Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Глаукома индуцирующего процедуры в Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831

Abstract

Глаукома является заболеванием центральной нервной системы, затрагивающей ганглиозных клеток сетчатки (ГКС). RGC аксоны, составляющие зрительного нерва несут визуальный ввод в мозг для зрительного восприятия. Повреждение ГКС и их аксонов приводит к потере зрения и / или слепота. Хотя конкретная причина глаукомы неизвестна, основной фактор риска развития заболевания является повышенное внутриглазное давление. Глаукома индуцирующего процедуры на животных моделях являются ценным инструментом для исследователей, изучающих механизм смерти RGC. Такая информация может привести к разработке эффективных нейропротекторов лечения, которые могли бы помочь в предотвращении потери зрения. Протокол , используемый в данной статье описан способ индукции глаукомы - как в условиях в естественных условиях модели на крысах , где 50 мкл 2 М гипертонического раствора впрыскивается в Эписклеральные венозных сплетений. Побледнение сосудов свидетельствует об успешном окончании инъекции. Эта процедура приводит к потере ГКС для имитации глаукому. В течение месяца послеинъекции, животных умерщвляют и глаза не будут удалены. Далее, роговица, хрусталик, стекловидное тело и удаляются, чтобы сделать окуляр. Сетчатка затем отслаивается от задней части глаза и возлагали на Sylgard блюда с использованием кактус иглы. В этот момент, нейроны в сетчатке могут быть окрашены для анализа. Результаты этой лаборатории показывают, что примерно 25% РГК теряются в течение одного месяца после процедуры по сравнению с внутреннего контроля. Эта процедура позволяет для количественного анализа сетчатки смерти ганглиозных клеток в в естественных условиях модели глаукомы у крыс.

Introduction

Глаукома это группа глазных болезней , влияющих на нейроны в сетчатке, в частности, ганглиозных клеток сетчатки 1-2. Аксоны этих клеток сходятся, чтобы стать зрительный нерв несущий визуальную информацию в мозг, где воспринимается видение. Повреждение ГКС и их аксонов поэтому вызывает визуальные дефекты.

Основные характеристики, связанные с нарушениями глаукомой являются ГКС вырождение и смерть, повышенное внутриглазное давление (ВГД) и оптический диск кровопускание и атрофии. Эти особенности приводят к потере зрения поля или полной, необратимой слепоте. В настоящее время глаукома привело к слепоте в 70 миллионов человек во всем мире 3. Как таковой, он является третьим по величине причиной в мире слепоты 4.

Точный механизм смерти RGC при глаукоме остается неизвестной. Много исследований было сделано, чтобы раскрыть тайну. Известно, однако, что основным фактором риска глаукомы является увеличение Iп внутриглазного давления из-за неправильной циркуляции внутриглазной жидкости (АГ) в передней камере глаза. AH действует в качестве прозрачного и бесцветного замены крови в лишенной сосудов передней камеры глаза. Она питает окружающие клетки, удаляет продукты жизнедеятельности из секретируемых обменных процессов, транспорта нейромедиаторов и позволяет циркуляцию лекарственных средств и воспалительных клеток в глаза при патологических состояниях 1.

Поддержание водного циркуляции юмора вовлекает цилиарное тело и трабекулярной сети. Водные юмора производится цилиарного тела. Затем она поступает в переднюю камеру для поддержания общего состояния здоровья глазной ткани. 75 - 80% водного оттока юмор активно секретируются через не-пигментного эпителия цилиарного когда жидкость фильтруют через три слоя губчатой ​​ткани в цилиарной мышцы. Жидкость выходит через трабекулярной сети и через канал Schlemm, который упредитьх годов в кровеносную систему 5 .The остальные 20 - 25% оттока обходит трабекулярной сети и пассивно секретируется ультрафильтрации и диффузии через uveo-склеры пути. Этот путь , как представляется, относительно не зависит от внутриглазного давления 1.

Когда водный юмор производство и отток из равновесия, нарастает давление внутри глаза. Как было указано, это увеличение внутриглазного давления является основным фактором риска в развитии глаукомы. Такое давление приводит к повреждению запутанных слоев нейронов в сетчатке в задней части глаза. Повреждение сетчатки ганглиозных клеток аксонов зрительного нерва заставляет мозг больше не получать точную визуальную информацию. В результате, восприятие зрения теряется и полная слепота может произойти.

На сегодняшний день, нет никакого лечения глаукомы. Различные методы лечения существуют, которые в первую очередь направлены на снижение внутриглазного давления. К ним относятся местноеКлассы препараты, такие как блокаторы рецепторов бета1-адренорецепторов или местного аналогов простагландинов. Бета - блокаторы снижают внутриглазное давление за счет уменьшения производства водянистой влаге 7. Простагландины функции для снижения ВГД за счет увеличения оттока водянистой влаги 8-14. Альфа-адренергические агонисты и ингибиторы карбоангидразы также используются в качестве вторичных методов лечения. Альфа - адренергические агонисты увеличивают отток через увеосклерального пути 15-17. Ингибиторы карбоангидразы уменьшают выработку АГ путем ферментативного торможения 18. Гораздо более инвазивных процедур, также используются для лечения глаукомы. Лазер трабекулопластика используется для увеличения оттока водянистой влаги 19. Еще одна хирургическая терапия, называемая трабекулэктомия, создает альтернативный дренажный узел для фильтрации AH , когда традиционный трабекулярная путь заблокирован 20-21.

Эти варианты лечения, как известно, эффectively снизить ВГД. Тем не менее, до 40% пациентов с глаукомой показывают нормальный уровень ВГД , указывающие на необходимость более полных терапевтических методов. 22,23 Кроме того, смерть сетчатки ганглиозных клеток видно при глаукоме является необратимым , как только она начинается и современные методы лечения не останавливают прогрессирование заболевания 24-28. Это подчеркивает необходимость принятия эффективных нейропротекторов терапии, которые нацелены на выживание самих нейронов. Разработка моделей глаукомой имеет решающее значение для этого развития.

В данном исследовании мы демонстрируем способ индукции глаукомы-подобных эффектов у взрослых крыс Long Evans с помощью модифицированной методики , описанной первоначально Моррисоном 29. В этой процедуре, инъекции 2 М гипертонического раствора в Эписклеральные в венозных сплетений индуцирует Глаукома как условия рубцами ткани, чтобы уменьшить оттоку юмор в трабекулярной сети, приводящей к повышению внутриглазного давления и значительной потере ГКС шithin один месяц процедуры 30-31. Глаукома индуцирующего процедуры, такие, как описанный здесь, может быть ключом к открытию новых разработок при глаукоме лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры с использованием предметов животного происхождения были в соответствии со стандартами Института уходу и использованию животных комитета (IACUC) в Университете Западного Мичигана.

1. Животные

  1. Используйте самцов и самок крыс 3-месячного возраста в данном исследовании.
  2. Держите животных в 12-часовом цикле свет / темнота со свободным доступом к пище и воде.

2. Приготовление Kax Коктейль для наркоза животных

  1. Растворите 50 мг ксилазина (20 мг / мл) в 5 мл кетамина (100 мг / мл) с 1 мл ацепромазина (10 мг / мл) и 3 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать.
  2. Стерилизация с шприцевой фильтр и хранить этот раствор в бутылку сыворотки на 10 мл.

3. Kax Инъекции

  1. Взвешивание животных (г) и для возврата в клетке до готовности к инъекции.
  2. Вводят 0,1 мл Kax / 100 г массы тела животного внутрибрюшинно, с помощью шприца 1 мл инсулина с иглой 28 G.
  3. Позволятьдля животных, чтобы стать в бессознательном состоянии. Проверить рефлексы, зажимая ноги и хвост.
  4. Хранить всех животных безопасно в лаборатории на время операции.
  5. Послеоперационный, заменить животных в их клетки и держать комфортно в РТ, пока сознание не восстанавливается. Только вернуть животных в виварии, когда животные пробуждаются и возобновить нормальное поведение.

4. Подготовка к хирургии и микроиглы Ассамблеи

  1. Сделать стерильный раствор 2 М NaCl.
  2. Используйте микроэлектродного съемника (рис 1C) , чтобы потянуть за одну 0,86 мм внутренний диаметр , тяжелый отполированный стандарт и тонкостенную боросиликатного трубки на две мелко конусообразных стеклянных микроиглы (рис 1D, 1E рис).
  3. Засыпка один микроиглы из предыдущего шага с 2 М раствор соли с помощью засыпки иглу шприца и 1 мл шприц (рис 1B). Вытряхнуть пузырьки воздуха от кончика электрода.
  4. Заполните вторую 1 мл шприц с 2 МNaCl. Подключите 18 G иглу , а затем прикрепить длину (около 10 дюймов) из полиэтиленовых труб (рисунок 1А). С помощью шприца для заполнения полиэтиленовой трубки с физиологическим раствором через иглу.
  5. Когда оба микроиглы и трубки заполнены солевым раствором, тщательно соединить два. Устранить любой воздух в связи между ними (рисунок 2).
  6. Мелко скос кончик микроиглы, очищая его очень легко против зерна конечно бумажным полотенцем.
  7. Проверьте сопротивление микроиглы, осторожно надавив на поршень шприца до тех пор, тонкую струю жидкости можно увидеть на бумажное полотенце. Поток жидкости должен быть не шире, чем на 0,5 мм.

5. Подготовка животных

  1. Применяют 1 - 2 капли местный анестетик к роговице (пропаракаина гидрохлорид офтальмологических решение, USP, 0,5%). Подождите, пока не происходит рефлекс.
  2. Обрезка усов с ножницами.
  3. Saturate ватного наконечника аппликатора с раствором бетадин и области тампоном вокруг экспериментального глаза.
  4. С помощью микроскопа, приложите кровоостанавливающего зажимать нижнюю веко выпуклость глаз, подвергать эписклеральная вены и ограничивают движение глаз. (Рисунок 3, стрелолист)

6. Глаукома индуцирующего физиологический раствор для инъекций

  1. Когда узел микроиглы и животное готовят, начинают инъекции.
  2. Когда животное подтверждается не реагирует на ноги / хвост крайнем случае, осторожно прокалывают вену эписклеральная с микроиглы, придя под небольшим углом от 10 до 20 градусов по отношению к вене (рисунок 3, белая стрелка). Успешный прокол в вену проявляется , когда кровь поступает в наконечник микроиглы (рис 3, черная стрелка).
  3. Медленно и вручную вводят около 50 мкл физиологического раствора в вену. Это должно занять около 10 сек. Жилы будет бланшируют белыми, как соль циркулирует беспересадочныйтьфу сосудистая сеть (рис 4, стрелолист). Некоторые регионы могут поддерживать кроваво - красный внешний вид (рисунок 4, стрелка).
    1. Выполните вторую инъекцию в вену, напротив того места первого, чтобы обеспечить полное повреждение сетчатки полного слоя ганглиозных клеток сетчатки глаза.
      Примечание: В течение нескольких минут, следует увидеть отчетливую мутный вид через радужку глаза в виде соли циркулирует через сосудистую систему.
  4. Оставьте противоположный глаз без лечения для использования в качестве внутреннего контроля.

7. Восстановление животных

  1. Удалите кровоостанавливающего.
  2. Используйте ватный аппликатор для применения тройной мазь с антибиотиком (Bacitracin цинк, неомицина сульфат, polymysin B сульфат) на сайт зажали кровоостанавливающего и местах инъекций. Повреждение тканей вокруг глаз не происходит с помощью кровоостанавливающего.
  3. > Место под наркозом животных в их клетках на циркулирующей теплой воды одеяло к предлор гипотермии. Держите животных под наблюдением, пока сознание и нормальное поведение не восстанавливается. Транспорт будите животных обратно к животному колонии. Животные остаются в колонии до времени жертвы.

8. жертвоприношение животных и Retina для удаления

  1. В течение месяца после процедуры , чтобы вызвать глаукому, животных умерщвляли СО 2 удушья и вторичной грудном пункции.
    1. Поместите животное в камере и поставить крышку надежно.
    2. Откройте CO 2 и регулятор газа клапаны , чтобы объем 20% / мин СО 2 смещение кислорода в камере.
    3. Разрешить четыре до 5 мин для животных истекает.
    4. Выключите оба клапана.
    5. Удалить животное из камеры и выполняют вторичную торакальной пункцию с стерильным скальпелем.
  2. После эвтаназии, использовать скальпель, чтобы разрезать соединительную ткань в глазницы, окружающие глаз, Beiнг осторожны, чтобы не врезаться в самой глазного яблока.
  3. Осторожно использовать изогнутый край ножницы, чтобы вырезать зрительный нерв и оставшуюся ткань для того чтобы извлечь неповрежденный глазного яблока. Поместите извлеченный глазного яблока в стерильную 60 мм х 15 мм располагаемого чашку Петри, содержащую свежий PBS.
  4. Сделать окуляр из глазного яблока. Чтобы сделать это, сделайте небольшой надрез скальпелем только позади границы между радужной оболочкой и склеры. Выполните этот надрез по окружности глаза с небольшими пружинными ножницами, чтобы удалить роговой полушарие из глазного яблока. Полусфера подключен к зрительному нерву остается.
  5. Найти очень тонкий розовый / бежевый сетчатку внутри окуляра от эвтаназии животного. Удерживая пигментный слой сетчатки с затупленных щипцов для стабилизации наглазник. Используйте другую пару закрытых щипцов очень осторожно дразнить всю неповрежденную сетчатку от задней части глаза. Избегайте щипать, тянуть или дергать сетчатку непосредственно.
  6. Используйте маленькие пружинные ножницы, чтобы вырезатьобласть, где зрительный нерв все еще прикреплен к сетчатке.
  7. Обязательно срезаны все остатки пигментный эпителий или склеры ткани от сетчатки.
  8. С помощью пипетки передачи, очень мягко перевести изолированный сетчатку на чистую Sylgard покрытием 35 мм х 10 мм чашку Петри, содержащую свежий PBS.

9. Всего-Mount Retina Подготовка

  1. После того, как в Sylgard блюдо, используйте щипцы и один кактус иглу, чтобы прикрепить сетчатку на место. Держите сетчатке слой ганглиозных клеток вверх и вниз зрительного нерва. полусферической формы сетчатки глаза является заметным даже после фиксации. Кривизна сетчатки будет скручиваться к потолку, когда сетчатки слой ганглиозных клеток находится в нужной ориентации.
  2. Используйте маленькие ножницы, чтобы разрезать сетчатку на четыре квадранта, что делает форму четыре листа клевера, расходящихся от головки зрительного нерва.
  3. Pin квадранты сетчатки с дополнительными иглами кактуса, чтобы сделать сетчатка как можно более плоскими withoут растяжения (рис 5).
  4. Закрепить возлагали сетчатку в Sylgard блюдо с 3 мл 4% параформальдегида O / N при комнатной температуре.

10. Антитело Окрашивание Retina

Примечание: Пятно фиксированные сетчатку с первичными и вторичными антителами для просмотра нейронов в сетчатке (рисунок 6).

  1. Полоскание фиксированы, плоские монтажа сетчатке три раза в течение 2 мин каждый раз в PBS.
  2. Проницаемыми сетчатку с добавлением 1% Тритон Х-100 с 1% фетальной телячьей сыворотки в PBS в течение 60 мин.
  3. Полоскание сетчатке три раза, 2 мин каждый, в PBS.
  4. Промыть два раза с 0,1% Тритон Х-100 в PBS, 5 мин на каждую промывку.
  5. Промыть два раза с PBS, 5 мин на каждую промывку.
  6. Инкубируйте с 1% Тритон Х-100 и 1% фетальной телячьей сыворотки в PBS при комнатной температуре в течение 45 мин.
  7. Промыть два раза с 0,1% Тритон Х-100 в PBS, 5 мин на каждую промывку.
  8. Промыть два раза с PBS, 5 мин на каждую промывку.
  9. Инкубируют каждый сетчатку в 3 мл 1% фетальной телячьей сыворотки в PBSочищенным мышиным анти-CD90 крысы / мыши CD90.1 (1: 300 разведение) O / N при комнатной температуре.
  10. Полоскание сетчатку один раз с 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 5 мин.
  11. Промыть два раза с PBS, 5 мин на каждую промывку.
  12. Инкубируют каждый сетчатку в 3 мл PBS (без FBS) с вторичным Alexa Fluor 594 козьего анти-мышиного IgG (1: 300) O / N при комнатной температуре.
  13. Вымойте сетчатку с PBS обильно.
  14. Использование рассекает микроскоп, тщательно удалить кактус иглы от сетчатки.
  15. Аккуратно перенести сетчатку на предметные стекла микроскопа с пипетки передачи. Обязательно поддерживать ориентацию с сетчатке ганглиозных клеток слой был обращен к потолку. полусферической формы сетчатки глаза является заметным даже после фиксации. Кривизна сетчатки будет скручиваться к потолку, когда сетчатки слой ганглиозных клеток находится в нужной ориентации.
  16. Поглощенный любой избыток PBS с Kimwipe или другого такого поглощающего материала. Будьте осторожны, чтобы не впитывать сетчатку.
  17. Добавьте 5 капель глицерина и ½ ½ PBS по массе в качестве часовounting СМИ.
  18. Накройте сетчатку с покровное, избегая пузырьков воздуха.
  19. Безопасный покровное с использованием четких лак для ногтей, клей или другой клей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе показаны компоненты оборудования и процедуры , используемые для индукции глаукомы подобных условиях в естественных условиях в модели глаукомы у крыс. Показано, отдельные инструменты и оборудование, используемые для выполнения гипертонического раствора для инъекций, которые вызывает увеличение внутриглазного давления. Мы показываем инъекции в Эписклеральные венозных сплетений с характерным эффектом бланшировки и облачный внешний вид передней камеры, что приводит. Мы также опишем процесс удаления сетчатки глаза и плоские крепления для анализа утраченных РГК. И, наконец, мы показываем последствия инъекции на выживаемость клеток ганглия сетчатки глаза. Поскольку распределение РГК неравномерно в различных регионах сетчатки крысы, изображения получаются из четырех 200 мкм 2 областей в каждой сетчатке, 4 мм от центра диска зрительного нерва. Общее число Thy 1.1, меченных РГК в каждой секции подсчитываются, усредняются и сравниваются в экспериментальной и Contr ол сетчатке 31. Используя этот метод, RGC подсчитывает изменился в среднем 225 в образе контрольных необработанных условиях до 168 за один месяц после процедуры, чтобы вызвать глаукому подобные условия (N = 30). Взятые вместе, эти процедуры, описанные здесь, могут следовать шаг за шагом, чтобы проанализировать смерть ганглиозных клеточных тел и аксонов сетчатки.

Рисунок 1
Рисунок 1. Компоненты микроиглы. (А) Шприц с полиэтиленовой трубкой , используемой для инъекции физиологического раствора. (В) Засыпка шприц используется для засыпки боросиликатного микроиглы. (С) Narishige электрод съемник используется для изготовления боросиликатного микроигл. (D) из боросиликатного стекла электроды до и после втягиваться электрода съемник. (E) Увеличенный вид микроэлектродный кончика иглы после того, как тянет.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Полное собрание микроиглы. Microneedle прилагается к полиэтиленовые трубки , присоединенные к шприцу с гипертоническим раствором. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Глаукома индуцирующего Saline инъекции в Эписклеральные венозных сплетений. Изображение инъекции физиологического раствора в Эписклеральные вену живой, под наркозом Long Evans крысу. Стрелолист указывает местоположение кровоостанавливающего используемого выпирать глаз и предотвратить его перемещение. Белая стрелка указывает на то, расположение закачиваемой вены. Черная стрелка показывает кровь течет обратно в наконечник микроиглы , свидетельствующего об успешном пункцию вены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Бланшировка Влияние гипертонического раствора для инъекций. Изображение крысы глаз впрыскивают с гипертоническим раствором. Стрелолист показывает характерный побледнение эффект физиологического раствора в Эписклеральные венозных сплетений. Стрелка указывает часть Эписклеральные венозных сплетений , что до сих пор не побледнел. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Плоский-гора Крыса Retina. Изображение всего монтажа сетчатки удалены из глаза крысы и возлагали квартиру в Sylgard блюдо с использованием кактуса иглы. Черная стрелка указывает на головку зрительного нерва. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Повреждение ганглиозных клеток сетчатки после того, как глаукома , индуцирующего хирургии. Сравнение контрольных необработанных глаза (А) к экспериментальным глазом (B) через один месяц после получения глаукому индукции инъекции физиологического раствора. Сетчатка метили антителами против маркера RGC, Thy 1.1 (CD90). Тонкие стрелки указывают на отдельные РГК в обоих контрольных и экспериментальных условиях. Процедура приводит к уменьшению числа ГКС, деподрагивание аксонов от главной пучков аксонов, и искажение к округлости остальных РГК. Блок стрелки указывают характерные defasciculating аксонов, что приводит от инъекции физиологического раствора. Стрелолист показывает кровеносный сосуд в сетчатке. Двухсторонние стрелки этикетки аксонов пучки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает способ индукции глаукомы подобных условиях в естественных условиях в модели крысы. Эта процедура использует инъекцию гипертонического раствора , чтобы вызвать образование рубцов в трабекулярной сети 29, 32. Развитие рубцовой ткани закупоривает оттока водянистой влаги , что увеличивает давление в передней камере. В результате снижения оттока и повышения давления, объектив приостановлено эластичными связками отодвигает в стекловидное тело камеры. Стекловидное тело затем применяет давление на сетчатку повреждения хрупкие нейроны сетчатки. Наши результаты с использованием этой процедуры показывают, что число ганглиозных клеток сетчатки глаза начинают истощаться через 2 недели с существенной потери потери ганглиозных клеток на 1 месяц после процедуры.

Этот протокол является только одним из способов индукции глаукомы у грызунов. Есть много других экспериментальных моделей, в которых повреждение ганглиозных клеток сетчатки осуществляется либо увеличением внутриглазного давления или путем непосредственного дамагу зрительного нерва 30. Часто эти методы были разработаны в более крупных животных и модифицированы для применения к мышам и крысам 33. Интраокулярные инъекции токсинов , таких как стауроспорином 34 и NMDA, не-гидролизуемый аналоговый глутамат 35 вызывают быструю гибель сетчатке ганглиозных клеток. Исследования показали, однако, что такие токсины следуют кривой доза-ответ у мышей и эффекте, чем мишень ганглиозных клеток 35 клеток. Кроме того, повреждение ганглиозных клеток сетчатки в этой модели намного более прямой, чем постепенного прогрессирования глаукомы человека.

Прямое повреждение зрительного нерва также может быть нанесен. Лазерная аксотомии является распространенным способом разорвать аксоны, составляющие зрительного нерва у мышей 36. Тем не менее, этот метод представляет некоторые осложнения. Небольшой размер грызунах орбит делает его трудно точно повредить зрительный нерв, не затрагивая поток крови через центральной артерии сетчаткии вены. Чтобы преодолеть это, некоторые исследователи используют более инвазивные подход , включающий удаление небольшого участка мозга , с тем чтобы обеспечить более широкий доступ к зрительному нерву 37. Оптические модели нерва раздавливания доступ зрительного нерва intraorbitally, а также. В этой модели, нерв защемлен самозакрывающихся пинцетом и глазное поток крови не будет нарушена. Эта процедура приводит к немедленному оскорблении и синхронной смерти сетчатки ганглиозных клеток. Исследования с использованием этой модели показывают значительные потери ГКС 38. Тем не менее, некоторые утверждают , что это может вызвать больший ущерб , чем вызвано только 39 повышенным ВГД. Кроме того, глаукома характеризуется медленным, хроническим, асинхронная потери ганглиозных клеток сетчатки 33, 39-42 .Therefore, время курса и основной механизм ущерба , нанесенного с зрительного нерва давка может быть совершенно иным , чем это имеет место в человеческой глаукомы. В отличие от этого, модели, рассмотренной в данной работе, позволяет избежать необходимости непосредственного аксессс зрительного нерва, устраняет рассечение ткани головного мозга, а также позволяет постепенное повреждение сетчатки ганглиозных клеток.

Microbead модели окклюзия использования глаукома полистирола или магнитных шариков инъецируют в переднюю палатами крыс или мышей, чтобы поднять ВГД. Большая часть этой работы было сделано на мышах , и они показывают лишь от низкого до умеренного уровня повреждения зрительного нерва с широким изменением результатов и противоречивых данных 43-50. При использовании крыс, длительность повышенным ВГД было слишком коротким , чтобы вызвать достаточное повреждение клеток 48. Даже с изменениями в процедуре, модель до сих пор нанесло серьезный ущерб в короткий срок , представляющий собой острый нейропатической модель , а не модели хронической глаукоме 51. Smedowski и др 43 недавно разработали дополнительно модифицированной методики Microbead с использованием дополнительного начального 'травмы высокого давления " , чтобы добиться более прочного повышение ВГД с хроническим повреждением , что Does обещают показать. Другие исследования с использованием этой методики необходимы для дальнейшей проверки этой модели.

Модели хронической глазной гипертензии направлены препятствовать оттоку юмора. Лазерная коагуляция из Эписклеральные и лимбальных вен 52 и Эписклеральные окклюзии вены 53 два таких методов. Тем не менее, также было показано , что метод лазерной абляции производят лишь кратковременное повышение ВГД и умеренный уровень фактической потери клеток 36, 54-55.

Глаукома является хроническим заболеванием, в результате повреждения и гибели клеток сетчатки ганглия аксоны которых составляют зрительный нерв. Механизм этой потери неизвестна. В то время как увеличение внутриглазного давления является отличительным фактором риска, некоторые из них предложили участие других факторов. К таким факторам относятся воспалительные процессы, оксидативный стресс, метаболические нарушения или нарушения кровотока 56-58. Для того, чтобы раскрыть точный механизм КВЖДл смерть в этой болезни, исследователи нуждаются в простых, воспроизводимые и функциональные возможности точно имитировать условия, возникающие в человеческой глаукомы. Только тогда исследователи могут надеяться изобрести способ защитить ганглиозных клеток сетчатки от смерти. Процедура , описанная в данном документе , использует искусственно вызванное повышение внутриглазного давления , чтобы производить постепенное, необратимой потери клеток сетчатки ганглия , похожий на вид при глаукоме у пациентов 31. Процедура минимально инвазивной. Значительные потери сетчатки ганглиозных клеток измеряется в течение одного месяца операции. Этот метод является одним важным инструментом для исследования глаукомы. Потенциальным ограничением этого метода является ручной инъекции гипертонического раствора. Из-за этого ручного метода, можно ожидать большой изменчивости в результатах. Тем не менее, мы определили бланширования эффект в вену, чтобы быть важным шагом. Если происходит побледнение, потеря сетчатки ганглиозных клеток всегда находится между 18 и 29%. Для поддержки этого, все будущие исследования могут МодиFY процедура включает рутинные измерения ВГД , чтобы гарантировать , что эти инъекции приводят к ощутимому увеличению ВГД. 29,31. Возможно, эта модель смерти RGC приведет к развитию более полного нейропротекторного лечения, который борется с разрушительной потери зрения страдают миллионы людей во всем мире.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Медицина выпуск 109 крыса глаукома инъекции, сетчатка целом монтажа плоским Mount неврология ганглиозных клеток сетчатки глазная гипертензия заболевания глаз
Глаукома индуцирующего процедуры в<em&gt; В Vivo</em&gt; Крыса модель и всего монтажа Retina Подготовка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter