Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

doi: 10.3791/53825 Published: February 26, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

Abstract

Bu iletişim kuralı Npratik bir kılavuzdur-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Çok sayıda son yıllarda yapılan çalışmalarda nöronal korunması ve genel beyin dilim canlılığı arttırmak için bu yöntemin yarar doğrulanmış var. Bu teknik erken benimseyenler tarafından uygulanması çeşitli deneysel uygulamalar kullanarak ve çok çeşitli hayvan yaş, beynin ve hücre tipleri kapsayan beyin fonksiyonu ayrıntılı soruşturmalar kolaylaştırdı. Güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimler için yama kelepçe Elektrofizyoloji elde etmek için bir en iyi duruma getirilmiş NMDG yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) medya formülasyonu ve gelişmiş yordamı kullanarak koruyucu kurtarma beyin dilim tekniği oynayabilmeniz için adımları özetlenmiştir. Güncellenme Zamanı Bu yaklaşımla önemli bir gelişme hızı görülmektedir ve gigaohm güvenilirliğini mühür hedeflenen yama kelepçe böylece zorlu kolaylaştırmak mükemmel nöronal koruma koruyarak deneyler kayıt esnasında deneysel uygulamalar. Genç Yetişkin transgenik fareler ve olgun yetişkin insan Nöroşirürji numuneler sinaptik bağlantısı'nda neocortical beyin dilimleri tahlil için deneyler kayıt çok nöron yama kelepçe hazırlanan sağlanan temsilcisi sonuçlarıdır. Ayrıca, en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi beyin Dilimleme böylece özgün metodoloji sınırlamasından çözme çocuk ve yetişkin hayvanlar ile uyumludur. Özet olarak, bir tek medya formülasyonu ve yordam Dilimleme beyin çeşitli tür ve yaş mükemmel canlılık ve doku koruma elde etmek için uygulanabilir.

Introduction

Akut beyin dilim hazırlık nörolojik bir temel deneysel model sistemidir. Kabaca yarısı bir yüzyıl için çok çeşitli anatomik beyin bölgeleri ve hayvan türleri arasında yaşayan beyin dinamik fonksiyonel çalışmalar bu platform sağlamıştır. Amaçlanan uygulama biyokimya, fonksiyonel görüntüleme, Morfoloji, Elektrofizyoloji olup, bu en iyi bütünlüğü ve dilimlenmiş doku canlılık sağlamak için son derece önemlidir. Son derece esnek Juvenil kemirgen beyin dilim hazırlık (Yani, doğum sonrası gün 30 fareler için daha genç) en çok tercih edilen tarih oldu bu nedenle içindir. Yeterince sağlıklı beyin almak üzere zorluk olgun yetişkin dilimler ve hayvanlar eskime çoğu için müthiş bir meydan okuma olduğu kanıtlanmıştır ve olgun beyin işlev Mimarlık eğitimi için ciddi sınırlamalar empoze. Bu özellikle kayıt düzeltme eki kelepçe mükemmel morfolojik ve fonksiyonel koruma gerektirir ve detaylı iç ve sinaptik özelliklerini tespit tek nöronların karakterize için vazgeçilmez bir teknik için de geçerlidir. Son birkaç on yıl için sağlıklı beyin dilimleri--dan genç ve çok daha az için hazırlamak için Sükroz yerine düşük Na+ aCSF1 kullanarak bir 'koruyucu kesme' yöntem yama kelepçe electrophysiologists büyük çoğunluğu dayanıyordu ölçüde, genç yetişkin hayvanlar. Bu yöntem pasif Na+ akını ve sonraki su giriş ve dilim kesme adımı sırasında şişme hücre olduğunu nöronlar, zavallı yaşama neden baskın hakaret özellikle yer alan bu nöronlar için öncül dayalı bıçak hareketi direkt travma sürdürebilmek olasılıkla yüzeysel katmanları. Ancak, koruyucu kesme yöntemi hala beyin dilim hazırlık bağımsız olarak uygulanan belirli aCSF formülasyonu olgun yetişkin hayvanlardan için arzu edilen düzeyde bırakır.

Bu sorun için basit ama etkili bir çözüm oldu2,3,4,5,6 açıklanan ve 'koruyucu Kurtarma' beyin dilim yöntemi olarak adlandırdığı. NMDG en çok yönlü ve (Sükroz, gliserol, Kolin ve Tris dahil) çeşitli diğer aday sodyum iyon yedekler arasında etkili olarak tanımlandığı gibi bir NMDG yerine aCSF bu yöntem özgün sürümünü kullanır. Medya formülasyon daha fazla beyin dilim ödem karşı ve daha güçlü pH7tampon sağlamak için HEPES eklenmesi, hem de takviyeleri zararlı etkilerini oksidatif stres (Tablo 1) eklenmesi tarafından geliştirilmiş oldu. Bu ampirik bir başlangıç kurtarma kuluçka adım düşük Na+, düşük Ca2 +, ve yetişkin beyin doku Dilimleme gerekli ve yeterli için hemen sonra yüksek Mg2 + NMDG aCSF nöronal geliştirilmiş belirlendi beyin bölgeleri, hücre tipleri ve hayvan yaş3,5,6geniş bir aralığı boyunca korunması.

Özellikle, ne şimdi koruyucu kurtarma yöntemi nitelenen önceki enkarnasyonları edebiyat1,8,9,10,11,12', bulunabilir 13, tam potansiyeline için olgun yetişkin ve hayvan beyin dilim ve yama kelepçe kayıt eskime değildi ancak tanınan veya bu önceki eserlerinde gösterdi. Buna ek olarak, farklı yaklaşımlar içeren yordam varyasyonları belirli deneysel uygulamalar4,14,15,16destek çıkmaya devam edin. Çok sayıda araştırma gruplarının çalışmalarını toplu gövdesi koruyucu kurtarma yöntemi geliştirilmiş doku koruma için sağlamlık yüksek güven kazandırır. NMDG koruyucu kurtarma yöntemi yaygın şekilde benimsenen şimdi ve yetişkin hayvan beyin dilim preparatları kullanan çok sayıda Yayınlanan araştırma çalışmalarında uygulanan. Bu akut dilim çalışmalar yayılan neocortical3,17,18, Hipokampal15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, orta25,26,27,28,29ve arka beyin30,31,32, 33 , 34 bölgeler ve nörotransmitter ve Nöromodülatör türleri glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 de dahil olmak üzere çeşitli ,36, dopaminerjik24,29,37,38, kolinerjik14,37,38, 39, noradrenergic40ve serotonerjik27,28 neurotransmission. Yöntemi Ayrıca Transjenik hayvanlar3,39 veya vivo içinde viral enjeksiyonları17,27ardından elde edilen dilimleri nöronal faaliyette optogenetic kontrolü için de uygun olduğu, 28,40,41,42,43, iyi olarak fonksiyonel Ca2 + görüntüleme nöronal aktivite2,44 olarak ,45,46. Analizleri, kısa vadeli plastisite4,47,48 ve uzun vadeli plastisite16,35,48 farklı biçimleri olmuştur bildirdi. Yeni yapılan bir çalışmada kapsamlı ve sistematik bir olgun yetişkin fare beyin dilimleri yapılandırma49 kayıt octopatch kullanarak görsel kortekste sinaptik bağlantı sondalama kolaylaştırmak için NMDG koruyucu kurtarma yöntemi uygulanan — güçlü gösteri yardımcı programını ve sağlamlık bu yöntemin. Koruyucu kurtarma yöntemi bile başarıyla gibi damarlara ve yetişkin kortikal beyin dilimleri50, yama kelepçe üzerinden kayıt perisitlerden geliştirilmiş korunması önceden öngörülemeyen deneysel bağlamlarda uygulandı interneuron nüfus 1-1.5 yaşında Alzheimer hastalığı fare modelleri20ve bir yetişkin beyni dilim reseptör kaçakçılığı tahlil51nakledilmektedir.

Aşağıdaki iletişim kuralı beyin dilim hazırlık akut beyin dilimleri canlılık geliştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir NMDG koruyucu kurtarma yöntemi uygulamak için adım adım yordamlar açıklanır. Gösteri bu metodoloji karmaşık çok nöron yama kelepçe deneyler genç yetişkin transgenik fare beyin dilimleri ve olgun yetişkin kayıt için açık faydaları yanı sıra geliştirilmiş nöronal korunmasına ilişkin ilkeleri tartışılmıştır insan Nöroşirürji beyin dilimleri. Aşağıdaki iletişim kuralı birden fazla yaş 21 gün eski fareler için de yetişkin hastalardan elde edilen insan Nöroşirürji numuneler gelince doğrulandı.

Protocol

Transgenik fareler içeren yordamlar beyin bilim için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Allen Enstitüsü tarafından onaylanmıştır. Hem erkek hem de dişi C57BL/6 fare (ağırlık aralığı 10-30 g) bu deneylerde kullanılıyordu. Bazı temsilcisi sonuçları yaşayan insan beyni dilimleri toplanan veriler açıklanmıştır. Neocortical doku örnekleri neurosurgeries tümör kaldırma sırasında elde edilmiştir. Hastalıklı doku erişmek için üstteki neocortical doku kaldırmak için gerekli. Bilinçli hasta rızası Nöroşirürji doku kullanmak İsveç Tıp Merkezi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylı bir protokol altında araştırma amacıyla her durumda elde edildi.

1. medya ve Kimyasalları (tablo 1) hazırlanması

Not: Çözümler izleme metaller ve diğer kirleri olmadığından arıtılmış suya yapılmalıdır. Kullanılmayan çözümler 4 ° C'de 1 hafta kadar için isterseniz depolanabilir, ancak bu çözümleri taze deneme, gününde yapılması tavsiye edilir. Yukarıdaki her formülasyon 1 L 1 – 2 Dilimleme yordamlar için yeterlidir. Tüm aCSF çözümler carbogen (% 95'i O2/5% CO2) ile istikrarlı pH tamponlama ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için kullanılmadan önce doymuş olmalı. Tüm çözümler pH 7.3 7.4 ve osmolalite için ayarlanması gereken ölçülen ve 300-310 mOsmol/kg için ayarlanır.

  1. NMDG-HEPES aCSF (mM) olarak hazırlamak: 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glikoz, 2 Tioüre, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H2O ve 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7,3 için 17 mL +/-0,5 mL 5 M hidroklorik asit ile –7.4.
    Not: Bu titrasyon adım ideal yağış önlemek için divalent özellikler eklenmesi önce gerçekleştirilmelidir; Ancak, yağış fizyolojik aralığı pH ayarlaması ters olabilir.
  2. ACSF (mM) tutan HEPES hazırlamak: 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glikoz, 2 Tioüre, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O ve 2 MgSO4·7H2O. Titrate 10 N NaOH pH 7,3-7.4 ile birkaç damla için konsantre.
  3. Kayıt aCSF (mM) olarak hazırlamak: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glikoz, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O ve 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3 7.4 için birkaç damla ile 10 N NaOH yoğunlaşmıştır.
  4. Na+ spike içinde çözüm (2 M) hazırlamak: NaCl 580 mg 5 mL taze hazırlanmış NMDG-HEPES aCSF çözülmüş. Bu bir beyin dilim hazırlık için yeterli çözümüdür.
  5. % 2 özel doku gömmek için kullanılmak üzere hazırlayın. Özel tip 1B 2 g dağıtılması ( Tablo malzemelerigörmek) 100 ml 1 x PBS ve mikrodalga sadece kaynar kadar. Karıştırın, sonra 10 cm steril Petri yemekler karışımı dökmek ve kuvvetlendirmek için izin vermek için girdap. Özel plaka 4 ° C'de mühürlü bir plastik torba kullanmak kadar saklamak.
  6. Enjekte edilebilir anestezi hisse senedi çözüm çalışma hazırlamak. 2-metil-2-butanol ile 5 mL 2.5 g 2,2,2-Tribromoethanol mix ve sonra yavaş yavaş 200 mL PBS, pH 7,0-7,3 geçiyoruz. Hisse senedi çözüm kullanmadan önce 0.22 µm filtre ile filtre ve ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
    Not: kendi hayvan kullanım Komitesi kurallar ve kurallar hisse senedi çözüm çalışma anestezi için süre sonu ve elden çıkarma yordamı belirlemek için başvurun.

2. Kurulum Dilimleme istasyonu

  1. Dilimleme istasyonunu havaya doku dilimleme makinesi ve cerrahi aletler ( Tablo malzemelerigörmek) ile ayarlayın. Dilimleme makinesi ayarlamak için zirkonyum seramik enjektör bıçak kullanarak hızlı yapıştırıcı tutkal, bıçak kol eklemek sonra numune tutucu takın ve öncü bir bıçak bıçak değil kazımak sağlamak için küçük bir boşluk bırakarak numune tutucu RIM için hizalayın metal.
    Not: bıçak kenarı değil fiziksel olarak zarar görmüşse bu için adl hafta hatta yeniden kullanılabilir ay yerine koymadan. Çeşitli doku parçaların modelleri ticari olarak kullanılabilir, bunların çoğu zaman en iyi şekilde kalibre mükemmel performans sağlar. İdeal araç en az z ekseni saptırma, ya doğrudan ölçülen ve ayarlı veya ampirik olarak gözlenen olmalıdır.
  2. NMDG-HEPES aCSF ve öncesi soğuk buz üzerinde 200 mL ile sürekli carbogenation (taş medyada dalmış bir gaz difüzör ile uygulanan) için dolu bir 250 mL ölçek ayarlamak > 10 dak.
    Not: Bu çözüm için transcardial perfüzyon ve dilimleme makinesi rezervuar kesit sırasında doldurmak için kullanılır.
  3. NMDG-HEPES aCSF 150 mL ile dolu ilk beyin dilim kurtarma odası kurmak (sürekli carbogenation korumak) ve 32-34 ° C'de tutulan suyu Banyo odası yer
    Not: Bir dilim odası tasarımı sonra Edwards ve Konnerth (1992)52 için bu adım önerilir. Bu odaları hazır laboratuvar öğeleri ile yapılabilir (250 mL kabı, naylon örgü örgü, 50 mL konik tüp, 35 mm plastik yuvarlak tabak). Kalan hava ücretsiz kumaşı dilim kabarcıklar olduğunu, özellikle de bu kadar float ve hasar için dilimler neden olabilir gibi sürekli carbogen gaz kabarcık taşlar tarafından üretilen sağlamak için özen göstermelidir. Örgü sıvı yüzeyin altında yaklaşık 1 cm sular altında.
  4. Odası tutan bir beyin dilim kadar ayarlayın; daha büyük bir rezervuar içinde birden çok bağımsız wells bir tasarımla tavsiye edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Havzanın HEPES aCSF ve sürekli carbogenation altında oda sıcaklığında sıcak 450 mL kadar kullanmak doldurmak.
    Not: Beyin dilimleri ilk kurtarma odasından bu odasına Elektrofizyolojik kayıt önce uzun süreli depolama için transfer edilir. Dilim örgü kalır hava kabarcıkları ücretsiz her zaman emin olmak için bakım alınması gerekir.
  5. Erimiş özel doku gömmek için hazırlayın. 50 mL konik şişe bir çerez kesici gibi açık uçlu önceden hazırlanmış yemek % 2 özel bir blok kesmek için kullanın. Gevşek konik şişeyi kap sonra özel sadece erimiş kadar 10-30 s için mikrodalga. Aşırı ısınma değil.
  6. Erimiş özel 1,5 mL tüpler içine dökün. Özel bir thermomixer ile 42 ° C arasında güçlü sallayarak ile ayarla kullanarak erimiş durumda koruyun. Dikkatle erimiş özel zamanından önce kuvvetlendirmek değil emin olun.
  7. İçin dilimleyici şu anda önceden soğutmak için buz Bloğu soğutma Aksesuar yerleştirin.

3. Transcardial perfüzyon

Not: Transcardial perfüzyon yordam Yetişkin Hayvanlar ile çalışırken önemli bir adımdır ve beyni hızlı soğutma elde etmek önemlidir ve metabolizma düşük Na+beyin infüzyonu ile yavaşladı, Ca2 +düşük/yüksek Mg2 + aCSF çözüm. Transcardial perfüzyon Ayrıca görselleştirme ve transgenik satırlarındaki fluorescently etiketli hücre popülasyonlarının hedefleme engelleyebilmesi autofluorescence azaltır beyin damarlara kırmızı kan hücreleri temizlemek için hizmet vermektedir. Transcardial perfüzyon atlamak için tavsiye edilmez.

  1. Fareler anestezik çalışan hisse senedi çözüm mayi enjeksiyonu ile derin anestezi (250 mg / kg: 0,2 mL %1,25 anestezik başına 10 g vücut ağırlığı, hisse senedi çözüm çalışma bkz: Malzemeler tablo). Sonra ~ 2-3 dk, ayak çimdik refleks değerlendirmek tarafından yeterli anestezi derinliği doğrulayın. Gerekirse, ek bir anestezik çalışma stok hacmi enjekte ve ayak çimdik refleks başka bir 2-3 dakika sonra yeniden değerlendirmek.
  2. Carbogenated NMDG-HEPES aCSF 25 mL 30 mL şırınga (2-4 ° C sulu veya dondurulmuş çözüm olarak karşı en iyi yöntemdir) önceden soğutulmuş 250 mL kabı yüklemek. 25 5/8 gauge iğne takın.
  3. Sırtında fare ile forepaws ve istikrar için arka paws aşağı pin. 15 cm cam Petri kabına de üs olarak sertleştirilmiş silikon inşaat ile dolu.
  4. Bir neşter kullanmadan, diyafram düzeyde göğüs boşluğuna açmak için yanal bir kesi olun. İyi makas göğüs kafesi her iki yan kalp ve akciğer kırpma önlemek için dikkat çekici üzerinde kesmek için kullanın.
  5. Geri kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi Merkezi kısmındaki toplu iğne. 30 mL şırınga iğne sol ventrikül yerleştirin ve sağ Kulakçık kan kalp çıkmak izin vermek için iyi makasla kesme.
  6. El ile sabit basınç kullanarak şırınga pistonu basın ve soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF ~ 10 mL/dk hızında hayvanla sıvı.
    Not: perfüzyon başarılı ise karaciğer soluk sarı koyu kırmızı rengi ve bazı durumlarda sıvıları burun delikleri yordamının sonuna doğru çıkarken dikkat edilmesi açık değişecek.

4. beyin diseksiyon ve dilimleme

  1. Hayvan başını kesmek. Neşteri kafasına cilt açmak ve kafatası kapağı açmak için kullanın.
  2. Cilt üzerinde kafatası kap Kes gitsin ve küçük kesiler yanal Kaudal/ventral adlı iki tarafında kafatasını temel kullanım iyi süper kesim makas. Alttaki beyin zarar vermemeye dikkat çekici dorsal orta hat kadar rostral yönde hareket kafatası Kaudal/dorsal yönünü başlayan ek sığ kesim yapmak. Bir final 'T yapmak ' dik olfaktör Ampüller düzeyde için orta hat kesilmiş.
    Not: Faiz beyin region(s) bir zarar emin olmak için bakım alınması gerekir. Özellikle, hiçbir zaman orada beyin için basınç herhangi bir yük olmalı.
  3. Yuvarlak uçlu forseps medial rostral yönü de başlayan kafatası kavramak ve Kaudal-lateral yönde geri soyma için kullanın. Çatlamak her iki taraf için tekrar açın ve beyin ortaya çıkarmak için kafatası kapağı dorsal yarısı çıkarın. Yavaşça önceden soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF kabı sağlam beynini dışarı kepçe. Beyin ~ 1 dk için düzgün soğutmak izin.
  4. Büyük spatula kabı ve filtre kağıdı ile kaplı Petri kabına üzerine beyin kaldırmak için kullanın. Trim ve dilimleme tercih edilen açısı according ve beyin bölgesi ilgi istenen beyin engellemek. Hızlı uzun süreli oksijen yetmezliği işleme sırasında uzak durmaya çalışın.
    Not: Birçok Dilimleme açıları mümkündür. Tam engelleme yöntemi ve dilimleme açısı tam beyin bölgesi, hücre tipi ve devre üzerinde belirlenmesi için bağlı olacaktır.
  5. Beyin blok yapıştırıcı tutkal kullanarak örnek sahibi için yapıştırmayın. Numune yeterince beyin blok tamamen içten çekilmeye sahibi iç parçası geri çek. Beyin blok tamamen özel kaplı kadar erimiş özel doğrudan sahibi dökün. Bloğun etrafında ~ 10 için numune tutucu ürpertici önceden soğutulmuş Aksesuar kelepçe özel katılaşmış kadar s.
  6. Numune tutucu dilimleme makinesi üzerinde kabın içine yerleştirin ve doğru hizalaması doğrulayın. Havzanın 250 mL kabı üzerinden kalan önceden soğutulmuş, oksijenli NMDG-HEPES aCSF ile doldurun ve bir kabarcık göle süresi için yeterli oksijenasyonu sağlamak için dilimleme pulu.
  7. Özel katıştırılmış beyin numune ilerleyen başlamak için mikrometre ayarlayın. Dilimleyici başlatmak ve ampirik olarak önceden hız ve salınım frekansı istenen düzeye ayarlayın.
    Not: Her iki ayar düşük aralığında olmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için tek bir geçmek ve bıçak kol almak yaklaşık 20 s ve salınım yok açık uğultu ile bir çok pürüzsüz ve yumuşak uğultu gürültü üretmek gerekir.
  8. İlerleyen devam ve 300 µm artışlarla (veya diğer tercih edilen kalınlık) kadar beyin bölgesi ilgi dokusunda Dilimleme tam kesitli; Dilimleme işlemi için toplam süre daha az 15dk olmalıdır.

5. en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yordamı

  1. İlk NMDG kurtarma adım (kritik adım): parça yordamı tamamlandığında, tüm bir kesme Pasteur plastik boru t kullanma dilim toplamak ve 150 mL ile dolu bir Önceden ısıtılmış (34 ° C) ilk kurtarma odasına aktarmak NMDG-HEPES aCSF. Tüm dilimler kısa olacak biçimde aktarmak ve en kısa zamanda tüm dilimler kurtarma odasına taşınır bir Zamanlayıcıyı başlatmak.
  2. En iyi Na+ spike içinde zamanlamaya göre fare yaş belirlemek için Tablo 2 bakın.
    Not: Bu yordam Na+ reintroduction beyin dilim odasına kontrollü bir oranı elde etmek için pratik bir yöntem olup bir belirli beyin dilim odası geometrisi ve rezervuar hacmi ve türü için (bkz. Tablo reçetesi) en iyi duruma getirilmiş.
  3. Na+ spike içinde çözüm belirtilen birimleri belirtilen ekleyerek spike içinde kademeli Na+ yordamı gerçekleştirmek kez. Na+ spike-çözüm doğrudan hızlı karıştırma kolaylaştırmak için ilk kurtarma odası bubbler baca ekleyin.
  4. Tüm dilimler oda sıcaklığında muhafaza HEPES aCSF uzun vadeli holding odası aktarın. Dilimleri yeniden elde etmek için ek bir 1 h odası yama kelepçe kayıt deneyler başlatılıyor önce holding HEPES içinde izin.

6. yama kelepçe kayıt

Not: Aşağıdaki temel yordamlar sadece bazı pratik hususlar sağlamak ve olarak bunlar başka bir yerde53,54bulunabilir için yama kelepçe kayıtları, detaylı iletişim kuralları göstermek için amaçlanmamıştır. Bir yama kelepçe Elektrofizyoloji teçhizat bu uygulama için gereklidir. Bu genellikle kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) optik ile donatılmış bir dik mikroskop oluşacaktır ve micromanipulator ve mikroskop bir floresan aydınlatma sistemi, bir yama kelepçe amplifikatör ve veri çizim tablası, motorlu Platform, titreşim yalıtım tablo, Faraday kafesi ve çözüm Isıtma ve perfüzyon sistemi. Örnek odası ve platform batık dilim kaydı için tasarlanmış. Birden çok amplifikatörler, baş aşamaları ve yüksek kaliteli micromanipulators donatılmış bir teçhizat çok nöron yama kelepçe kayıtları için gereklidir. Buna ek olarak, en iyi sonuçlar bir teçhizat 900 nm IR bant geçiren filtre ile donatılmış ve optik bileşenleri eşleşen son derece tavsiye edilir bulunan hücre yeterli görselleştirme sağlamak için > 50 µm derin beyin dilimleri içinde. Kӧhler aydınlatma için doğru hizalaması da açık görselleştirme için önemlidir.

  1. Hücre içi pipet çözümde (mM) hazırlamak: 130 K-glukonat, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0.3 Na2-GTP ve 13.4 biocytin. 1 M KOH ile 7,35 için pH ve osmolalite 285 – 290 mOsmol/kg Sükroz gerektiği gibi kullanarak ayarlayın.
  2. Yama EKG mandalları borosilikat cam kalın duvarlı kılcal üzerinden hazırlamak; ideal yama kelepçe elektrot nispeten kısa ve güdüktüler konik vardır ~ 3 – 6 ile MOhm uç direnci banyoda dolu.
  3. Gümüş elektrot teller istikrarlı kayıtları sağlamak için düzgün chlorided olduğundan emin olun. Bunu yapmak son batış tarafından (tipik) 3-4 mm gümüş tel içinde sıvı çamaşır suyu yaklaşık 30 dk ya kadar tel siyaha döner.
  4. Taşma önlemek için 3-4 mL/dak Circulate carbogenated aCSF giriş ve çıkış eşleştirmek için dikkat çekici kayıt odası aracılığıyla kayıt kümesine bir Peristaltik pompa kullanarak çözüm perfüzyon kurmak.
  5. Bir tek beyin dilim batma kayıt odasına aktarmak ve güvenli yerde naylon ile bir dilim U şeklinde çapa kullanarak dizeleri çapraz. Daha yüksek bir güç amaç için (örneğin, yüksek sayısal diyafram veya 40 X 60 X su daldırma hedefleri) geçiş yapmadan önce bir 4 X hava hedefi kullanarak hedef beyin bölgesi tanımlayın.
  6. Görsel olarak sağlıklı hedef hücre belirle. Soma, nöronal membran görünümünü IR-DIC mikroskobu tarafından görüntülenmiştir gibi bir aday hücre yama kelepçe kayıt için uygunluğu yargılamak için kullanılır.
    Not: Sağlıklı nöronların genellikle aşağıdaki özellikleri Sergi: ne çekmiş ne de şişmiş somata, membran kenarları ve pürüzsüz membran görünüm yumuşak karşıtlık. Buna ek olarak, sağlıklı hücreler bulunan çoğu > 30 µm yüzeysel nöronlar ile hasar görmüş gibi muhtemel olarak derin dilimi, dendritik süreçleri kopmuş. Oluklu bir görünüm, açıkça görünür çekirdeği veya 'kızarmış yumurta' görünüm veya çok koyu veya yüksek karşıtlık membran kenarları sorun oluşturan nöronlar kaçınılmalıdır.
  7. Arka-dolgu yama ile hücre içi çözüm ~ 5 µL pipet ve elektrot tutucu yükleyin. Pipet beyin dilim üzerinde kayıt banyo içine taşıyın ve ucu herhangi bir engelleri temizlemek için hafif pozitif basınç uygulayın. Pipet uzaklık sıfır ve bir membran sınama işlevini kullanarak uç direnci izlemek.
  8. Pipet ucu hedef nöron'ın hücre vücut ile temas ilerlemenizi sağlar. küçük bir çukur hafif pozitif basınç nedeniyle membran yüzeyinde oluşturmalıdır.
  9. En kısa zamanda bir membran Gamze görülmektedir, hızla pozitif basınç kaldırmak ve nazik emiş mührü oluşumu kolaylaştırmak için uygulayın. Bir kez için pipet direncini artırır > 100 MOhm, beklenen istirahat membran ile eşleşen bir seviyeye bir holding komut hedef hücre türü için potansiyel açın (-70 mV olan iyi bir başlangıç noktası).
  10. İpucu direnç ≥1 gigaohm ulaştığında, membran keskin emme kısa nöbetleri kullanarak düzeltme eki pipet altında omuriliği tarafından hücre içine kırmaya girişimi; 'zap' özelliği içeri girmenin gerektiği gibi kolaylaştırmak için yararlı.
    Not: Bir holding potansiyelini-70 mV kortikal nöronlar üzerinde gerilim kelepçe deneyler için önerdi. Sağlıklı nöronlar bir sızıntı geçerli deneme süresi için-100 pA daha daha fazla negatif olacak ama bu kısmen hücre türüne bağlıdır. İstirahat membran potansiyeli -50 daha fazla depolarized Eğer bir nöron analizinden dışlanacak mV, ya da erişim direnci fazla % 20 oranında değişiklik olmadığını.
  11. İstikrarlı bütün hücreli yama kelepçe kayıt alındıktan sonra kayıt için ek nöronlar adımları 6,6-6.10 tekrar ederek hedef. İlk kayıt kaybetmenize neden olur mekanik bozuklukları önlemek için dikkat ediniz.
    1. 100 µm içinde ek nöronlar ilk nöron synaptically birleştiğinde nöronlar bulma ihtimali makul emin olmak için seçin.
      Not: Birden fazla aday nöronlar ön tanımlamak ve ön yük ve çeşitli hedeflenen hücrelere yakın tüm Pipetler ilk yama kelepçe kayıt kurmadan önce önceden konumlandırmak için bazı durumlarda yararlı olabilir.

Representative Results

Bu bölümde rutin beyin dilim hazırlık ve en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi (Yani, kademeli Na+ ile kombine NMDG koruyucu kurtarma kullanarak düzeltme eki kelepçe Elektrofizyoloji deneyleri temsilcisi sonuçları sağlar Spike-in prosedürü). Nöronlar ilk, morfolojik korunması beyin dilimler veya en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi (Resim 1) uygulama olmadan hazırlanan çeşitli beyin bölgelerinde değerlendirilmiştir. Üç ay eski yetişkin fare bu deneyler için seçildi ve biz IR-DIC mikroskobu nöron sağlık şekli ve somata ve proksimal dendrites genel görünümüne göre belirlemek için kullanılır. Beyin dilimleri (tüm görüntüleri dilim hazırlık sonra 1-2 h elde edilmiştir,) koruyucu kurtarma yöntemi olmadan hazırlanan temsilcisi görüntülerde çoğu nöronlar buruşmuş, pyknotic görünümünü unutmayın. Bu denetim dilimler NMDG aCSF transcardial perfüzyon için kullanarak ve adımları Dilimleme hazırlanmıştır ama başlangıçta yüksek Na+ele geçirildi-HEPES aCSF içeren. Buna ek olarak, nöronlar (şekil kayıt düzeltme eki kelepçe için uygun olan gelişmiş türleri Morfoloji (daha düzgün, daha dolgun, daha az oluklu görünüm) ile en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi kullanılarak hazırlanan dilimleri temsilcisi görüntülerden ortaya 1). geliştirilmiş nöronal koruma gözlendi birden çok beyin bölgeleri arasında neocortical de dahil olmak üzere Katmanlar II/III ve V, subiculum ve dorsal yanal geniculate çekirdeği (dLGN).

Ardından, en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi (Yani, spike-in yavaş yavaş Na+ prosedürü olmadan) özgün NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ile karşılaştırıldı. Yama kelepçe girişimleri kayıt gigaohm mühür oluşumu için ortalama süre önemli ölçüde ve önemli ölçüde azaldı (9,9 33,3 karşı s s, **p < 0.005, eşleştirilmiş t-test) ne zaman aşamalı Na+ spike-in prosedürü uygulandığı NMDG koruyucu kurtarma adım ile birlikte (Şekil 2). Büyük ölçüde kez mühürleme daha hızlı ve daha güvenilir membran genç yetişkin beyin dilimler halinde kayıt düzeltme eki kelepçe throughput geliştirilmiş. En iyi zamanlama Na+ spike içinde daha fazla hayvan yaş (Tablo 2) göre güncellenmiştir ve her yaş (1 yıl yaşlı fareler için 3 hafta) test için yararlı. Kademeli sodyum iyon konsantrasyonu ayrıcalık spike-in prosedürü seyri boyunca profil ( Tablo 2' de gösterilen zamanlamaları eşlik edecek,şekil 3) sağlanır.

Iç Elektrofizyolojik özellikleri, genç yetişkin (doğum sonrası günlük 40-80) bireysel nöronların Allen Enstitüsü hücre türleri programı (http://celltypes.brain-map.org/) büyük ölçüde çaba için sistematik olarak sürüyor parçası olarak karakterize fare görsel kortikal beyin dilimleri transgenik hatları nöron popülasyonları (kortikal katman ve hücre tipi belirli Cre sürücü satırları Cre-bağımlı floresan geçti genetik olarak tanımlı hücre türüne özgü floresan marker ifade ile elde muhabir hattı55). Şekil 4 Parvalbumin (Pvalb) kaydedilen ateş desenleri izleri örnek gösterir-kortikal hızlı yükseliyor (FS) interneurons (Pvalb-IRES-Cre/Ai14 fareler) yanıt dinamik aralığını kapsayan 1 s geçerli enjeksiyon adımları bir dizi olarak ifade nöron ateş. F-22 kortikal FS interneurons bir dataset sağda gösterilir için eğri. Hedef benzer yama kelepçe kayıt deneyler Rorb ifade 23 eksitatör nöronlar içinde Rorb-IRES-Cre/Ai14 fareler (şekil 4) IV katmandan karakterize etmek için gerçekleştirilen. FS interneurons ve piramidal nöronların kortikal bölgelerde ve katmanlar arasında da dahil olmak üzere çeşitli sağlıklı nöron türleri bu kullanma dilim hazırlık Protokolü optimize sonra en az 6-8 h için kayıt düzeltme eki kelepçe için düzenli olarak ve güvenilir bir şekilde hedeflenebilir.

Iç nöronal özellikleri ölçme yanı sıra, sinaptik bağlantı görsel kortikal Mikri şemalar tanımlanmış türlerden birden çok eşzamanlı olarak kaydedilen arasındaki probed. Çok sayıda sağlıklı aday nöronlar tanımlı türleri yüksek kalite elde etme makul bir şans sağlamak için beyin dilim nispeten küçük bir alan içinde mevcut olmalıdır gibi teknik kayıt çok nöron yama kelepçe son derece, talep ediyor eş zamanlı kayıt ve bona fide sinaptik bağlantıları tanımlama. Şekil 5 genç yetişkin Pvalb-IRES-Cre/Ai14 fareler elde edilen beyin dilimleri görsel kortekste iki tdTomato + FS interneurons eşleştirilmiş kaydını gösterir. Güçlü bir tek yönlü inhibitör sinaptik bağlantı (yüksek klorür iç pipet çözüm ile kaydedilen) tespit edilmiştir. Örnek kayıtları ve kısa vadeli sinaptik plastisite özelliklerini ölçmek için protokolleri mevcuttur. Yüksek frekans tren stimülasyon (10 bakliyat her 10, 50 ve 100 Hz) nöbetleri tek kurtarma test bakliyat çeşitli zaman aralıklarında tarafından takip (1, 2 veya 4 s) sinaptik depresyon kurtarma zamanlı Kurs ölçmek için.

Mükemmel başarı aynı zamanda olgun yetişkin ex vivo beyin dilimleri içinde insan neocortical nöronlar için elde edilmiştir. Nöroşirürji numune hastaneleri, tümör çıkarılması için zamanlanmış ameliyat geçiren hastalar elde edilir. Yordamlar insan Nöroşirürji doku toplama ve beyin dilim hazırlık için birkaç pratik şekilde fare beyin dilim yordamlardan farklı. Kısacası, rezeke neocortical doku (patoloji siteye distal) ameliyathane toplanır ve buz gibi oksijenli NMDG-HEPES aCSF dalmış ve sürekli soğutma ve işletim odasından oksijenlenme ile taşınan Laboratuvar 30 dk içinde veya daha az. Beyin dilimler NMDG koruyucu kurtarma yordamı kullanılarak hazırlanan ve yeniden elde etmek için yama kelepçe kayıtları başlatılıyor önce uzun bir süre yaklaşık 3 h için izin. Şekil 6 başarılı bir deneme ve frontal korteks bölgesinde bu şekilde hazırlanan insan ex vivo beyin dilimleri bir başarılı dört kişilik yama kelepçe kayıt deneyden kayıt eşleştirilmiş göstermektedir. Eşleştirilmiş kayıt bir kortikal piramit nöron (eksitatör postsinaptik akımları kaydedilen) bir kortikal interneuron üzerine tek yönlü eksitatör sinaptik girişten gösterir. Dört yama eksitatör iki deneme ve iki inhibitör nöronlar aynı anda kaydedildi ve üç inhibitör sinaptik bağlantıları (inhibitör postsinaptik potansiyeller kaydedilen) algılandı probed on iki toplam bağlantı dışında. Böylece, bu en iyi duruma getirilmiş beyin dilim metodoloji dilim uygulamalarının, çok nöron yama kelepçe deneyler devre bağlantısı'nda akut rezeke olgun yetişkin insan beyni çalışmaya dahil beyin en zorlu güvenilir deneysel başarı sağlayan doku.

Figure 1
Şekil 1: En iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık ile geliştirilmiş nöronal koruma. Temsilcisi IR-DIC görüntüleri üç aylık bir fareden akut dilimleri içinde çeşitli beyin bölgelerinden elde. NMDG koruyucu kesme yöntemi bir koruyucu kurtarma adım (sol kapı aynası) olmadan en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi (doğru panelleri) karşı denetler. (A)katman v. yeni korteksimiz, (B) Katman II/III yeni korteksimiz, (C) subiculum ve (D) dorsal yanal geniculate çekirdeği (dLGN). Tüm panelleri ölçek barlarda çoğu 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Hızlandırılmış hızı ve geliştirilmiş güvenilirlik-in gigaohm Na+ spike-in prosedürü ile NMDG koruyucu kurtarma yöntemi kullanarak deneyler kayıt düzeltme eki kelepçe oluşumunda mühür. (A)arsa gigaohm mühür oluşumu kez NMDG kurtarma için yalnız (siyah veri noktaları, n = 19) NMDG kurtarma artı Na+ spike-in prosedürü karşı (kırmızı veri noktaları, n = 23). Tüm kaydedilen hücre katmanı II/III veya V görsel korteksin piramidal nöronların vardı. Dikkat, maksimal zaman 100 de şapkalı s asla gigaohm mühürler oluşan hücreler için hesap. Eşleştirilmiş t-testi, **p < 0.005. (B) arsa membran potansiyeli (RMP) katman V piramidal nöronların için istirahat (turuncu veri noktaları, n = 10/11), II/III piramidal nöronların (yeşil veri noktaları, n = 9/10), veya kortikal Pvalb + FS interneurons (mavi veri noktaları, n = 23/22). Katı daireler NMDG kurtarma koşulu belirtmek ve daireler NMDG kurtarma artı Na+ spike içinde yordam açın. Her veri noktası bir neuron ve her iki ortalama temsil eder ve SEM +/-görüntülenir. Her üç tip hücre için beyin dilim hazırlık şartları karşılaştırarak RMPs hiçbir önemli farklılıklar vardır (eşleştirilmiş t-test). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Profil yükselen kademeli sodyum iyon konsantrasyonu spike-in prosedürü seyri boyunca. (A)arsa spike bileşenini NaCl konsantrasyonunun kez karşı. (B) arsa toplam ekstraselüler NaCl konsantrasyonunun kez karşı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Iç Elektrofizyolojik özellikleri genetik olarak tanımlanan kortikal hücre tiplerinin. (A)örnek izleri, yanıt Pvalb + kortikal FS interneurons (sol panelde) için geçerli enjeksiyon adımlara nöronal ateş. tdTomato + nöronlar beyin dilimler Pvalb-IRES-Cre/Ai14 fareler gelen kayıtları için hedef. Oranı geçerli enjeksiyon ilişki atış için Özet verileri (F-ben eğri) sağda gösterilir (n = 22). (B) örnek nöronal ateş yanıt olarak Rorb ifade kortikal katman IV eksitatör nöronlar (sol panelde) için geçerli enjeksiyon adımları izler. tdTomato + nöronlar beyin dilimler Rorb-IRES-Cre/Ai14 fareler gelen kayıtları için hedef. Oranı geçerli enjeksiyon ilişki atış için Özet verileri (F-ben eğri) sağda gösterilir (n = 23). Her ince renkli çizgi F temsil eder-için tek bir neuron; eğri kalın siyah çizgiler ise, SEM +/-her grup için ortalama Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Kısa vadeli plastisite synaptically bağlı Pvalb ifade kortikal FS interneurons. (A)fark girişim kontrast ve epifluorescence tdTomato-pozitif, Pvalb ifade FS interneurons fare birincil görsel korteksin hedeflemek için kullanılmıştır. İki interneurons arasındaki tek taraflı sinaptik bağlantı gösteren bir renk kodlu şematik bağlantı diyagramı. (B) şeması synaptically bağlı nöronların kısa vadeli dynamics değerlendirmek için kullanılan stimülasyon iletişim kuralları. Tren 10 aksiyon potansiyelleri (10, 50 ve 100 Hz) içinde bir tek eylem farklı saat gecikmeyle teslim potansiyel (Kurtarma Test darbe, RTP) ardından presynaptic nöron uyarılmış (1, 2 ve 4 s) sonra tren sona erdi. Her RTP netlik için kodlu renk vardır. (C) karşılık gelen tek taraflı inhibitör Post sinaptik potansiyeller (uIPSPs) hücre #2 yanıt eylem hücre #1 uyarılmış potansiyeller tren olarak ortalama izleri. Gri iç metin uIPSP tren tarif göstermek için zaman ölçeğini genişletti. (D) NORMALIZED uIPSP genlikleri trenler farklı frekanslarda sırasında konumlarını bir fonksiyonu olarak çizilen. NET depresyon olduğunu net üzerinden tüm giriş oranları uIPSP önemli bir iyileşme ile 4'de s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Çok nöron yama kelepçe kayıtları yetişkin insan Nöroşirürji beyin dilimler. (A)düşük ve yüksek büyütme IR-DIC görüntüleri kaydedilen nöronların (üst panelleri) kimlik ve konumunu gösteren. Bir piramit nöron (siyah yıldız) ve komşu interneuron (Kızıl Yıldız) aynı anda kaydedildi. Örnek renk tek yönlü eksitatör sinaptik bağlantı (ESPC) izleri piramit hücreden (voltaj kelepçe içinde EPSCs ölçülür) interneuron ve karşılık gelen fiziksel bağlantı Haritası (alt paneller) kodlu. (B) dört kişilik yama kelepçe kayıt deney dorsolateral prefrontal korteks bir yetişkin insan Nöroşirürji beyin dilim. İki piramidal nöronların ve iki interneurons aynı anda, sıralı on iki olası sinaptik bağlantıları problama için izin kaydedilir. Hücre #3 (yeşil izleri) uyarılmış aksiyon potansiyelleri tren hafiye-in her diğer üç aynı anda kaydedilen nöronların (üç kutulu bölgeler, en iyi panelleri) inhibitör Post sinaptik potansiyeller (IPSPs) yol açtı. Tek tek her neuron kaydedilen renk netlik için kodlu yanıtlardır. Fiziksel bağlantı haritanın alt panelinde gösterilir. (B) gösterilen ham izlemeler ortalamaları en az 20 ardışık ham veri temizleyicileri temsil unutmayın. Sözde hücre tipinin tanımlaması soma şekli, floresan boya yanıt geçerli enjeksiyon adımları olarak ateş desenleri dahil olmak üzere iç Elektrofizyolojik özellikleri ve kayıtları sırasında doldurma tarafından Morfoloji analizi dayanıyordu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

NMDG-HEPES aCSF HEPES holding aCSF ACSF kayıt
Bileşen mM MW g/litre mM MW g/litre mM MW g/litre
NMDG 92 195.22 17.96
HCl 92 36.46 *
NaCl 92 58.44 5,38 124 58.44 7.25
KCl 2.5 74.55 0,19 2.5 74.55 0,19 2.5 74.55 0,19
NaH2PO4 1.2 138,00 0.17 1.2 138,00 0.17 1.2 138,00 0.17
NaHCO3 30 84.01 2.52 30 84.01 2.52 24 84.01 2,02
HEPES 20 238.31 4.77 20 238.31 4.77 5 238.31 1.19
Glikoz 25 180.20 4.51 25 180.20 4.51 12,5 180.20 2.25
Sodyum askorbat 5 198,00 0,99 5 198,00 0,99 0 198,00 0,00
Tioüre 2 76.12 0,15 2 76.12 0,15 0 76.12 0,00
Sodyum pyruvate 3 110.04 0,33 3 110.04 0,33 0 110.04 0,00
MgSO4.7H2O 10 246.48 5 mL 2 246.48 1 mL 2 246.48 1 mL (2M stok)
CaCl2.2H2O 0,5 147.01 0.25 mL 2 147.01 1 mL 2 147.01 1 mL (2M stok)
* titre NMDG-HEPES aCSF 7.3 7.4 konsantre HCl kullanarak için pH
Tüm çözümler aralığı 300-310 mOsm/Kg olmalıdır

Tablo 1: Medya formülasyonları.

Hayvan Yaş
Süresi (dk) * < 1 ay 1-3 ay 3-6 ay 6-12 ay 12 + ay
0 250 ΜL 250 ΜL
1
2 250 ΜL
3
4 500 ΜL
5 250 ΜL 250 ΜL
6 1000 ΜL
7
8 2000 ΜL
9
10 transfer 500 ΜL 250 ΜL 250 ΜL
11
12
13
14
15 1000 ΜL 500 ΜL 250 ΜL 250 ΜL
16
17
18
19
20 2000 ΜL 1000 ΜL 500 ΜL 250 ΜL
21
22
23
24
25 transfer 2000 ΜL 1000 ΜL 500 ΜL
26
27
28
29
30 transfer 2.000 ΜL 1000 ΜL
31
32
33
34
35 transfer 2.000 ΜL
36
37
38
39
40 transfer
* An dilimleri ilk kurtarma odasına aktarılır zaman sıfırdır

Tablo 2: Kademeli Na için önerilen zamanlama + fare yaş göre spike-in prosedürü.

Discussion

Na + Spike, Gigaohm mühür oluşumu ve yama kelepçe başarı kayıt geliştirir
NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ilk sürümü özellikle yetişkin ve atma hayvanlar2,5için tasarlanmıştır. Biraz erken benimseyenler de çocuk hayvan beyin Dilimleme için bu yöntemi uygulamak çalışmışlardır (Yani, fareler < 30 gün eski). Ancak, bu olağanüstü görsel olarak teyit nöronal korunması aksine bu yaş aralığında NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ile gigaohm mühür oluşumu sık sık dışarı, girişimleri kayıt başarısız yama kelepçe için önde gelen oyalayabilirim olduğunu not edildi. Bir hipotez NMDG özellikler daha kolay yetişkin beyin dilimleri göre çocuk beyin dilimleri içinde sıkışıp kalırlar ve mühür oluşumu engelleyebilir. Ancak, genç beyin dilimler tam olarak NMDG aCSF (veri gösterilmez) batık iken gigaohm mühürler kolayca oluşturabilir, böylece gösteren o NMDG aCSF başına gigaohm mühür oluşumu engelleyen şey değil.

Düşük yüksek Na+ çözüm ilk beyin dilim kurtarma adım bitiminde hızlı geçiş nöronal membranların hasara neden ve mühür oluşumu süreci perturbs. Verilen bu Mg2 + oranı düşük yüksek Na+, soğuk sıcak sıcaklık ve dramatik ayrıcalık yükselmesi Ca2 + geçiş toplu olarak kurşun spontan sinirsel aktivite büyük bir canlanma için bu sezgileri var. Bu yordam Dilimleme beyin inhibitör rebound aşamasında iskemik hakaret takip reperfüzyon hasarı ayna muhtemeldir. Böylece, daha da nöronal membran hasarı olduğu Na+ konsantrasyon NMDG koruyucu kurtarma kuluçka odasında yükselmesine yavaş yavaş yavaş yavaş Na+ spike-in prosedürü dahil ilk kurtarma aşamasında azaltmak ve tekrarlanarak hassas zamanlama ile yükseltilmiş. Özgün koruyucu kurtarma yordamı olduğu gibi sıcaklık yüksekliğinden Na+ ve Ca2 +/Mg2 + oranı ayrıcalık zamansal ayrılma faydalıdır. Ama Ayrıca, spike-in Na+ prosedürü artımlı artışlar küçük hücre dışı Na+ konsantrasyon erken zaman puan ve böylece beyin dokusu saglayan geç zaman Puan doğru büyük artışlar üzerinde yol açar bir daha iyi yükselen Na+ seviyesi yerleştirmek için bir fırsat. Bu yordam kademeli çözüm Satım alternatif bir perfüzyon pompa veya yerçekimi tarafından denetlenen Na+ düzeyleri sabit artışlara yol ve giriş ve çıkış taşma dilim odasının önlemek için dikkat gerektiren damla satırlar olacaktır. Özellikle, bu Na+ spike-in dilim odası çözümde osmolalite prosedürü yavaş yavaş bir dilimleri normal osmolalite eriyik-e doğru döndürülür, ancak bu dilim sağlığı olumsuz yönde etkilemedi birkaç dakika boyunca yükselir ya da yama kelepçe başarı kaydetme. Bir yüksek osmolalite kesme çözüm daha önce Orta dilim hazırlıkları daha iyi dopamin nöronlar için böylece gösteren yama kelepçe kayıtları57,58, o bu geçici korumak için kullanılmıştır hyperosmolality bazı bağlamlarda yararlı olabilir.

NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ve kademeli Na+ birleştirerek en iyi duruma getirilmiş bir yordamı uygulayarak spike-adım bu beyin dilim metodoloji yardımcı programı olgun yetişkin hayvan çağlar boyunca Juvenil kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Güncellenme Zamanı bu iletişim kuralı şimdi geniş bir tek en iyi NMDG aCSF formülasyonu ve yordamı kullanarak hayvan yaş için uygundur. Gerekirse, spike-in Na+ prosedürü bir aşamalı olarak daha uzun gecikme ve/veya beyin dilim üzerinden büyük hayvanlar canlılık geliştirmek için daha yavaş zaman ders ile uygulanabilir ve spike içinde önerilen zamanlamaları göre temel bir rehber hazırladık hayvan için yaş (bkz. Tablo 2). Biz temel bir çerçeve uygulamaları geniş bir dizi için uygun şartıyla iken, ek gelişmiş adımlar daha fazla canlılık ve uzun yaşam-in beyin dilimleri yetişkin ve atma hayvanlardan geliştirme için keşfedilmeyi olabilir. Örneğin, glutatyon restorasyon stratejileri bu bağlamda özellikle etkilidir ve başka bir yerde2,6açıklandığı gibi uygulanabilir.

Deneyler zor için üretilen iş geliştirme
Yama kelepçe kaydederek sinaptik bağlantı analizi başarı yüksek bir güvenilirlik elde etmek için nöronal yapısı ve işlevi mükemmel korunması gereken zorlu bir uygulamadır. Aynı anda kaydedilmesi için nöronların sayısı olarak doğrusal olarak, teknik zorluk seviyesi supra-doğrusal olarak artar artar. Çok sayıda hata modu vardır ve bir veya daha fazla hedef hücreleri üzerine form yeterli gigaohm mühürler yetersizlik başarısızlık en sık nedenleri biridir. Bu ilerleme, özellikle üç büyük ölçüde yavaşlatabilir veya daha fazla nöronlar aynı anda kaydedilmesi gerekir. Gigaohm mühür oluşumu zaman en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ile daha hızlı bulgusu ile tutarlı, transgenik başarı oranı ve akış verimi çok nöron yama kelepçe kayıt deneyler, belirgin bir iyileşme ile her iki yetişkin fare beyin dilimlerini ve yetişkin insan Nöroşirürji beyin dilimleri. İyileştirilmiş verimliliği neredeyse kesinlikle daha hızlı ve güvenilir gigaohm mühür oluşumu ve dilimleri bu iletişim kuralı ile geliştirilmiş nöronal korunması atfedilebilecek olduğunu. Bu iletişim kuralı açıkça uygulamalar kayıt düzeltme eki kelepçe için faydaları üzerinde duruluyor olsa da, benzer kazançlar beyin dilim canlılığı her şeyden nerede diğer zorlu deneysel uygulamalar için beklenmektedir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser beyin bilim için Allen Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Allen Enstitüsü kurucuları, Paul G. Allen ve Jody Allen, vizyon, cesaret ve destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de hayvan bakımı, Hayvancılık ve Genotipleme gerçekleştirmek için Allen Enstitüsü teknik destek personeline teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compresstome VF-200 Precisionary Instruments VF-200 Vibrating tissue slicer (recommended)
N-methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 aCSF constituent
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014 aCSF constituent
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5405 aCSF constituent
Sodium Phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71505 aCSF constituent
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 aCSF constituent
HEPES Sigma Aldrich H4034 aCSF constituent
Glucose Sigma Aldrich G7021 aCSF constituent
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A4034 aCSF constituent
Thiourea Sigma Aldrich T8656 aCSF constituent
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P5280 aCSF constituent
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902 aCSF constituent
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma Aldrich M1880 aCSF constituent
2,2,2-Tribromoethanol  Sigma Aldrich T48402 Anesthetic component 1
2-methyl-2-butanol  Sigma Aldrich 240486 Anesthetic component 2
Curved blunt forceps Fine Science Tools 11065-07 Brain dissection tools
Fine dissecting scissors (supercut) Fine Science Tools 14058-09 Brain dissection tools
Large heavy duty scissors 7'' Fine Science Tools 14000-18 Brain dissection tools
Metal spatula Sigma Aldrich Z511455-1PAK Brain dissection tools
Razor blades VWR 89031-954 Brain dissection tools
Brain Slice Keeper-4 Automate Scientific S-BSK4 brain slice holding chamber
nylon netting  Warner Instruments 64-0198 For building small slice recovery chambers
Pyrex glass beakers (250 mL) VWR 89090-434 For building small slice recovery chambers
35 mm plastic dish, round VWR 100488-376 For building small slice recovery chambers
Gas diffuser stones (10 µm) Sigma Aldrich 59277 For constant carbogenation (fine bubbles)
Agarose Type I-B Sigma Aldrich A0576 For embedding brain specimens
Micro loader tips Eppendorf 22491229 For filling patch clamp electrodes
Sylgard VWR 102092-312 For making a custom dissecting platform
Hydrochloric acid  Sigma Aldrich H1758-100ML For pH adjustment of media
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich 221465-25G For pH adjustment of media
Potassium Hydroxide Sigma Aldrich 221473 For pH adjustment of media
Plastic transfer pipets 3 mL graduated VWR 89497-676 For slice transfer
Zirconium ceramic injector blades Cadence Specialty Blades EF-INZ10 http://cadenceinc.com/
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament King Glass Company custom quote ID: 0.87mm, OD 1.50mm
Biocytin Sigma Aldrich B4261 Intern pipette solution
Phosphocreatine disodium Sigma Aldrich P7936 Intern pipette solution
Potassium Gluconate Sigma Aldrich G4500-100G Intern pipette solution
EGTA Sigma Aldrich E3889 Intern pipette solution
Mg-ATP Sigma Aldrich A9187 Intern pipette solution
Na2-GTP Sigma Aldrich 51120 Intern pipette solution
sucrose Sigma Aldrich S0389 Intern pipette solution
Heated water bath (2.5L) VWR 13491-060 Miscellaneous
Filter paper rounds VWR 28456-022 Miscellaneous
Cyanoacrylate glue Amazon B000BQRBO6 Miscellaneous
Glass petri dish VWR 89000-326 Miscellaneous
10X Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5493 Miscellaneous
30 mL syringes VWR BD302832 Miscellaneous
1 mL syringes VWR BD-309628 Miscellaneous
25 5/8 gauge needles VWR 89219-292 Miscellaneous
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) VWR 89232-908 To keep agarose molten 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303, (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148, (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1, (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23, (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26, (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24, (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80, (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31, (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34, (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37, (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95, (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32, (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8, (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18, (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84, (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110, (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113, (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16, (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77, (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34, (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33, (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33, (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39, (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64, (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76, (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79, (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35, (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33, (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350, (6264), 9462 (2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9, (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58, (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9, (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59, (2), 288-297 (2008).
En iyi duruma getirilmiş bir <em>N</em>kullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ting, J. T., Lee, B. R., Chong, P., Soler-Llavina, G., Cobbs, C., Koch, C., Zeng, H., Lein, E. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (132), e53825, doi:10.3791/53825 (2018).More

Ting, J. T., Lee, B. R., Chong, P., Soler-Llavina, G., Cobbs, C., Koch, C., Zeng, H., Lein, E. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (132), e53825, doi:10.3791/53825 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter