Abstract
El sistema nervioso entérico (ENS) juega un papel importante en la regulación de la motilidad gastrointestinal (GI) y puede funcionar independientemente del sistema nervioso central. Cambios en la función ENS son una causa importante de los síntomas GI y la enfermedad y pueden contribuir a los síntomas GI reportados en los trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo el autismo. Está bien establecido que los segmentos de colon aisladas generan contracciones rítmicas espontáneas, conocidas como colónica Migración Motor Complejos (CMMCs). Un procedimiento para analizar la regulación neural entérica de CMMCs en la ex vivo de las preparaciones de colon de ratón se describe. El colon se disecciona del animal y lava para eliminar el contenido fecal antes de ser canulado en un baño de órganos. Los datos se adquieren a través de una cámara de vídeo situada por encima del baño de órganos y se convierte en mapas espacio-temporales de alta resolución a través de un paquete de software de la casa. Usando esta técnica, los patrones contráctiles de línea de base y los efectos farmacológicos sobre la función ENS en Colon segments se pueden comparar más de 3-4 horas. Además, la longitud de propagación y la velocidad de CMMCs se pueden grabar, así como cambios en el diámetro del intestino y frecuencia de las contracciones. Esta técnica es útil para la caracterización de los patrones de la motilidad gastrointestinal en modelos de ratones transgénicos (y en otras especies, incluyendo rata y cobaya). De esta manera, los cambios farmacológicamente inducidos en CMMCs se registran en ratones de tipo salvaje y en el modelo de ratón R451C neuroligin-3 del autismo. Además, esta técnica se puede aplicar a otras regiones del tracto GI, incluyendo el duodeno, el yeyuno y el íleon y a diferentes edades de desarrollo en ratones.
Introduction
El sistema nervioso entérico (ENS) es la red neuronal intrínseca del tracto gastrointestinal y modula diversas funciones tales como la digestión del contenido intestinal, la absorción de nutrientes y la secreción y reabsorción del líquido. Las neuronas de la ENS están situados en los plexos mientérico y submucoso. El plexo mientérico juega un papel importante en la regulación de la motilidad gastrointestinal 1, mientras que el plexo submucoso es principalmente involucrado en el control de la secreción de 2,3. El plexo mientérico está situado entre las capas musculares longitudinales y circulares de la pared gastrointestinal. La actividad contráctil de las capas musculares lisas de la pared intestinal facilita las funciones primarias del tracto gastrointestinal mediante la mezcla y propulsando contenido intestinal a lo largo de la longitud del intestino 3. Aunque la inervación extrínseca al tracto gastrointestinal del CNS contribuye a la función gastrointestinal in vivo, El ENS es capaz de regular la función gastrointestinal de forma independiente. Esta característica única permite a la investigación funcional de los circuitos neuronales entéricas y su contribución a la motilidad gastrointestinal ex vivo.
Colon migran complejos de motor (CMMCs) son eventos espontáneos, neurogénicos que son el patrón motor predominante observada en aislados de colon de ratón en ausencia de bolitas fecales 4-9. CMMCs se definen como contracciones rítmicas que se propagan a lo largo de una distancia horizontal que es al menos la mitad de la longitud total de los dos puntos (es decir, desde el ciego hasta el recto) 10. La relación entre CMMCs y los patrones contráctiles que impulsan bolitas fecales aún no se ha establecido claramente, sin embargo, algunas diferencias farmacológicas se han reportado 11. Sin embargo, la capacidad de la ENS de funcionar independientemente de la CNS y la existencia de patrones motores neural mediada en la SIde colon olated proporciona un sistema de ensayo ideal para examinar las perturbaciones en la motilidad resultantes de la disfunción ENS subyacente. La espontaneidad de los patrones motores gastrointestinales permite cambios funcionales en respuesta a estímulos farmacológicos que han de evaluarse.
El uso de imágenes de vídeo y mapeo espacio-temporal se desarrolló primero en examinar cuantitativamente pequeña peristaltismo intestinal en cerdos de guinea 12. Aquí, una técnica ex vivo se describe que permite el estudio de los patrones de la motilidad del colon de ratón utilizando imágenes y el análisis de estas grabaciones de video para la construcción de alta resolución (~ 100 micras, 33 mseg) mapas de diámetro del colon como una función de posición a lo largo del colon y de tiempo (mapas espacio-temporales). El uso de software interno de detección de bordes (Analyse2; a petición), los datos de larga duración en segmentos colónicos contratantes en tiempo real son procesados para generar mapas espacio-temporales para cada experimento. En este paso, los archivos de vídeo (AVI) son summatorizado y convertido en espacio-temporales mapas utilizando Analyse2. Mapas espacio-temporales (Figura 2) representan la contractilidad en el tiempo y permiten la medición de varios parámetros tales como la velocidad de propagación, la magnitud, la duración y la duración. diámetro Gut también se registra a lo largo de la duración del experimento como una medida de la contractilidad global del segmento de tejido. Este método se puede aplicar para identificar diferencias en el punto de inicio de complejos contráctiles lo que podría indicar la conectividad neuronal entérico alterado.
Un protocolo de formación de imágenes de vídeo similar diseñado para evaluar la propulsión pellet en cobayas Se ha informado que 13 sin embargo aquí describimos la aplicación del enfoque de formación de imágenes de vídeo para la cuantificación de la motilidad colónica espontánea (es decir, en ausencia de gránulos). También proporcionamos información detallada para ayudar en la disección y preparación del tejido gastrointestinal para el enfoque de formación de imágenes de vídeo. Estaprotocolo proporciona a los investigadores una herramienta accesible y fácilmente replicado para el análisis de control neural entérico de la función gastrointestinal en modelos animales de enfermedad, incluyendo modelos genéticos de ratón.
La técnica de imagen de vídeo permite el análisis de la motilidad del colon en respuesta a diversos agentes farmacológicos. Los medicamentos pueden ser administrados a través de la luz del intestino o el baño de órganos externos a la preparación del colon. Diferentes regiones del tracto gastrointestinal de ratón exhiben patrones de motilidad específicos, tales como pequeño segmentación intestinal y CMMCs en el colon.
Esta técnica se ha utilizado para identificar las diferencias de deformación en función del intestino delgado; sensibilidad diferencial a 5-HT 3 y 5-HT 4 antagonistas se observaron en el yeyuno de ratones Balb / c y ratones C57 / Bl6 debido a la naturaleza polimórfica del gen TPH2 expresado en las dos cepas 6. El efecto de la inhibición de 5-HT en la motilidad se mantiene conpolémico, ya que los datos contradictorios se ha informado sobre la importancia de la 5-HT endógena en el peristaltismo del colon y CMMCs 14,15. Las alteraciones en la motilidad pre- y postnatal durante el desarrollo 7, y los efectos de las mutaciones del gen sobre la motilidad gastrointestinal en modelos animales de la enfermedad 10 también pueden ser examinados mediante la utilización de imágenes de vídeo. Aquí se ilustra el uso del método para un estudio de la motilidad del colon en el modelo de ratón NL3 R451C de autismo, que expresa una mutación sin sentido en el gen que codifica la proteína NLGN3 adhesión sináptica neuroligin-3 16. Esta mutación se identificó por primera vez en pacientes con diagnóstico de trastorno del espectro autista (TEA) 17, que está fuertemente asociada con la disfunción GI 18-22. Hemos investigado si la mutación R451C sináptica NL3 afecta a las salidas de los nervios en la ENS utilizando la técnica de imagen de vídeo. Se presentan los datos que caracterizan CMMCs al inicio y en respuesta a la 5H serotoninérgicaT 3/4 antagonista del receptor de tropisetrón en el modelo de ratón NL3 R451C del autismo.
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Protocol
Manejo de animales y dislocación cervical de los animales antes de todos los experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Melbourne (Ética ID: 1212494.7)
1. Tejido Recogida y disección
- La eutanasia a los ratones adultos por dislocación cervical. Si es posible evitar la anestesia para evitar influencias sobre la función intestinal a través de receptores situados en poblaciones neuronales de interés.
- Registrar el peso total del cuerpo del animal, fijar el cuerpo (a través de las cuatro patas, cara ventral expuesta al experimentador) firmemente a una placa de disección usando agujas hipodérmicas (Tamaño: 20 G).
- Con unas pinzas de disección y tijeras; hacer una incisión a través de la epidermis superposición de las capas musculares abdominales inferiores. Seguir utilizando las pinzas y tijeras para abrir la cavidad abdominal a lo largo de la línea media del abdomen hasta el esternón.
- Para evitar la deshidratación del tejido, se vierte physisolución salina gico (solución de Krebs: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 11 D-glucosa en mM - burbujear a TA con gas Carbógeno; 95% de O2 y 5 % de CO 2 durante un mínimo de 20 min) sobre el contenido abdominal a intervalos regulares (es decir, cada 30 a 60 segundos) durante el proceso de disección.
- Para aislar el colon mientras está conectada al intestino ciego y el recto, mantenga el ciego (que se encuentra adyacente al extremo proximal del colon) suavemente con fórceps de disección aproximadamente 4-5 cm por encima del cuerpo del animal, mientras que el recorte del mesenterio usando tijeras de disección finas.
- Tenga cuidado de no manejar, estirar o cortar el tejido gastrointestinal mientras se quita el mesenterio contiguo.
- Retire el exceso de tejido (es decir, la vejiga urinaria y los testículos). Con unas tijeras de disección gruesas, hacen dos incisiones verticales (es decir, aproximadamente 0,5 cm de la línea media) para cortar el hueso de la pelvis en each lado del colon.
- Utilice unas tijeras finas para separar el recto de la contigua tejido pélvico y el asiento que rodea los músculos del colon.
- Coloque el colon de longitud completa (desde el ciego hasta el recto) en un vaso de precipitados que contiene solución salina fisiológica (previamente oxigenada con carbógeno) y continuar para oxigenar a TA. Retire el ciego y el recto uso de las tijeras de disección finas y vuelva a colocar en el vaso de precipitados.
- bolitas fecales vacío / contenido intestinal a partir de preparaciones de colon mediante la aplicación de presión positiva al final suave oral utilizando una jeringa de 5 ml unido a una punta de pipeta de 200 l lleno de solución salina fisiológica. Con el fin de orientar el tejido en el futuro, utilizar un pasador de insectos para marcar el extremo más proximal del colon, donde las estrías en la mucosa son visibles.
- Modificar la punta de pipeta de plástico para adaptarse a la jeringa 5 ml mediante la eliminación de aproximadamente 1 cm del extremo más ancho / proximal utilizando una hoja de afeitar. Para aumentar la velocidad de flujo, ensanchar el extremo distal / más pequeño por el corte en un angle (aproximadamente 45 ° C) usando una cuchilla de afeitar.
- Agarre el tejido del colon suavemente en su extremo proximal con pinza de disección, inserte la punta de la pipeta en el lumen del colon y solución salina fisiológica al ras a través del lumen.
2. Preparación de colon tejidos y montaje experimental para imágenes de vídeo
- Solución salina fisiológica Flush a través de toda la tubería unida a un baño de dos órganos de cámara configurar (Figura 1 y la Figura 3), utilizando una jeringa conectada a una punta de pipeta 200 l. Esta etapa elimina cualquier residuo dentro de la tubería que pueda bloquear el flujo de solución. Para tubería de especificaciones se refieren a la tabla de materiales.
- Asegúrese de que las cámaras de baño de órganos se superfused continuamente con solución salina fisiológica burbujear con Carbógeno (95% de O2 y 5% de CO 2, velocidad de 5 ml min -1 flujo). El uso de una sonda de temperatura a intervalos regulares, asegurarse de que la temperatUre del baño se mantiene entre 33 ° C -37 ° C.
- Llenar el depósito de flujo de entrada conectado a través de una llave de paso de 3 vías para el tubo de entrada con aproximadamente 20 a 30 ml de solución salina fisiológica con una jeringa de 50 ml.
- Durante el experimento, mantener la presión en el depósito de entrada utilizando arubber tapón con un tubo de vidrio (5 mm de diámetro interior) que se inserta a través de su centro. Asegúrese de que la abertura superior del depósito de entrada se sella de forma segura (con el tubo de vidrio interior permaneciendo sin sellar).
- Coloque los dos puntos (5-7 cm de longitud) en la cámara de baño de órganos, asegurándose de que esté totalmente sumergido en solución salina fisiológica.
- Canular cada extremo del segmento de colon a los dos tubos de entrada / salida sumergidas (entrada / tubos de salida de diferente diámetro se puede cambiar de acuerdo con el tamaño del lumen de tejido, por ejemplo. Tejido postnatal, los ratones adultos y conejillo de Indias) en el uso de baño ordinario hilo de coser de algodón. Una el extremo proximal del colon para el tubo de entrada y laextremo distal del colon para el tubo de salida (conectado a través de una llave de paso de 3 vías a un tubo de salida vertical; 6 cm de altura). Asegúrese de que el tejido no se estira demasiado o demasiado relajado después de la canalización para evitar interferencias con las mediciones y análisis futuros.
- Registrar la longitud del colon mediante la medición de la distancia entre los extremos proximal y distal canulaciones utilizando una regla 15 cm. Esto es importante para la interpretación de los cambios en la contracción de la longitud, la velocidad de propagación y puntos de iniciación de la contracción.
- Asegurar que se establezca antes de comenzar el experimento una presión luminal línea de base estable (cm H2O). Calcular la presión luminal por la medición de la distancia vertical desde el tejido al menisco de solución salina fisiológica en el tubo de vidrio de depósito de flujo de entrada (oral) y el tubo de salida vertical (anal).
- Mantener preparaciones de tejidos a una presión intraluminal constante (por ejemplo, 1-2 cm H 2 O) asegurándose de que el sello del tapón de entrada pressure se mantiene constante y que no hay obstrucciones están presentes en la puesta en marcha.
- Deje el colon para equilibrar en solución salina fisiológica durante 30 minutos antes de grabar los movimientos intestinales. Comprobar que no existen bloqueos que surgen en los tubos de entrada o salida y eliminarlos mediante la aplicación de presión a través del depósito de flujo de entrada o volviendo a cannulating los extremos oral y anal del colon.
3. Captura de Imagen y Protocolo Experimental
- Movimientos intestinales de registro como archivos de vídeo utilizando una cámara de vídeo (30 cuadros / seg, 640 x 840 píxeles) posicionados 10-15 cm por encima del baño de órganos en una retorta de laboratorio estándar de pie (Figura 1).
- Abra Virtual Dub (software de captura de vídeo) desde el icono en el escritorio. En la ficha "Archivo", seleccione "AVI captura" para ver la imagen de la cámara. En la 'Audio' para deshacer la selección pestaña «permitir la captura de audio 'para desactivar el sonido.
- En la pestaña de vídeo, seleccione "compresión" y "DivX6.9.2. Codec & #39; para comprimir archivos de vídeo para minimizar el uso de espacio de almacenamiento. Esta función estará disponible tras la instalación del software de compresión "DivX".
- Ajustar manualmente la ubicación de la cámara de manera que todo el segmento de colon canulado es visible (con regiones canulados inmediatamente adyacentes a los bordes verticales del marco de vídeo) a través de la ventana del software de captura de vídeo (véase la Figura 1). Con el fin de mejorar la calidad de la imagen y la mínima reflexión, adjuntar una protección de papel / cartón para el soporte de la cámara para bloquear la luz extraña en el baño de órganos. Optimizar la calidad de vídeo mediante el ajuste de los ajustes de brillo, contraste y la exposición utilizando la interfaz de software de la cámara.
- Antes de grabar, establecer un nombre de archivo específico; en la pestaña "Archivo", seleccione "archivo de captura Set 'y especificar un nombre único para el video.
- Iniciar la captura de vídeo pulsando 'archivo de captura "de la barra de herramientas' captura '. Para detener la grabaciong seleccionar el botón "Detener captura" o la tecla "Esc" en el teclado.
- Vuelva a colocar la solución salina fisiológica contenida dentro del depósito de entrada con solución salina fisiológica fresca cada 30 minutos.
- la presión luminal registro (véase 2.9) y usando una sonda de temperatura, toman nota de la temperatura del baño de órganos. Repita estos pasos durante todo el experimento (es decir, cada 30 min) para asegurar que estas variables son constantes.
- la actividad del colon récord en total de 3 horas (incluyendo la aplicación del fármaco y la duración de lavado). Para los propósitos de almacenamiento de datos, los datos de registro en los segmentos de vídeo 15 min. Un experimento completo normalmente se compone de grabaciones de vídeo de 12 x 15 min.
- registrar la actividad durante 1 hora bajo condiciones de control (solución salina fisiológica).
- Aplicar el fármaco (ya sea superfused en el baño o administrada en el lumen a través del depósito de flujo de entrada) durante 30 min a 1 hr.
Nota: Las diferentes vías de administración y puedenield diferentes efectos 23. - Aplicar solución salina fisiológica fresca para el baño o lumen durante un período de lavado de 1 hr.
Procesamiento de Datos y 4. Generación de mapas espacio-temporales
- Proceso de cada grabación de vídeo en línea usando software propio escrito en MATLAB (R2012a, versión 7.4, disponible bajo petición) con el fin de generar mapas espacio-temporales que ilustran la motilidad del colon.
- software de análisis abierto desde el icono en el escritorio.
- En la ventana de comandos, escriba "Analyse2" con el fin de abrir el panel de control de análisis.
- Utilizar la función de detección de bordes para generar mapas espacio-temporales haciendo clic en "Detección de bordes para los archivos .avi" en la ventana del panel de control. Esta función permitirá al software de análisis para leer los vídeos recodificadas en formato de audio y vídeo (AVI).
- Llevar a cabo los siguientes pasos secuencialmente para generar mapas espacio-temporales mediante un adaalgoritmo de detección de bordes ptive.
- Abrir archivos de vídeo grabados seleccionando la pestaña "Añadir archivos", seleccionar "Abrir video 'y seleccione la ubicación de los archivos de vídeo.
- A partir de los archivos de vídeo que figuran en el software de análisis, seleccione el archivo de interés.
- Seleccione una región rectangular de interés en el marco de la de vídeo, por ejemplo, toda la longitud del colon, desde el punto en el que se canula el colon por vía oral a la canulación anal. Asegúrese de que los puntos de canulación proximal y distal son adyacentes a los límites verticales de la región de interés. líneas de detección de borde (rojo y verde) serán automáticamente aparecen superpuesta a la imagen en tiempo real sobre.
- Asegúrese de que las líneas de umbral de detección de bordes son inmediatamente adyacentes a los dos puntos en ambos de los límites superior e inferior del tejido de colon (esto puede ser optimizado para cada vídeo mediante la alteración de valores de umbral de detección en el panel de control). Asegúrese de que el borde de detección lines son continuas a lo largo de la longitud de la imagen del colon mediante el ajuste del contraste y el brillo usando el panel de control.
- Introduzca toda la longitud del colon (mm) en el cuadro de diálogo de ancho (según consta en el paso 2.7). A continuación, seleccione "Generar mapa de calor".
- En la ventana emergente, seleccione una ubicación para el archivo que desea guardar y especificar un nombre de archivo para el mapa espacio-temporal.
- Seleccione el formato de '.su2 "y seleccione" Agregar a la cola ".
Nota: El formato .su2 comprime los datos a un varios archivos de vídeo tamaño de archivo más pequeño y se pueden añadir a la cola. - Seleccione 'Comenzar detección' para generar mapas espacio-temporales.
5. Análisis de Mapas espacio-temporales
- Utilizar mapas espacio-temporales para calcular los parámetros tales como la frecuencia, la velocidad de propagación, la longitud y duración de CMMCs, diámetro de la tripa y el punto de inicio y la dirección de las contracciones.
- Para iniciar el análisis espacio-temporalmapas, tipo 'analyse2' en la ventana de comandos, como se describe en la sección anterior. En lugar de "Detección de bordes", seleccione el botón de "análisis del mapa de calor".
- Abrir archivos de mapas espacio-temporales (archivos .su2) seleccionando la pestaña 'Añadir archivos' y especificar la ubicación de archivos que hayan sido obtenidos .su2.
- Una vez que el mapa espacio-temporal es visible en la pantalla, especifique un rango de color en el panel de control, asegurando que el mínimo se establece en 1.
Tenga en cuenta que la máxima puede oscilar desde 5 hasta 10 según la contractilidad del tejido. - Seleccione 'gama de colores Lock' para asegurar que todos los mapas de un solo experimento son analizadas en las mismas condiciones.
- Asegúrese de que los ajustes de marcos de tiempo son constantes para todos los mapas espacio-temporales de un experimento dado.
- Con el fin de determinar la frecuencia CMMC, contar manualmente las contracciones que atraviesan más de 50% de la longitud del colon. Estas contracciones pueden ser visualizado como rayas de color rojo / naranja (índice de color estándar VHS) en el mapa espacio-temporal (véase la Figura 2 para un ejemplo). Otros contracciones que son más cortas o no se propagan también pueden ser identificados y cuantificados.
- Si se desea, realizar un análisis más a fondo en una resolución más alta a partir de estos mapas. Por ejemplo, las propiedades detalladas, incluyendo la velocidad y la duración de cada contracción se pueden examinar.
- Con el fin de medir la velocidad y duración, seleccione el botón "Anotar ondas de contracción" en el mapa de calor panel de control de análisis.
- A continuación, el zoom para cada CMMC haciendo clic en el botón "Zoom" y seleccionar el área de interés. A continuación, seleccione el botón "anotar manualmente" para anotar cada contracción usando el ratón para dibujar una línea desde la posición más inicial al final de cada contracción. Este método puede ser usado para medir la velocidad de propagación aparente y la duración de las dilataciones que aparecen para propagar (por ejemplo, ver unaal final de los mapas en la Figura 2A, 2B).
Nota: Los datos para la velocidad y la duración aparecerá debajo de la ventana de resultados. Estos valores pueden ser transferidos a una hoja de cálculo de intereses seleccionando la pestaña "Exportar datos". anotaciones no deseados se pueden eliminar haciendo clic en el botón "Eliminar anotaciones seleccionadas".
- Si lo desea, utilice la coordenadas X e Y de los mapas espacio-temporales (tiempo y posición a lo largo de los dos puntos, respectivamente) para determinar la posición de inicio de pequeñas contracciones o CMMCs.
- Del mismo modo, con el fin de determinar los intervalos entre las contracciones, utilice la función "Anotar" para medir la duración entre las contracciones. Como anteriormente, estos resultados se pueden exportar a una hoja de cálculo seleccionando la pestaña "Exportar datos".
- Con el fin de medir la anchura del intestino en reposo, seleccione el botón "Tomar sección transversal" en el panel de análisis del mapa de calor.
- Seleccione 'Agregar9; en el panel de secciones transversales temporal. Haga doble clic en cualquier lugar dentro del mapa para generar una línea horizontal superpuesto sobre el mapa de calor. datos del diámetro de la tripa se mostrarán ahora en una nueva ventana.
- Para medir el diámetro del intestino, coloque el cursor sobre el pico y valle adyacente a obtener anchura media del intestino para una condición experimental específica. Los cambios en el diámetro de la tripa pueden ser comparados entre las condiciones experimentales.
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Representative Results
Hasta 90% de los pacientes con TEA experimentar una serie de trastornos gastrointestinales, incluyendo diarrea y estreñimiento 18,24,25. Sin embargo, las causas subyacentes de estos problemas gastrointestinales son desconocidos. Muchas mutaciones identificadas en pacientes con TEA se asocian con proteínas sinápticas contribuir a las alteraciones y perturbaciones en la transmisión o la función sináptica. Un tal mutación, en el gen que codifica la molécula de adhesión celular neuroligin-3 (NL3 R451C), se identificó en dos hermanos con TEA 17. Esta mutación da como resultado un residuo de arginina en la posición 451 de la proteína neuroligin siendo reemplazados por una cisteína. NL3 ratones que expresan este espectáculo R451C mutación aumento de la transmisión mediada por GABA en la corteza somatosensorial 16,26 junto con el aumento de la actividad mediada por los receptores AMPA y NMDA en el hipocampo 25,27.
28-30. A medida que el sistema nervioso entérico juega un papel importante en la regulación de la función gastrointestinal, que postula que la mutación R451C afectaría motilidad. Por lo tanto, con el fin de investigar posibles alteraciones en las funciones gastrointestinales debido a anormalidades sinápticas hemos tratado de examinar los efectos de la mutación R451C en la frecuencia CMMC en estos ratones.
Debido a que la serotonina (5-HT) actúa sobre el ENS para modular la función gastrointestinal en ratones 6 se analizaron patrones de motilidad en respuesta a la 5-HT 3/4 receptor tropisetrón antagonista en preparaciones de colon de los ratones WT y NL3 R451C.
Para evaluar si la mutación altera sináptica CMMCs cuando el sistema nervioso entérico es perturbado farmacológicamente, el antagonista del receptor 5-HT 3/4 Tropisetrón (Trop;10 M, que se añadió bloquea tanto 5HT3 y 5-HT 4 receptores) para el baño que contiene los preparativos de colon (Figura 2). Se utilizó tejido colónico desde los diecinueve años ratones macho emparejado (11 WT y 8 NL3 R451C). En presencia de tropisetrón, los ratones NL3 R451C mostraron una disminución en la frecuencia CMMC en comparación con compañeros de camada WT. Los ejemplos representativos de mapas espacio-temporales que muestran CMMCs y la actividad contráctil en preparaciones de colon WT y NL3 R451C se muestran en las figuras 2A a 2E, respectivamente. Aunque no se observó diferencia entre WT y NL3 R451C durante condiciones de control, tropisetrón reduce significativamente la frecuencia CMMC tanto en ratones WT y NL3 R451C (Figura 2C, 2F). En los ratones WT, la mediana del número de CMMCs era 23 en condiciones de control en comparación con 15 en el tropisetrón (p = 0,023). En los ratones NL3, el número medio de CMMCs en condiciones de control fue de 19,5en comparación con el 2 en presencia de tropisetrón (p = 0,022). Además, tropisetrón tenía un efecto mayor en la frecuencia de CMMCs en ratones NL3 R451C en comparación con WT (p = 0,047).
Figura 1. baño de órganos configurado y generación de mapas espacio-temporales. (A) Un segmento gastrointestinal recién disecados se coloca en un baño de órganos (vista en sección transversal) que contiene solución salina fisiológica y se canuló en extremos oral y anal. La cánula por vía oral está conectado a un depósito de flujo de entrada lleno de solución salina fisiológica y la cánula anal conectado a un tubo de salida. Una cámara de vídeo está situada encima del baño de órganos con el fin de registrar la actividad contráctil del colon. (B) se convierte en la motilidad de alta resolución espacio-temporales regiones de etiquetado mapas de colon que se dilatan en las regiones azul y constricción in rojo. (C) Un mapa espacio-temporal que muestra la motilidad del colon (CMMCs) a partir de un ratón adulto WT. CMMCs individuales se indican como regiones verticales rojas dentro del mapa. El eje X muestra el tiempo en aumento (0-15 min). El eje Y representa la ubicación espacial a lo largo del segmento de colon (anal en la base, por vía oral en la parte superior). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los mapas espacio-temporales muestran una mayor sensibilidad a la Tropisetrón en NL3 R451C colon de ratón mapas espacio-temporales que muestra la frecuencia CMMC en segmentos de colon de los controles WT (A) y en presencia de Tropisetrón. (Trop; B). Trop reduce la frecuencia CMMC en el documento WT de colon (C). Spatiote mporal mapas de NL3 de colon bajo condiciones de control (D) y en presencia de Trop (E). Trop provocó una fuerte reducción en la frecuencia CMMC en NL3 dos puntos (F). frecuencia CMMC en respuesta a Trop se redujo significativamente en comparación con NL3 de colon WT (p = 0,047, no mostrado). anchura Gut (color de píxeles) se indica en el eje Y (unidades arbitrarias, rango de 1 a 6). La barra de escala en E se aplica a todos los mapas. trop; Tropisetrón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Esquema de baño de órganos. (A) Vista superior, (B) inferior, (C) Vista frontal, (D) Vista lateral, de un baño de órganos cámaras de dos sets arriba. Dimensiones en mm.ref = objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando esta técnica de formación de imágenes de vídeo, la frecuencia CMMC se midió como una indicación de la motilidad del colon en ratones de tipo salvaje y NL3 R451C, un modelo de ratón de trastorno del espectro autista 17. Nuestros resultados indican una reducción en el número de CMMCs en ratones NL3 R451C mutantes en comparación con ratones de tipo salvaje en presencia del antagonista del receptor 5HT 3/4 Tropisetron lo que sugiere que los ratones NL3 R451C exhiben una mayor sensibilidad a tropisetrón. Por consiguiente, proponemos que la mutación R451C neuroligin-3 altera la vía de la serotonina, potencialmente mediante la modulación de la función o bien 5HT 3 o 4 5HT receptor en las neuronas entéricas, la mucosa o en ambos. Esto pone de relieve el valor del método para la identificación de las diferencias fenotípicas entre los genotipos y para la identificación de objetivos específicos para estudios posteriores.
Este método puede ser modificado para mejorar la resolución espacial mediante la adquisición de vídeos a través deun estereomicroscopio equipado con una cámara de montaje. Este enfoque permite grabaciones a estar hechas de pequeñas preparaciones del tracto gastrointestinal en puntos de tiempo embrionarias tan pronto como E12.5 31. Neuromoduladores pueden ser aplicados a través del lumen o en el baño de órganos externos a la preparación del colon. Además, este método es útil para evaluar la motilidad gastrointestinal grandes y pequeños en una gama de especies, incluyendo ratones, ratas y cobayas.
pasos para solucionar problemas comunes para este método incluyen la verificación del flujo de la solución a través de la tubería, la viabilidad de la preparación del tejido, el mantenimiento de la presión luminal constante y asegurar que los segmentos de colon se encuentran lejos de las paredes del baño de órganos. Las obstrucciones dentro de la tubería pueden alterar la presión luminal y evitar que se produzcan contracciones; Por lo tanto, todos los tubos deben limpiarse a fondo para eliminar los cristales de sal o restos de materia / fecal antes de la canulación. El aire debe ser retirado de líneas de tubería directamente asociado con la cánula antes de los experimentos (es decir, mediante cebado los tubos con solución salina). Además, las preparaciones de tejidos deben ser manipulados con cuidado a fin de evitar daños resultantes de la inmovilidad del colon. Para evitar daños en los tejidos, asegúrese de que el colon es firmemente (pero no apretado) unida a la cánula durante el proceso de grabación y mantener una temperatura constante y un suministro continuo de CO 2 + O 2 al baño. También asegúrese de que la presión luminal se mantiene constante y que no hay contracciones se inicia manualmente mediante el ajuste de depósitos de flujo de entrada durante el período de registro. Asegúrese de que el tejido del colon no hace contacto con la pared del baño de órganos durante las contracciones ya que esto evitará que el análisis de detección de bordes de los mapas espacio-temporales pertinentes. Esto se puede evitar mediante el control de las contracciones durante el período de equilibrio y ajuste de la posición de los dos puntos para evitar que esto ocurra durante el experimento.
_content "> Varias limitaciones asociadas con esta técnica se deben tomar en consideración a la hora de analizar e interpretar los datos, incluyendo la naturaleza de bajo rendimiento de este enfoque. Mientras que el método es eficaz en la identificación de los cambios en la migración de los patrones motores, no se puede determinar si las dilataciones que ocurre durante la progresión de una CMMC se neuralmente mediada o simplemente respuestas pasivas a la actividad contráctil (es decir, resultante de la circulación de fluido). los gradientes de concentración de difusión a través de la pared del colon permiten a los efectos de las drogas aplicadas luminally a atribuirse a las acciones dentro de la mucosa, pero en los experimentos prolongados degeneración de la mucosa puede producir alterando así los sitios de acción de estos fármacos durante el periodo de grabación. por otra parte, si los medicamentos tienen efectos distintos en los plexos mientérico y submucosas que no pueden determinarse usando este método. en contraste, este enfoque permite una evaluación colectiva de los efectos sobre la ne entéricarvous sistema mediante la medición de un cambio general en los patrones de motilidad. Otras consideraciones incluyen la necesidad de tener en cuenta la naturaleza de los datos (es decir, los datos de conteo de frecuencia CMMC, que requiere un análisis no paramétrico) y la baja frecuencia de CMMCs, en el diseño de experimentos y estrategias de análisis de datos apropiados.Recientemente, Barnes y sus colegas propusieron que el tejido del colon requiere la estimulación con el fin de observar CMMCs 32, sin embargo publicó los resultados de nuestro laboratorio demuestran que CMMCs espontáneos pueden ser observados por simplemente fijar el tejido al baño de órganos a través del mesenterio 7. La presencia de CMMCs en estas condiciones no sólo demuestra la espontaneidad de CMMCs, pero amplía detalles sobre la utilidad de esta técnica para determinar los cambios en la motilidad del colon. Aunque este enfoque es aplicable a las regiones extra-colon del tracto gastrointestinal, la complejidad de la motilidad del intestino delgado requiere más detailed estrategias de análisis que los utilizados para la cuantificación de CMMCs 33.
Este enfoque experimental tiene muy alta resolución espacial y temporal y incluye la opción de administración de fármacos tanto externo a y en el interior del lumen para la investigación de los efectos de variar gradientes de concentración en el sistema nervioso entérico. Por otra parte, este método es adecuado para el análisis de la segmentación pequeña intestinal durante el estado alimentado 6,23. La naturaleza ex vivo de este método permite que el papel del sistema nervioso entérico que evaluarse en ausencia de entradas del sistema nervioso central y por lo tanto es una forma ideal para investigar la motilidad gastrointestinal en una variedad de modelos, incluyendo modelos genéticos de la enfermedad (véase la figura 2) 6,34.
Este método también puede utilizarse para comparar los datos fisiológicos para simulaciones por ordenador de la actividad motora 23,33,35. Estas simulaciones pueden predecir patrones motores enla forma de mapas espacio-temporales para las comparaciones directas con los experimentos fisiológicos 33,35. Uso de Transformada Rápida de Fourier y análisis wavelet 36, la contribución de los marcapasos de músculo liso (generada por las células intersticiales de Cajal) para la motilidad también se puede extraer. Además, esta técnica de formación de imágenes de vídeo se puede combinar con registro extracelular de la actividad eléctrica en el músculo 3 para permitir contribuciones de neural y generadores de patrones myogenic a ser distinguidos. Nota, el método de grabación extracelular resuelve potenciales de unión inhibidoras en ausencia de contracciones del músculo liso o relajaciones.
Si bien esta técnica está bien establecida para el análisis de la motilidad gastrointestinal en una amplia gama de preparaciones y de las especies, sino que también tiene el potencial de ser utilizado en otros sistemas tales como el estudio de la vasoconstricción en el mesenterio (previamente analizado a través de un sistema de seguimiento de diámetro más sencillo 37) yen el músculo esquelético.
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Acknowledgments
JCB y ELH-Y fueron apoyados por el Departamento de Programa de Investigación del Autismo CDMRP Defensa (AR11034). NHMRC (1047674) a ELH-Y.The mayo Stewart beca-Universidad de Melbourne confianza financiado becas para la EM. Agradecemos a Ali Taher, Fátima Ramalhosa y Gracia Seger para las contribuciones técnicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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