Abstract
De enterisk nervesystem (ENS) spiller en viktig rolle i regulering av gastrointestinal (GI) motilitet og kan fungere uavhengig av det sentrale nervesystemet. Endringer i ENS funksjon er en viktig årsak til GI symptomer og sykdom, og kan bidra til å GI symptomer rapportert i nevropsykiatriske lidelser, inkludert autisme. Det er godt etablert at isolerte kolon segmenter generere spontane, rytmiske sammentrekninger kjent som colonic Migrere Motor komplekser (CMMCs). En fremgangsmåte for å analysere den enteriske nevrale regulering av CMMCs i ex vivo preparater av mus kolon, er beskrevet. Tykktarmen er dissekert fra dyret og spylt for å fjerne avføring innhold før den ble innført en kanyle i et organbad. Data samles inn via et videokamera plassert over organbadet og konvertert til høy oppløsning i tid og rom kartene via en in-house programvarepakken. Ved hjelp av denne teknikken, baseline kontraktile mønstre og farmakologiske effekter på ENS funksjon i tykktarmen segments kan sammenlignes over 3-4 timer. I tillegg kan forplantning lengde og hastighet CMMCs registreres samt endringer i tarmen diameter og sammentrekning frekvens. Denne teknikken er nyttig for karakterisering av gastrointestinal motilitet mønstre i transgene musemodeller (og i andre arter, inkludert rotte og marsvin). På denne måte blir farmakologisk induserte endringer i CMMCs registrert i villtype mus og i den Neuroligin-3 R451C musemodell for autisme. Videre kan denne teknikk anvendes på andre områder av mage-tarmkanalen inkludert duodenum, jejunum og ileum, og ved ulike utviklings aldre i mus.
Introduction
De enterisk nervesystem (ENS) er den iboende neuronal nettverk av mage-tarmkanalen og modulerer forskjellige funksjoner slik som fordøyelse av tarminnhold, absorpsjon av næringsstoffer og sekresjon og reabsorpsjon av væske. Nerveceller i ENS er lokalisert i myentericus og submukøse plexuses. Den myentericus plexus spiller en viktig rolle i å regulere gastrointestinal motilitet en mens submucosal plexus er primært involvert i kontrollen av sekresjon 2,3. Den plexus myentericus ligger mellom de langsgående og sirkulære muskel lag av tarmveggen. Den kontraktile aktivitet av de glatte muskellagene av tarmveggen forenkler de primære funksjonene til mage-tarmkanalen ved å blande og driver tarminnhold langs lengden av tarmen 3. Selv om den ytre nerve tilførsel til mage-tarmkanalen fra CNS bidrar til gastrointestinal funksjon in vivo, Er det ENS stand til å regulere gastrointestinal funksjon uavhengig av hverandre. Denne unike egenskap gjør at den funksjonelle undersøkelse av tarm nevrale kretser og deres bidrag til gastrointestinal motilitet ex vivo.
Colonic trekkende motor komplekser (CMMCs) er spontane, nevrogene hendelser som er den dominerende motor mønsteret observert i isolerte mus kolon i fravær av ekskrementpelletene 4-9. CMMCs er definert som rytmiske kontraksjoner som forplanter seg langs en horisontal avstand som er minst halvparten av den totale lengden av tykktarmen (dvs. fra cecum til endetarmen) 10. Forholdet mellom CMMCs og kontraktile mønstre som driver ekskrementpelletene er ennå ikke klarlagt, men noen farmakologiske forskjeller har blitt rapportert 11. Ikke desto mindre evne til ENS for å fungere uavhengig av CNS og eksistensen av neural-mediert motor mønstre i standarden ISolated kolon gir en ideell analysesystem for å undersøke forstyrrelser i bevegeligheten som følge av underliggende ENS dysfunksjon. Spontanitet av gastrointestinale motoriske mønstre gjør funksjonelle endringer i respons til farmakologiske stimuli som skal evalueres.
Bruk av video bildebehandling og spatiotemporal kartlegging ble først utviklet for å kvantitativt undersøke små intestinal peristaltikk i marsvin 12. Her blir en ex vivo teknikk som er beskrevet som gjør det mulig å studere mus tykktarmsmotilitet mønstre ved hjelp av video-avbildning og analyse av disse opptakene å konstruere høy oppløsning (~ 100 mikrometer, 33 msek)-kart av colonic diameter som en funksjon av posisjon langs kolon og tid (tid og rom kart). Ved hjelp av in-house edge deteksjon programvare (Analyse2, tilgjengelig på forespørsel), er data fra full lengde colonic segmenter entreprenør i sanntid behandlet for å generere tid og rom kart for hvert forsøk. I dette trinnet, video (AVI) -filer er summahovedservice-- og konvertert til tid og rom kart ved hjelp Analyse2. Tid og rom kart (figur 2) viser kontraktilitet over tid, og muliggjøre måling av flere parametere, inkludert forplantningshastighet, størrelse, lengde og varighet. Gut diameter er også registrert i løpet av varigheten av forsøket som et mål på den samlede kontraktilitet av vevet segmentet. Denne fremgangsmåten kan anvendes for å identifisere forskjeller i initieringspunkt for kontraktile komplekser som kan indikere forandrede enteriske nerve tilkobling.
En tilsvarende videoavbildningsprotokoll utviklet for å vurdere pellet fremdrift hos marsvin har blitt rapportert 13 imidlertid her vi forklarer anvendelsen av videobilled metode for kvantifisering av spontan tykktarmsmotilitet (dvs. i fravær av pellets). Vi gir også detaljert informasjon for å bistå i disseksjon og utarbeidelse av gastrointestinal vev for videobilde tilnærming. Detteprotokollen gir forskere med et tilgjengelig og lett å replikeres verktøy for å analysere enterisk neural kontroll av gastrointestinal funksjon i dyremodeller av sykdom, inkludert genetiske musemodeller.
Den videoavbildningsteknikk muliggjør analyse av tykktarmsmotilitet i respons til forskjellige farmakologiske midler. Legemidler kan administreres via tarmkanalen eller organbadet eksterne til colonic forberedelse. Forskjellige deler av mage-tarmkanalen mus utviser spesifikke motilitet mønstre slik som i tynntarmen segmentering og CMMCs i tykktarmen.
Denne teknikken har blitt anvendt for å identifisere forskjeller i strekk liten tarmfunksjonen; forskjellig sensitivitet til 5-HT3 og 5-HT-4-antagonister ble observert i jejunum fra Balb / c og C57 / BL6 mus på grunn av den polymorfe arten av tph2-genet uttrykkes i de to stammene 6. Effekten av 5-HT-inhibering på motilitet forblir controversielle, som motstridende data har blitt rapportert på betydningen av endogent 5-HT på colonic peristaltikk og CMMCs 14,15. Endringer i motilitet pre- og postnatalt under utvikling 7, og effekten av genmutasjoner på gastrointestinal motilitet i dyremodeller av sykdom 10 kan også bli undersøkt ved å benytte video bildebehandling. Her vi illustrere bruken av fremgangsmåten for et studium av tykktarmsmotilitet i NL3 R451C musemodell for autisme, som uttrykker en missense mutasjon i genet som koder for Nlgn3 synaptiske bindingsproteinet, Neuroligin-3 16. Denne mutasjonen ble først identifisert i pasienter diagnostisert med autisme spektrum lidelse (ASD) 17, som er sterkt assosiert med GI dysfunksjon 18-22. Vi undersøkte om NL3 R451C synaptiske mutasjonen påvirker nerve utganger i ENS ved å bruke videoavbildningsteknikk. Vi presenterer data som kjennetegner CMMCs ved utgangspunktet og som reaksjon på det serotonerge 5HT 3/4 reseptor antagonist tropisetron i NL3 R451C musemodell for autisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal håndtering og halshugging av dyr før alle forsøkene ble utført strengt i henhold til protokoller godkjent av forsøk med dyr Utvalget for University of Melbourne (Ethics ID: 1212494,7)
1. Tissue Collection og Dissection
- Avlive voksne mus ved cervikal dislokasjon. Hvis det er mulig unngå anestesi for å unngå påvirkning på tarmfunksjon via reseptorer plassert i nevronale populasjoner av interesse.
- Spill dyrets totale kroppsvekt, pin kroppen (via de fire poter, ventral side utsatt for experimenter) fast til en disseksjon bord med sprøyte nåler (Størrelse: 20 G).
- Bruke dissekere pinsett og saks; lage et snitt gjennom epidermis overliggende de nederste magemuskellagene. Fortsett å bruke pinsett og saks for å åpne bukhulen langs midtlinjen av magen til brystbenet.
- For å hindre at vev dehydrerende, hell physiological saltvann (Krebs-oppløsning: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, en NaH 2PO 4, 25 NaHCO3, 11 D-glukose i mM - boblet ved RT med karbogen gass; 95% O 2 og 5 % CO2 i minst 20 min) på mageinnholdet ved jevne mellomrom (dvs. hver 30-60 sek) i løpet av disseksjon prosessen.
- For å isolere tykktarmen mens festet til cecum og endetarm, hold cecum (ligger i tilknytning til den proksimale enden av tykktarmen) forsiktig ved hjelp dissekere pinsett ca 4-5 cm over kroppen på dyret mens trimming mesentery hjelp av gode disseksjon saks.
- Pass på ikke å håndtere, strekke eller kutte gastrointestinal vev mens du fjerner den tilstøtende mesentery.
- Fjern overflødig vev (dvs., urinblæren og testikler). Ved hjelp av grove dissecting saks, lage to vertikale snitt (dvs. ca 0,5 cm fra midtlinjen) for å kutte bekkenbenet på each side av colon.
- Bruk fin saks for å skille rektum fra tilstøtende bekken vev og trim omliggende muskler fra tykktarmen.
- Plasser full lengde kolon (fra cecum til rectum) inn i et beger inneholdende fysiologisk saltløsning (tidligere oksygenert med karbogen) og fortsette oksygenering ved RT. Ta av blindtarm og endetarm hjelp av gode dissekere saks og erstatt i beger.
- Tomme ekskrementpelletene / tarminnhold fra colonic preparater ved påføring av et lett positivt trykk ved den orale enden ved hjelp av en 5 ml sprøyte festet til en 200 ul pipette fylt med fysiologisk saltvann. For å orientere vevet i fremtiden ved å bruke en insekt tapp for å markere den mest proksimale enden av tykktarmen, hvor striper i slimhinnene er synlige.
- Endre plast pipettespissen å passe 5 ml sprøyte ved å fjerne ca 1 cm av den bredeste / proksimale ende ved hjelp av et barberblad. For å øke flow rate, utvide distal / minste enden ved å kutte på en angle (ca. 45 ° C) ved anvendelse av et barberblad.
- Grip kolon vev forsiktig ved sin proksimale ende med dissekere tang, sett pipettespissen inn i lumen av kolon og skyll fysiologisk saltvann gjennom lumen.
2. Utarbeidelse av Kolon Tissue og eksperimentell satt opp for Video Imaging
- Spyl fysiologisk saltvann gjennom hele produksjonsrøret er festet til en to-kammer, organbadet satt opp (figur 1 og figur 3), ved hjelp av en sprøyte koblet til et 200 ul pipettespiss. Dette trinnet fjerner eventuelle rester inne i røret som kunne blokkere strømmen av oppløsning. For rør spesifikasjoner refererer til materialer tabellen.
- Sikre at kamrene i organbadet kontinuerlig superfuseres med fysiologisk saltvann boblet med karbogen (95% O2 og 5% CO2, strømningshastighet på 5 ml min-1). Ved hjelp av en temperaturføler med jevne mellomrom, sikre at Temperature av badet opprettholdes mellom 33 ° C -37 ° C.
- Fyll innstrømningstanken er koblet via en 3-veis stoppekran til innløpsrøret med ca. 20-30 ml fysiologisk saltløsning ved anvendelse av en 50 ml sprøyte.
- Under eksperimentet opprettholde trykket i reservoaret ved hjelp av innstrømnings arubber propp med et glassrør (5 mm innvendig diameter) innsatt gjennom dets sentrum. Pass på at den øvre åpningen av tilsig reservoaret er godt forseglet (med den indre glassrøret rester utette).
- Plasser kolon (lengde 5-7 cm) i organbadet kammeret, noe som gjør at det er fullt nedsenket i fysiologisk saltvann.
- Cannulate hver ende av colonic segmentet til de to neddykkede innløp / utløp rør (innløp / utløp rør av forskjellig diameter kan endres i henhold til størrelsen av vevet lumen f.eks. Postnatal vev, voksne mus og marsvin) i badekaret ved hjelp av standard bomull sytråd. Feste den proksimale enden av tykktarmen til innløpsrøret og dendistale enden av tykktarmen til utløpsrøret (koblet via en 3-veis stoppekran til en vertikal utløpsrøret, 6 cm i høyde). Sørg for at vevet er ikke overstretched eller for avslappet etter kanylering å unngå interferens med fremtidige målinger og analyser.
- Registrere lengden av tykktarmen ved å måle avstanden mellom de proksimale og distale cannulations ved hjelp av en 15 cm linjal. Dette er viktig for å tolke endringer i sammentrekning lengde, forplantningshastighet og sammentrekning initieringspunkter.
- Sikre en stabil baseline luminal press (cm H 2 O) er etablert før du starter eksperimentet. Beregn luminal trykket ved å måle den vertikale avstand fra vevet til menisken av fysiologisk saltvann inne i glassrøret for innstrømning reservoar (oral) og den vertikale utløpsrøret (anal).
- Oppretthold vevspreparater ved en konstant intraluminale trykk (for eksempel 1-2 cm H2O) ved å sikre at innstrømnings stopperen tetningen Manometerre holdes konstant, og at ingen blokkeringer er tilstede i settet opp.
- La kolon skal stabilisere seg i fysiologisk saltvann i 30 minutter før du tar opp tarmbevegelsene. Sjekk om det er blokkeringer som oppstår i inn- eller utløpsrørene og fjerne dem ved å legge press gjennom tilsig reservoaret eller ved å re-kanylerør oral og anal endene av kolon.
3. Image Capture and Experimental Protocol
- Rekordtarmbevegelser som videofiler ved hjelp av et videokamera (30 bilder / sek, 640 x 840 piksler) plassert 10-15 cm over orgel bad på en standard laboratorium motsvar stå (figur 1).
- Åpne Virtual Dub (video fange programvare) fra ikonet på skrivebordet. Fra "Fil" -kategorien, velg "capture AVI" for å vise kamerabildet. På "Audio-fanen velge bort 'enable lydopptak" for å slå av lyden.
- I kategorien video velg "kompresjon" og "DivX6.9.2. Codec & #39; å komprimere videofiler for å minimere bruken av lagringsplass. Denne funksjonen vil bli tilgjengelig ved installasjon av kompresjons programvare 'DivX'.
- Justere kameraets plassering manuelt, slik at hele cannulated kolon segment er synlig (med kannulerte regioner i umiddelbar nærhet av de vertikale kantene av videobildet) via video fange programvare vinduet (se figur 1). For å bedre bildekvaliteten og redusere refleksjoner, feste en papir / papp skjold til kameraet støtte for å blokkere uvedkommende lys på organbadet. Optimalisere videokvaliteten ved å justere lysstyrke, kontrast og eksponeringsinnstillinger du bruker kameraet programvaren grensesnittet.
- Før innspillingen, angi et bestemt filnavn; i "File" fanen, velg "Set capture file" og angi et unikt navn for videoen.
- Begynn å spille inn video ved å trykke på "Capture file 'fra" Capture "verktøylinjen. For å stoppe recording velg "Stop capture" -knappen eller "Esc" -tasten på tastaturet.
- Sett på fysiologisk saltvann inneholdt i innløpsreservoaret med frisk fysiologisk saltvann hvert 30 min.
- Record luminal press (se 2.9) og ved hjelp av en temperaturføler, legg merke til organbadet temperatur. Gjenta disse trinnene gjennom hele forsøket (dvs. hvert 30 min) for å sikre at disse variablene er konstante.
- Record colonic aktivitet totalt for 3 timer (inkludert narkotika søknad og utvasking varighet). For datalagring formål, registrerer data i 15 min video segmenter. En full eksperiment vil typisk bestå av 12 x 15 min videoopptak.
- Record aktivitet for en timer under kontroll forhold (fysiologisk saltvann).
- Anvende medikamentet (enten superfuseres inn i badet eller administreres inn i hulrommet via innstrømningen reservoaret) i 30 min til 1 time.
Merk: Ulike administrasjonsveier kan yield ulike effekter 23. - Bruk frisk fysiologisk saltvann til badet eller lumen under en 1 time utvaskingsperiode.
4. Data Processing og generasjon av tid og rom Maps
- Prosess hver videoopptak pålogget bruker in-house programvare skrevet i MATLAB (R2012a, versjon 7.4, tilgjengelig på forespørsel) for å generere tid og rom kart som illustrerer tykktarmsmotilitet.
- Åpen programvare analyse fra ikonet på skrivebordet.
- I kommandovinduet, skriv "Analyse2" for å åpne analysen kontrollpanelet.
- Utnytte kantdeteksjon funksjonen for å generere tid og rom kart ved å klikke på "Edge deteksjon for AVI-filer" i kontrollpanelet vinduet. Denne funksjonen vil gjøre det mulig analyse programvare for å lese recoded videoene i Audio Video Interleaved (AVI) format.
- Utfør følgende trinn sekvensielt å generere tid og rom kart ved hjelp av en adaptive edge algoritme.
- Åpne innspilte videofiler ved å velge "Legg til filer" -kategorien, velg "Åpne video" og velge plasseringen av videofiler.
- Fra videofilene som er oppført i analyse programvare, velg filen av interesse.
- Velge en rektangulær region av interesse innenfor rammen av videoen, f.eks hele lengden av tykktarmen, fra det punkt hvor tykktarmen ble kanylert oralt til anal kanylering. Sørg for at de proksimale og distale kanylering punktene er ved siden av de vertikale grensene i regionen av interesse. Edge gjenkjenning linjer (rød og grønn) vil automatisk vises oppå sanntid bilde.
- Pass på at kanten deteksjonsgrensen linjer er rett ved siden av kolon på både øvre og nedre grense for tykktarmen vev (dette kan optimaliseres for hver video ved å endre deteksjonsterskelverdier på kontrollpanelet). Kontroller at kantdeteksjon lines er sammenhengende langs lengden av tykktarmen bildet ved å justere kontrast og lysstyrke ved hjelp av kontrollpanelet.
- Angi hele lengden av tykktarmen (mm) i bredde dialogboksen (som registrert i trinn 2.7). Velg deretter "Generer varmekartet».
- I pop up vinduet, velg en plassering for filen som skal lagres og angi et filnavn for spatiotemporal kartet.
- Velg ".su2" format og velg "Legg til i kø".
Merk: .su2 formatet komprimerer data til en mindre filstørrelse og flere videofiler kan legges til i køen. - Velg "Begynn gjenkjenning" for å generere tid og rom kart.
5. Analyse av tid og rom Maps
- Utnytte tid og rom kart å estimere parametere som frekvens, utbredelse hastighet, lengde og varighet av CMMCs, gut diameter og poenget med initiering og ledelse av sammentrekninger.
- For å begynne å analysere spatiotemporalkart, type 'analyse2' i kommandovinduet som beskrevet i forrige avsnitt. I stedet for "Edge gjenkjenning", velg "Heat kartanalyse" -knappen.
- Åpne tid og rom kartfiler (.su2 filer) ved å velge fanen "Legg til filer" og angi plasseringen av tidligere innhentet .su2 filer.
- Når spatiotemporal kartet er synlig på skjermen, angir et fargespekter på kontrollpanelet, slik at minimum er satt til 1.
Legg merke til at den maksimale kan ligge i området 5-10 i henhold til kontraktilitet av vevet. - Velg "Lås fargespekter" for å sikre at alle kartene fra et enkelt eksperiment er analysert under samme forhold.
- Pass på at rammeinnstillingene tid er konstant for alle tid og rom kart fra et gitt eksperiment.
- For å bestemme CMMC frekvens, manuelt telle sammentrekninger som krysser mer enn 50% av lengden av tykktarmen. Disse sammentrekningene kan være visualized som rød / oransje striper (standard HSV farge indeks) på spatiotemporal kartet (se Figur 2 for et eksempel). Andre sammentrekninger som er kortere eller ikke forplanter kan også bli identifisert og kvantifisert.
- Dersom det er ønskelig, foreta ytterligere analyser med høyere oppløsning fra disse kartene. For eksempel kan detaljerte egenskaper inkludert hastigheten og varigheten av hver sammentrekning undersøkes.
- For å måle hastighet og varighet, velg "Kommenter sammentrekning bølger" -knappen på varmen kartanalyse kontrollpanelet.
- Deretter zoome inn på hver CMMC ved å klikke på "Zoom" -knappen og velge det området av interesse. Deretter velger du «Manuell kommentere" -knappen for å kommentere hver sammentrekning ved å bruke musen til å tegne en linje fra den mest opprinnelige posisjon til slutten av hver sammentrekning. Denne fremgangsmåten kan brukes for å måle den tilsynelatende forplantningshastigheten og varigheten av strekkinger som synes å forplante (for eksempel, se detal slutten av kart i figur 2A, 2B).
Merk: data for hastighet og varighet vises under resultatvinduet. Disse verdiene kan overføres til et regneark av interesse ved å velge "Export data" -kategorien. Uønskede kommentarer kan fjernes ved å klikke på "Fjern valgte merknader" -knappen.
- Dersom det er ønskelig, bruke x- og y-koordinatene til tid og rom kartene (tid og posisjon langs den tykktarmen, henholdsvis) for å bestemme posisjonen til initiering av små sammentrekninger eller CMMCs.
- På samme måte, for å kunne fastslå intervaller mellom kontraksjoner, bruk "til tekst" funksjon for å måle varigheten mellom riene. Som tidligere, kan disse resultatene kan eksporteres til et regneark ved å velge "Export data" -kategorien.
- For å måle hvile gut bredde, velger du «Ta tverrsnitt" -knappen på Heat kartanalyse panel.
- Velg "Legg9; på time tverrsnitt panel. Dobbeltklikk på ethvert sted inne i kartet for å generere en vannrett linje, overlagret på kartet varmen. Gut diameter data vil nå vises i et nytt vindu.
- For å måle gut diameter, plasserer du markøren på en topp og tilstøtende trau for å oppnå gjennomsnittlig gut bredde for en bestemt eksperimentell tilstand. Endringer i tarmen diameter kan sammenlignes mellom eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opptil 90% av pasientene med ASD oppleve en rekke gastrointestinale lidelser, inkludert diaré og forstoppelse 18,24,25. Men de underliggende årsakene til disse gastrointestinale problemene er ukjent. Mange identifiserte mutasjoner hos pasienter med ASD er forbundet med synaptiske proteiner som bidrar til endringer og forstyrrelser i synaptisk transmisjon eller funksjon. En slik mutasjon i genet som koder for celleadhesjonsmolekylet neuroligin-3 (NL3 R451C), ble identifisert i to Brødrene med ASD 17. Denne mutasjonen fører til en argininrest ved posisjon 451 av den Neuroligin proteinet erstattes med en cystein. NL3 R451C mus som uttrykker denne mutasjonen viser økt GABA-mediert overføring i somatosensoriske cortex 16,26 sammen med økt AMPA og NMDA reseptor mediert aktivitet i hippocampus 25,27.
28-30. Som det enteriske nervesystemet spiller en stor rolle i å regulere gastrointestinal funksjon, postulerte vi at R451C mutasjon vil påvirke bevegelighet. Derfor, for å undersøke mulige endringer i gastrointestinale funksjoner på grunn av synaptiske abnormaliteter søkte vi å undersøke effektene av R451C mutasjons på CMMC frekvens i disse musene.
Fordi serotonin (5-HT) virker på ENS for å modulere mage-tarmfunksjonen hos mus 6 vi analysert motilitet mønstre som respons på 5-HT-reseptorantagonist 3/4 tropisetron in colonic preparater fra WT og NL3 R451C mus.
For å vurdere om den synaptiske mutasjon forandrer CMMCs når det enteriske nervesystemet er farmakologisk opprørt, 5HT 3/4 reseptor antagonist Tropisetron (Trop;10 uM, som blokkerer både 5HT3 og 5HT-4 reseptorer) ble tilsatt til badet som inneholder kolon preparater (figur 2). Colonic vev fra nitten år matchet hannmus (11 WT og 8 NL3 R451C) ble brukt. I nærvær av tropisetron, NL3 R451C mus viste en reduksjon i CMMC frekvens sammenlignet med WT littermates. Representative eksempler på tid og rom kart som viser CMMCs og kontraktile aktivitet i WT og NL3 R451C kolon preparater er vist i figur 2A til 2E hhv. Selv ble observert noen forskjell mellom WT og NL3 R451C under kontroll forhold, tropisetron betydelig redusert CMMC frekvens i både WT og NL3 R451C mus (figur 2C, 2F). I WT mus, median antall CMMCs var 23 i kontrollforhold sammenlignet med 15 i tropisetron (p = 0,023). I NL3 mus, median antall CMMCs i kontrollforholdene var 19,5sammenlignet med to i nærvær av tropisetron (p = 0,022). I tillegg, tropisetron hadde en større virkning på frekvensen av CMMCs i NL3 R451C mus sammenlignet med WT (p = 0,047).
Figur 1. organbadet satt opp og generering av tid og rom-kart. (A) En nylig dissekert gastrointestinale segment er plassert i et organbad (tverrsnitt) inneholdende fysiologisk saltoppløsning og kanylert ved oral og anal ender. Den orale kanyle er forbundet med en innstrømnings reservoar fylt med fysiologisk saltvann og den anal kanyle koblet til en utstrømning rør. Et videokamera er plassert over organbadet for å registrere kontraktil aktivitet i tykktarmen. (B) motilitet konverteres til høyoppløselig tid og rom kart merking regioner i tykktarmen som er dilatert i blått og trange områder in red. (C) En spatiotemporal kart som viser tykktarmsmotilitet (CMMCs) fra en voksen WT mus. Individuelle CMMCs er angitt som røde vertikale områder innenfor kartet. X-aksen viser tid øker (0-15 min). Y-aksen representerer den romlige plasseringen langs kolon segment (anal ved basen, oral på toppen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Spatiotemporal kartene viser økt følsomhet for Tropisetron i NL3 R451C mus kolon Spatiotemporal kart som viser CMMC frekvens i tykktarm segmenter fra WT kontroller (A) og i nærvær av Tropisetron. (Trop, B). Trop redusert CMMC frekvens i WT kolon (C). Spatiote mporal kart fra NL3 kolon i henhold til kontrollforhold (D) og i nærvær av Trop (E). Trop forårsaket en kraftig reduksjon i CMMC frekvens i NL3 kolon (F). CMMC frekvens som reaksjon på Trop ble signifikant redusert i NL3 sammenlignet med WT kolon (p = 0,047, ikke vist). Gut bredde (piksler) er angitt på Y-aksen (vilkårlige enheter, utvalg 1-6). Scale bar i E gjelder for alle kart. trop; Tropisetron. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjematisk av orgel bad. (A) ovenfra, (B) Under, (C) Sett forfra, (D) fra siden, av en to kammer orgel bad satt opp. Mål i mm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne videoen avbildningsteknikk, ble CMMC frekvens målt som en indikasjon på tykktarmsmotilitet i villtype og NL3 R451C mus, en musemodell av autisme spektrum lidelse 17. Våre resultater tyder på en reduksjon i antallet CMMCs i mutante NL3 R451C-mus sammenlignet med villtype mus i nærvær av 5HT 3/4 reseptorantagonist Tropisetron hvilket antyder at NL3 R451C mus oppviser en økt følsomhet for Tropisetron. Derfor foreslår vi at neuroligin-3 R451C mutasjonen forandrer serotonin vei, eventuelt ved modulering av 5HT enten 3 eller 4 5HT-reseptoren funksjon i enteriske neuroner, slimhinnene eller begge deler. Dette understreker metodens verdi for identifisering av fenotypiske forskjeller mellom genotyper og for identifisering av spesifikke mål for senere studier.
Denne metoden kan bli endret for å forbedre romlig oppløsning ved å kjøpe opp videoer viaen stereo-mikroskop utstyrt med et kamera festet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å foreta innspillinger fra små preparater av mage-tarmkanalen på embryonale tidspunkter så tidlig som E12.5 31. Nevromodulatorer kan påføres via hulrommet eller i organbadet på utsiden av colonic fremstillingen. Dessuten er denne metode som er nyttig for å vurdere både store og små gastrointestinal motilitet i en rekke arter, inkludert mus, rotter og marsvin.
Vanlige fremgangsmåter for feilsøking av denne fremgangsmåten omfatter å kontrollere strømningen av oppløsningen via produksjonsrøret, levedyktigheten av vev-preparatet, opprettholdelse av konstant trykk luminal og sikre at tykktarm segmentene er plassert vekk fra veggene i organbadet. Blokkeringer inne i produksjonsrøret kan endre luminal trykk og forhindre sammentrekninger oppstår; derfor alle rør må rengjøres grundig for å fjerne saltkrystaller eller rusk / avføring før kanylering. Luft må fjernes fra slangeledninger direkte forbundet med kanylen før eksperimenter (dvs. ved priming rørene med saltvann). I tillegg må vevspreparater håndteres med forsiktighet for å unngå skade som resulterer i immobilitet i tykktarmen. For å unngå skade på vev, sikre at tykktarmen er fast (men ikke tett) festet til kanylen under innspillingsprosessen og opprettholde en konstant temperatur og en kontinuerlig tilførsel av CO 2 + O 2 til badet. Også sikre at luminal trykket holdes konstant, og at ingen sammentrekninger blir manuelt startes ved å regulere innstrømnings reservoarer under registreringsperioden. Sørge for at tykktarmsvevet ikke kommer i kontakt med veggen av organbadet i løpet av sammentrekninger, da dette vil hindre kantdeteksjon analyse av de aktuelle tid og rom kartene. Dette kan unngås ved å overvåke sammentrekninger under likevekts-perioden, og å justere posisjonen til tykktarmen for å hindre at dette skjer i løpet av eksperimentet.
_content "> Flere begrensninger forbundet med denne teknikken bør tas i betraktning når analysere og tolke data, inkludert lav gjennomstrømning natur av denne tilnærmingen. Selv om fremgangsmåten er effektiv i å identifisere forandringer i å migrere motor mønstre, kan det ikke fastslå hvorvidt strekkinger som forekommer i løpet av progresjon av en CMMC er nevralt mediert eller bare passive respons til den kontraktile aktivitet (dvs. som følge av bevegelsen av fluidet). de konsentrasjonsgradienter for diffusjon over colonic veggen tillate virkningene av luminally appliserte legemidler for å føres tilbake til handlinger i slimhinner, men i lengre eksperimenter mucosal degenerasjon kan oppstå og dermed endre nettstedene til handling av disse stoffene over opptaksperioden. Videre om rusmidler har forskjellige effekter i myentericus og submukøse plexuses kan ikke bestemmes ved hjelp av denne metoden. i kontrast, gjør denne tilnærmingen en samlet vurdering av effekter på tarm nervous system ved å måle en generell endring i motilitet mønstre. Ytterligere betraktninger inkluderer behovet for å ta hensyn til arten av de data (dvs. telle data for CMMC frekvens, som krever ikke-parametrisk analyse) og den lave hyppigheten av CMMCs, ved utforming av eksperimenter og hensiktsmessige dataanalyse strategier.Nylig, Barnes og kolleger foreslo at colonic vev krever stimulering for å observere CMMCs 32, men publiserte funn fra vårt laboratorium viser at spontane CMMCs kan observeres ved ganske enkelt å feste vevet til organbadet via mesentery 7. Tilstedeværelsen av CMMCs under disse betingelser viser ikke bare de spontane CMMCs, men ytterligere utdyper nyttigheten av denne teknikken for å etablere endringer i tykktarmsmotilitet. Selv om denne fremgangsmåte kan anvendes for å ekstra colonic områder av mage-tarmkanalen, kompleksiteten av små intestinal motilitet krever mer detaljfeilte analyse strategier enn de som brukes for å kvantifisere CMMCs 33.
Denne eksperimentell tilnærming har meget høy romlig og tidsmessig oppløsning og inkluderer muligheten av medikamentavgivelse både eksternt til og inne i lumen for å undersøke effekten av varierende konsentrasjonsgradienter på den enterisk nervesystem. Dessuten er denne metoden egnet til å analysere tynntarm segmentering i løpet av matinntak 6,23. Den ex vivo natur av denne fremgangsmåte gjør det mulig rolle enterisk nervesystem som skal vurderes i fravær av sentralnervesystem innganger og er derfor en ideell måte for å undersøke gastrointestinal motilitet i en rekke modeller, inkludert genetiske modeller for sykdoms (se figur 2) 6,34.
Denne metoden kan også brukes til å sammenligne fysiologiske data til datasimuleringer av motorisk aktivitet 23,33,35. Slike simuleringer kan forutsi motoriske mønstre iform av tid og rom kart for direkte sammenligninger med fysiologiske eksperimenter 33,35. Ved hjelp av Fast Fourier Transform og wavelet-analyse 36, kan bidraget av glatte muskelceller pacemakere (generert av interstitiell celler av Cajal) til motilitet også trekkes ut. Videre kan denne videoen avbildningsteknikk kombineres med ekstracellulære opptak av elektrisk aktivitet i muskelen 3 for å tillate bidrag fra nevrale og myogeniske mønster generatorer for å skilles. Legg merke til den ekstracellulære innspillingen metoden løser hemmende koblings potensialer i fravær av glatte muskelsammentrekninger eller lettelser.
Selv om denne teknikken er velkjent for analyse av gastrointestinal motilitet i en lang rekke preparater og art, har den også potensiale til å bli brukt i andre systemer, for eksempel studier av vasokonstriksjon i mesenteriet (tidligere analysert via en enklere diameter sporingssystem 37) ogi skjelettmuskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JCB og ELH-Y ble støttet av US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) til ELH-Y.The mai Stewart Bursary-universitetet i Melbourne tillit finansiert stipend til MS. Vi takker Ali Taher, Fátima Ramalhosa og Gracia Seger for tekniske bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
- Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
- Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
- Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
- Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
- Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
- Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
- Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
- Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
- Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
- Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
- Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
- Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233 (2015).
- Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
- Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
- Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
- Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
- Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
- Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224 (2012).
- McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
- Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
- Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
- Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
- Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
- Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
- Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
- Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
- Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205 (2013).
- Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
- Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
- Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597 (2011).
- Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
- Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
- Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326 (2014).
- Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).
