Abstract
Le système nerveux entérique (ENS) joue un rôle important dans la régulation gastro-intestinal (GI), la motilité et peut fonctionner indépendamment du système nerveux central. Changements dans la fonction ENS sont une cause majeure de symptômes gastro-intestinaux et les maladies et peuvent contribuer à des symptômes gastro-intestinaux signalés dans les troubles neuropsychiatriques, y compris l'autisme. Il est bien établi que les segments isolés du côlon génèrent, contractions rythmiques spontanées appelées colique Migration Motor Complexes (CMMCs). Une procédure pour analyser la régulation neurale entérique des CMMCs en ex vivo de préparations colon de la souris est décrite. Le côlon est disséqué de l'animal et rincée pour enlever le contenu fécale avant d'être une canule dans un bain d'organe. Les données sont acquises par une caméra vidéo placée au-dessus du bain d'organe et converti en cartes spatio-temporelles à haute résolution via un logiciel interne. Grâce à cette technique, les modes de contraction de base et les effets pharmacologiques sur la fonction ENS en colon segments peuvent être comparés sur 3-4 heures. En outre, la durée de propagation et la vitesse de CMMCs peuvent être enregistrées ainsi que les changements de diamètre de l'intestin et de la fréquence de contraction. Cette technique est utile pour déterminer les caractéristiques de la motilité gastro-intestinaux chez des modèles de souris transgéniques (et dans d'autres espèces, y compris le rat et le cochon Guinée). De cette manière, les changements induits dans pharmacologiquement CMMCs sont enregistrées chez les souris de type sauvage et dans le modèle de l'autisme R451C Neuroligin-3 de la souris. En outre, cette technique peut être appliquée à d'autres régions du tractus gastro-intestinal y compris le duodénum, le jéjunum et l'iléon et à différents âges de développement chez la souris.
Introduction
Le système nerveux entérique (ENS) est le réseau neuronal intrinsèque du tractus gastro-intestinal et module diverses fonctions telles que la digestion du contenu intestinal, l'absorption de nutriments et la sécrétion et la réabsorption d'eau. Les neurones de l'ENS sont situés dans les myentériques et la sous-muqueuse plexus. Le plexus myentérique joue un rôle majeur dans la régulation de la motilité gastro-intestinale 1 alors que le plexus sous-muqueux est principalement impliquée dans le contrôle de la sécrétion 2,3. Le plexus myentérique est située entre les couches musculaires longitudinales et circulaires de la paroi gastro-intestinale. L'activité contractile des couches de muscles lisses de la paroi intestinale facilite les fonctions principales du tractus gastro-intestinal et en mélangeant le contenu intestinal propulsion sur toute la longueur de l'intestin 3. Bien que l'innervation extrinsèque au tractus gastro-intestinal du CNS contribue à la fonction gastro-intestinale in vivo, L'ENS est capable de réguler la fonction gastro-intestinale indépendamment. Cette caractéristique unique permet à l'exploration fonctionnelle des circuits neuronaux entériques et leur contribution à la motilité gastro-intestinale ex vivo.
Les complexes du côlon qui migrent à moteur (CMMCs) sont des événements spontanés neurogènes qui sont le motif du moteur prédominant observé dans le côlon de souris isolé en l'absence de boulettes fécales 4-9. CMMCs sont définis comme des contractions rythmiques qui se propagent sur une distance horizontale qui est au moins la moitié de la longueur totale du côlon (par exemple, à partir du caecum au rectum) 10. La relation entre CMMCs et les motifs contractiles qui propulsent pelotes fécales est pas encore clairement établie, cependant quelques différences pharmacologiques ont été signalés 11. Néanmoins, la capacité de l'ENS de fonctionner indépendamment du système nerveux central ainsi que l'existence de motifs de neurones moteurs à médiation dans le SIcôlon olated fournit un système de dosage idéal pour étudier des troubles de la motilité résultant d'un dysfonctionnement ENS sous-jacent. La spontanéité de la motricité gastro-intestinaux fonctionnels permet des changements en réponse à des stimuli pharmacologiques pour être évalués.
L'utilisation de l'imagerie vidéo et la cartographie spatio-temporelle a été développé afin d'examiner quantitativement faible péristaltisme intestinal chez des cobayes 12. Ici, une technique ex vivo est décrite qui permet l'étude des schémas de la motilité du côlon de souris en utilisant l'imagerie et l'analyse de ces enregistrements vidéo sur la construction à haute résolution (~ 100 um, de 33 msec) des cartes du diamètre du côlon en fonction de la position le long du côlon et de temps (cartes spatio-temporelles). En utilisant un logiciel interne de détection de bord (Analyse2; disponible sur demande), les données de pleine longueur segments coliques contractantes en temps réel sont traitées pour générer des cartes spatio-temporelles pour chaque expérience. Dans cette étape, vidéo (AVI) sont summarisée et convertis en cartes spatio-temporelles en utilisant Analyse2. Cartes spatio-temporelles (figure 2) représentent la contractilité dans le temps et permettent la mesure de plusieurs paramètres, dont la vitesse de propagation, l'ampleur, la durée et la durée. diamètre de l'intestin est également enregistrée pendant toute la durée de l'expérience en tant que mesure de la contractilité globale du segment de tissu. Cette méthode peut être appliquée pour identifier les différences de point d'initiation de complexes contractiles qui pourrait indiquer altérée connectivité neurale entérique.
Un protocole d'imagerie vidéo similaire conçu pour évaluer culot propulsion chez le cobaye a été rapporté 13 mais ici, nous présentons l'application de l'approche d'imagerie vidéo pour la quantification de la motilité colique spontanée (ie, en l'absence de pellets). Nous fournissons également des informations détaillées pour aider à la dissection et la préparation de tissu gastro-intestinal de l'approche d'imagerie vidéo. Ceprotocole fournit aux chercheurs un outil accessible et facile à reproduire pour l'analyse de contrôle neural entérique de la fonction gastro-intestinale chez des modèles animaux de la maladie, y compris les modèles génétiques de souris.
La technique d'imagerie vidéo permet l'analyse de la motricité colique en réponse à divers agents pharmacologiques. Les médicaments peuvent être administrés par l'intermédiaire de la lumière intestinale ou du bain d'organes externes de la préparation du côlon. Différentes régions du tractus gastro-intestinal de souris présentent des schémas de la motilité spécifiques tels que les petits segmentation CMMCs intestinal et dans le côlon.
Cette technique a été utilisée pour identifier les différences de contrainte en petite fonction intestinale; la sensibilité différentielle pour 5-HT3 et 5-HT4 antagonistes ont été observés dans le jéjunum de Balb / c et des souris C57 / BL6 en raison de la nature polymorphique du gène TPH2 exprimée dans les deux souches 6. L'effet de la 5-HT inhibition sur la motilité reste concontroversée, car les données contradictoires a été rapporté sur l'importance d'un développement endogène 5-HT sur le péristaltisme du côlon et CMMCs 14,15. Modifications de la motilité avant et pendant le développement postnatal 7, ainsi que les effets de mutations géniques sur motilité gastro-intestinale chez des modèles animaux de maladie 10 peuvent également être examinés par imagerie en utilisant vidéo. Ici, nous illustrons l'utilisation du procédé à une étude de la motilité du côlon dans le modèle de souris NL3 R451C de l'autisme, qui exprime une mutation faux-sens dans le gène codant pour la protéine NLGN3 d'adhérence synaptique Neuroligin 3-16. Cette mutation a été identifiée pour la première chez les patients diagnostiqués avec un trouble du spectre autistique (TSA) 17, qui est fortement associée à un dysfonctionnement de GI 18-22. Nous avons examiné si la mutation R451C synaptique NL3 affecte sorties de neurones dans l'ENS en utilisant la technique d'imagerie vidéo. Nous présentons des données caractérisant CMMCs au départ et en réponse à la 5H sérotoninergiqueT 3/4 antagoniste du récepteur tropisétron dans le modèle de souris NL3 R451C de l'autisme.
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Protocol
Contact avec les animaux et la dislocation cervicale des animaux avant toutes les expériences ont été réalisées dans le strict respect des protocoles approuvés par le Comité pour l'expérimentation animale de l'Université de Melbourne (Éthique ID: 1,212,494,7)
1. Tissue Collection et Dissection
- Euthanasier souris adultes par dislocation cervicale. Si possible, éviter l'anesthésie pour éviter les influences sur la fonction de l'intestin par l'intermédiaire des récepteurs situés sur les populations neuronales d'intérêt.
- Enregistrez poids total du corps de l'animal, la broche du corps (par l'intermédiaire des quatre pattes, face ventrale exposée à expérimentateur) fermement à une carte de dissection à l'aide d'aiguilles hypodermiques (Taille: 20 G).
- En utilisant des pinces à dissection et ciseaux; faire une incision à travers l'épiderme recouvrant les couches musculaires abdominaux inférieurs. Continuer à utiliser les pinces et ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale le long de la ligne médiane de l'abdomen au sternum.
- Pour éviter la déshydratation des tissus, versez physaline gique (solution de Krebs: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucose en mM - barboter à TA avec du gaz carbogène; 95% O 2 et 5 % CO 2 pour un minimum de 20 min) sur le contenu abdominal à intervalles réguliers (par exemple, tous les 30-60 sec) au cours du processus de dissection.
- Pour isoler le côlon tout attaché à le caecum et le rectum, maintenez le caecum (situé à côté de l'extrémité proximale du colon) doucement à l'aide des pinces à dissection environ 4-5 cm au-dessus du corps de l'animal tout en réduisant le mésentère utilisant des ciseaux fins de dissection.
- Prenez soin de ne pas manipuler, étirer ou couper le tissu gastro-intestinal, tout en éliminant le mésentère attenant.
- Retirer l'excès de tissu (par exemple, de la vessie et les testicules urinaire). Avec des ciseaux de dissection grossiers, faire deux incisions verticales (soit environ 0,5 cm de la ligne médiane) pour couper l'os du bassin sur eacôté ch du côlon.
- Utilisez des ciseaux fins pour séparer le rectum attenant tissu pelvien et les garnitures entourant les muscles du côlon.
- Placez le côlon pleine longueur (à partir du caecum à rectum) dans un bécher contenant du sérum physiologique (précédemment oxygéné avec carbogène) et de continuer à oxygéner à la température ambiante. Retirer le caecum et le rectum à l'aide des ciseaux fins de dissection et de le remplacer dans le bécher.
- pelotes fécales vides / contenu intestinal à partir de préparations coliques en appliquant une pression positive en douceur à la fin par voie orale en utilisant une seringue de 5 ml fixée à une pointe de pipette 200 pi rempli avec du sérum physiologique. Afin d'orienter le tissu à l'avenir, utiliser une tige d'insectes à l'occasion de l'extrémité la plus proximale du colon, où des stries de la muqueuse sont visibles.
- Modifier la pointe de la pipette en plastique pour tenir la seringue de 5 ml en enlevant environ 1 cm de l'extrémité la plus large / proximale en utilisant une lame de rasoir. Pour augmenter le débit, d'élargir l'extrémité distale / petit en coupant sur un angle (environ 45 ° C) en utilisant une lame de rasoir.
- Grip le tissu doucement à son extrémité proximale avec une pince de dissection du côlon, insérez la pointe de la pipette dans la lumière du côlon et du sérum physiologique rincer à travers la lumière.
2. Préparation du côlon tissus et expérimental mis en place pour l'imagerie vidéo
- Sérum physiologique Flush travers tous les tubes attachés à un bain de deux organes chambrée mis en place (Figure 1 et Figure 3), en utilisant une seringue attachée à une pointe de pipette de 200 pi. Cette étape élimine les débris dans le tube qui pourrait bloquer l'écoulement de la solution. Pour les tubes spécifications se réfèrent à la table des matières.
- Veiller à ce que les chambres de bain d'organe sont continuellement perfusées avec du sérum physiologique barboter avec carbogène (95% O 2 et 5% de CO 2, le taux de 5 ml min -1 débit). En utilisant une sonde de température à intervalles réguliers, en sorte que la température du bain est maintenue entre 33 ° C -37 ° C.
- Remplir le réservoir d'entrée connectée par l'intermédiaire d'un robinet à trois voies dans le tube d'admission à environ 20 à 30 ml de solution saline physiologique en utilisant une seringue de 50 ml.
- Pendant l'expérience, maintenir la pression dans le réservoir d'entrée en utilisant arubber bouchon d'un tube de verre (5 mm de diamètre intérieur) insérée à travers son centre. Assurez-vous que l'ouverture supérieure du réservoir d'entrée est correctement scellé (avec le tube de verre intérieure restant descellé).
- Placez le côlon (longueur 5-7 cm) dans la chambre de bain d'organe, en vous assurant qu'il est complètement immergée dans du sérum physiologique.
- Cathétériser chaque extrémité du segment du côlon aux deux tubes d'entrée / sortie immergée (entrée / tubes de sortie ayant un diamètre différent peut être modifiée en fonction de la taille de la lumière des tissus ex. Un tissu post-natal, des souris adultes et Guinée porc) en utilisant la norme de bain coton fil à coudre. Fixer l'extrémité proximale du côlon à la tubulure d'entrée et lal'extrémité distale du côlon dans le tube de sortie (relié par l'intermédiaire d'un robinet à 3 voies à un tube d'écoulement vertical; 6 cm de hauteur). Assurez-vous que le tissu est pas surchargés ou trop détendu après une canule pour éviter les interférences avec les mesures et les analyses futures.
- Enregistrer la longueur du côlon en mesurant la distance entre les extrémités proximale et distale à l'aide de canules 15 cm règle. Ceci est important pour l'interprétation des variations de longueur de contraction, la vitesse de propagation et des points d'initiation de la contraction.
- Assurer une pression stable base luminale (cm H 2 O) est établie avant de commencer l'expérience. Calculer la pression intracavitaire en mesurant la distance verticale à partir du tissu à la surface du bain de solution saline physiologique à l'intérieur du tube en verre du réservoir d'entrée (par voie orale) et le tube d'écoulement vertical (anal).
- Maintenir les préparations de tissu à une pression intraluminale constante (par exemple, 1 à 2 cm H 2 O) en faisant en sorte que le PRESSU d'étanchéité de bouchon d'entréere est maintenue constante et qu'aucune blocages sont présents dans la mise en place.
- Laissez le côlon à l'équilibre dans du sérum physiologique pendant 30 minutes avant d'enregistrer les mouvements intestinaux. Vérifiez la présence de blocages qui se posent dans les tubes de flux entrants ou sortants et les supprimer en appliquant une pression dans le réservoir d'entrée ou en re-canulant les extrémités orales et anales du côlon.
3. Capture d'image et protocole expérimental
- Mouvements intestinaux records en tant que fichiers vidéo à l'aide d'une caméra vidéo (30 images / s, 640 x 840 pixels) positionnés 10-15 cm au-dessus du bain d'organe sur une réplique de laboratoire standard support (Figure 1).
- Ouvrez Virtual Dub (logiciel de capture vidéo) à partir de l'icône sur le bureau. Dans l'onglet «Fichier», sélectionnez «capture AVI" pour afficher l'image de la caméra. Sur la 'Audio' onglet désélectionner «permettre la capture audio 'pour désactiver le son.
- Dans l'onglet vidéo sélectionnez «compression» et «DivX6.9.2. Codec & #39; pour compresser des fichiers vidéo pour minimiser l'utilisation de l'espace de stockage. Cette fonction sera disponible sur l'installation du logiciel de compression «DivX».
- Régler manuellement la position de la caméra de sorte que l'ensemble du segment du côlon canule est visible (avec les régions canule immédiatement adjacentes aux bords verticaux de l'image vidéo) via la fenêtre du logiciel de capture vidéo (voir Figure 1). Afin d'améliorer la qualité de l'image et de minimiser les réflexions, attacher un bouclier papier / carton sur le support de la caméra pour bloquer la lumière parasite sur le bain d'organe. Optimiser la qualité vidéo en ajustant les paramètres de luminosité, contraste et l'exposition en utilisant l'interface du logiciel de la caméra.
- Avant l'enregistrement, définir un nom de fichier spécifique; dans l'onglet «Fichier», sélectionnez «fichier de capture Set 'et indiquez un nom unique pour la vidéo.
- Commencer la capture vidéo en appuyant sur «fichier de capture" de la 'capture' barre d'outils. Pour arrêter recording sélectionnez le bouton «Stop capture» ou la touche «Esc» sur le clavier.
- Remplacer le sérum physiologique contenue dans le réservoir d'entrée avec une solution saline physiologique fraîche toutes les 30 min.
- pression luminale d'enregistrement (voir 2.9) et en utilisant une sonde de température, de prendre note de la température du bain d'organe. Répéter ces étapes tout au long de l'expérience (par exemple, toutes les 30 min) afin d'assurer que ces variables sont constantes.
- activité colique fiche au total pendant 3 heures (y compris l'application de la drogue et de la durée de lavage). À des fins de stockage de données, les données d'enregistrement de 15 min segments vidéo. Une expérience complète sera généralement composé d'enregistrements vidéo 12 x 15 min.
- Fiche activité pendant 1 heure dans des conditions témoins (sérum physiologique).
- Appliquer le médicament (superfusées soit dans le bain ou administré dans la lumière par l'intermédiaire du réservoir d'entrée) pendant 30 min à 1 h.
Remarque: Différentes voies d'administration peuvent yield effets différents 23. - Appliquer une solution saline physiologique fraîche au bain ou de la lumière pendant une période de sevrage de 1 h.
Traitement 4. Les données et génération de cartes spatiotemporelles
- Traiter chaque déconnecté d'enregistrement vidéo en utilisant le logiciel en interne écrit en MATLAB (R2012a, Version 7.4, disponible sur demande) afin de produire des cartes spatio-temporels illustrant la motilité colique.
- Ouvrez le logiciel d'analyse de l'icône sur le bureau.
- Dans la fenêtre de commande, entrez "Analyse2" afin d'ouvrir le panneau de contrôle de l'analyse.
- Utiliser la fonction de détection de bord pour générer des cartes spatio-temporelles en cliquant sur "détection de bord pour les fichiers .avi" dans la fenêtre du panneau de commande. Cette fonction permettra au logiciel d'analyse de lire les vidéos recodé Audio Video Interleaved (AVI).
- Effectuer les étapes suivantes de manière séquentielle pour générer des cartes spatio-temporelle en utilisant un adaalgorithme de détection de bord ptive.
- Ouvrez les fichiers vidéo enregistrés en sélectionnant l'onglet "Ajouter des fichiers", sélectionnez "Open video 'et sélectionnez l'emplacement des fichiers vidéo.
- Des fichiers vidéo figurant dans le logiciel d'analyse, sélectionnez le fichier d'intérêt.
- Sélectionner une région rectangulaire d'intérêt dans le cadre de la vidéo, par exemple, sur toute la longueur du côlon, du point où le côlon est canulée par voie orale à la canulation anal. Faire en sorte que les points de canulation proximale et distale sont contiguës aux limites verticales de la région d'intérêt. lignes de détection de bord (rouge et vert) seront automatiquement apparaissent en surimpression sur l'image en temps réel.
- Faire en sorte que les lignes de seuil de détection de bord sont à proximité immédiate du côlon à la fois des limites supérieures et inférieures du tissu du côlon (ce qui peut être optimisée pour chaque vidéo en modifiant des valeurs de seuil de détection sur le panneau de commande). Veiller à ce que le bord de détection lines sont continues sur toute la longueur de l'image du côlon en ajustant le contraste et la luminosité à l'aide du panneau de commande.
- Entrez la longueur du côlon (mm) dans la boîte de dialogue largeur (comme enregistré dans l'étape 2.7). Ensuite, sélectionnez "Générer carte de chaleur".
- Dans la fenêtre pop-up, sélectionnez un emplacement pour le fichier à enregistrer et spécifier un nom de fichier pour le plan spatio-temporel.
- Sélectionnez le format '.su2 »et sélectionnez« Ajouter à la liste'.
Remarque: format .su2 compresse les données à une taille de fichier et de plusieurs fichiers vidéo peuvent être ajoutés à la file d'attente. - Sélectionnez 'Commencez détection »pour générer des cartes spatio-temporelles.
5. Analyse des Plans spatiotemporelles
- Utiliser des cartes spatio-temporelle pour estimer les paramètres tels que la fréquence, la vitesse de propagation, la longueur et la durée de CMMCs, le diamètre de l'intestin et le point de l'initiation et la direction de contraction.
- Pour commencer à analyser spatio-temporellecartes, type 'analyse2 »dans la fenêtre de commande tel que décrit dans la section précédente. Au lieu de "détection de Edge", sélectionnez le bouton «carte thermique d'analyse".
- Ouvrir la carte fichiers spatio-temporelles (fichiers .su2) en sélectionnant l'onglet «Ajouter des fichiers» et en précisant l'emplacement des fichiers obtenus précédemment .su2.
- Une fois le plan spatio-temporel est visible à l'écran, spécifier une plage de couleur sur le panneau de commande, veiller à ce que le minimum est fixé à 1.
A noter que le maximum peut varier de 5 à 10 en fonction de la contractilité du tissu. - Sélectionnez 'Lock gamme de couleurs »pour assurer toutes les cartes à partir d'une seule expérience sont analysés dans les mêmes conditions.
- Assurez-vous que les paramètres de la zone de temps sont constants pour toutes les cartes spatio-temporelles d'une expérience donnée.
- Afin de déterminer la fréquence CMMC, compter manuellement les contractions qui traversent plus de 50% de la longueur du côlon. Ces contractions peuvent être visualisée comme des stries rouge / orange (index standard de couleur HSV) sur la carte spatio-temporelle (voir la figure 2 pour un exemple). Autres contractions qui sont plus ou ne se propagent pas peuvent également être identifiés et quantifiés.
- Si vous le souhaitez, effectuer une analyse plus approfondie à une résolution supérieure à partir de ces cartes. Par exemple, les propriétés détaillées, la vitesse et la durée de chaque contraction peuvent être examinées.
- Afin de mesurer la vitesse et la durée, sélectionnez le bouton "Annoter ondes de contraction" sur le panneau de contrôle de l'analyse de la carte de chaleur.
- Ensuite, un zoom sur chaque CMMC en cliquant sur le bouton "Zoom" et en sélectionnant la zone d'intérêt. Puis cliquez sur le bouton "annoter manuellement" pour annoter chaque contraction en utilisant la souris pour dessiner une ligne à partir de la position la plus initiale à la fin de chaque contraction. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la vitesse de propagation apparent et la durée de dilatations qui semblent se propager (par exemple, voir unefin al de cartes de la figure 2A, 2B).
Remarque: Les données pour la vitesse et la durée apparaît sous la fenêtre de résultats. Ces valeurs peuvent être transférées à une feuille de calcul d'intérêt en sélectionnant l'onglet "Données d'exportation". annotations indésirables peuvent être supprimés en cliquant sur le bouton "Supprimer annotations sélectionnés".
- Si l'on désire utiliser les coordonnées x et y des cartes spatio-temporelles (temps et position le long du côlon, respectivement) pour déterminer la position d'ouverture de petites contractions ou CMMCs.
- De même, afin de déterminer les intervalles entre les contractions, utilisez la fonction "Annoter" pour mesurer la durée entre les contractions. Comme précédemment, ces résultats peuvent être exportés vers un tableur en sélectionnant l'onglet "Données d'exportation".
- Afin de mesurer la largeur de l'intestin au repos, sélectionnez le bouton «Prendre section" sur le panneau d'analyse de la carte de chaleur.
- Sélectionnez 'Ajouter9; sur le panneau de sections temporelle. Double-cliquez à tout endroit de la carte afin de générer une ligne horizontale superposée sur la carte de chaleur. les données de diamètre Gut seront désormais affichés dans une nouvelle fenêtre.
- Pour mesurer le diamètre du tube digestif, placez le curseur sur un pic et le creux adjacent à obtenir largeur moyenne de l'intestin pour une condition expérimentale spécifique. Changements de diamètre du tube digestif peuvent être comparés entre les conditions expérimentales.
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Representative Results
Jusqu'à 90% des patients atteints de TSA profiter d'une gamme de troubles gastro-intestinaux, notamment la diarrhée et la constipation 18,24,25. Cependant, les causes sous-jacentes de ces problèmes gastro-intestinaux sont inconnus. Beaucoup de mutations identifiées chez des patients atteints de TSA sont associés à des protéines synaptiques contribuant à des modifications et des perturbations dans la transmission ou la fonction synaptique. Une telle mutation dans le gène codant pour la molécule d'adhésion cellulaire de neuroligin-3 (NL3 R451C), a été identifié chez deux frères avec ASD 17. Cette mutation se traduit par un résidu arginine en position 451 de la protéine Neuroligin étant remplacés par une cystéine. Souris NL3 R451C exprimant cette mutation spectacle augmenté GABA transmission médiation dans le cortex somatosensoriel 16,26 côté augmenté récepteur AMPA et NMDA activité générée au sein de l'hippocampe 25,27.
28-30. Comme le système nerveux entérique joue un rôle majeur dans la régulation de la fonction gastro-intestinale, nous avons postulé que la mutation R451C affecterait la motilité. Par conséquent, afin d'enquêter sur d'éventuelles modifications dans les fonctions gastro-intestinales dues à des anomalies synaptiques nous avons cherché à examiner les effets de la mutation R451C sur la fréquence CMMC chez ces souris.
En raison de la sérotonine (5-HT) agit sur l'ENS pour moduler la fonction gastro-intestinale chez les souris 6 nous avons analysé les schémas de la motilité en réponse à la 5-HT 04/03 tropisétron antagoniste des récepteurs à la préparation du côlon de souris WT et NL3 R451C.
Pour déterminer si la mutation synaptique modifie CMMCs lorsque le système nerveux entérique est pharmacologiquement perturbé, l'antagoniste du récepteur 5-HT 3/4 Tropisetron (Trop;10 um, ce qui bloque les récepteurs 5HT3 et les récepteurs 5HT 4) a été ajoutée au bain contenant la préparation du côlon (Figure 2). Tissu du côlon à partir de dix-neuf ans souris assorti mâle (11 WT et 8 NL3 R451C) a été utilisé. En présence d'tropisétron, R451C NL3 souris ont montré une diminution de la fréquence par rapport à la même portée CMMC WT. Des exemples représentatifs de cartes spatio-temporels montrant CMMCs et l'activité contractile de la préparation du côlon WT et NL3 R451C sont présentés sur les figures 2A à 2E, respectivement. Bien qu'aucune différence n'a été observée entre le WT et R451C NL3 dans des conditions de contrôle, réduit de façon significative la fréquence tropisétron CMMC chez les souris WT et NL3 R451C (figure 2C, 2F). Chez les souris WT, le nombre médian de CMMCs était 23 dans des conditions de contrôle par rapport à 15 dans le tropisétron (p = 0,023). Chez les souris NL3, le nombre médian de CMMCs dans des conditions de contrôle était de 19,5par rapport à 2 en présence d'tropisétron (p = 0,022). En outre, le tropisétron avait un effet plus important sur la fréquence de CMMCs chez la souris NL3 R451C par rapport à WT (p = 0,047).
Figure 1. bain d'organe mis en place et la génération de cartes spatio-temporelles. (A) un segment gastro fraîchement disséqué est placé dans un bain d'organe (vue en coupe) contenant du sérum physiologique et une canule aux extrémités orales et anales. La canule est connectée par voie orale à un réservoir rempli d'entrée avec une solution saline physiologique et la canule anal relié à un tube d'évacuation. Une caméra vidéo est positionnée au-dessus du bain d'organe pour enregistrer l'activité contractile du côlon. (B) la motilité est converti en spatiotemporelles régions du côlon d'étiquetage des cartes à haute résolution qui sont dilatés dans les régions bleues et rétrécies in rouge. (C) Une carte spatio-temporelle montrant la motilité du côlon (des CMMCs) d'un adulte WT souris. CMMCs individuels sont indiquées comme des régions verticales rouges au sein de la carte. L'axe des X en augmentant (0-15 min) montre. L'axe des Y représente la localisation spatiale le long du segment du côlon (anal à la base, par voie orale en haut). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les cartes spatiotemporelles montrent une augmentation de la sensibilité à Tropisetron dans NL3 R451C colon de la souris cartes spatiotemporelles montrant fréquence CMMC dans les segments du côlon de contrôles WT (A) et en présence de Tropisetron. (Trop; B). Trop réduit la fréquence CMMC WT points (C). Spatiote cartes mporal de NL3 colon dans des conditions de contrôle (D) et en présence d'Trop (E). Trop provoqué une forte réduction de la fréquence CMMC en NL3 colon (F). CMMC fréquence en réponse à Trop a été significativement réduite dans NL3 par rapport à WT côlon (p = 0,047, non représenté). largeur de Gut (couleur du pixel) est indiqué sur l'axe Y (unités arbitraires, la gamme 1-6). La barre d'échelle dans E applique à toutes les cartes. trop; Tropisetron. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Schéma de bain d'organe. (A) Vue d'en haut, (B) Dessous, (C) Vue de face, (D) Vue de côté, d'un bain d'organe chambré deux mis en place. Dimensions en mm.ref = cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En utilisant cette technique d'imagerie vidéo, la fréquence CMMC a été mesurée comme une indication de la motilité du côlon dans le type sauvage et les souris NL3 R451C, un modèle de souris de troubles du spectre autistique 17. Nos résultats indiquent une réduction du nombre de CMMCs chez les souris mutantes NL3 R451C par rapport aux souris de type sauvage en présence de l'antagoniste du récepteur 5-HT 04/03 Tropisetron suggérant que les souris NL3 R451C présentent une sensibilité accrue à Tropisetron. En conséquence, nous proposons que la mutation R451C neuroligin-3 modifie le trajet de la sérotonine, ce qui pourrait en modulant soit 5HT 3 ou 4 5HT la fonction du récepteur dans les neurones entériques, les muqueuses ou les deux. Cela met en évidence la valeur de la méthode d'identification des différences phénotypiques entre les génotypes et pour l'identification des cibles spécifiques pour des études ultérieures.
Cette méthode peut être modifiée pour améliorer la résolution spatiale par l'acquisition de vidéos viaune chaîne stéréo-microscope équipé d'un support de caméra. Cette approche permet à des enregistrements réalisés à partir de préparations de l'appareil gastro-intestinal à des moments embryonnaires E12.5 aussi tôt que 31. Neuromodulateurs peuvent être appliqués par l'intermédiaire de la lumière ou dans le bain d'organe externe pour la préparation du côlon. En outre, cette méthode est utile pour évaluer à la fois grandes et petites motilité gastro-intestinale dans un éventail d'espèces, y compris les souris, les rats et cochon Guinée.
des étapes de dépannage courantes pour ce procédé comprennent la vérification de l'écoulement de la solution par l'intermédiaire de la tubulure, la viabilité de la préparation de tissu, maintien de la pression constante luminale et faire en sorte que les segments du côlon sont situés à l'écart des parois du bain d'organe. Les blocages dans la tubulure peuvent modifier la pression luminale et de prévenir l'apparition de contractions; donc tous les tubes doivent être nettoyés à fond pour enlever les cristaux de sel ou de débris / matières fécales avant cathétérisme. L'air doit être retiré de tubulures directement associé à la canule avant expériences (par exemple, par l'amorçage des tubes avec une solution saline). En outre, les préparations de tissu doivent être manipulés avec précaution afin d'éviter les dommages résultant de l'immobilité du côlon. Pour éviter des dommages aux tissus, en sorte que le côlon est solidement (mais pas trop serrée) fixé à la canule au cours du processus d'enregistrement et de maintenir une température constante et une alimentation continue de CO 2 + O 2 dans le bain. assurer que la pression intracavitaire est maintenue constante et qu'aucun contractions sont déclenché manuellement en ajustant les réservoirs d'amenée pendant la période d'enregistrement. Faire en sorte que le tissu du côlon n'a pas en contact avec la paroi du bain d'organe pendant les contractions car cela permet d'éviter l'analyse de détection de bord de l'une des cartes spatio-temporels pertinents. Ceci peut être évité en surveillant les contractions pendant la période d'équilibrage et de réglage de la position des deux points pour empêcher que cela se produise au cours de l'expérience.
_content "> Plusieurs limitations associées à cette technique devraient être prises pour considération lors de l'analyse et l'interprétation des données, y compris la nature à faible débit de cette approche. Bien que la méthode est efficace pour identifier les changements dans la migration de schémas moteurs, il ne peut pas déterminer si les dilatations survenant au cours de la progression d'une CMMC sont neurale ou simplement réponses passives à l'activité contractile (ie, résultant de la circulation des fluides). les gradients de concentration pour la diffusion à travers la paroi colique permettent les effets des médicaments luminale appliquées à être attribuées aux actions dans le muqueuse, mais dans des expériences de longues dégénérescence muqueuse peut se produire en modifiant ainsi les sites d'action de ces médicaments au cours de la période d'enregistrement. en outre, si les médicaments ont des effets distincts dans les myentériques et la sous-muqueuse plexus ne peut être déterminée en utilisant cette méthode. en revanche, cette approche permet une évaluation collective des effets sur la ne entériquesystème rvous en mesurant un changement global dans les habitudes de la motilité. D'autres considérations comprennent la nécessité de tenir compte de la nature des données (c.-à compter des données pour la fréquence CMMC, nécessitant une analyse non-paramétrique) et la faible fréquence des CMMCs, lors de la conception des expériences et des stratégies d'analyse de données appropriées.Récemment, Barnes et ses collègues ont proposé que les tissus du côlon nécessite une stimulation afin d'observer CMMCs 32, mais a publié les résultats de notre laboratoire démontrent que CMMCs spontanées peuvent être observées par tout simplement épingler le tissu dans le bain d'organe par le mésentère 7. La présence de CMMCs dans ces conditions démontre non seulement la spontanéité de CMMCs, mais insiste davantage sur l'utilité de cette technique pour établir les variations de la motilité colique. Bien que cette approche est applicable aux régions extra-coliques du tractus gastro-intestinal, de la complexité de la motilité intestinale nécessite plus detailed stratégies d'analyse que celles utilisées pour quantifier CMMCs 33.
Cette approche expérimentale a une résolution spatiale et temporelle très élevée et inclut la possibilité de délivrance de médicaments à la fois externe et à l'intérieur de la lumière pour étudier les effets de la variation des gradients de concentration sur le système nerveux entérique. De plus, cette méthode est adaptée pour analyser petite segmentation intestinale pendant l'état nourri 6,23. La nature ex vivo de cette méthode permet le rôle du système nerveux entérique être évalués en l'absence d'entrées du système nerveux central et est donc un moyen idéal pour enquêter sur la motilité gastro-intestinale dans une variété de modèles, y compris les modèles génétiques de la maladie (voir Figure 2) 6,34.
Cette méthode peut également être utilisé pour comparer les données physiologiques à des simulations informatiques de l'activité motrice 23,33,35. Ces simulations peuvent prédire les modèles à moteur ensous forme de cartes spatio-temporelles pour des comparaisons directes avec des expériences physiologiques 33,35. Utilisation de transformée de Fourier rapide et l'analyse en ondelettes 36, la contribution des stimulateurs musculaires lisses (généré par les cellules interstitielles de Cajal) à la motilité peut également être extrait. En outre, cette technique de formation d'images vidéo peut être combiné avec l'enregistrement extracellulaire de l'activité électrique du muscle 3 pour permettre contributions des neurones et des générateurs de motifs myogéniques être distingués. Noter que le procédé d'enregistrement extracellulaire résout inhibiteurs potentiels de jonction en l'absence de contractions des muscles lisses ou relaxations.
Bien que cette technique est bien établi pour l'analyse de la motilité gastro-intestinale chez un grand nombre de préparations et des espèces, il est également susceptible d'être utilisé dans d'autres systèmes tels que l'étude de la vasoconstriction dans le mésentère (précédemment analysées au moyen d'un système de suivi de diamètre plus simple 37) etdans le muscle squelettique.
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Acknowledgments
JCB et ELH-Y ont été pris en charge par le ministère américain du programme de recherche sur l'autisme CDMRP Défense (AR11034). NHMRC (1047674) à ELH-Y.Procédé mai Stewart Bourse-Université de confiance Melbourne financé bourse pour MS. Nous remercions Ali Taher, Fátima Ramalhosa et Gracia Seger des contributions techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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