Abstract
Det enteriske nervesystem (ENS) spiller en vigtig rolle i reguleringen af gastrointestinal (GI) motilitet og kan fungere uafhængigt af centralnervesystemet. Ændringer i ENS funktionen er en væsentlig årsag til GI symptomer og sygdom, og kan bidrage til GI symptomer rapporteret i neuropsykiatriske lidelser, herunder autisme. Det er velkendt, at isolerede kolon segmenter generere spontane, rytmiske sammentrækninger kendt som Colon Overfør Motor komplekser (CMMCs). En procedure til at analysere enterisk neurale regulering af CMMCs i ex vivo præparater af mus kolon beskrives. Tyktarmen dissekeres fra dyret og skylles for at fjerne fækalt indhold, inden den kanyle i et organbad. Data erhvervet via et videokamera anbragt over organbadet og omdannes til høj opløsning spatiotemporale kort via en intern softwarepakke. Ved hjælp af denne teknik, baseline kontraktile mønstre og farmakologiske virkninger på ENS funktionen i tyktarmen segments kan sammenlignes over 3-4 timer. Desuden kan formering længde og hastighed CMMCs registreres samt ændringer i tarmen diameter og sammentrækning frekvens. Denne teknik er nyttig til karakterisering gastrointestinal motilitet mønstre i transgene musemodeller (og i andre arter, herunder rotte og marsvin). På denne måde er farmakologisk inducerede ændringer i CMMCs registreres i vildtypemus og i Neuroligin-3 R451C musemodel for autisme. Endvidere kan denne teknik anvendes på andre områder i mavetarmkanalen, herunder duodenum, jejunum og ileum og på forskellige udviklingsmæssige aldre i mus.
Introduction
Det enteriske nervesystem (ENS) er den iboende neuronale netværk af mavetarmkanalen og modulerer forskellige funktioner såsom fordøjelse af tarmindhold, optagelse af næringsstoffer og sekretion og reabsorption af væske. Neuroner i ENS er placeret i de myenteriske og submukøse plexus. Myentericus plexus spiller en stor rolle i regulering af gastrointestinal motilitet 1 henviser det submukøse plexus er primært involveret i kontrollen af sekretion 2,3. Myentericus plexus ligger mellem de langsgående og cirkulære muskellag i mave væg. Kontraktile aktivitet af glat muskel lag af tarmvæggen letter de primære funktioner i mavetarmkanalen ved blanding og fremdrive tarmindhold langs længden af tarmen 3. Selv om den ydre nerveforsyningen til mavetarmkanalen fra CNS bidrager til gastrointestinal funktion in vivo, ENS er i stand til regulering af gastrointestinal funktion uafhængigt. Denne unikke egenskab gør det muligt funktionelle undersøgelse af enteriske neuronale kredsløb og deres bidrag til gastrointestinal motilitet ex vivo.
Colon migrerer motoriske komplekser (CMMCs) er spontane, neurogene begivenheder, der er den fremherskende motor mønster observeret i isolerede mus kolon i mangel af fecal pellets 4-9. CMMCs defineres som rytmiske sammentrækninger, der udbreder sig langs en horisontal afstand, som er mindst halvdelen af den samlede længde af tyktarmen (dvs. fra coecum til endetarmen) 10. Forholdet mellem CMMCs og kontraktile mønstre, der fremdrive fækalpellets er endnu ikke klart fastlagt, dog nogle farmakologiske forskelle er blevet rapporteret 11. Alligevel evne ENS kan fungere uafhængigt af CNS og eksistensen af neurale-medieret motordrevne mønstre i ISolated kolon giver en ideel analysesystem at undersøge forstyrrelser i motilitet som følge af underliggende ENS dysfunktion. Den spontanitet af gastrointestinale motoriske mønstre giver funktionelle ændringer i respons på farmakologiske stimuli skal evalueres.
Brugen af video billedbehandling og Spatiotemporal kortlægning blev først udviklet til kvantitativt at undersøge små tarmperistaltikken i marsvin 12. Her er en ex vivo teknikken beskrevet som muliggør studiet af muse colon motilitet mønstre ved hjælp af video billeddannelse og analyse af sådanne optagelser at konstruere høj opløsning (~ 100 um, 33 ms) kort af colon diameter som funktion af positionen langs kolon og af tid (spatiotemporale maps). Brug i-hus kant afsløring software (Analyse2, efter anmodning), er data fra fuld længde colon segmenter ordregivende i realtid behandlet for at generere spatiotemporale kort til hvert forsøg. I dette trin video (AVI) filer er summarized og konverteret til spatiotemporale kort ved hjælp Analyse2. Spatiotemporale kort (figur 2) viser kontraktilitet over tid og muliggøre måling af flere parametre, herunder udbredelseshastighed, størrelse, længde og varighed. Gut diameter optages også under hele forsøget som et mål for den samlede kontraktilitet af vævet segment. Denne metode kan anvendes til at identificere forskelle i punkt om indledning af kontraktile komplekser som kunne indikere ændret enterisk neural forbindelse.
En lignende video imaging protokol designet til at vurdere pellet fremdrift i marsvin er blevet rapporteret 13 dog her vi skitsere anvendelsen af videoen imaging tilgang til kvantificering af spontan colon motilitet (dvs, i fravær af pellets). Vi giver også detaljerede oplysninger for at hjælpe dissektion og forberedelse af gastrointestinal væv for video imaging tilgang. Denneprotokol giver forskere med en tilgængelig og nemt gentages værktøj til analyse enterisk neurale styring af gastrointestinal funktion i dyremodeller for sygdomme, herunder genetiske musemodeller.
Videoen imaging teknik muliggør analysen af colon motilitet som reaktion på forskellige farmakologiske midler. Lægemidler kan indgives via tarmlumen eller organbadet uden for colon præparat. Forskellige regioner af muse mavetarmkanalen udviser specifikke motilitet mønstre såsom små intestinale segmentering og CMMCs i tyktarmen.
Denne teknik er blevet anvendt til at identificere strain forskelle i tyndtarmens funktion; differentiel følsomhed over for 5-HT 3 og 5-HT 4-antagonister blev observeret i jejunum af Balb / c og C57 / BL6-mus på grund af den polymorfe beskaffenhed af TPH2 genet udtrykkes i de to stammer 6. Virkningen af 5-HT-inhibering på motilitet forbliver conkontroversielt, da modstridende data er blevet rapporteret om betydningen af endogene 5-HT på colon peristaltikken og CMMCs 14,15. Ændringer i motilitet præ- og postnatalt under udviklingen 7, og virkningerne af genmutationer på gastrointestinal motilitet i dyremodeller for sygdomme 10 kan også undersøges ved at bruge video billeddannelse. Her viser vi brug af metoden til en undersøgelse af colon motilitet i NL3 R451C musemodel for autisme, som udtrykker en missense mutation i Nlgn3 gen, der koder den synaptiske vedhæftning protein Neuroligin-3 16. Denne mutation blev først identificeret i patienter diagnosticeret med autisme spektrum forstyrrelse (ASF) 17, som er stærkt forbundet med GI dysfunktion 18-22. Vi undersøgte, om NL3 R451C synaptiske mutation påvirker neurale udgange i ENS hjælp af video imaging teknik. Vi præsenterer data karakteriserer CMMCs ved baseline og som svar på den serotonerge 5HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i NL3 R451C musemodel for autisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal håndtering og cervikal dislokation af dyr før alle forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med protokoller godkendt af dyreforsøg Komité for University of Melbourne (Etik ID: 1.212.494,7)
1. Tissue Collection og Dissection
- Euthanize voksne mus ved cervical dislokation. Hvis det er muligt at undgå bedøvelse for at forhindre påvirkninger tarmfunktion via receptorer på neuronale populationer af interesse.
- Optag dyrets samlede kropsvægt, pin kroppen (via de fire poter, ventrale side udsættes for forsøgslederen) fast til en dissektion bord ved hjælp af kanyler (Størrelse: 20 G).
- Brug af dissekere pincet og saks; lave et snit gennem epidermis overlejrer de lavere abdominal muskellag. Fortsæt med at bruge pincet og saks til at åbne bughulen langs midterlinjen af maven til brystbenet.
- At forhindre vævet dehydrerende, hæld physigiske saltvand (Krebs-opløsning: 118 NaCl, 4,6 KCI, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH 2 PO4, 25 NaHCO3, 11 D-glucose i mM - boblet ved stuetemperatur med carbogen gas; 95% O2 og 5 % CO2 i mindst 20 min) på abdominale indhold med jævne mellemrum (dvs. hver 30-60 sek) under dissektion processen.
- Til isolering af tyktarmen, mens fastgjort til coecum og rectum, holde coecum (placeret tilstødende den proximale ende af kolon) forsigtigt ved anvendelse dissekere pincet ca. 4-5 cm over kroppen af dyret under trimningen mesenterium hjælp fine dissektion saks.
- Pas på ikke at håndtere, strække eller skære mave væv samtidig fjerne den tilstødende mesenterium.
- Fjern overskydende væv (dvs., urinblære og testikler). Brug grove Dissecting saks, lave to lodrette snit (dvs. ca. 0,5 cm fra midterlinjen) at skære skinkeben på each side af tyktarmen.
- Anvendes der fine sakse til at adskille rektum fra tilstødende bækken væv og trim omgivende muskel fra tyktarmen.
- Placer fuld længde kolon (fra coecum til endetarmen) i et bægerglas indeholdende fysiologisk saltvand (tidligere iltet med carbogen) og fortsætte med at ilte ved stuetemperatur. Fjern blindtarmen og endetarmen ved hjælp fine dissekere saks og erstat i bæger.
- Tomme fækalpellets / tarmindholdet fra colon præparater ved at tilføre et let positivt tryk under den mundtlige ende under anvendelse af en 5 ml sprøjte fastgjort til en 200 pi pipettespids fyldt med fysiologisk saltvand. For at orientere vævet i fremtiden, bruge et insekt pin at markere den mest proximale ende af tyktarmen, hvor riller i slimhinden er synlige.
- Modificere plast pipettespidsen til at passe til 5 ml sprøjte ved at fjerne ca. 1 cm af det bredeste / proksimale ende under anvendelse af et barberblad. For at øge flowet, udvide den distale / mindre ende ved at skære på en angle (ca. 45 ° C) under anvendelse af et barberblad.
- Grip tyktarmen væv forsigtigt ved sin proximale ende med dissekere pincet, indsætte pipettespidsen i lumen i colon og flush fysiologisk saltvand gennem hulrummet.
2. Udarbejdelse af Colon Tissue og Eksperimentel Set Up for Video Imaging
- Flush fysiologisk saltvand gennem alle rør fastgjort til en to kamre organbad oprettet (figur 1 og figur 3), anvendelse af en sprøjte fastgjort til en 200 pi pipettespids. Dette trin fjerner eventuelle rester inden slangen, der kunne blokere for strømmen af opløsning. For slanger specifikationer henvises til materialer tabellen.
- Sørg for, at kamre orgel bad kontinuerligt overhældt med fysiologisk saltvand boblede med carbogen (95% O 2 og 5% CO2, strømningshastighed af 5 ml min-1). Ved hjælp af en temperaturføler med jævne mellemrum, at sikre, at Temperature af badet holdes mellem 33 ° C -37 ° C.
- Fyld indstrømningen reservoir forbundet via en 3-vejs stophane til indløbsrøret med ca. 20-30 ml fysiologisk saltvand under anvendelse af en 50 ml sprøjte.
- Under eksperimentet opretholde trykket i tilgangen reservoir under anvendelse arubber prop med et glasrør (5 mm indvendig diameter) indsat gennem dens centrum. Sørg for, at den øverste åbning af indstrømningen reservoir er forsvarligt forseglet (med den indre glasrør resterende tætnet).
- Placer kolon (længde 5-7 cm) ind i orgel bad kammer, og sørg for, at det er fuldt nedsænket i fysiologisk saltvand.
- Kanyle hver ende af colon-segmentet til de to nedsænkede ind- / udløbs rør (indløb / udløb rør med forskellig diameter kan ændres efter størrelsen af de væv lumen f.eks. Postnatal væv, voksne mus og marsvin) i badet ved hjælp af standard bomuld sytråd. Fastgør den proksimale ende af tyktarmen til indløbsrøret ogdistale ende af tyktarmen til udløbsrøret (forbundet via en 3-vejs stophane til en lodret udmunder; 6 cm i højde). Sørg for, at vævet ikke er overbebyrdet eller for afslappet efter kanylering at undgå interferens med fremtidige målinger og analyser.
- Optage længden af tyktarmen ved at måle afstanden mellem de proksimale og distale kanyleringerne bruger 15 cm lineal. Dette er vigtigt for at fortolke ændringer i sammentrækning længde, udbredelseshastighed og sammentrækning initiation point.
- Sikre en stabil basislinje luminale tryk (cm H2O) er etableret, før du begynder eksperimentet. Beregn luminale tryk ved at måle den lodrette afstand fra vævet til menisken i fysiologisk saltvand inden glasrøret af indstrømning reservoir (oral) og den lodrette udstrømning rør (anal).
- Oprethold vævspræparater ved et konstant intraluminale tryk (f.eks 1-2 cm H2O) ved at sikre, at tilstrømningen prop tætning tryk lore holdes konstant, og at der ikke blokeringer er til stede i sættet op.
- Lad tyktarmen i ligevægt i fysiologisk saltvand i 30 min før optagelse tarm bevægelser. Kontroller for eventuelle blokeringer opstår i ind- eller udstrømning rør og fjerne dem ved at anvende pres gennem tilgangen reservoir eller ved at re-kanylering de orale og anale ender i tyktarmen.
3. Billedoverførsel og Eksperimentel protokol
- Optag tarm bevægelser som video filer ved hjælp af et videokamera (30 billeder / sek, 640 x 840 pixels) placeret 10-15 cm over orglet bad på en standard laboratorium retort stå (figur 1).
- Åbn Virtual Dub (videooptagelse software) fra ikonet på skrivebordet. Under fanen "Filer", vælg "capture AVI" for at se kameraets billede. På 'Lyd' fanen fravælge "aktivere audio capture" for at deaktivere lyd.
- På fanen video vælg 'kompression "og" DivX6.9.2. Codec & #39; at komprimere video filer til at minimere brugen af lagerplads. Denne funktion vil blive tilgængelige på installation af kompression software "DivX".
- Manuelt justere kameraets placering, således at hele kanylerede colon-segmentet er synlig (med kanylerede regioner umiddelbart op til de vertikale kanter af videobilledet) via video capture software vindue (se figur 1). For at forbedre billedkvaliteten og minimere refleksioner, vedhæfte et papir / pap skjold til kameraet støtte til at blokere udefra kommende lys på orglet bad. Optimer videokvaliteten ved at justere indstillingerne for lysstyrke, kontrast og eksponering bruger kameraet software interface.
- Før optagelse, angive en bestemt filnavn; under fanen 'Filer' skal du vælge 'Set capture file "og angive et entydigt navn til videoen.
- Begynd at optage video ved at trykke på "Capture filen 'fra" Capture "værktøjslinjen. For at stoppe recording vælge knappen "Stop capture" eller "Esc" tasten på tastaturet.
- Erstatte den fysiologisk saltvand indeholdt i indstrømningen reservoiret med frisk fysiologisk saltvand hver 30 min.
- Optag luminale tryk (se 2.9), og ved hjælp af en temperaturføler, notere orglet badet temperatur. Gentag disse trin gennem hele forsøget (dvs. hver 30 min) for at sikre, at disse variable er konstante.
- Optag colon aktivitet i alt til 3 timer (herunder narkotika ansøgning og udvaskning varighed). Til lagring af data formål registrerer data i 15 min video segmenter. En fuld eksperiment vil typisk bestå af 12 x 15 min videooptagelser.
- Optag aktivitet i 1 time under kontrolbetingelser (fysiologisk saltvand).
- Påfør lægemidlet (enten overhældt ind i badet eller administreres i lumen via tilgangen reservoir) i 30 min til 1 time.
Bemærk: Forskellige administrationsveje kan yield forskellige effekter 23. - Anvend frisk fysiologisk saltvand til badet eller lumen i løbet af en 1 time udvaskningsperiode.
4. Databehandling og Generation of Maps Spatiotemporal
- Proces hver videooptagelse offline med in-house software skrevet i MATLAB (R2012a, Version 7.4, efter anmodning) for at generere spatiotemporale kort illustrerer colon motilitet.
- Åbent analyse software fra ikonet på skrivebordet.
- I kommando vinduet, indtaste "Analyse2" for at åbne analysen kontrolpanelet.
- Udnyt kanten afsløring funktion til at generere spatiotemporale kort ved at klikke på "Edge detektion for .avi filer" i vinduet på kontrolpanelet. Denne funktion gør det muligt analysen software til at læse recoded videoer i Audio Video Interleaved (AVI) format.
- Udfør følgende trin sekventielt at generere spatiotemporale kort ved hjælp af et adaptive kantdetektering algoritme.
- Åbne optagede videofiler ved at vælge "Tilføj filer" fanen, skal du vælge 'Åbn video', og vælg placeringen af videofiler.
- Fra videofilerne opført i analyse software, vælge filen af interesse.
- Vælg et rektangulært område af interesse inden for rammerne af videoen, f.eks hele længden af tyktarmen, fra det punkt, hvor tyktarmen kanyleres oralt til den anale kanylering. Sikre, at de proksimale og distale kanylering punkter er støder op til de lodrette grænser området af interesse. Edge afsløring linjer (rød og grøn) vises automatisk overlejret på realtid billedet.
- Sikre, at kantdetektering tærskel linjer er umiddelbart op til tyktarmen på både de øvre og nedre grænser for colon væv (dette kan optimeres til hver video ved at ændre påvisning tærskelværdier på kontrolpanelet). Sørg for, at kanten afsløring lines er kontinuerlig langs længden af tyktarmen billedet ved at justere kontrast og lysstyrke ved hjælp af kontrolpanelet.
- Indtast den fulde længde af tyktarmen (mm) ind bredden dialogboks (som registreret i trin 2.7). Vælg derefter "Generer zonekort".
- I pop op-vinduet, skal du vælge en placering til filen skal gemmes, og angiv et filnavn til den Spatiotemporal kortet.
- Vælg ".su2 'format og vælg' Føj til kø".
Bemærk: .su2 format komprimerer data til en mindre filstørrelse og flere videofiler kan tilføjes til køen. - Vælg 'Start detektering "til generering spatiotemporale maps.
5. Analyse af Maps Spatiotemporal
- Udnyt spatiotemporale kort til at estimere parametre som frekvens, formering hastighed, længde og varighed af CMMCs, tarm diameter og det sted, initiering og retning sammentrækninger.
- For at begynde at analysere spatiotemporalekort, type «analyse2 'i kommandoen vinduet som beskrevet i det foregående afsnit. I stedet for "Edge afsløring", vælg "Heat kortet analyse" knappen.
- Åbne spatiotemporale kort filer (.su2 filer) ved at vælge fanen 'Tilføj filer "og med angivelse af placeringen af tidligere opnåede .su2 filer.
- Når Spatiotemporal kortet er synligt på skærmen, angive en farveskala på kontrolpanelet, der sikrer, at den mindste er indstillet til 1.
Bemærk, at den maksimale kan variere fra 5-10 ifølge kontraktilitet af vævet. - Vælg 'Lock farveområde "for at sikre, at alle kortene fra et enkelt forsøg er analyseret under samme betingelser.
- Sørg for, at tidsrammen indstillinger er konstant for alle spatiotemporale kort fra en given eksperiment.
- For at bestemme CMMC frekvens, manuelt tælle sammentrækninger går igennem mere end 50% af længden af tyktarmen. Disse sammentrækninger kan være udstyr og forretnilized som rød / orange striber (standard HSV farve indeks) på Spatiotemporal kortet (se figur 2 for et eksempel). Andre sammentrækninger, der er kortere eller ikke udbreder kan også identificeres og kvantificeres.
- Hvis det ønskes, foretage yderligere analyser i en højere opløsning fra disse kort. For eksempel kan detaljerede egenskaber, herunder hastigheden og varigheden af hvert sammentrækning undersøges.
- For at måle hastighed og varighed, skal du vælge knappen "Anmærke sammentrækning bølger" på zonekort analyse kontrolpanel.
- Dernæst zoome ind til de enkelte CMMC ved at klikke på knappen "Zoom" og vælge det område af interesse. Vælg derefter på knappen "Manuel anmærke" at anmærke hver sammentrækning ved at bruge musen til at trække en linje fra den mest udgangsposition til slutningen af hver sammentrækning. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at måle den tilsyneladende udbredelseshastighed og varigheden af udvidelser, der synes at forplante (for eksempel, se etal ende af kortene i figur 2A, 2B).
Bemærk: data for hastighed og varighed vises under vinduet resultater. Disse værdier kan overføres til et regneark med interesse ved at vælge fanen "Export data". Uønskede annotationer kan fjernes ved at klikke på knappen "Fjern valgte anmærkninger".
- Om ønsket udnytte x- og y-koordinaterne for de spatiotemporale maps (tid og position langs kolon, henholdsvis) for at bestemme positionen af indledningen af små sammentrækninger eller CMMCs.
- Ligeledes for at kunne fastslå intervaller mellem veerne, bruge "Kommentér" funktion til at måle varigheden mellem veerne. Som tidligere, kan disse resultater eksporteres til et regneark ved at vælge fanen "Export data".
- For at måle den hvile gut bredde, skal du vælge knappen "Tag tværsnit" på Heat kortet analyse panel.
- Vælg 'Tilføj9; om den tidsmæssige panel tværsnit. Dobbeltklik på ethvert sted inden for kort til at generere en horisontal linje overlejret på varme kort. data Gut diameter vil nu blive vist i et nyt vindue.
- For at måle gut diameter, placere markøren på en top og tilstødende trug at opnå gennemsnitlig gut bredde for en bestemt eksperimentel tilstand. Ændringer i tarmen diameter kan sammenlignes mellem eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op til 90% af patienterne med ASF oplever et array af gastrointestinale lidelser, herunder diarré og forstoppelse 18,24,25. Men de underliggende årsager til disse gastrointestinale problemer er ukendt. Mange mutationer identificeret i patienter med ASF er forbundet med synaptiske proteiner bidrager til ændringer og forstyrrelser i synaptisk transmission eller funktion. En sådan mutation, i det gen, der koder for celleadhæsionsmolekylet neuroligin-3 (NL3 R451C), blev identificeret i to brødre med ASD 17. Denne mutation resulterer i en argininrest i position 451 af Neuroligin proteinet bliver erstattet med en cystein. NL3 R451C mus, der udtrykker denne mutation viser øget GABA medieret transmission i somatosensoriske cortex 16,26 sammen øget AMPA og NMDA-receptor medieret aktivitet i hippocampus 25,27.
28-30. Som det enteriske nervesystem spiller en stor rolle i regulering af gastrointestinal funktion, vi postuleret, at R451C mutation ville påvirke motilitet. Derfor, for at undersøge mulige ændringer i mave-funktioner på grund af synaptiske abnormiteter vi forsøgt at undersøge virkningerne af R451C mutationen på CMMC frekvens i disse mus.
Fordi serotonin (5-HT) virker på ENS at modulere gastrointestinal funktion i mus 6 analyserede vi motilitet mønstre som respons på 5-HT 3/4 receptorantagonist tropisetron i colon præparater fra WT og NL3 R451C mus.
For at vurdere om den synaptiske mutation ændrer CMMCs når det enteriske nervesystem er farmakologisk forstyrres, 5HT 3/4 receptorantagonisten Tropisetron (Trop;10 um, som blokerer både 5HT3 og 5HT 4 receptorer) sattes til bad indeholdende kolon præparater (figur 2). Colonvæv fra nitten aldersmatchede hanmus (11 WT og 8 NL3 R451C) blev anvendt. I nærvær af tropisetron, viste NL3 R451C mus et fald i CMMC frekvens sammenlignet med WT kuld. Repræsentative eksempler på spatiotemporale kort, der viser CMMCs og kontraktile aktivitet i WT og NL3 R451C kolon præparater er vist i figur 2A til 2E hhv. Selvom der ikke blev observeret nogen forskel mellem WT og NL3 R451C under kontrol betingelser, tropisetron betydeligt reduceret CMMC frekvens i både WT og NL3 R451C mus (Figur 2C, 2F). I WT mus, median antal CMMCs var 23 i kontrol- betingelser i forhold til 15 i tropisetron (p = 0,023). I NL3 mus, median antal CMMCs i kontrol- betingelser var 19,5mod 2 i nærvær af tropisetron (p = 0,022). Desuden tropisetron havde en større effekt på hyppigheden af CMMCs i NL3 R451C mus sammenlignet med WT (p = 0,047).
Figur 1. organbad oprettet og generering af spatiotemporale maps. (A) En frisk dissekeret gastrointestinal segment anbringes i et organbad (tværsnit) indeholdende fysiologisk saltopløsning og kanyleret ved orale og anale ender. Den orale kanyle er forbundet til en indstrømning reservoir fyldt med fysiologisk saltvand og den anale kanyle forbundet til en udstrømning rør. Et videokamera er placeret over organbadet for at registrere kontraktile aktivitet i tyktarmen. (B) motilitet omdannes til høj opløsning spatiotemporale regioner i tyktarmen mærkning kort, der er udvidede i blå og trange områder in rød. (C) En Spatiotemporal kort, der viser colon motilitet (CMMCs) fra en voksen WT mus. Individuelle CMMCs er angivet som røde lodrette regioner i kortet. X-aksen viser tiden stigende (0-15 min). Y-aksen repræsenterer den rumlige placering langs colon segment (anal ved basis, oral øverst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. spatiotemporale kort viser øget følsomhed over for tropisetron i NL3 R451C muse colon spatiotemporale kort, der viser CMMC frekvens i kolon segmenter fra WT kontroller (A) og i nærvær af tropisetron. (Trop; B). Trop reduceret CMMC frekvens i WT kolon (C). Spatiote mporal kort fra NL3 kolon under kontrolbetingelser (D) og i nærvær af Trop (E). Trop forårsagede en kraftig reduktion i CMMC frekvens i NL3 kolon (F). CMMC frekvens som reaktion på Trop blev reduceret betydeligt i NL3 sammenlignet med WT kolon (p = 0,047, ikke vist). Gut bredde (pixel farve) er angivet på Y-aksen (arbitrære enheder, range 1-6). Scale bar i E gælder for alle kort. trop; Tropisetron. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk af orgel bad. (A) fra oven, (B) Undersiden, (C) forfra, (D) Side view, af en to kamre organbad oprettet. Mål i mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brug af denne video imaging teknik, blev CMMC frekvens målt som en indikation af colon motilitet i vildtype og NL3 R451C mus, en musemodel for autisme spektrum forstyrrelse 17. Vore resultater viser en reduktion i antallet af CMMCs i mutante NL3 R451C-mus sammenlignet med vildtype-mus i nærvær af 5HT 3/4 receptorantagonisten tropisetron antyder, at NL3 R451C mus udviser en øget følsomhed over tropisetron. Derfor foreslår vi, at neuroligin-3 R451C mutation ændrer serotonin pathway, potentielt ved at modulere enten 5HT 3 eller 5HT 4 receptorfunktion i enteriske neuroner, slimhinden eller begge. Dette fremhæver metodens værdi til identifikation af fænotypiske forskelle mellem genotyper og til identifikation af specifikke mål for efterfølgende undersøgelser.
Denne metode kan modificeres til at øge rumlige opløsning ved at erhverve videoer viaet stereomikroskop forsynet med et kamera mount. Denne tilgang muliggør optagelser, der skal foretages fra små præparater af mave-tarmkanalen på embryonale tidspunkter så tidligt som E12.5 31. Neuromodulatorer kan påføres via hulrummet eller i organbadet uden for colon præparat. Desuden er denne fremgangsmåde er anvendelig til vurdering både store og små gastrointestinal motilitet i en række arter, herunder mus, rotter og marsvin.
Fælles fejlfindingstrin for denne fremgangsmåde indbefatter kontrol af strømmen af opløsningen via slangen, levedygtighed af præparatet væv, opretholdelse af konstant luminale tryk og sikre, at colon-segmenter er placeret væk fra væggene i organbadet. Blokeringer i slangen kan ændre luminale tryk og forhindre sammentrækninger skade; derfor alle rør skal rengøres grundigt for at fjerne saltkrystaller eller snavs / fecal sagen kanyle. Luften skal fjernes fra slanger linjer direkte associeret med før forsøg (dvs. ved at prime rørene med saltvand) kanylen. Desuden skal præparater væv håndteres forsigtigt for at undgå skader medfører immobilitet af tyktarmen. For at undgå vævsskader, at tyktarmen er fast (men ikke stramt) er fastgjort til kanylen under optagelsen og opretholde en konstant temperatur og en konstant forsyning af CO 2 + O 2 til badet. Også sikre, at den luminale tryk holdes konstant, og at ingen kontraktioner manuelt initieres ved at justere indstrømningstiderne reservoirer under optagelsen periode. Sørg for, at tyktarmen væv ikke kontakte væggen i organbadet under veer, da dette vil forhindre kantdetektering analyse af de relevante spatiotemporale kort. Dette kan undgås ved at overvåge sammentrækninger i ækvilibreringsperioden og indstilling af positionen af tyktarmen for at forhindre dette i at ske under eksperimentet.
_content "> bør tages flere begrænsninger forbundet med denne teknik til overvejelse ved analyse og fortolkning af data, herunder den lille produktion natur af denne fremgangsmåde. Mens metode effektivt identificere ændringer i migrerende motoriske mønstre, kan den ikke afgøre, om dilations opstår under progression af en CMMC er neuralt medieret eller blot passive reaktioner på den kontraktile aktivitet (dvs. som følge af flytning af væske). de koncentrationsgradienter for diffusion på tværs af colon væg tillader virkningerne af luminally anvendte lægemidler, der skal tilskrives aktioner inden for slimhinde, men i lange eksperimenter kan opstå slimhinde degeneration derved ændrer de steder, hvor virkningen af disse lægemidler over optagelsen periode. Desuden om medicin har forskellige virkninger i myenteriske og submukøse plexus kan ikke bestemmes ved hjælp af denne metode. i modsætning hertil denne tilgang gør det muligt en kollektiv vurdering af virkningerne på enteriske nervous ved måling af en generel ændring i motilitet mønstre. Yderligere overvejelser omfatter behovet for at tage hensyn til arten af de data (dvs. tæller data for CMMC frekvens, der kræver ikke-parametrisk analyse) og den lave hyppighed af CMMCs, når designe eksperimenter og hensigtsmæssige strategier dataanalyse.For nylig, Barnes og kolleger foreslog, at colon væv kræver stimulation for at observere CMMCs 32, men offentliggjorde resultater fra vores laboratorium viser, at spontane CMMCs kan observeres ved blot pinning vævet på organet bad via mesenteriet 7. Tilstedeværelsen af CMMCs under disse betingelser viser ikke kun spontanitet CMMCs, men giver yderligere oplysninger om nytten af denne teknik til at fastslå ændringer i colon motilitet. Selv om denne fremgangsmåde er anvendelig til ekstra-colon regioner af mavetarmkanalen, kompleksiteten af tyndtarmens motilitet kræver mere thefattedes analysestrategier end dem, der anvendes til at kvantificere CMMCs 33.
Denne eksperimentelle fremgangsmåde har en meget høj rumlig og tidsmæssig opløsning og omfatter muligheden for lægemiddelafgivelse både uden for og inde i hulrummet for at undersøge virkningerne af varierende koncentrationsgradienter på det enteriske nervesystem. Desuden er denne metode er velegnet til at analysere tyndtarmens segmentering under fødeindtagelse 6,23. Ex vivo karakter af denne metode muliggør rolle det enteriske nervesystem, der skal vurderes i fravær af centralnervesystemet indgange og er derfor en ideel måde at undersøge gastrointestinal motilitet i en række forskellige modeller, herunder genetiske sygdomsmodeller (se figur 2) 6,34.
Denne metode kan også anvendes til at sammenligne fysiologiske data til computersimulationer af motorisk aktivitet 23,33,35. Sådanne simulationer kan forudsige motoriske mønstre ii form af spatiotemporale kort til direkte sammenligninger med fysiologiske eksperimenter 33,35. Ved hjælp af Fast Fourier Transform og wavelet analyse 36, kan bidraget fra glatte muskelceller pacemakere (genereret af interstitielle celler af Cajal) til motilitet også ekstraheret. Endvidere kan denne video imaging teknik kombineres med ekstracellulær registrering af elektrisk aktivitet i musklen 3 for at give bidrag neurale og myogene mønster generatorer skal skelnes. Bemærk, den ekstracellulære optagelse metode løser hæmmende junction potentialer i mangel af glatte muskelsammentrækninger eller lempelser.
Mens denne teknik er veletableret til analyse af gastrointestinal motilitet i en lang række præparater og arter, har også potentiale til at blive anvendt i andre systemer, såsom studiet af vasokonstriktion i mesenteriet (tidligere analyseret via en enklere diameter tracking system 37) ogi skeletmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB og ELH-Y blev støttet af det amerikanske Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) til ELH-Y.The May Stewart stipendium-Universitetet i Melbourne tillid finansieret stipendium til MS. Vi takker Ali Taher, Fátima Ramalhosa og Gracia Seger tekniske bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
