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Neuroscience

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Published: February 3, 2016 doi: 10.3791/53828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Physiology, The University of Melbourne, 2Melbourne School of Engineering, The University of Melbourne, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Abstract

Die enterische Nervensystem (ENS) spielt eine wichtige Rolle gastrointestinale (GI) Motilität bei der Regulierung und unabhängig von dem zentralen Nervensystem wirken kann. Änderungen in der ENS-Funktion sind eine Hauptursache für gastrointestinale Symptome und Krankheit und kann zur Anzeige zu gastrointestinalen Symptome bei neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Autismus beitragen. Es ist bekannt, dass isolierte Kolonabschnitten spontan, rhythmische Kontraktionen bekannt als Kolon-Migration Motor-Komplexe (CMMCs) erzeugen. Ein Verfahren, das enterische neuronale Regulation der CMMCs in Ex-vivo-Präparate von Maus Doppelpunkt zu analysieren beschrieben. Der Doppelpunkt wird aus dem Tier herausgeschnitten und gespült fäkale Inhalte zu entfernen, bevor in einem Organbad kanüliert werden. Die Daten werden über eine Videokamera über dem Organbad positioniert und konvertierte zum hochauflösenden Raum-Zeit-Karten über ein Inhouse-Software-Paket erworben. Mit dieser Technik Muster Grundlinie Kontraktions und pharmakologischen Wirkungen auf ENS Funktion in Doppelpunkt segments kann über 3-4 Stunden verglichen werden. Zusätzlich Ausbreitungslänge und der Geschwindigkeit der CMMCs kann sowie Änderungen in gut Durchmesser und Kontraktionsfrequenz aufgezeichnet werden. Diese Technik ist nützlich, um gastrointestinale Motilität Muster in transgenen Mausmodelle charakterisieren (und in anderen Spezies, einschließlich Ratten und Meerschweinchen). Auf diese Weise pharmakologisch in CMMCs induzierten Veränderungen sind in Wildtyp-Mäusen aufgezeichnet und im Neuroligin-3 R451C Mausmodell für Autismus. Darüber hinaus kann diese Technik auf andere Regionen des GI-Trakts einschließlich der Duodenum, Jejunum und Ileum und in verschiedenen Entwicklungsalter bei Mäusen angewendet werden.

Introduction

Die enterische Nervensystem (ENS) ist die intrinsische neuronale Netzwerk des Gastrointestinaltraktes und moduliert verschiedene Funktionen wie Verdauung von Darminhalt, der Absorption von Nährstoffen und die Sekretion und Resorption von Flüssigkeit. Neuronen der ENS sind in den myentericus und submuköse Plexus entfernt. Der Plexus myentericus spielt eine wichtige Rolle gastrointestinale Motilität 1 während das submuköse Plexus bei der Regulierung ist bei der Steuerung der Sekretion 2,3 primär beteiligt. Der Plexus myentericus zwischen den Längs- und Ringmuskelschichten des Magen-Darm-Wand befindet. Die Kontraktionsaktivität der glatten Muskelschichten der Darmwand erleichtert die primären Funktionen des Magen-Darm-Trakt durch Mischen und Treibdarminhalt über die Länge des Darms 3. Obwohl die extrinsische Nervenversorgung an den Gastrointestinaltrakt vom CNS trägt zu Magen-Darm-Funktion in vivoIst das ENS Magen-Darm-Funktion der Regulierung unabhängig in der Lage. Diese einzigartige Eigenschaft ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Darm neuronalen Schaltkreisen und ihren Beitrag zu Magen-Darm-Motilität ex vivo.

Colon-Migration Motor-Komplexe (CMMCs) sind spontan, neurogene Ereignisse, die die vorherrschende Motor Muster in isolierten Maus-Doppelpunkt in Abwesenheit von fäkalen Pellets 9.4 eingehalten werden. CMMCs als rhythmische Kontraktionen definiert, die entlang einer horizontalen Distanz propagieren, die mindestens die Hälfte der Gesamtlänge des Dickdarms (dh vom Blinddarm zum Rektum) 10. Die Beziehung zwischen CMMCs und die Kontraktionsmuster, die fäkalen Pellets treiben wird noch eindeutig festgestellt werden, jedoch einige pharmakologische Unterschiede haben 11 berichtet. Dennoch ist die Fähigkeit des ENS unabhängig von dem CNS und die Existenz von neuralen-vermittelten Bewegungsmuster in der IS zu funktionierenolated Doppelpunkt ist ein idealer Testsystem Störungen der Motilität zu untersuchen, die aus Basis ENS Dysfunktion. Die Spontaneität von gastrointestinalen motorischen Mustern ermöglicht funktionelle Veränderungen in Reaktion auf pharmakologische Reize bewertet werden.

Der Einsatz von Video-Imaging und Raum-Zeit-Mapping wurde zuerst 12 kleine Darmperistaltik bei Meerschweinchen quantitativ zu untersuchen entwickelt. Hier wird ein ex vivo-Verfahren wird beschrieben, dass die Studie von Maus Kolonmotilität Muster mit Videobildverarbeitung und Analyse dieser Aufnahmen ermöglicht hochauflösenden zu konstruieren (~ 100 & mgr; m, 33 msec) Karten von Kolon-Durchmesser als Funktion der Position entlang des Dickdarms und der Zeit (Raum-Zeit-Karten). Mit In-House-Kantenerkennungssoftware (Analyse2; auf Anfrage), Daten aus voller Länge Vertrags Kolon-Segmente in Echtzeit verarbeitet werden für jedes Experiment Raum-Zeit-Karten zu erzeugen. In diesem Schritt, video (AVI-Dateien) sind SummaRized und konvertierte zum Raum-Zeit-Karten Analyse2 verwenden. Raum-Zeit-Karten (Abbildung 2) Kontraktilität im Laufe der Zeit zeigen und die Messung mehrerer Parameter einschließlich Ausbreitungsgeschwindigkeit, Größe, Länge und Dauer ermöglichen. Gut Durchmesser wird auch während der gesamten Dauer des Experiments als Maß für die Gesamt Kontraktilität des Gewebesegments aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um Unterschiede in der Initiationspunkt der kontraktilen Komplexe zu identifizieren, die veränderte enterischen neuronalen Konnektivitäts hinweisen könnte.

Ein ähnliches Video-Imaging-Protokoll entwickelt Pellet Vortrieb bei Meerschweinchen zu beurteilen hat 13 aber hier berichtet worden, wir die Anwendung des Ansatzes Videobild skizzieren zur Quantifizierung der spontanen Kolonmotilität (dh in Abwesenheit von Pellets). Wir bieten auch detaillierte Informationen in der Präparation und Vorbereitung von Magen-Darm-Gewebe für den Video-Imaging-Ansatz zu unterstützen. DiesProtokoll stellt Forscher mit einem zugänglichen und leicht repliziert Werkzeug für magensaftresistente neuronalen Kontrolle von Magen-Darm-Funktion in Tiermodellen von Krankheiten, einschließlich genetischer Mausmodelle zu analysieren.

Die Videoabbildungstechnik ermöglicht die Analyse von Kolonmotilität in Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel. Medikamente können über das Darmlumen oder das Organbad außerhalb des Kolon Zubereitung verabreicht werden. Verschiedene Regionen der Maus Gastrointestinaltrakt zeigen spezifische Motilität Muster wie Dünndarmsegmentierung und CMMCs im Dickdarm.

Diese Technik wurde verwendet, um Stamm Unterschiede in Dünndarmfunktion identifizieren; differentielle Empfindlichkeit zu 5-HT 3 und 5-HT 4 -Antagonisten wurden im Jejunum von Balb / c und C57 / BL6-Mäusen durch die polymorphe Natur der TPH2 Gen exprimiert in den beiden Stämmen 6 beobachtet. Die Wirkung von 5-HT-Hemmung auf die Motilität bleibt conumstritten, da widersprüchliche Daten über die Bedeutung des endogenen 5-HT auf colonic Peristaltik und CMMCs 14,15 gemeldet. Veränderungen in der Motilität vor und während der Entwicklung postnatal 7, und die Wirkungen der Gen-Mutationen auf die gastrointestinale Motilität in Tiermodellen der Krankheit 10 kann auch durch die Verwendung von Videoabbildungssucht werden. Hier veranschaulichen wir die Verwendung des Verfahrens für eine Studie von Kolonmotilität im NL3 R451C Mausmodell von Autismus, die eine Missense-Mutation in dem Gen exprimiert NLGN3 Codieren des synaptischen Adhäsionsprotein Neuroligin-3 16. Diese Mutation wurde zum ersten Mal mit der Diagnose Autismus-Spektrum-Störung bei Patienten identifiziert (ASD) 17, die stark mit GI Dysfunktion 18-22 verbunden ist. Wir untersuchten, ob die NL3 R451C synaptischen Mutation neuronalen Ausgänge im ENS mit dem Video-Imaging-Technik betrifft. Wir präsentieren Daten CMMCs an der Basislinie und in Reaktion auf die serotonerge 5H CharakterisierungT 4.3-Rezeptor-Antagonisten Tropisetron im NL3 R451C Mausmodell für Autismus.

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Protocol

Tier Handhabung und Genickbruch der Tiere vor allen Versuchen waren streng durchgeführt nach Protokollen, die von der Tierversuchskommission für die University of Melbourne (Ethik-ID: 1.212.494,7) genehmigt

1. Gewebeentnahme und Dissection

  1. Euthanize erwachsene Mäuse durch Genickbruch. Wenn möglich Anästhesie vermeiden Einflüsse auf die Darmfunktion über Rezeptoren auf neuronalen Populationen des Interesses zu verhindern.
  2. Notieren Sie die Gesamtkörpergewicht des Tieres, pin den Körper (über die vier Pfoten, ausgesetzt Bauchseite zu Experimentator) fest mit einer Dissektion Bord mit Injektionsnadeln (Größe: 20 G).
  3. Mit Pinzette und Schere; Einen Einschnitt durch die Haut der unteren Bauchmuskelschichten überlagern. Weiter die Zange und Schere zu verwenden, um die Bauchhöhle entlang der Mittellinie des Bauches bis zum Brustbein zu öffnen.
  4. Um die Gewebeentwässerungs verhindern, gießen physiological Salzlösung (Krebs-Lösung: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-Glucose in mM - bei RT mit Carbogen Gas geperlt, 95% O 2 und 5 CO 2% für mindestens 20 min) auf Bauch-Inhalte in regelmäßigen Abständen (zB alle 30-60 sec) während der Präparation Prozess.
  5. Um den Dickdarm isolieren, während an den Blinddarm und Mastdarm befestigt, halten Sie den Blinddarm (angrenzend an das proximale Ende des Dickdarms) sanft Pinzette mit ca. 4-5 cm über dem Körper des Tieres, während das Gekröse Trimmen feinen Sezierung Schere.
  6. Achten Sie darauf, nicht zu handhaben, strecken oder den Magen-Darm-Gewebe geschnitten, während die angrenzenden Mesenterium entfernen.
  7. Überschüssiges Gewebe (dh, der Harnblase und Hoden). Mit groben Präparierschere, machen zwei vertikale Einschnitte (dh ungefähr 0,5 cm von der Mittellinie), um den Beckenknochen auf ea zu schneidench Seite des Dickdarms.
  8. Verwenden einer feinen Schere das Rektum von angrenzenden Becken Gewebe zu trennen und zu trimmen Muskel aus dem Dickdarm umgibt.
  9. Legen Sie das in voller Länge Doppelpunkt (von Blinddarm zu Rektum) in ein Becherglas mit physiologischer Kochsalzlösung (vorher mit Carbogen mit Sauerstoff angereichert) und weiter bei RT mit Sauerstoff anzureichern. Entfernen Sie den Blinddarm und Mastdarm mit feinen Dissektionsscheren und in Becherglas ersetzen.
  10. Leere Stuhl Pellets / Darminhalt von Kolon-Präparate durch sanfte Überdruck in der mündlichen Ende Aufbringen einer 5 ml Spritze an einem 200 ul Pipettenspitze mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Um das Gewebe in der Zukunft zu orientieren, verwenden Sie ein Insekt Stift am meisten proximale Ende des Dickdarms zu kennzeichnen, in denen Rillen in der Schleimhaut sichtbar sind.
    1. Ändern Sie den Kunststoffpipettenspitze die 5-ml-Spritze durch Entfernen von etwa 1 cm von der breitesten / proximalen Ende zu passen mit einer Rasierklinge. Um die Fließgeschwindigkeit zu erhöhen, erweitern das distale / kleinere Ende von auf einem ang Schneidle (ca. 45 ° C) mit einer Rasierklinge.
  11. Fassen Sie den Doppelpunkt Gewebe sanft an seinem proximalen Ende mit Pinzette, legen Sie die Pipettenspitze in das Lumen des Dickdarms und bündig physiologischer Kochsalzlösung durch das Lumen.

2. Herstellung von Dickdarmgewebe und Versuchsaufbau für Video Imaging

  1. Flush physiologischer Kochsalzlösung durch alle Rohre zu einem Zweikammer Organbad befestigt einrichten (Abbildung 1 und Abbildung 3), mit einer Spritze an einem 200 ul Pipettenspitze. Dieser Schritt entfernt jeglichen Schmutz innerhalb der Rohrleitung, die den Fluss der Lösung blockieren könnte. Für Schläuche siehe technische Daten zum Materialtabelle.
  2. Sicherstellen, dass die Kammern des Organbad kontinuierlich mit physiologischer Kochsalzlösung geperlt mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2 Durchflussrate von 5 ml min -1) superfundiert werden. Mit einem Temperaturfühler in regelmäßigen Abständen, sicherzustellen, dass die temperature des Bades zwischen 33 ° C -37 ° C gehalten.
  3. Füllen Sie das Zulaufreservoir über einen 3-Wegehahn mit dem Einlassrohr mit etwa 20-30 ml physiologischer Kochsalzlösung eine 50 ml Spritze.
  4. Während des Experiments, halten den Druck in der Zulaufbehälter mit arubber Stopfen mit einem Glasrohr (5 mm Innendurchmesser) durch seine Mitte eingesetzt. Stellen Sie sicher, dass die obere Öffnung des Einlaufbehälter sicher verschlossen (mit der inneren Glasröhre unversiegelt bleibt).
  5. Setzen Sie den Doppelpunkt (Länge 5-7 cm) in das Organbad Kammer, um sicherzustellen, dass sie vollständig in physiologische Kochsalzlösung eingetaucht ist.
  6. Kanülieren jedes Ende des Kolon-Segment mit den beiden eingetauchten Einlass / Auslass-Rohre (Einlass / Auslass-Rohre unterschiedlichen Durchmessers kann je nach Größe des Gewebelumens zB geändert werden. Postnatal Gewebe, erwachsenen Mäusen und Meerschweinchen) in dem Bad unter Verwendung von Standard Baumwolle Nähgarn. Befestigen des proximalen Endes des Dickdarms zu dem Einlaßrohr und dasdistalen Ende des Dickdarms zu dem Auslassrohr (verbunden über ein 3-Wege-Hahn in eine vertikale Abflußrohr; 6 cm in der Höhe). Stellen Sie sicher, dass das Gewebe nicht überdehnt oder zu entspannt nach Kanülierung Interferenz mit zukünftigen Messungen und Analysen zu vermeiden.
  7. Nehmen die Länge des Dickdarms durch den Abstand zwischen dem proximalen und distalen Kanülierungen Messen einer 15 cm Lineal. Dies ist wichtig für Änderungen in Kontraktion Länge Ausbreitungsgeschwindigkeit und Kontraktion Initiationspunkten zu interpretieren.
  8. Achten Sie auf eine stabile Grundlinie Lumendruck (cm H 2 O) hergestellt wird, bevor das Experiment beginnt. luminalen Druck berechnen, indem der vertikale Abstand von dem Gewebe zu dem Meniskus der physiologischen Kochsalzlösung in das Glasrohr der Zulaufbehälter (oral) Messung und der vertikalen Abflußrohr (anal).
  9. Pflegen Gewebezubereitungen mit einer konstanten intraluminale Druck (zB 1-2 cm H 2 O), indem sichergestellt wird, dass der Zufluss-Anschlagdichtung pressuRe konstant gehalten wird und dass keine Blockaden, die in der Einrichtung sind.
  10. Lassen Sie den Doppelpunkt in physiologischer Kochsalzlösung ins Gleichgewicht für 30 Minuten vor dem Darmbewegungen aufzuzeichnen. Prüfen Sie, ob Verstopfungen in den Zu- bzw. Abgänge aus Rohren ergeben, und entfernen Sie sie von Druck durch den Zufluss Reservoir Anwendung oder durch Wieder Kanülierung der oralen und analen Enden des Dickdarms.

3. Bilderfassung und experimentelles Protokoll

  1. Nehmen Darmbewegungen als Video-Dateien mit einer Videokamera (30 Bilder / s, 640 x 840 Pixel), die 10 bis 15 cm über dem Organbad auf einem Standard-Labor Retorte stehen (Abbildung 1).
  2. Öffnen Sie Virtual Dub (Video-Capture-Software) über das Symbol auf dem Desktop. Von der "Datei" Tab wählen "Capture AVI 'das Kamerabild zu sehen. Auf der Registerkarte 'Audio' abwählen 'ermöglichen Audio-Aufnahme "den Ton abzuschalten.
    1. In der Video-Registerkarte "Kompression" und "DivX6.9.2. Codec & #39; Videodateien zu minimieren Nutzung des Speicherplatzes zu komprimieren. Diese Funktion wird bei der Installation der Kompressionssoftware 'DivX' verfügbar sind.
  3. Sie manuell die Kameraposition so einstellen, dass die gesamte Kanüle versehen Kolonsegment (mit einer Kanüle versehen Regionen unmittelbar angrenzend an den vertikalen Kanten des Videobildes) über die Video-Capture-Software-Fenster zu sehen ist (siehe Abbildung 1). Um die Bildqualität und minimieren Reflexionen zu verbessern, fügen Sie eine Papier / Pappe Schild an der Kamera Unterstützung Fremdlicht auf das Organbad zu blockieren. Videoqualität optimieren, indem Sie die Helligkeit, Kontrast und Belichtungseinstellungen Einstellen der Kamera-Software-Schnittstelle.
    1. Vor der Aufnahme legen Sie eine bestimmte Dateinamen; im "Datei" Tab wählen 'Set-Capture-Datei' und einen eindeutigen Namen für das Video festlegen.
    2. Start der Videoaufnahme von "Capture-Datei" von der "Capture 'Werkzeugleiste drücken. So stoppen recordinG Wählen Sie den "Capture stoppen" Taste oder die "Esc" -Taste auf der Tastatur.
  4. Ersetzen Sie die physiologische Kochsalzlösung in den Zulauf Reservoir mit frischem physiologischer Kochsalzlösung enthalten alle 30 Minuten.
    1. Nehmen Lumendruck (siehe 2.9) und einen Temperaturfühler verwenden, beachten Sie die Orgel Badetemperatur. Wiederholen Sie diese Schritte während des gesamten Versuchs (dh alle 30 Minuten), um sicherzustellen, dass diese Variablen konstant sind.
  5. Nehmen Kolon-Aktivität insgesamt 3 Stunden (einschließlich Medikamentenapplikation und Auswaschen Dauer). Zur Datensicherung, Datensatzdaten in 15 Minuten Videosegmente. Eine vollständige Experiment wird in der Regel von 12 x 15 Minuten Videoaufnahmen zusammengesetzt sein.
    1. Nehmen Aktivität für 1 Stunde unter Kontrollbedingungen (physiologische Kochsalzlösung).
    2. Wenden Sie das Medikament (entweder strömt in der Badewanne oder in das Lumen über den Zulauf Reservoir verabreicht) für 30 Minuten bis 1 Stunde.
      Hinweis: Verschiedene Arten der Verabreichung können yELD unterschiedliche Auswirkungen 23.
    3. Bewerben frischen physiologischer Kochsalzlösung in das Bad oder Lumen bei einer 1 Std Auswaschphase.

4. Datenverarbeitung und Erzeugung von Raum-Zeit-Karten

  1. Prozess jede Videoaufzeichnung offline Inhouse-Software in Matlab geschrieben mit (R2012a, Version 7.4, auf Anfrage), um Raum-Zeit-Karten veranschaulicht Kolonmotilität zu erzeugen.
    1. Offene Analysesoftware über das Symbol auf dem Desktop.
    2. Im Befehlsfenster, geben Sie "Analyse2", um die Analyse Systemsteuerung zu öffnen.
  2. Nutzen Sie die Kantenerkennungsfunktion zu raumzeitlichen Karten generieren, indem "Kantenerkennung für AVI-Dateien" in der Systemsteuerung klicken. Diese Funktion wird die Analysesoftware ermöglichen der neu kodierte Videos in Audio Video Interleaved (AVI) Format zu lesen.
  3. Führen Sie die folgenden Schritte nacheinander Raum-Zeit-Karten zu erzeugen, unter Verwendung eines adaptive Kantendetektionsalgorithmus.
    1. Offene aufgenommenen Videodateien durch die Registerkarte "Dateien hinzufügen" auswählen, legen Sie "Open Video" und die Position der Videodateien wählen.
    2. Aus den Video-Dateien innerhalb der Analyse-Software enthalten sind, wählen Sie die Datei von Interesse.
    3. Wählen Sie eine rechteckige Region von Interesse in dem Rahmen des Videos, beispielsweise die gesamte Länge des Dickdarms, von dem Punkt, an dem der Dickdarm oral an den analen Kanülierung einer Kanüle versehen ist. Sicherstellen, dass die proximalen und distalen Kanülierung Punkte an den vertikalen Grenzen der Region von Interesse benachbart sind. Kantenerkennung Linien (rot und grün) erscheint automatisch auf dem Echtzeitbild überlagert.
    4. Sicherstellen, dass die Kantenerkennungsschwelle Leitungen mit dem Doppelpunkt unmittelbar benachbart sind sowohl an den oberen und unteren Grenzen des Colongewebe (dies kann für jeden Video optimiert werden durch Verändern Detektionsschwellenwerten auf der Steuertafel). Stellen Sie sicher, dass die Kantenerkennung lines sind entlang der Länge des Dickdarms Bild kontinuierlich durch den Kontrast anpassen und Helligkeit über das Bedienfeld.
    5. Geben Sie den vollständigen Länge des Dickdarms (mm) in der Breite Dialogfeld (wie in Schritt aufgezeichnet 2.7). Wählen Sie dann "Heatmap erzeugen".
    6. In der Pop-up-Fenster, wählen Sie einen Speicherort für die Datei einen Dateinamen für die Raum-Zeit-Karte gespeichert werden und zu spezifizieren.
    7. Wählen Sie den ".su2 'Format und wählen Sie" In den Warteschlange ".
      Hinweis: .su2 Format komprimiert die Daten auf eine kleinere Dateigröße und mehrere Video-Dateien können in der Warteschlange hinzugefügt werden.
    8. Wählen Sie "Start Erkennung" auf raumzeitliche Karten erzeugen.

5. Analyse der Raum-Zeit-Karten

  1. Nutzen Raum-Zeit-Karten-Parameter zu schätzen, wie Frequenz, Ausbreitungsgeschwindigkeit, Länge und Dauer der CMMCs, Darmdurchmesser und dem Punkt der Initiierung und Leitung von Kontraktionen.
    1. So starten Raum-Zeit-AnalyseKarten, Typ 'analyse2 "im Befehlsfenster, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Anstelle von "Kantenerkennung", wählen Sie die "Heat Kartenanalyse" -Taste.
    2. Offene Raumzeit-Map-Dateien (.su2 Dateien), indem Sie die "Dateien hinzufügen" Tab und die Position des zuvor erhaltenen .su2 Dateien angeben.
    3. Sobald der Raum-Zeit-Karte auf dem Bildschirm sichtbar ist, geben Sie einen Farbbereich auf dem Bedienfeld gewährleistet, dass die Mindest auf 1 gesetzt ist.
      Man beachte, dass die maximale 5-10 gemäß der Kontraktionsfähigkeit des Gewebes reichen kann.
    4. Wählen Sie 'Lock Farbpalette ", um sicherzustellen, alle Karten aus einem einzigen Experiment werden unter den gleichen Bedingungen untersucht.
    5. Stellen Sie sicher, dass der Zeitrahmen Einstellungen für alle Raum-Zeit-Karten von einem bestimmten Experiment konstant sind.
  2. Um CMMC Frequenz zu bestimmen, manuell Kontraktionen zählt, die mehr als 50% der Länge des Dickdarms durchlaufen. Diese Kontraktionen kann visualized als rot / orange Streifen (Standard HSV-Farbindex) auf dem Raum-Zeit-Karte (Abbildung 2 für ein Beispiel siehe). Andere Kontraktionen, die kürzer sind oder nicht ausbreiten kann auch identifiziert und quantifiziert werden.
  3. Falls gewünscht, führen weitere Analyse mit einer höheren Auflösung von diesen Karten. Beispielsweise detaillierten Eigenschaften einschließlich der Geschwindigkeit und der Dauer jeder Kontraktion untersucht werden.
    1. Um die Geschwindigkeit und Dauer zu messen, wählen Sie die "Anmerken Kontraktionswellen" auf der Heatmap-Analyse Bedienfeld.
    2. Als nächstes vergrößern durch Klicken auf die Taste "Zoom" auf jeden ZMMK in und den interessierenden Bereich auswählen. Dann wählen Sie die "Manuelle kommentieren", um jeder Kontraktion zu annotieren mit Hilfe der Maus eine Linie von der die meisten Ausgangsposition bis zum Ende jeder Kontraktion zu ziehen. Dieses Verfahren verwendet werden können, um die scheinbare Ausbreitungsgeschwindigkeit und Dauer der Streckungen zu messen, die (zum Beispiel zu verbreiten scheinen, sehen einal Ende Karten in 2A, 2B).
      Hinweis: Die Daten für Geschwindigkeit und Dauer unter dem Ergebnisfenster angezeigt. Diese Werte können durch Auswahl des "Exportdaten" in eine Tabellenkalkulation von Interesse übertragen werden. Unerwünschte Kommentare können durch Klicken auf den "Entfernen ausgewählten Anmerkungen" Taste entfernt werden.
  4. Falls gewünscht, verwenden, um die x und y Koordinaten der Raum-Zeit-Karten (Zeit und Position entlang des Dickdarms, beziehungsweise) die Position der Einleitung kleinen Kontraktionen oder CMMCs zu bestimmen.
  5. In ähnlicher Weise, um Intervalle zwischen den Kontraktionen zu bestimmen und nutzen die "Beschriften" Funktion, die Dauer zwischen den Wehen zu messen. Wie zuvor können diese Ergebnisse in eine Tabelle exportiert werden, indem die "Exportdaten" auswählen.
  6. Um den Ruhe Darm Breite zu messen, wählen Sie die "Take Querschnitt" auf der Heatmap-Analyse-Panel.
    1. Wählen Sie "Add9; zum zeitlichen Querschnitte Panel. Doppelklicken Sie an einer beliebigen Stelle innerhalb der Karte eine horizontale Linie auf dem Wärme Karte überlagert zu erzeugen. Gut Durchmesser Daten werden nun in einem neuen Fenster angezeigt.
    2. Um gut Durchmesser messen, setzen Sie den Cursor auf einer Spitze und angrenzende Mulde durchschnittlich gut Breite für einen bestimmten experimentellen Bedingungen zu erhalten. Veränderungen im Darm Durchmesser zwischen experimentellen Bedingungen verglichen werden.

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Representative Results

Bis zu 90% der Patienten mit ASD eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen auftreten, wie Durchfall und Verstopfung 18,24,25. Allerdings sind die Ursachen dieser Magen-Darm-Probleme nicht bekannt. Viele Patienten mit ASD identifizierten Mutationen sind im Zusammenhang mit der synaptischen Proteinen Änderungen und Störungen in der synaptischen Übertragung oder Funktion beiträgt. Eine solche Mutation in dem Gen, das für das Zelladhäsionsmolekül neuroligin-3 (NL3 R451C), wurde in beiden Brüder mit ASD 17 identifiziert. Diese Mutation führt zu einem Argininrest an Position 451 des Neuroligin Protein mit einem Cystein ersetzt wird. NL3 R451C Mäuse diese Mutation zeigen exprimieren erhöhte GABA-vermittelte Übertragung im somatosensorischen Kortex 16,26 neben erhöht AMPA und NMDA-Rezeptor-vermittelten Aktivität im Hippocampus 25,27.

28-30. Da das enterische Nervensystem eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Magen-Darm-Funktion spielt, postulierten wir, dass die Mutation R451C Motilität beeinflussen würde. Daher wird, um mögliche Veränderungen in der Magen-Darm-Funktionen zu untersuchen, aufgrund synaptischen Anomalien haben wir versucht, die Wirkungen der Mutation auf R451C CMMC Frequenz in diesen Mäusen zu untersuchen.

Da Serotonin (5-HT) an der ENS wirkt gastrointestinalen Funktion in Mäusen zu modulieren 6 analysierten wir Motilität Muster als Reaktion auf die 5-HT-Rezeptorantagonist Tropisetron 3/4 in Kolon-Präparationen aus WT und NL3 R451C Mäusen.

Um zu beurteilen, ob die synaptische Mutation CMMCs ändert, wenn das enterische Nervensystem pharmakologisch gestört, die 5-HT-Rezeptor-Antagonist 3/4 Tropisetron (Trop;10 um, welche Blöcke sowohl 5HT3 und 5HT 4-Rezeptoren) zu dem Bad gegeben, die den Dickdarm Zubereitungen (Abbildung 2). Dickdarmgewebe aus neunzehn Alter angepaßten männlichen Mäusen (11 WT und 8 NL3 R451C) verwendet. In Gegenwart von Tropisetron zeigte NL3 R451C Mäusen eine Abnahme in CMMC Frequenz im Vergleich zu WT-Wurfgefährten. Repräsentative Beispiele für raumzeitliche Karten CMMCs und kontraktilen Aktivität in WT und NL3 R451C colon Zubereitungen zeigen, sind in den 2A bis 2E gezeigt. Obwohl kein Unterschied zwischen WT und NL3 R451C während Kontrollbedingungen beobachtet wurde, reduziert Tropisetron deutlich ZMMK Frequenz in beiden WT und NL3 R451C Mäuse (2C, 2F). In WT-Mäusen betrug die mittlere Anzahl der CMMCs 23 in Kontrollbedingungen im Vergleich zu 15 in Tropisetron (p = 0,023). In NL3 Mäusen betrug die mittlere Anzahl der CMMCs in Kontrollbedingungen 19.5Vergleich 2 in Gegenwart von Tropisetron (p = 0,022). Darüber hinaus hatte Tropisetron einen größeren Einfluss auf die Häufigkeit von CMMCs in NL3 R451C Mäusen im Vergleich zu WT (p = 0,047).

Abbildung 1
Abbildung 1. Orgel Bad eingerichtet und die Erzeugung von Raum-Zeit-Karten. (A) Ein frisch präpariert Magen-Darm-Segment wird bei oralen und analen Enden in einem Organbad (Querschnitt) mit physiologischer Kochsalzlösung und eine Kanüle gelegt. Die mündliche Kanüle wird zu einem Zufluss Reservoir mit physiologischer Kochsalzlösung und der After Kanüle mit einem Abfluss Rohr gefüllt verbunden. Eine Videokamera ist über dem Organbad angeordnet, um kontraktile Aktivität des Dickdarms zu erfassen. (B) Motilität ist mit hoher Auflösung Raum-Zeit-Karten Kennzeichnung Regionen des Dickdarms überführt, die in blau und verengte Bereiche erweitert werden in-Rot. (C) Ein Raum-Zeit-Karte Kolonmotilität (CMMCs) von einem Erwachsenen WT Maus zeigt. Einzelne CMMCs sind als rote vertikale Bereiche innerhalb der Karte angezeigt. Die X-Achse zeigt die Zeit zunehmenden (0-15 min). Die Y-Achse repräsentiert die räumliche Lage an der Kolonsegment (anal an der Basis, oral oben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Spatiotemporal Karten zeigen Sensibilität für Tropisetron in NL3 R451C Maus Doppelpunkt erhöht Spatiotemporal Karten ZMMK Frequenz in Kolonabschnitten von WT Kontrollen (A) und in Gegenwart von Tropisetron zeigt. (Trop; B). Trop reduziert ZMMK Frequenz in WT Doppelpunkt (C). Spatiote mporal Karten von NL3 Doppelpunkt unter Kontrollbedingungen (D) und in Gegenwart von Trop (E). Trop verursacht eine starke Reduktion in ZMMK Frequenz in NL3 Doppelpunkt (F). CMMC Frequenz in Reaktion auf Trop deutlich in NL3 reduziert wurde im Vergleich zu WT Doppelpunkt (p = 0,047, nicht gezeigt). Gut Breite (Pixelfarbe) auf der Y-Achse angegeben (willkürliche Einheiten, Bereich 1-6). Maßstabsbalken in E gilt für alle Karten. trop; Tropisetron. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung der Organbad. (A) Draufsicht, (B) Unterseite (C) Frontansicht, (D) Seitenansicht, eines Zweikammer Organbad aufgestellt. Abmessungen in mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Mit diesem Video-Imaging-Technik, wurde ZMMK Frequenz als Hinweis auf Kolonmotilität gemessen in Wildtyp und NL3 R451C Mäusen, einem Mausmodell für Autismus-Spektrum-Störung 17. Unsere Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Anzahl der CMMCs in mutierten Mäusen NL3 R451C im Vergleich zu Wildtypmäusen in Gegenwart des 5HT-Rezeptorantagonist Tropisetron 3/4 darauf hindeutet, dass NL3 R451C Mäusen eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Tropisetron aufweisen. Wir schlagen daher vor, dass die neuroligin-3 R451C Mutation die Serotonin-Weg ändert, möglicherweise von entweder 5-HT 3 oder 5-HT 4 Rezeptor-Funktion in enterischen Nervenzellen, die Schleimhaut oder beides zu modulieren. Dies unterstreicht den Wert der Methode zur Identifizierung von phänotypischen Unterschiede zwischen Genotypen und zur Identifizierung von spezifischen Ziele für nachfolgende Untersuchungen.

Dieses Verfahren kann modifiziert werden räumliche Auflösung zu verbessern, indem sie Videos Erwerb überein Stereo-Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet montieren. Dieser Ansatz ermöglicht Aufnahmen von kleinen Zubereitungen des Gastrointestinaltraktes bei embryonalen Zeitpunkten bereits E12.5 31 vorgenommen werden. Neuromodulatoren können über das Lumen oder in das Organbad außerhalb des Darmvorbereitung angewendet werden. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nützlich für große und kleine gastrointestinale Motilität in einer Reihe von Spezies, einschließlich Mäusen, Ratten und Meerschweinchen zu beurteilen.

Gemeinsame Schritte zur Fehlerbehebung für dieses Verfahren umfassen die Überprüfung der Fluss der Lösung über die Rohrleitung, die Lebensfähigkeit des Gewebes, Aufrechterhaltung von konstanten Lumendruck und sicherzustellen, dass Kolonabschnitten befinden sich weg von den Wänden des Organbad. Blockaden innerhalb der Rohrleitung kann Lumendruck verändern und verhindern Kontraktionen auftreten; Daher müssen alle Rohre gründlich gereinigt werden, um Salzkristalle oder Schmutz / Fäkalien vor Kanülierung entfernen. Die Luft muss aus Rohrleitungen entfernt werden direkt mit der Kanüle vor den Experimenten zugeordnet (dh durch die Rohre mit Kochsalzlösung Priming). Darüber hinaus Vorbereitungen Gewebe muss mit Sorgfalt behandelt, um eine Beschädigung zu verhindern, dass in Unbeweglichkeit des Dickdarms führt. Um Gewebeschäden zu vermeiden, dass der Doppelpunkt fest (aber nicht fest), der an der Kanüle während der Aufnahme und eine konstante Temperatur und eine kontinuierliche Zufuhr von CO 2 + O 2 zu dem Bad. Achten Sie auch darauf, dass der Lumendruck konstant gehalten wird und dass keine Kontraktionen werden manuell durch Einstellung Zufluss Reservoirs während der Aufzeichnungsperiode eingeleitet. Stellen Sie sicher, dass der Doppelpunkt Gewebe nicht an der Wand des Organs Bad während der Wehen nicht berührt, da dies Kantenerkennung Analyse der relevanten Raum-Zeit-Karten zu verhindern. Dies kann durch die Überwachung der Kontraktionen während der Äquilibrierung und Einstellen der Position des Kolons vermieden werden, dies zu verhindern, dass während des Versuchs auftreten.

_content "> einige Einschränkungen mit dieser Technik verbunden sind, sollten in zu berücksichtigen, wenn die Analyse und die Daten einschließlich der geringen Durchsatz Natur dieser Ansatz zu interpretieren. Während das Verfahren bei der Identifizierung von Änderungen in der Migration Bewegungsmuster effektiv ist, kann es nicht bestimmen, ob auftretende Dehnungen während das Fortschreiten eines CMMC sind neurokardiogenen oder einfach passive Antworten auf die kontraktile Aktivität (dh, die sich aus der Bewegung des Fluids). die Konzentrationsgradienten für Diffusion durch die Darmwand ermöglichen die Wirkungen von luminal angewendet Medikamente werden zuzuschreiben Aktionen innerhalb der Schleimhaut, sondern in längeren Experimente können Schleimhautdegeneration dadurch auftreten, um die Wirkorte dieser Medikamente über die Aufzeichnungsdauer zu verändern. Darüber hinaus, ob Drogen unterschiedliche Effekte in den myentericus und submuköse Plexus haben, können nicht mit dieser Methode bestimmt werden. im Gegensatz dazu ist dieser Ansatz ermöglicht eine kollektive Beurteilung der Auswirkungen auf das enterische nervous System durch eine Gesamtänderung der Motilität Muster zu messen. Weitere Überlegungen umfassen die Notwendigkeit, die Art der Daten zu berücksichtigen (dh Zähldaten für CMMC Frequenz und erfordert nicht-parametrische Analyse) und der niedrigen Frequenz von CMMCs, wenn Experimente und entsprechende Datenanalysestrategien zu entwerfen.

Kürzlich schlug Barnes und Kollegen, dass Dickdarmgewebe Stimulation erfordert, um CMMCs 32, jedoch veröffentlicht Ergebnisse aus unserem Labor zu beobachten zeigen, dass spontane CMMCs kann durch einfaches Ablegen des Gewebes in das Organbad über das Gekröse 7 beobachtet werden. Die Anwesenheit von CMMCs unter diesen Bedingungen zeigt nicht nur die Spontaneität CMMCs, aber weiter ausgeführt über die Nützlichkeit dieser Technik Änderungen in Kolonmotilität zu etablieren. Obwohl dieser Ansatz zu extra colonic Regionen des Gastrointestinaltraktes anwendbar ist, erfordert die Komplexität von kleinen Darmmotilität mehr detdiejenigen fehlte Analysestrategien als verwendet zur Quantifizierung CMMCs 33.

Dieser experimentelle Ansatz hat eine sehr hohe räumliche und zeitliche Auflösung und schließt die Möglichkeit der Arzneimittelabgabe sowohl außerhalb und innerhalb des Lumens zur Untersuchung der Wirkungen von Konzentrationsgradienten auf dem enterischen Nervensystems variiert. Darüber hinaus ist dieses Verfahren geeignet für 6,23 im gefütterten Zustand Dünndarmsegmentierung analysieren. Die ex vivo Natur dieses Verfahren ermöglicht, die Rolle des enterischen Nervensystem in der Abwesenheit des zentralen Nervensystems Eingänge bewertet werden und ist daher eine ideale Möglichkeit, die gastrointestinale Motilität in einer Vielzahl von Modellen zu untersuchen, einschließlich genetischer Krankheitsmodelle (siehe Abbildung 2) 6,34.

Dieses Verfahren kann auch Simulationen der motorischen Aktivität 23,33,35 an den Computer verwendet werden physiologische Daten zu vergleichen. Solche Simulationen können Bewegungsmuster vorherzusagen, indie Form der Raumzeit-Karten für direkte Vergleiche mit physiologischen Experimenten 33,35. Verwendung von schnellen Fourier-Transformation und Wavelet-Analyse 36, kann auch der Anteil der glatten Muskulatur Schrittmacher (erzeugt durch interstitielle Cajal-Zellen) zu Motilität extrahiert werden. Darüber hinaus kann diese Videoabbildungstechnik mit extrazelluläre Aufzeichnung der elektrischen Aktivität im Muskel 3 kombiniert werden Beiträge von neuronalen und myogenen Mustergeneratoren zu ermöglichen zu unterscheiden. Beachten Sie, die extrazelluläre Aufzeichnungsverfahren löst hemmende Junction Potentiale in Abwesenheit von Kontraktionen der glatten Muskulatur oder Lockerungen.

Während diese Technik auch für die Analyse von Magen-Darm-Motilität in einer Vielzahl von Zubereitungen und Arten hergestellt ist, hat es auch das Potenzial in anderen Systemen verwendet werden, wie beispielsweise das Studium der Vasokonstriktion im Mesenterium (vorher über eine einfachere Durchmesser Verfolgungssystem analysiert 37) undin der Skelettmuskulatur.

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Acknowledgments

JCB und ELH-Y wurden durch das US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034) unterstützt. NHMRC (1047674) zu ELH-Y.The Mai Stewart Bursary-Universität von Melbourne Vertrauen Stipendium für MS finanziert. Wir danken Ali Taher, Fátima Ramalhosa und Gracia Seger für technische Beiträge.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
NaCl (MW: 58.44) Sigma-Aldrich S7653-250G
KCl (MW: 74.55) Sigma-Aldrich P9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) Chem Supply 471-500G
MgSO4.7H20 (MW: 246.48) Chem Supply MA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02) Chem Supply CA033
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) Chem Supply GA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01) Chem Supply GA018-500G
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Two chambered organ bath
Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm		 Custom Made Contact Laboratory Directly 
 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR Dow Corning Australia Pty Ltd 1890573
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT  Dow Corning Australia Pty Ltd 1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S Terumo Medical Corporation 0912-2006
SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml Terumo Medical Corporation N/A
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing Masterflex 508-008
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing Masterflex 508-005
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing Masterflex 508-007
1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 - 14
4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 - 15 
3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing  Masterflex 96410 -16
Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml      Thermofisher Scientific  100-400
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm 
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm
Water heater  (thermo regulator)  Ratek  TH7000 
Logitech Webcam Logitech
Name Company Catalog Number Comments
Software
Virtual Dub - 1.9 11 virtualdub.org
MATLAB R2012a  Graph Pad
Logitech Webcam Software Logitech

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References

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Tags

Neuroscience Ausgabe 108 Magen-Darm-Motilität Colon-Migration Motor-Komplexe (CMMCs) Raum-Zeit-Karten enterischen Nervensystems (ENS) Video-Bildgebung Pharmakologie synaptischen Störungen Maus genetische Mutation neuroligin-3
Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen
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Swaminathan, M., Hill-Yardin, E., Ellis, M., Zygorodimos, M., Johnston, L. A., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53828, doi:10.3791/53828 (2016).

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