser enveis eksitatoriske synaptic inndata fra en kortikale pyramidale Nevron til en kortikale interneuron (registrert som eksitatoriske postsynaptic strøm). I fire patch eksperimentere to eksitatoriske to hemmende neurons ble innspilt samtidig og tre hemmende synaptic tilkoblinger fant (registrert som hemmende postsynaptic potensialer) ut av tolv totale forbindelser analysert. Dermed lar denne optimalisert hjernen skive metoden pålitelig eksperimentelle suksess i de mest utfordrende av hjernen stykke, inkludert flere Nevron oppdateringen klemme eksperimenter for å studere krets tilkobling i akutt resected moden voksen menneskelige hjerne vev.
Figur 1: Forbedret neuronal bevaring med optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden hjernen stykke forberedelser. Representant IR-DIC bildene ble anskaffet fra mangfoldig hjernen regioner i akutt skiver fra en tre måneder gammel mus. Kontrollere NMDG beskyttende kutte metoden uten et beskyttende utvinning skritt (venstre panel) versus optimalisert NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode (høyre panel). (A) lag V neocortex, (B) Layer II/III neocortex, (C) subiculum og (D) dorsal lateral geniculate kjernen (dLGN). Skala barer i alle paneler er 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Akselerert hastighet og bedre pålitelighet av gigaohm forsegle formasjon i oppdateringen klemme opptak eksperimenter med NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode Na+ pigg innsjekkingsprosedyren. (A) tomt gigaohm segl formasjon tider for NMDG utvinning alene (svart datapunkt, n = 19) versus NMDG utvinning pluss Na+ pigg innsjekkingsprosedyren (rød datapunkt, n = 23). Alle innspilte celler var pyramidale nevroner i layer II/III eller V av hjernebarken. Oppmerksom på maksimal tid er avkortet på 100 s står for celler som aldri dannet gigaohm segl. Koblet t-test, **p < 0.005. (B) tomt hviler membran potensial (rpm) for lag V pyramidale nevroner (oransje datapunkt, n = 10/11), II/III pyramidale nevroner (grønn datapunkt, n = 9/10), eller kortikale Pvalb + FS interneurons (blå datapunkt, n = 23/22). Solid sirkler betegne NMDG frisk tilstand og åpne sirkler NMDG utvinning pluss Na+ pigg innsjekkingsprosedyren. Hvert datapunkt representerer en Nevron og begge mener og +/-SEM vises. Det er ingen betydelige forskjeller i RMPs sammenligne hjernen stykke forberedelse forhold for alle tre celle typer (koblet t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Profil av gradvis natrium ion konsentrasjon høyde i løpet av den spike innsjekkingsprosedyren. (A) Plot pigg i NaCl konsentrasjon versus tid. (B) Plot totale ekstracellulære NaCl konsentrasjon versus tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Indre elektrofysiologiske egenskaper genetisk brukerdefinert kortikale celletyper. (A) eksempel spor av neuronal svar på gjeldende injeksjon trinnene for Pvalb + kortikale FS interneurons (venstre panel). tdTomato + neurons var rettet for opptak i hjernen skiver fra Pvalb-IRES-grobunn/Ai14 mus. Sammendragsdata skyte rate gjeldende injeksjon forhold (F-jeg kurve) er vist til høyre (n = 22). (B) eksempel spor av neuronal svar på gjeldende injeksjon trinnene for Rorb-uttrykke kortikale lag neurons på IV av eksitatoriske (venstre panel). tdTomato + neurons var rettet for opptak i hjernen skiver fra Rorb-IRES-grobunn/Ai14 mus. Sammendragsdata skyte rate gjeldende injeksjon forhold (F-jeg kurve) er vist til høyre (n = 23). Hver tynn fargede linje representerer F-jeg kurven for en enkelt Nevron; mens de tykke svarte streker representerer gjennomsnittet for hver gruppe +/-SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kortsiktige plastisitet i synaptically koblet Pvalb-uttrykke kortikale FS interneurons. (A) differensial forstyrrelser kontrast og epifluorescence ble brukt til å målrette tdTomato-positive, Pvalb-uttrykke FS interneurons av musen primære hjernebarken. En fargekodet skjematisk tilkobling diagrammet viser en ensidig synaptic forbindelse mellom de to interneurons. (B) skjematisk stimulering protokollene som brukes til å vurdere kortsiktige dynamikken i synaptically-tilkoblet neurons. Tog for 10 action potensialer (10, 50 og 100 Hz) er fremkalles i presynaptic Nevron, etterfulgt av et enkelt handling potensial (utvinning Test puls, RTP) leveres med forskjellige tidsforsinkelse (1, 2 og 4 s) etter toget er avsluttet. Hver RTP er fargekodet for klarhet. (C) gjennomsnittlig spor av tilsvarende ensidige hemmende etter synaptic potensialer (uIPSPs) i celle #2 Svar tog for handlingen potensialer fremkalles i celle #1. Grå innfelt har utvidet tidsskalaen for å vise avgrensning av uIPSP tog. (D) Normalized uIPSP amplituder tegnes som en funksjon av sin posisjon i tog på ulike frekvenser. Netto depresjon er klar over alle input priser med en betydelig utvinning av uIPSP på 4 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Multi Nevron oppdateringen klemme opptakene i voksent menneske neurosurgical hjernen skiver. (A) lav og høy forstørrelse IR-DIC bilder som angir plasseringen og identiteten til innspilte neurons (topp panel). En pyramideformet Nevron (svart stjerne) og nærliggende interneuron (rød stjerne) ble spilt inn samtidig. Eksempel fargekodet spor av en enveis eksitatoriske synaptic tilkobling (ESPC) fra pyramideformet celle interneuron (målt som EPSCs i spenning klemme) og tilsvarende fysisk tilkoblingskart (bunnen panel). (B) firemannsrom oppdateringen klemme opptak eksperiment i en voksen neurosurgical hjernen stykke dorsolateral prefrontal cortex. To pyramidale nevroner og to interneurons registreres samtidig, tillater for sekvensiell undersøkelser av tolv mulige synaptic tilkoblinger. Et tog av evoked handling potensialer i celle #3 (grønn spor) førte til oppdagelsen av hemmende etter synaptic potensialer (IPSPs) i hver av de andre tre samtidig opptak nervecellene (tre innrammet regioner, toppen panelene). Svarene innspilt fra hver enkelt Nevron er fargekodet for klarhet. Fysisk tilkobling kartet vises i det nedre panelet. Merk rå spor vises i (B) representerer gjennomsnitt av minst 20 påfølgende rådata feier. Antatte identifikasjon av cellen var basert på soma form, analyse av morfologi av fluorescerende dye fylling under opptak og iboende elektrofysiologiske egenskaper inkludert avfyring mønstre som svar på gjeldende injeksjon trinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| NMDG-HEPES aCSF | HEPES holder aCSF | Registrere aCSF | |||||||
| Komponent | mM | MW | g/Liter | mM | MW | g/Liter | mM | MW | g/Liter |
| NMDG | 92 | 195.22 | 17.96 | ||||||
| HCl | 92 | 36.46 | * | ||||||
| NaCl | 92 | 58.44 | 5.38 | 124 | 58.44 | 7.25 | |||
| KCl | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 | 2.5 | 74.55 | 0,19 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 138.00 | 0,17 | 1.2 | 138.00 | 0,17 | 1.2 | 138.00 | 0,17 |
| NaHCO3 | 30 | 84.01 | 2,52 | 30 | 84.01 | 2,52 | 24 | 84.01 | 2,02 |
| HEPES | 20 | 238.31 | 4,77 | 20 | 238.31 | 4,77 | 5 | 238.31 | 1,19 |
| Glukose | 25 | 180.20 | 4.51 | 25 | 180.20 | 4.51 | 12.5 | 180.20 | 2,25 |
| natrium ascorbate | 5 | 198.00 | 0.99 | 5 | 198.00 | 0.99 | 0 | 198.00 | 0,00 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0,15 | 2 | 76.12 | 0,15 | 0 | 76.12 | 0,00 |
| natrium pyruvate | 3 | 110.04 | 0,33 | 3 | 110.04 | 0,33 | 0 | 110.04 | 0,00 |
| MgSO4.7H2O | 10 | 246.48 | 5 mL | 2 | 246.48 | 1 mL | 2 | 246.48 | 1 mL (2M Stock) |
| CaCl2.2H2O | 0,5 | 147.01 | 0,25 mL | 2 | 147.01 | 1 mL | 2 | 147.01 | 1 mL (2M stock) |
| * sjarmere pH i NMDG-HEPES aCSF 7.3-7,4 bruker konsentrert HCl | |||||||||
| Alle løsninger skal være i området 300-310 mOsm/Kg | |||||||||
Tabell 1: Media formuleringer.
| Dyr alder | |||||
| Tid (min) * | < 1 måned | 1-3 måneder | 3-6 måneder | 6-12 måneder | 12 + måneder |
| 0 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
| 1 | |||||
| 2 | 250 ΜL | ||||
| 3 | |||||
| 4 | 500 ΜL | ||||
| 5 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
| 6 | 1000 ΜL | ||||
| 7 | |||||
| 8 | 2000 ΜL | ||||
| 9 | |||||
| 10 | overføring | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
| 11 | |||||
| 12 | |||||
| 13 | |||||
| 14 | |||||
| 15 | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
| 16 | |||||
| 17 | |||||
| 18 | |||||
| 19 | |||||
| 20 | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | |
| 21 | |||||
| 22 | |||||
| 23 | |||||
| 24 | |||||
| 25 | overføring | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | |
| 26 | |||||
| 27 | |||||
| 28 | |||||
| 29 | |||||
| 30 | overføring | 2000 ΜL | 1000 ΜL | ||
| 31 | |||||
| 32 | |||||
| 33 | |||||
| 34 | |||||
| 35 | overføring | 2000 ΜL | |||
| 36 | |||||
| 37 | |||||
| 38 | |||||
| 39 | |||||
| 40 | overføring | ||||
| * Tid null er øyeblikket skiver overføres i første utvinning kammeret | |||||
Tabell 2: Anbefalt tidsplan for gradvis Na + pigg innsjekkingsprosedyren etter musen alder.
Discussion
Na + Spike i forbedrer Gigaohm Seal dannelse og Patch klemme opptak suksess
Den første versjonen av metoden NMDG beskyttende utvinning var spesielt utviklet for voksne og aldring dyr2,5. Betatestere har også søkt å bruke denne metoden på juvenile dyr hjernen slicing (dvs, mus < 30 dager gamle). Det har imidlertid blitt bemerket at i motsetning til fremragende visuelt bekreftet neuronal bevaring med NMDG beskyttende utvinning metoden i denne aldersgruppen, gigaohm segl formasjon kan ofte stall, fører til mislykkede oppdateringen klemme opptak forsøk. Én hypotese er at NMDG kasjoner er lettere fanget i juvenile hjernen skiver i forhold til voksen hjernen skiver og kan hindre segl formasjon; men gigaohm sel kan lett danne mens juvenile hjernen skiver fullstendig senkes i NMDG aCSF (data ikke vist), således indikerer at NMDG aCSF sådan hindrer ikke gigaohm segl formasjon.
Rask overgang fra lav til høy Na+ løsning det første hjerne stykke utvinning trinnet er ferdig forårsaker skade neuronal membraner og perturbs segl formasjon prosessen. Dette er intuitivt at overgangen fra lav til høy Na+, kulde til varme temperatur og dramatisk høyde av Ca2 + Mg2 + forhold kollektivt føre til en massiv oppblomstringen av spontan synaptic aktivitet. Denne hemmende etterpå fasen i hjernen kutting prosedyren er sannsynligvis speil reperfusion skader etter en iskemiske fornærmelse. Dermed ytterligere redusere neuronal membran skade i første restitusjonsfasen en gradvis Na+ pigg innsjekkingsprosedyren har blitt innlemmet som høyden av Na+ konsentrasjon i NMDG beskyttende utvinning inkubasjon kammeret er sakte og reproduserbar opphøyet med presis timing. Som den opprinnelige beskyttende Gjenopprettingsprosedyren er timelige dissosiasjon Na+ høyde fra temperatur og Ca2 +/Mg2 + forholdet høyde gunstig. Men i tillegg Na+ pigg i fremgangsmåten fører til små inkrementelle økninger i ekstracellulære Na+ konsentrasjon over tidlig tidspunkt og stor økning mot slutten tid poeng, og dermed affording hjernevev en mulighet til bedre til stigende Na+ nivåer. Denne fremgangsmåten er et alternativ til gradvis løsning exchange kontrollert av en perfusjonsmåling pumpen eller gravitasjon dryppe linjer som fører til konstant økning i Na+ nivåer og krever oppmerksomhet til både tilsig og utløp å unngå overløp av skive kammeret. Spesielt i denne Na+ stiger pigg innsjekkingsprosedyren osmolality for løsningen i skive kammeret gradvis over en periode på flere minutter før skiver tilbake til normal osmolality løsning, men dette ikke negativt påvirke helsen skive eller oppdateringen klemme opptak suksess. En høy osmolality kutte løsning har tidligere blitt brukt for mellomhjernen skive forberedelser for å bedre bevare dopamin neurons for oppdateringen klemme opptak57,58, dermed demonstrere at dette midlertidige hyperosmolality kan være gunstig i noen sammenhenger.
Ved å implementere en optimalisert prosedyre kombinere NMDG beskyttende gjenopprettingsmetode og gradvis Na+ er pigg i trinn nytten av denne hjernen skive metoden utvidet for å dekke juvenile gjennom moden voksen dyr aldre. Denne oppdaterte protokollen er nå egnet for en rekke dyr alder bruke en enkelt optimale NMDG aCSF formulering og prosedyre. Eventuelt Na+ pigg i fremgangsmåten kan brukes med en stadig lengre forsinkelse og/eller tregere gang løpet å øke levedyktigheten til hjernen skiver fra eldre dyr, og vi har gitt en grunnleggende veiledning i anbefalte pigg i tidsplaner ifølge dyr alder (se tabell 2). Mens vi gir en grunnleggende rammeverk som er egnet for en rekke applikasjoner, kan avansert forholdsregler utforskes for å ytterligere forbedre levedyktighet og lang levetid på hjernen skiver fra voksne og aldring dyr. For eksempel glutation restaurering strategier er spesielt effektiv i denne henseende og kan implementeres som beskrevet andre steder2,6.
Bedre gjennomstrømming for utfordrende eksperimenter
Analyse av synaptic tilkobling av oppdateringen klemme innspillingen er et krevende program som krever gode bevaring av både neuronal struktur og funksjon for å oppnå en høy pålitelighet av suksess. Som antall nevroner spilles samtidig går lineært, teknisk vanskelighetsgraden går opp supra-lineært. Det er mange feilmodi, og en av de vanligste årsakene til feil er manglende evne til skjemaet tilstrekkelig gigaohm pakninger på ett eller flere av de målrettede cellene. Dette kan dramatisk langsom fremgang, spesielt når tre eller flere neurons må tas opp samtidig. Samsvar med funn av raskere gigaohm forsegle formasjon tid med optimalisert NMDG beskyttende utvinning metoden, var det en markert forbedring i suksessrate og gjennomstrømning multi Nevron oppdateringen klemme opptak eksperimenter med både voksen transgene musen hjernen skiver og voksen neurosurgical hjernen skiver. Forbedret effektiviteten er nesten helt sikkert tilskrives både raskere og pålitelig gigaohm segl dannelse og forbedret neuronal bevaring av skivene med denne protokollen. Selv om denne protokollen fokuserer på fordelene eksplisitt for oppdateringen klemme opptak programmer, er lignende gevinst forventet for andre utfordrende eksperimentelle applikasjoner der hjernen stykke levedyktighet er avgjørende.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Allen Institute for hjernen vitenskap. Forfatterne ønsker å takke Allen Institute grunnleggerne, Paul G. Allen og Jody Allen, for deres visjon, oppmuntring og støtte. Vi takker også Allen Institute kundestøtte for å utføre dyr pleie husbandry og genotyperingteknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
| Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
| Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
| Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
| Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
| Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
| Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
| nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
| Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
| 35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
| Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
| Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
| Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
| Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
| Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
| Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
| Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
| KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
| Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
| Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
| Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
| Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
| Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
| 10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
| 30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
| 1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
| 25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
| Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |
References
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
- Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
- Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
- Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
- Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
- Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
- Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
- Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
- Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
- Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
- Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
- LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
- Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
- Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
- Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
- Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
- McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
- Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
- Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
- Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
- Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
- Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
- Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
- Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
- Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
- Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
- Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
- DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
- Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
- Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
- Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
- Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462 (2015).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
- Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
- Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).
