Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad N-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod

doi: 10.3791/53825 Published: February 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll visar genomförandet av en optimerad N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. En enda media formulering används för att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor från djur i alla åldrar och för olika experimentella tillämpningar.

Abstract

Detta protokoll är en praktisk guide till N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. Många senare studier har validerat nyttan av denna metod för att öka neuronal bevarande och övergripande hjärnan slice livskraft. Genomförandet av denna teknik av tidiga användare har underlättat detaljerade utredningar av hjärnans funktion med hjälp av experimentell applikationsmöjligheter och som spänner över ett brett utbud av djur åldrar, regioner i hjärnan och celltyper. Stegen beskrivs för att utföra den skyddande återhämtning hjärna slice tekniken använder en optimerad NMDG konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) media formulering och förbättrade förfarandet att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor för patch clamp elektrofysiologi. Med detta uppdaterade synsätt, en betydande förbättring observeras i hastigheten och tillförlitligheten hos gigaohm försegla bildandet under riktade patch clamp inspelning experiment bibehållen utmärkt neuronala konservering, därigenom underlätta utmanande experimentella program. Representativa resultat tillhandahålls från flera neuron patch clamp inspelning experiment till assay synaptic anslutning i hjärnbarkens hjärnan skivor tillagad av unga vuxna transgena möss och mogna vuxna människors Neurokirurgiska exemplar. Metoden optimerad NMDG skyddande återhämtning för hjärnan skivning är dessutom kompatibel med både juvenila och vuxna djur, alltså lösa en begränsning av den ursprungliga metoden. Sammanfattningsvis, kan en enda media formulering och hjärnan skivning förfarandet genomföras över olika arter och åldrar att uppnå utmärkta livskraft och vävnad bevarande.

Introduction

Akut hjärnskada slice beredningen är en grundläggande experimentellt modellsystem i neurovetenskap. För ungefär hälften av ett sekel, har denna plattform aktiverad dynamiska funktionella studier av hjärnan levande över en mängd olika anatomiska hjärnregioner och djurarter. Om den avsedda användningen är biokemi, funktionell avbildning, morfologi eller elektrofysiologi, är det av yttersta vikt att säkerställa optimal integritet och lönsamhet av skivad vävnad. Det är anledningen till att mycket flexibel juvenil gnagare hjärnan slice beredning (dvs.yngre än postnatal dag 30 för möss) har varit de mest föredragna hittills. Svårigheten att erhålla tillräckligt frisk hjärna skivor från mogna vuxna och åldrande djur har visat sig vara en stor utmaning för de flesta och har infört stränga begränsningar för att studera hjärnans mogna funktionella arkitektur. Detta är särskilt sant för patch clamp inspelning, en teknik som kräver utmärkta morfologiska och funktionella bevarande och är oumbärlig för att karaktärisera detaljerade inneboende och synaptic egenskaper av identifierade enda nervceller. För de senaste decennierna, den stora majoriteten av patch clamp Elektrofysiologer har förlitat sig på en ”skyddande skära' metod där sackaros-substituerade låg Na+ aCSF1 för att förbereda friska hjärnan skivor från juvenil, och i långt mindre utsträckning, unga vuxna djur. Denna metod bygger på förutsättningen att passiv Na+ tillströmning och efterföljande vatten inresa och cell svullnad under slice styckning steg är den dominerande förolämpning som leder till dålig överlevnad av nervceller, särskilt för de nervcellerna som ligger i den ytliga lager som är mest sannolikt att upprätthålla direkt trauma från bladet rörelsen. Men lämnar metoden skyddande skärande fortfarande mycket att önska för hjärnan slice förberedelse från mogna vuxna djur oavsett särskilt aCSF utformningen genomförs.

En enkel men effektiv lösning på problemet har varit beskrivs2,3,4,5,6 och kallas metoden 'skyddande återhämtning' hjärna slice. Den ursprungliga versionen av denna metod använder en NMDG-substituerade aCSF, som NMDG identifierades som den mest mångsidiga och effektiva bland olika andra kandidat natrium ion substitut (inklusive sackaros, glycerol, kolin och Tris). Media formuleringen var ytterligare förbättras genom tillägg av HEPES att motstå hjärnan slice ödem och ge starkare pH buffert7, samt tillägg av tillskott för att motverka de skadliga effekterna av oxidativ stress (tabell 1). Det bestämdes empiriskt att en inledande återhämtning inkubation steg i låg Na+, låg Ca2 +, och hög Mg2 + NMDG aCSF omedelbart efter vuxna hjärnan vävnad skivning var både nödvändig och tillräcklig för bättre neuronala bevarande över ett brett spektrum av områden i hjärnan, celltyper och djur åldrar3,5,6.

Särskilt, kan tidigare inkarnationer av vad nu dubbas de skyddande återställningsmetoden hittas i litteraturen1,8,9,10,11,12, 13, även om den fulla potentialen för mogen vuxen och åldrande djur hjärnan skiva och patch clamp inspelning var inte erkännas eller visat i dessa tidigare arbeten. Dessutom fortsätta nyanserad procedurmässiga variationer växa fram för att stödja specifik experimentella program4,14,15,16. Kollektiva kroppen av arbete av dessa många forskargrupper förmedlar högt förtroende i robustheten i de skyddande återställningsmetoden för förbättrad vävnad bevarande. Metoden NMDG skyddande återhämtning har nu allmänt antagits och genomförts i många publicerade studier utnyttjar vuxna djur hjärnan slice preparat. Dessa akuta slice studier span hjärnbarkens3,17,18, Hippocampus15,19,20,21, striatum22 , 23 , 24, mellanhjärnan25,26,27,28,29och hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioner, och en mängd signalsubstans och neuromodulator typer inklusive glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminerga24,29,37,38, kolinerga14,37,38, 39, noradrenerga40och serotonerga27,28 neurotransmission. Metoden lämpar sig också väl för optogenetic kontroll av neuronal aktivitet i skivor som härrör från transgena djur3,39 eller efter i vivo viral injektioner17,27, 28,40,41,42,43, som väl så funktionell Ca2 + avbildning av neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser av både kortsiktiga plasticitet4,47,48 och varierande formerna av långsiktiga plasticitet16,35,48 har varit rapporterade. En nyligen genomförd studie tillämpas metoden NMDG skyddande återhämtning för att underlätta omfattande och systematisk sondering av synaptic anslutning i syncentrum i mogen vuxen mus hjärnan skivor med hjälp av den octopatch inspelning konfiguration49 — en kraftfull demonstration av verktyget och robusthet av denna metod. Den skyddande återställningsmetoden har även tillämpats i tidigare oförutsedda experimentella sammanhang, såsom, förbättrad bevarandet av kärlsystemet och pericyter i vuxna kortikala hjärnan skivor50, patch clamp inspelning från transplanterade interneuron populationer i 1-1,5 år gammal Alzheimers sjukdom mus modeller20och en vuxen hjärna slice receptor människohandel assay51.

Följande protokoll beskriver stegvisa procedurer för att genomföra en optimerad NMDG skyddande återställningsmetod hjärnan slice förberedelser att förbättra lönsamheten för akut hjärnskada skivor. Principerna för förbättrad neuronala bevarande diskuteras, samt demonstration av de tydliga fördelarna med denna metod för komplexa multi neuron patch clamp inspelning experiment i både unga vuxna transgena möss hjärnan skivor och mogna vuxna Neurokirurgiska människohjärnan skivor. Följande protokoll har validerats för möss från 21 dagar gamla till mer än ett år gamla, samt när det gäller mänskliga Neurokirurgiska prover från vuxna patienter.

Protocol

Förfaranden som inbegriper transgena möss har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Allen Institute for Brain Science. Både manliga och kvinnliga C57BL/6 möss (viktintervall 10-30 g) användes i dessa experiment. Några av de representativa resultat beskriver data samlas in från levande mänskliga hjärnan skivor. Hjärnbarkens vävnadsprover erhölls under neurosurgeries för borttagning av tumören. Det var nödvändigt att ta bort den överliggande hjärnbarkens vävnaden för att få tillgång till den sjuka vävnaden. Patientens informerade samtycke erhölls i alla fall för användning av Neurokirurgiska vävnad för forskningsändamål enligt ett protokoll som godkänts av den institutionella Granskningsnämnden för Swedish Medical Center.

1. beredning av Media och reagenser (tabell 1)

Obs: Lösningar bör göras i renat vatten som är fritt från spårmetaller och andra orenheter. Det rekommenderas att lösningar göras färsk på dagen för experimentet, även om oanvända lösningar kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka, om så önskas. 1 L av varje formulering ovan räcker för 1 – 2 skivning förfaranden. Alla aCSF lösningar måste vara mättad med carbogen (95% O2/5% CO2) före användning för att säkerställa stabila pH buffert och adekvat syresättning. PH-värdet i alla lösningar bör anpassas till 7,3-7,4 och osmolalitet mätt och justeras till 300-310 mOsmol/kg.

  1. Förbereda NMDG-HEPES aCSF (i mM): 92 NMDG, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 2 tiourea, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O och 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3 –7.4 med 17 mL +/-0,5 mL 5 M saltsyra.
    Obs: Detta titrering steg bör helst utföras före tillsats av divalenta katjoner att undvika utfällning; nederbörden kan dock återföras vid justering av pH till fysiologiska intervallet.
  2. Förbereda HEPES holding aCSF (i mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 2 tiourea, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvat och 2 CaCl2·2H2O 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3 – 7,4 med flera droppar koncentrerad 10 N NaOH.
  3. Förbereda inspelning aCSF (i mM): 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukos, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O och 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3-7.4 med några droppar koncentrerad 10 N NaOH.
  4. Förbereda Na+ spike-in-lösning (2 M): 580 mg NaCl löses i 5 mL av nylagade NMDG-HEPES aCSF. Detta är tillräckligt lösning för en hjärna slice prep.
  5. Förbered 2% agaros som ska användas för inbäddning av vävnad. Lös upp 2 g av agaros typ 1B (se Tabell för material) i 100 mL 1 x PBS och mikrovågsugn tills bara kokande. Snurra för att blanda, därefter Häll blandningen i en steril 10 cm petriskålar och låt stelna. Lagra agaros plattan i en förseglad plastpåse vid 4 ° C fram till användning.
  6. Förbereda injicerbart anestetikum arbetar stamlösning. Blanda 2,5 g 2,2,2-Tribromoethanol med 5 mL 2-metyl-2-butanol och lös sedan gradvis i 200 mL PBS, pH 7,0 – 7,3. Filtrera stamlösning med 0,22 µm filter före användning och förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus.
    Obs: Kontakta respektive användning av djur kommittén riktlinjer och regler för att bestämma förfallodatum och bortskaffande förfarandet för det bedövningsmedel som arbetar stamlösning.

2. inställning av skivning Station

  1. Ställa in skivning stationen med slicer mjukpappersmaskinen och kirurgiska instrument (se Tabell för material). Att kalibrera slicer maskinen, bifoga en zirkonium keramiska injektor blad till blad armen med snabb-självhäftande lim, sedan infoga preparathållaren och justera den ledande kanten på bladet till preparatet innehavaren rim lämnar en liten lucka för att se till bladet inte skrapar metallen.
    Obs: Om bladet kanten inte är fysiskt skadat det kan återanvändas för många veckor eller månader utan ersättning. Olika vävnad slicer modeller är kommersiellt tillgängliga, av vilka många kan ge utmärkt prestanda när optimalt kalibrerade. Det ideala instrumentet bör ha minimal z-axeln böjning, antingen direkt mätt och trimmad eller empiriskt observerat.
  2. Ställa in en 250 mL bägare fylld med 200 mL NMDG-HEPES aCSF och före chill på is med konstant carbogenation (tillämpas via en gas diffusor sten nedsänkt i media) för > 10 min.
    Obs: Denna lösning kommer att användas för transcardial perfusion och för att fylla reservoaren skivning maskin vid snittning.
  3. Ställ in inledande hjärnan slice återhämtning kammare fylld med 150 mL NMDG-HEPES aCSF (upprätthålla konstant carbogenation) och placera kammaren i uppvärmda vattenbad hålls 32 – 34 ° C.
    Obs: En slice kammare efter design av Edwards och Konnerth (1992)52 rekommenderas för det här steget. Dessa kammare kan göras med lätt tillgängliga laboratorium objekt (250 mL-bägare, nylon mesh-nät, 50 mL koniska tube, 35 mm plast rund maträtt). Var noga med att säkerställa att segmentet nettning återstår gratis luft bubblor, särskilt sådana som produceras kontinuerligt av carbogen gas bubbla stenarna som dessa kan orsaka skivor att flyta upp och bli skadade. Nettning bör vara nedsänkt ungefär 1 cm under vätskeytan.
  4. Ställa in ett hjärnan segment håller kammaren. en design med flera oberoende brunnar i en större behållare rekommenderas (se Tabell för material). Fyll behållaren med 450 mL av HEPES aCSF och varm rumstemperatur under konstant carbogenation fram till användning.
    Obs: Hjärnan skivor kommer att överföras från inledande återhämtning kammaren till kammaren för långsiktig lagring innan elektrofysiologiska inspelning. Var noga med att säkerställa att de slice nettning är fri från luftbubblor alltid.
  5. Förbereda smält agarosgelelektrofores för inbäddning av vävnad. Använd den öppna änden av en 50 mL konisk injektionsflaska som en cookie cutter för att skära ut ett block med 2% agaros från tidigare beredda skålen. Löst mössa koniska injektionsflaskan, då mikrovågsugn för 10 – 30 s tills Agarens bara smält. Inte överhettas.
  6. Häll den smälta agarosen i 1,5 mL rör. Upprätthålla Agarens i smält tillstånd att använda en thermomixer inställd på 42 ° C med kraftig skakning. Se noga till att smält Agarens inte stelna förtidigt.
  7. Placera tillbehöret kylning block för utsnittet på is svalna före vid denna tid.

3. Transcardial Perfusion

Obs: Transcardial perfusion förfarandet är ett viktigt steg när du arbetar med vuxna djur och är viktigt att uppnå snabb kylning av hjärnan och långsammare metabolism via hjärnan infusion av låg Na+, låg Ca2 +/ hög Mg2 + aCSF lösning. Transcardial perfusionen tjänar också till att rensa röda blodkroppar från hjärnan kärlsystemet, vilket minskar autofluorescens som kan störa visualisering och inriktning av fluorescently märkt cellpopulationer i transgena linjerna. Det är inte tillrådligt att utelämna transcardial perfusion.

  1. Djupt söva möss av intraperitoneal injektion av bedövningsmedel arbetande stamlösning (250 mg / kg: 0,2 mL 1,25% bedövningsmedel arbetar stamlösning per 10 g kroppsvikt, se Tabell för material). Efter ~ 2 – 3 min, verifierar tillräckligt djup anestesi genom att bedöma tå nypa reflex. Om så krävs, injicera en ytterligare volym av bedövningsmedel fungerande lager och ompröva tå nypa reflex efter en annan 2-3 min.
  2. Fyll en 30 mL spruta med 25 mL av carbogenated NMDG-HEPES aCSF från pre kylda 250 mL bägaren (2 – 4 ° C är optimalt, i motsats till slaskiga eller fryst lösning). Bifoga en 25 5/8 gauge nål.
  3. Med musen på ryggen, fästa ned framtassarna och hind tassar för stabilitet. En 15 cm glas petriskål fylld med härdad silikon fungerar väl som bas.
  4. Med en skalpell, göra en laterala snitt öppna brösthålan på nivån av membranet. Använd fina sax för att klippa genom bröstkorgen på antingen sida ta hand att undvika klippning hjärta och lungor.
  5. Fästa tillbaka mitt del av bröstkorgen att exponera hjärtat. Stick in nålen i 30 mL sprutan i vänster kammare och skär höger förmak med fina sax att låta blod att avsluta hjärtat.
  6. Tryck in sprutkolven använder manuell konstant tryck och BEGJUTA djuret med den kylda NMDG-HEPES aCSF med en hastighet på ~ 10 mL/min.
    Obs: Om perfusionen lyckas kan levern kommer att förändras i färg från djupröd till svagt gul och i vissa fall klara vätskor kan observeras spännande näsborrarna mot slutet av förfarandet.

4. hjärnan dissektion och skivning

  1. Halshugga djuret. Använd en skalpell för att öppna huden på huvudet och exponera kalott.
  2. Använd Super finskuren sax att klippa bort huden över kalott och göra små snitt sido på vardera sidan på den kaudala/ventrala basen av skallen. Göra ytterligare grunt nedskärningar börjar vid den kaudala/dorsala aspekten av skallen i rostralt riktning upp dorsala mittlinjen utan för att skada underliggande hjärnan. Göra en slutlig 'T' skära vinkelrätt till mittlinjen på nivån av luktsinnet lökar.
    Obs: Var noga att se till att ingen skada sker till hjärnan regionerna av intresse. I synnerhet inte vid något tillfälle bör det finnas någon tryckkraft som tillämpas på hjärnan själv.
  3. Använda runda-tip tången och förstå skallen börjar vid den rostralt-mediala aspekten som du kan skala tillbaka mot den caudal-lateral riktningen. Upprepa för båda sidor att spricka öppna och ta bort de dorsala halvorna av skalle locket att exponera hjärnan. Gröp försiktigt ur intakt hjärnan i bägaren av pre kylda NMDG-HEPES aCSF. Låt hjärnan svalna jämnt för ~ 1 min.
  4. Använd stora spateln för att lyfta hjärnan ur bägaren och på petriskål täckt med filterpapper. Trim och blockera hjärnan enligt rekommenderad vinkel skivning och önskas hjärnregionen sevärdheter. Arbeta snabbt för att undvika långvarig syrebrist under hantering.
    Obs: Många skivning vinklarna är möjligt. Den exakta blockerande metod och skivning vinkeln beror på den exakta hjärnregionen celltyp och krets att studeras.
  5. Anbringa hjärnan blocket att preparathållaren använda klister. Dra tillbaka den inre bit av preparathållaren nog att dra tillbaka hjärnan blocket helt inuti. Häll den smälta agarosen direkt i hållaren tills hjärnan blocket är helt täckt av agaros. Klämma den nedkylda tillbehör kylning block runt preparathållaren för ~ 10 s tills agarosen stelnat.
  6. Sätt in preparathållaren i kärlet på utsnittet maskinen och kontrollera korrekt anpassning. Fyll behållaren med kvarvarande pre kylda, syresatt NMDG-HEPES aCSF från 250 mL bägaren och flytta en bubbla sten i behållaren för varaktigheten av skivning för att säkerställa adekvat syresättning.
  7. Justera Mikrometern börja avancera agaros-embedded hjärnan preparatet. Starta utsnittet och empiriskt justera advance hastighet och svängningen frekvens till önskad nivå.
    Obs: Båda inställningarna bör vara i det lägre intervallet. För bästa resultat passera en enda av bladet armen bör ta cirka 20 s och svängningen bör producera mycket smidig och skonsam brummande med ingen overt surrande.
  8. Fortsätta framåt och skivning vävnaden i steg om 300 µm (eller annan önskad tjocklek) tills hjärnregionen sevärdheter är fullt sektioneras; den totala tiden för skivning förfarandet bör vara mindre än 15 min.

5. optimerad NMDG skyddande indrivningsförfarandet

  1. NMDG återhämtning initsteget (kritiska steg): efter avslutad snittningen förfarandet, samla upp alla skivor med hjälp av en cut-off plast Pasteur röret t och överföra dem till en pre värmde (34 ° C) inledande återhämtning kammare fylld med 150 mL NMDG-HEPES aCSF. Överföra alla skivor i kort följd och starta en timer så snart alla skivor flyttas in i recovery-kammaren.
  2. Se tabell 2 för att fastställa optimala Na+ spike-i schemat enligt mus ålder.
    Obs: Detta förfarande är en praktisk metod för att uppnå en kontrollerad återinförandet av Na+ in i hjärnan slice kammaren och är optimerad för en specifik hjärnan slice kammare geometri och reservoar volym och typ (se Tabell för material).
  3. Utföra stegvis Na+ spike-i förfarandet genom att lägga till de angivna volymerna av Na+ -spike-in-lösning på den angivna tider. Lägg till Na+ spike-i lösningen direkt i bubbelflaskan skorstenen av inledande återhämtning kammaren att underlätta snabba blandning.
  4. Överföra alla skivor till HEPES aCSF långsiktiga innehav kammaren hålls vid rumstemperatur. Tillåta skivor att återvinna för en ytterligare 1 h i den HEPES håller kammaren innan patch clamp inspelning experiment.

6. Patch Clamp inspelning

Obs: Följande grundläggande procedurer endast ge några praktiska överväganden och är inte avsedda att representera detaljerade protokoll för patch-clamp inspelningar, eftersom dessa kan hittas någon annanstans53,54. En patch clamp elektrofysiologi rigg krävs för denna ansökan. Detta kommer vanligtvis att bestå av ett upprätt Mikroskop utrustad med infraröd differentiell störningar kontrast (IR-DIC) optik och ett fluorescens belysning system, en patch clamp förstärkare och data digitizer, motoriserade micromanipulator och Mikroskop plattform, vibrationer isolering tabell, Faradays bur och lösning värme och perfusion system. Den provkammare och plattformen bör utformas för nedsänkt skiva inspelning. För flera neuron patch clamp inspelningar krävs en rigg utrustad med flera förstärkare, huvudet stadier och hög kvalitet micromanipulators. Dessutom, för bästa resultat, en rigg utrustad med ett 900 nm IR band pass filter och matchande optiska komponenter rekommenderas att säkerställa adekvat visualisering av celler ligger > 50 µm djupt i hjärnan skivor. Korrekt anpassning för Kӧhler belysning är också viktigt för tydlig visualisering.

  1. Förbereda intracellulära pipett lösning (i mM): 130 K-glukonat, 4 10 HEPES, 0.3 EGTA, KCl, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0.3 Na2-GTP, och 13,4 biocytin. Justera pH till 7,35 med 1 M KOH och osmolalitet till 285 – 290 mOsmol/kg använder sackaros som behövs.
  2. Förbereda patch clamp elektroder från tjockväggiga borosilikatglas kapillärer; den idealiska patch clamp elektroden har en relativt korta och knubbiga Kona med en ~ 3 – 6 MOhm fylld tip motstånd i badet.
  3. Säkerställa att silverelektroden kablarna är ordentligt chlorided för att säkerställa stabila inspelningar. Göra detta (typisk) genom att dränka sist 3-4 mm av silver tråd i flytande blekmedel i ca 30 min eller tills tråden blir svart.
  4. Upprätta lösning perfusion med en peristaltiska pumpen inställt på 3 – 4 mL/min. Circulate carbogenated inspelning aCSF genom inspelning kammaren ta hand för att matcha inflöde och utflöde för att undvika spill.
  5. Överföra en enda hjärnan skiva in i kammaren med nedsänkning i inspelning och säkra på plats med en U-formad skiva ankare med nylon cross strängar. Identifiera mål hjärnregionen med ett 4 X air mål innan du byter till en högre makt mål (t.ex., hög numeriska bländaröppningen 40 X eller 60 X vatten nedsänkning mål).
  6. Visuellt identifiera en hälsosam målcellen. Utseendet på den neuronala membranen på soma, används som visualiseras med hjälp av IR-DIC mikroskopi, för att bedöma lämpligheten hos en kandidat cell för patch clamp inspelning.
    Obs: Friska nervceller normalt uppvisar följande funktioner: varken krympta eller svullna somata, mjuk kontrast av membran kanter och släta membran utseende. Dessutom majoriteten av friska celler finns > 30 µm djupt i segmentet, som ytliga nervceller kan skadas med avhuggna dendritiska processer. Nervceller som uppvisar ett plisserat utseende, klart synliga kärnor eller 'stekt ägg' utseende eller mycket mörka eller hög kontrast membran kanter bör undvikas.
  7. Back-fylla plåstret pipett med ~ 5 µL av intracellulära lösning och lasta det på elektrodhållare. Flyttar pipetten till inspelning badet ovan hjärnan slice och applicera lätt positiv tryck att rensa några hinder i spetsen. Noll pipett offset och övervaka tip motståndet med en membran test funktionen.
  8. Flytta pipettspetsen i kontakt med målet neuron's cell kropp; en liten grop bör bilda på membran ytan på grund av lätt positivt tryck.
  9. Så snart en membran dimple observeras, snabbt ta bort realiteten pressar och tillämpa skonsam sugkraft för att underlätta förseglar bildandet. När pipetten motståndet ökar till > 100 MOhm, aktiverar en anläggning-kommando till en nivå som motsvarar den förvänta vilande membranet potential för den rikta celltypen (-70 mV är en bra utgångspunkt).
  10. När tip motståndet når ≥1 gigaohm, försök bryta in i cellen genom att sprängas sönder membranet under patch pipetten med korta anfall av kraftig sug; funktionen 'zap' kan utnyttjas för att underlätta inkörning som behövs.
    Obs: En anläggning potential -70 mV föreslås för spänningen klämman experiment på kortikala neuroner. Friska nervceller kommer att ha en läcka nuvarande ingen mer negativ än-100 pA för varaktigheten av experimentet, men detta är delvis beroende på celltyp. En neuron skulle uteslutas från analys om vilande membranpotentialen var mer Aricebo än -50 mV, eller om tillgång motståndet ändras med mer än 20%.
  11. När en stabil hela-cell patch clamp inspelning erhålls, rikta ytterligare neuroner för inspelning genom att upprepa steg 6,6 – 6.10. Var noga med för att undvika mekaniska störningar som skulle resultera i att förlora den första inspelningen.
    1. Välj ytterligare nervceller inom 100 µm första neuron att säkerställa en rimlig sannolikhet för att hitta synaptically-kopplade nervceller.
      Obs: Det kan vara bra i vissa fall att identifiera flera kandidat nervceller i framsätet och att pre-load och vald position alla pipetter i närheten till olika riktade celler innan den första patch clamp inspelningen.

Representative Results

Detta avsnitt ger representativa resultat för rutinmässig hjärnan slice förberedelse och patch clamp elektrofysiologi experiment med optimerad NMDG skyddande återvinning metoden (dvs, det NMDG skyddande återhämtning i kombination med gradvis Na+ Spike-i förfarandet). Första, morfologiska bevarandet av nervceller utvärderades i olika hjärnregioner av hjärnan skivor beredd med eller utan användning av optimerad NMDG skyddande återvinning metoden (figur 1). Tre månad gammal vuxna möss valdes för dessa experiment och vi används IR-DIC mikroskopi för att bestämma neuron hälsa baserat på form och övergripande utseende av somata och proximala dendriter. Observera skrumpna, pyknotiska utseendet på de flesta nervceller i de representativa bilderna av hjärnan skivor beredd utan den skyddande återställningsmetod (alla bilder erhölls 1 – 2 h efter slice förberedelse). Dessa kontroll skivor var förberedda med NMDG aCSF för transcardial perfusion och skivning steg men återfanns initialt i hög Na+-innehållande HEPES aCSF. Däremot avslöja de representativa bilderna från skivor tillagas med den optimerade NMDG skyddande återställningsmetoden nervceller med förbättrad morfologier (mjukare, fylligare, mindre plisserade utseende) som är lämpliga för patch-clamp inspelning (figur 1). förbättrad neuronala bevarandet observerades över flera regioner i hjärnan inklusive hjärnbarkens lager II/III och V, subiculum och dorsala laterala geniculate kärnan (dLGN).

Nästa, optimerad NMDG skyddande återvinning metoden jämfördes med den ursprungliga NMDG skyddande återvinning metoden (dvs.utan spike-i förfarandet gradvis Na+ ). Den genomsnittliga tiden för gigaohm förseglar bildandet i patch clamp inspelning försök sänktes dramatiskt och betydligt (9,9 s jämfört med 33,3 s, **p < 0,005, Parade t-test) när gradvis Na+ spike-i förfarandet tillämpades tillsammans med NMDG skyddande återhämtning steg (figur 2). Snabbare och mer tillförlitlig membranet tätning gånger kraftigt förbättrad genomströmning av patch clamp inspelning i unga vuxna hjärnan skivor. Optimal Na+ spike-i schemat ändrades ytterligare enligt djurens ålder (tabell 2) och var fördelaktigt för alla åldrar testade (3 veckor till 1 år gamla möss). Profilen för gradvis natrium ion koncentration höjd under hela förfarandet spike-i tillhandahålls (figur 3) för att följa scheman visas i tabell 2.

Som en del av Allen Institute Cell typer programmet (http://celltypes.brain-map.org/) en storskalig insats pågår att systematiskt karaktärisera de inneboende elektrofysiologiska egenskaperna av enskilda nervceller i ung vuxen (postnatal dag 40-80) mus visuella kortikala hjärnan skivor härrör från transgena linjerna med cell typspecifika fluorescerande markör uttryck i genetiskt definierade neuronala populationer (kortikala skikt och celltyp specifika Cre driver linjerna korsas till en Cre-beroende fluorescerande reporter linje55). Figur 4 visar exempel spår av bränning mönster inspelade från Parvalbumin (Pvalb)-att uttrycka kortikala snabb-tillsatta (FS) interneuroner (Pvalb-IRES-Cre/Ai14 möss) som svar på en rad 1 s nuvarande injektion steg som täcker det dynamiska omfånget av neuron bränning. F-jag kurvan för en datamängd av 22 kortikala FS interneuroner visas till höger. Liknande riktade patch clamp inspelning experiment utfördes för att karakterisera 23 Rorb-uttryckande excitatoriska nervceller i lager IV från Rorb-IRES-Cre/Ai14 möss (figur 4). Skiftande friska neuron typer inklusive FS interneuronen och pyramidal nervceller i kortikala regioner och lager kan rutinmässigt och tillförlitligt riktas för patch-clamp inspelning för minst 6-8 h efter slice Tillredning via detta optimerade protokoll.

Förutom att mäta inneboende neuronala egenskaper, var synaptic anslutning utforskad mellan flera samtidigt inspelade nervceller av definierade typer i visuella kortikala mikrokretsar. Flera neuron patch klämman inspelning teknik exceptionellt krävande, så många friska kandidat nervceller av definierade typer måste finnas inom ett relativt litet område av hjärnan slice för att säkerställa en rimlig chans att få hög kvalitet samtidiga inspelningar och identifiera bona fide synapsförbindelser. Figur 5 visar Parade inspelning av två tdTomato + FS interneuroner i syncentrum i hjärnan skivor härrör från unga vuxna Pvalb-IRES-Cre/Ai14 möss. En stark enkelriktad hämmande synaptisk anslutning upptäcktes (inspelad med hög inre pipett natriumkloridlösning). Här presenteras exempel inspelningar och protokoll för mätning av egenskaperna för kortsiktiga synaptisk plasticitet. Anfall av högfrekventa tåg stimulering (10 pulser varje på 10, 50 och 100 Hz) följdes av enda recovery test pulser med olika intervall (1, 2 eller 4 s) att mäta tidsförloppet för återhämtning från synaptic depression.

Utmärkt framgång har också erhållits för mänskliga hjärnbarkens nervceller i mogen vuxen ex vivo brain skivor. Neurokirurgiska exemplar erhålls från patienter som genomgår planerade operationer för borttagning av tumören på lokala sjukhus. Förfarandena för mänsklig Neurokirurgiska vävnad samling och hjärnan slice förberedelse skiljer sig från mus hjärnan slice förfarandena i några praktiska sätt. I korthet den opererande hjärnbarkens vävnaden (distala till platsen för patologi) samlas in från operationssalen och nedsänkt i iskall syresatt NMDG-HEPES aCSF och transporteras med kontinuerlig kylning och syresättning från operationssalen till den laboratoriet inom 30 minuter eller mindre. Hjärnan skivor är tillagade NMDG skyddande indrivningsförfarandet och tillåtna att återhämta sig under en längre tid av cirka 3 h innan patch clamp inspelningar. Figur 6 visar en framgångsrik ihopkopplade inspelning experiment och en framgångsrik Fyrbäddsrum patch clamp inspelning experiment från mänskliga ex vivo brain skivor beredd på detta sätt från regionen frontala cortex. Parade inspelningen visar enkelriktad excitatoriska synaptic input från en kortikala pyramidala neuron på en kortikal interneuron (inspelad som excitatoriska postsynaptiska strömmar). I quad patch experimentera två excitatoriska två hämmande nervceller spelades samtidigt och tre hämmande synapsförbindelser upptäcktes (inspelad som hämmande postsynaptiska potentialer) av tolv anslutningar totalt utforskad. Således gör denna optimerat hjärnan slice metoden tillförlitlig experimentella framgång i de mest utmanande av hjärnan slice applikationer, inklusive flera neuron patch clamp experiment för att studera krets connectivity i akut opererande mogen vuxen mänskliga hjärnan vävnad.

Figure 1
Figur 1: Förbättrades neuronala bevarande med optimerad NMDG skyddande återhämtning framställningsmetoden hjärnan slice. Representant IR-DIC bilder förvärvades från olika hjärnregioner i akut skivor från en tre månader gammal mus. Styra NMDG skyddande skärande metod utan ett skyddande återhämtning steg (vänster paneler) kontra optimerad NMDG skyddande återställningsmetod (rätt panelerna). (A) lager V i neocortex, (B) Layer II/III neocortex, (C) subiculum och (D) dorsala laterala geniculate kärnan (dLGN). Skala barer i alla paneler är 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Accelerated speed och förbättrad tillförlitlighet av gigaohm förseglar bildandet i patch clamp inspelning experiment med NMDG skyddande återvinning metod med Na+ spike-i förfarandet. (A) tomt på gigaohm förseglar bildandet gånger för NMDG återhämtning ensam (svart datapunkter, n = 19) jämfört med NMDG recovery plus Na+ spike-i förfarandet (röda datapunkter, n = 23). Alla inspelade celler var pyramidal neuroner i skiktet II/III eller V i syncentrum. Observera att den längsta tiden är maximerad till 100 s för celler som aldrig bildas gigaohm tätningar. Parat t-test, **p < 0,005. (B) handlingen i vila membranpotential (RMP) för lager V pyramidal nervceller (orange datapunkter, n = 10/11), II/III pyramidal nervceller (grön datapunkter, n = 9/10), eller kortikal Pvalb + FS interneuroner (blå datapunkter, n = 23/22). Heldragna cirklar betecknar NMDG återhämtning skick och öppna cirklar NMDG recovery plus Na+ spike-i förfarandet. Varje datapunkt representerar en neuron och båda medelvärdet och +/-SEM visas. Det finns inga signifikanta skillnader i RMPs jämföra hjärnan slice förberedelse villkor för alla tre cell typer (parat t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Profil av gradvis natrium ion koncentration förhöjning under hela förfarandet spike-i. (A) tomt spike-i NaCl koncentrationen mot tiden. (B) tomt totala extracellulära NaCl koncentrationen mot tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Inneboende elektrofysiologiska egenskaper genetiskt definierade kortikala celltyper. (A) exempel spår av neuronala bränning svar på nuvarande injektion steg för Pvalb + kortikala FS interneuroner (till vänster). tdTomato + nervceller blev måltavla för inspelningar i hjärnan skivor från Pvalb-IRES-Cre/Ai14 möss. Sammanfattningsdata för bränning kurs-nuvarande injektion relation (F-jag kurva) visas till höger (n = 22). (B) exempel spår av neuronala bränning svar på nuvarande injektion steg för Rorb-uttryckande kortikala skikt IV excitatoriska nervceller (till vänster). tdTomato + nervceller blev måltavla för inspelningar i hjärnan skivor från Rorb-IRES-Cre/Ai14 möss. Sammanfattningsdata för bränning kurs-nuvarande injektion relation (F-jag kurva) visas till höger (n = 23). Varje tunna färgade linjen representerar F-jag kurvan för en enda neuron; medan, de tjocka svarta linjerna representerar genomsnittet för varje grupp +/-SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kortfristiga plasticitet i synaptically anslutna Pvalb-uttryckande kortikala FS interneuroner. (A) Differential störningar kontrast och epifluorescence användes för att rikta tdTomato-positiv, Pvalb-uttryckande FS interneuroner av mus primära syncentrum. En färgkodade Schematisk anslutning diagrammet visar en ensidig synaptic anslutning mellan de två interneuroner. (B) Schematisk bild av protokollen stimulering som används för att bedöma kortsiktiga dynamiken i synaptically-anslutna nervceller. Tåg av 10 handlingspänningar (10, 50 och 100 Hz) är framkallat i den presynaptiska neuron, följt av en enda potentiell handling (Recovery Test puls, RTP) levereras med olika tidsfördröjning (1, 2 och 4 s) efter tåget upphört. Varje RTP är färgkodade för tydlighet. (C) genomsnittliga spår av motsvarande ensidiga hämmande efter synaptic potentialer (uIPSPs) i cell #2 svar på tåg av handlingspänningar framkallat i cell #1. Grå infälld expanderat tidsskalan för att Visa avgränsning av uIPSP tåg. (D) Normalized uIPSP amplituder ritas som en funktion av deras position under tåg vid olika frekvenser. Netto depression är klart över alla ingående priser med en betydande återhämtning av uIPSP på 4 s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Multi neuron patch clamp inspelningar i vuxen människa Neurokirurgiska hjärnan skivor. (A) låg och hög förstoring IR-DIC bilder som visar plats och identitet av de inspelade nervcellerna (översta paneler). En pyramidal neuron (svart asterisk) och angränsande interneuron (röd asterisk) spelades samtidigt. Exempel färgkodade spår av en enkelriktad excitatoriska synaptic anslutning (ESPC) från pyramidal cell interneuron (mätt som EPSCs i spänningen klämman) och motsvarande fysisk anslutning karta (bottenpaneler). (B) Fyrbäddsrum patch clamp inspelning experiment i en vuxen människohjärna Neurokirurgiska skiva av dorsolaterala prefrontala cortex. Två pyramidal nervceller och två interneuroner registreras samtidigt möjliggör sekventiell sondering av tolv möjliga synapsförbindelser. Ett tåg av evoked handlingspänningar i cell #3 (gröna spår) ledde till upptäckt av hämmande efter synaptic potentialer (IPSPs) i alla de andra tre samtidigt inspelade nervcellerna (tre boxed regioner, övre paneler). Svaren registreras från varje enskild neuron är färgkodade för tydlighet. Fysisk anslutning kartan visas i den nedre panelen. Observera de råa spår visas i (B) representerar genomsnittet av minst 20 på varandra följande rådata sveper. Förmodad identifiering av celltyp baserades på soma form, analys av morfologi av fluorescerande färg fylla under inspelningar och inneboende elektrofysiologiska egenskaper inklusive bränning mönster som svar på aktuella injektion stegen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

NMDG-HEPES aCSF HEPES innehav aCSF Inspelning aCSF
Komponent mM MW g/Liter mM MW g/Liter mM MW g/Liter
NMDG 92 195.22 17.96
ICM 92 36,46 *
NaCl 92 58.44 5,38 124 58.44 7.25
KCl 2.5 74.55 0,19 2.5 74.55 0,19 2.5 74.55 0,19
NaH2PO4 1.2 138,00 0,17 1.2 138,00 0,17 1.2 138,00 0,17
NaHCO3 30 84.01 2,52 30 84.01 2,52 24 84.01 2,02
HEPES 20 238.31 4,77 20 238.31 4,77 5 238.31 1.19
Glukos 25 180.20 4,51 25 180.20 4,51 12.5 180.20 2,25
natriumaskorbat 5 198,00 0,99 5 198,00 0,99 0 198,00 0.00
Tiourea 2 76.12 0,15 2 76.12 0,15 0 76.12 0.00
natrium pyruvat 3 110.04 0,33 3 110.04 0,33 0 110.04 0.00
MgSO4.7H2O 10 246.48 5 mL 2 246.48 1 mL 2 246.48 1 mL (2M lager)
CaCl2.2H2O 0,5 147.01 0,25 mL 2 147.01 1 mL 2 147.01 1 mL (2M lager)
* Titrera pH NMDG-HEPES aCSF till 7,3-7,4 använder koncentrerad HCl
Alla lösningar bör vara i intervallet 300-310 mOsm/Kg

Tabell 1: Media formuleringar.

Djurs ålder
Tid (min) * < 1 månad 1-3 månader 36 månader 612 månader 12 + månader
0 250 ΜL 250 ΜL
1
2 250 ΜL
3
4 500 ΜL
5 250 ΜL 250 ΜL
6 1000 ΜL
7
8 2000 ΜL
9
10 överföring 500 ΜL 250 ΜL 250 ΜL
11
12
13
14
15 1000 ΜL 500 ΜL 250 ΜL 250 ΜL
16
17
18
19
20 2000 ΜL 1000 ΜL 500 ΜL 250 ΜL
21
22
23
24
25 överföring 2000 ΜL 1000 ΜL 500 ΜL
26
27
28
29
30 överföring 2 000 ΜL 1000 ΜL
31
32
33
34
35 överföring 2 000 ΜL
36
37
38
39
40 överföring
* Tid noll är ögonblick skivor överförs in i inledande återhämtning kammaren

Tabell 2: Rekommenderat schema för gradvis Na + spike-i förfarandet enligt mus ålder.

Discussion

Na + Spike-i förbättrar Gigaohm förseglar bildandet och Patch Clamp inspelning framgång
Den första versionen av metoden NMDG skyddande återhämtning utformades specifikt för vuxen och åldrande djur2,5. Vissa tidiga användare har också försökt att tillämpa denna metod på juvenila djur hjärnan skivning (dvs, möss < 30 dagar gammal). Det har dock noterats att i motsats till utestående visuellt-bekräftade neuronala bevarandet med metoden NMDG skyddande återhämtning i detta åldersintervall, gigaohm förseglar bildandet kan ofta stall ut, vilket leder till misslyckade patch clamp inspelning försök. En hypotes är att NMDG kationer lättare fastnar i juvenil hjärnan skivor i förhållande till vuxna hjärnan skivor och kan hindra förseglar bildandet; dock gigaohm tätningar kan lätt bilda medan juvenil hjärnan skivor är helt nedsänkt i NMDG aCSF (inga data anges), vilket indikerar att NMDG aCSF i sig hindrar inte gigaohm förseglar bildandet.

Den snabba övergången från låg till hög Na+ lösning vid slutförandet av det inledande hjärnan slice återhämtning steget orsakar skador på neuronala membran och perturbs förseglar bildandet processen. Detta är intuitiv eftersom övergången från låg till hög Na+, kall-till-varm temperatur och dramatisk höjning av de Ca2 + Mg2 + förhållande till kollektivt leda till en massiv återkomsten av spontana synaptisk aktivitet. Denna hämmande rebound fas i hjärnan skivning förfarandet sannolikt att spegla reperfusionsskada efter en ischemisk förolämpning. Därmed ytterligare mildra neuronala membran skador i inledande återhämtningsfasen en gradvis Na+ spike-i förfarandet har införlivats som höjden av Na+ koncentration i NMDG skyddande återhämtning inkubation kammaren är långsamt och reproducibly förhöjda med exakt timing. Liksom i den ursprungliga skyddande indrivningsförfarandet är temporal dissociationen av Na+ höjd från temperatur och Ca2 +/Mg2 + baserat höjd fördelaktigt. Men dessutom Na+ spike-i förfarandet leder till små stegvisa ökningar extracellulära Na+ koncentration över tidiga tidpunkter och stora ökningar mot slutet tidpunkter, därmed ger hjärnvävnaden en möjlighet att bättre tillgodose till de stigande nivåerna som Na+ . Detta förfarande är ett alternativ till gradvis lösning exchange kontrolleras av en perfusion pump eller gravity dropp linjer som leder till ständiga ökningar i Na+ nivåer och kräver uppmärksamhet på både in- och utflöde till undvika överflöde av slice kammaren. Noterbart i denna Na+ stiger spike-i förfarandet osmolalitet av lösningen i slice kammaren gradvis under flera minuter innan skivor returneras till normal osmolalitet lösning, men detta påverkade inte negativt slice hälsa eller patch clamp inspelning framgång. En hög osmolalitet skärande lösning har tidigare använts för mellanhjärnan slice preparat för att bättre bevara dopaminneuron för patch clamp inspelningar57,58, vilket visar att detta tillfälliga hyperosmolality kan vara fördelaktigt i vissa sammanhang.

Genom att implementera en optimerad förfarande att kombinera NMDG skyddande återställningsmetod och gradvis Na+ utökats spike-i steg nyttan av hjärnan slice metoden för att täcka juvenil genom mogna vuxna djur åldrar. Detta uppdaterade protokoll är nu lämplig för ett brett utbud av djur åldrar använder en enda optimal NMDG aCSF formulering och förfarande. Om det behövs, Na+ spike-i förfarandet kan tillämpas med ett successivt längre dröjsmål eller långsammare tid kursen att förbättra lönsamheten för hjärnan skivor från äldre djur och vi har gett en grundläggande guide Rekommenderad spike-i scheman enligt till djur ålder (se tabell 2). Medan vi har gett en grundläggande ram som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer, kan ytterligare avancerade steg utforskas för att ytterligare förbättra lönsamhet och livslängd av hjärnan skivor från vuxna och åldrande djur. Exempelvis strategier för återställande av glutation är särskilt effektiv i detta avseende och kan genomföras som beskrivs på andra ställen2,6.

Att förbättra genomströmning för utmanande experiment
Analysen av synaptic anslutning av patch clamp inspelning är ett krävande program som kräver utmärkt konservering av både neuronala struktur och funktion för att uppnå en hög tillförlitlighet av framgång. Som antalet neuroner registreras samtidigt går upp linjärt, teknisk svårighetsgrad går upp supra-linjärt. Det finns många felmoder, och en av de vanligaste orsakerna till misslyckanden är oförmågan att formuläret adekvat gigaohm tätningar på en eller flera av de rikta cellerna. Detta kan dramatiskt långsamma framsteg, särskilt när tre eller fler nervceller måste registreras samtidigt. Överensstämmer med konstaterandet av snabbare gigaohm försegla bildandet tid med den optimera NMDG skyddande återvinning metoden, det var en markant förbättring i framgång och genomströmning av flera neuron patch clamp inspelning experiment med båda vuxen transgena mus hjärnan skivor och vuxna människohjärnan Neurokirurgiska skivor. Förbättrad effektivitet är nästan säkert kan tillskrivas både snabb och pålitlig gigaohm förseglar bildandet och förbättrad neuronala bevarandet av skivor med detta protokoll. Även om detta protokoll fokuserar på fördelarna uttryckligen för patch-clamp inspelning program, förväntas liknande vinster för andra utmanande experimentella tillämpningar där hjärnan slice lönsamhet är avgörande.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Allen Institute for Brain Science. Författarna vill tacka Allen Institute grundarna Paul G. Allen och Jody Allen, för deras vision, uppmuntran och stöd. Vi tackar också Allen Institute teknisk supportpersonal för att utföra Djurvård, djurskötsel och genotypning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compresstome VF-200 Precisionary Instruments VF-200 Vibrating tissue slicer (recommended)
N-methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 aCSF constituent
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014 aCSF constituent
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5405 aCSF constituent
Sodium Phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71505 aCSF constituent
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 aCSF constituent
HEPES Sigma Aldrich H4034 aCSF constituent
Glucose Sigma Aldrich G7021 aCSF constituent
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A4034 aCSF constituent
Thiourea Sigma Aldrich T8656 aCSF constituent
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P5280 aCSF constituent
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902 aCSF constituent
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma Aldrich M1880 aCSF constituent
2,2,2-Tribromoethanol  Sigma Aldrich T48402 Anesthetic component 1
2-methyl-2-butanol  Sigma Aldrich 240486 Anesthetic component 2
Curved blunt forceps Fine Science Tools 11065-07 Brain dissection tools
Fine dissecting scissors (supercut) Fine Science Tools 14058-09 Brain dissection tools
Large heavy duty scissors 7'' Fine Science Tools 14000-18 Brain dissection tools
Metal spatula Sigma Aldrich Z511455-1PAK Brain dissection tools
Razor blades VWR 89031-954 Brain dissection tools
Brain Slice Keeper-4 Automate Scientific S-BSK4 brain slice holding chamber
nylon netting  Warner Instruments 64-0198 For building small slice recovery chambers
Pyrex glass beakers (250 mL) VWR 89090-434 For building small slice recovery chambers
35 mm plastic dish, round VWR 100488-376 For building small slice recovery chambers
Gas diffuser stones (10 µm) Sigma Aldrich 59277 For constant carbogenation (fine bubbles)
Agarose Type I-B Sigma Aldrich A0576 For embedding brain specimens
Micro loader tips Eppendorf 22491229 For filling patch clamp electrodes
Sylgard VWR 102092-312 For making a custom dissecting platform
Hydrochloric acid  Sigma Aldrich H1758-100ML For pH adjustment of media
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich 221465-25G For pH adjustment of media
Potassium Hydroxide Sigma Aldrich 221473 For pH adjustment of media
Plastic transfer pipets 3 mL graduated VWR 89497-676 For slice transfer
Zirconium ceramic injector blades Cadence Specialty Blades EF-INZ10 http://cadenceinc.com/
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament King Glass Company custom quote ID: 0.87mm, OD 1.50mm
Biocytin Sigma Aldrich B4261 Intern pipette solution
Phosphocreatine disodium Sigma Aldrich P7936 Intern pipette solution
Potassium Gluconate Sigma Aldrich G4500-100G Intern pipette solution
EGTA Sigma Aldrich E3889 Intern pipette solution
Mg-ATP Sigma Aldrich A9187 Intern pipette solution
Na2-GTP Sigma Aldrich 51120 Intern pipette solution
sucrose Sigma Aldrich S0389 Intern pipette solution
Heated water bath (2.5L) VWR 13491-060 Miscellaneous
Filter paper rounds VWR 28456-022 Miscellaneous
Cyanoacrylate glue Amazon B000BQRBO6 Miscellaneous
Glass petri dish VWR 89000-326 Miscellaneous
10X Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5493 Miscellaneous
30 mL syringes VWR BD302832 Miscellaneous
1 mL syringes VWR BD-309628 Miscellaneous
25 5/8 gauge needles VWR 89219-292 Miscellaneous
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) VWR 89232-908 To keep agarose molten 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303, (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148, (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1, (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23, (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26, (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24, (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80, (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31, (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34, (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37, (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95, (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32, (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8, (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18, (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84, (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110, (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113, (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16, (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77, (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34, (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33, (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33, (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39, (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64, (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76, (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79, (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35, (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33, (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350, (6264), 9462 (2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9, (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58, (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9, (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59, (2), 288-297 (2008).
Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad <em>N</em>-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ting, J. T., Lee, B. R., Chong, P., Soler-Llavina, G., Cobbs, C., Koch, C., Zeng, H., Lein, E. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (132), e53825, doi:10.3791/53825 (2018).More

Ting, J. T., Lee, B. R., Chong, P., Soler-Llavina, G., Cobbs, C., Koch, C., Zeng, H., Lein, E. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (132), e53825, doi:10.3791/53825 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter