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Medicine

緑内障誘導の手順 Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831

Abstract

緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)に影響する中枢神経系の疾患です。視神経を構成するRGC軸索は、視覚のための脳に視覚入力を運びます。 RGCとその軸索の損傷は、視力低下および/または失明につながります。緑内障の特定の原因は不明であるが、疾患の主要な危険因子は、高眼圧です。動物モデルにおける緑内障を誘発する手順は、RGC死のメカニズムを研究する研究者にとって貴重なツールです。このような情報は、視力低下の予防に役立つ可能性があり効果的な神経保護治療法の開発につながることができます。 2 M高張食塩水の50μlを上強膜静脈叢に注入されたin vivoでのラットモデルにおける条件のように-本稿におけるプロトコルは、緑内障を誘導する方法を説明します。血管の白化は、成功した注射を示しています。この手順は、緑内障をシミュレートするために、RGCの損失を引き起こします。次の一ヶ月注射は、動物を屠殺し、眼を除去します。次に、角膜、レンズ、および硝子体は、アイカップを作るために除去されます。網膜は、その後、目の奥から剥離し、サボテン​​の針を使用して、シルガード皿上に固定されています。この時点で、網膜のニューロンは、分析のために染色することができます。このラボからの結果は、内部統制と比較した場合、RGCの約25%は、手順の1カ月以内に失われていることを示しています。この手順は、 インビボでラット緑内障モデルにおける網膜神経節細胞死の定量的分析を可能にします。

Introduction

緑内障は、具体的には、網膜神経節細胞1-2、網膜内ニューロンに影響を及ぼす眼疾患群です。これらの細胞の軸索は、視力が知覚される脳に視覚情報を運ぶ視神経になるように収束します。 RGCとその軸索の損傷は、したがって、視覚的な欠陥を引き起こします。

緑内障の障害に関連する主要な特性は、RGCの変性と死、眼圧の上昇(IOP)、および視神経乳頭陥凹と萎縮しています。これらの機能は、視野欠損、または完全な、不可逆的な失明につながります。現在、緑内障は、世界中7000万人3に失明を引き起こしました。このように、それは失明4の世界第三位の原因です。

緑内障におけるRGC死の正確なメカニズムは不明のまま。多くの研究は謎のロックを解除するために行われてきました。緑内障の主要な危険因子が増加Iであることが知られています眼の前房内の房水(AH)の不規則な循環へのn眼圧。 AHは、眼の無血管前房内の血液のための無色透明の代替として機能します。それは、周囲の細胞に栄養を与える代謝プロセスから分泌された老廃物を除去し、神経伝達物質を搬送し、病理学的状態1の間に薬や眼内の炎症細胞の循環を可能にします。

房水循環の維持は毛様体および小柱網を必要とします。房水は、毛様体により産生されます。その後、眼組織の全体的な健康を維持するために、前房に流入します。 75 - 流体は毛様体筋における海綿状組織の3層を介して濾過されたときに、房水流出の80%が積極的に非色素毛様体上皮を介して分泌されます。小柱網を通じて、どの優先使用シュレム管を通る流体の出口20残りの血液系5【選択に新設-流出の25%は、小柱網をバイパスして受動的にuveo -強膜経路を介して限外濾過し、拡散によって分泌されます。この経路は、眼圧1の相対的に独立であるように見えます。

房水の生産と流出がバランスの外にある場合、圧力は、目の中に構築します。上述のように、眼圧の増加は、緑内障の発症における主要な危険因子です。このような圧力は、目の奥の網膜における神経細胞の複雑な層への損傷を引き起こします。視神経の網膜神経節細胞の軸索の損傷は、もはや正確な視覚情報を受け取るには、脳を引き起こしません。その結果、視覚の認識は失われ、完全な失明が発生する可能性があります。

現在までに、緑内障の治療法は存在しません。別の治療法は、主に眼内圧を低下させることを目指していること存在します。これらは、局所含みますこのようなベータアドレナリン受容体遮断薬などの薬物クラス、または局所プロスタグランジン類似体。ベータ遮断薬は、房水7の産生を減少させることによって眼圧を低下させます。プロスタグランジンは、房水8~14の流出を増加させることにより、IOPを低下させるように機能します。アルファアドレナリン作動薬および炭酸脱水酵素阻害剤はまた、治療の二次方法として使用されています。アルファアドレナリン作動薬は、ブドウ膜強膜経路15-17を介して流出を増加させます。炭酸脱水酵素阻害剤、酵素阻害18 AHの産生を減少させます。はるかに侵襲的な手順はまた、緑内障を治療するために使用されています。レーザー線維柱帯形成術は、房水19の流出を増加させるために使用されます。線維柱帯切除術と呼ばれる別の外科的治療は、従来の小柱経路が20-21ブロックされたときにAHをフィルタリングするための代替排水サイトを作成します。

これらの治療の選択肢は、EFFに知られていますectively IOPを低下させます。しかし、緑内障患者の最大40%が、より完全な治療法の必要性を示す正常なIOPレベルを示す。22,23は、さらにそれが始まり、現在の治療は、疾患の進行を停止しないと、緑内障で見られる網膜神経節細胞死は不可逆的です24-28。これは、神経細胞自体の生存をターゲットに効果的な神経保護治療の必要性を強調しています。緑内障モデルの開発は、この開発のために重要です。

本研究では、元々モリソン29によって概説修飾手順を用いて、成体のロングエバンスラットの緑内障のような効果を誘導する方法を実証しています。この手順では、上強膜静脈叢に2 M高張生理食塩水の注射は、眼圧の上昇とワットRGCの有意な損失につながる小柱網で房水の流出を減らすために組織を瘢痕により、緑内障のような条件を誘発します手順30-31の1ヶ月ithin。このような、ここで説明したものと緑内障を誘発する手順は、緑内障治療における新たな展開のロックを解除するための鍵であってもよいです。

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Protocol

動物被験体を使用して、すべての手順は、ウェスタンミシガン大学の動物実験委員会(IACUC)の研究所の基準に準拠していました。

1.動物

  1. 本研究で雌雄ラットに生後3ヶ月を使用してください。
  2. 食料と水に自由にアクセスさせて12時間の明/暗サイクルで動物を保​​管してください。

動物麻酔のためのKAXカクテルの調製

  1. 1 mLのアセプロマジン(10mg / ml)および蒸留水3mlで5 mlのケタミン(100 mg / mlで)にキシラジン(20 mg / mlで)50mgを溶解します。完全に混合。
  2. シリンジフィルターで滅菌し、10ミリリットルの血清ボトルにこのソリューションを保存します。

3. KAXインジェクション

  1. 動物(g)を秤量し、注射の準備ができるまで、ケージに戻します。
  2. 28 G針で1mlのインスリンシリンジを用いて、腹腔内に0.1 mlのKAX / 100gの動物の体重を注入します。
  3. 許可します動物のために無意識になるために。足と尾をつまんで反射神経をチェックしてください。
  4. 安全に手術期間中のラボですべての動物を保管してください。
  5. 術後、それらのケージに動物を交換し、意識が回復されるまで、RTで快適に保ちます。動物のみが目覚めたときに動物施設に動物を返し、通常の動作を再開します。

手術およびマイクロニードルアセンブリ4.準備

  1. 無菌の2 M NaCl溶液を作ります。
  2. 2細かくテーパーガラスマイクロニードル( 図1D、図1E)に1 0.86ミリメートル、内径重い研磨標準と薄い壁ホウケイ酸チューブを引っ張って微小電極プラー( 図1C)を使用ます。
  3. 埋め戻しの注射針と1ml注射器( 図1B)を使用して、2 M生理食塩水で前の手順から1マイクロニードルを埋め戻し。電極の先端から気泡をタップします。
  4. 2 Mで第1ミリリットル注射器を埋めますNaClを。 18 G針を接続し、ポリエチレンチューブ( 図1A)の長さ(約10インチ)を添付。針を介して生理食塩水でポリエチレン管を埋めるために、シリンジのプランジャーを使用してください。
  5. マイクロニードルとチューブの両方を生理食塩水で満たされている場合には、慎重に2を接続してください。それらの間の接続( 図2)内の任意の空気を排除します。
  6. 細かくコースペーパータオルの粒に対して非常に軽くこすることによってマイクロニードルの先端を面取り。
  7. 液体の細い流れは、ペーパータオル上で見ることができるようになるまで静かにシリンジのプランジャーを押すことによってマイクロニードルの抵抗を確認してください。液体の流れは、0.5ミリメートルよりも広いべきではありません。

動物の5.準備

  1. 適用1から2は、角膜(プロパラカイン塩酸塩点眼液、USP 0.5%)に局所麻酔薬をドロップします。何の眼反射が発生しなくなるまで待ちます。
  2. ハサミでウィスカーをト​​リミング。
  3. S実験的な目の周りベータダイン液と綿棒エリアで綿棒をaturate。
  4. 顕微鏡を使用して、目を膨らみ強膜上静脈を露出させ、目の動きを制限するには、下部まぶたをクランプするように止血剤を添付します。 ( 図3、矢印)

6.緑内障誘導生理食塩水注射

  1. マイクロニードルアセンブリおよび動物を製造する場合、注射を開始します。
  2. 動物が足/テールピンチに反応しないことが確認された場合には、慎重に静脈( 図3、白矢印)に10と20度との間に低角度で来ることにより、マイクロニードルと強膜上静脈を突き刺します。血液はマイクロニードル( 図3、黒い矢印)の先端に入ったときに静脈に成功したパンクは明らかです。
  3. ゆっくりと手動で静脈に約50μlの生理食塩水を注入します。これは、約10秒を取る必要があります。静脈意志塩のthro循環するように白く、白ぐふ血管系( 図4、矢印)。一部の地域は、血液の赤い外観( 図4、矢印)を維持することができます。
    1. 完全な網膜神経節細胞層への徹底した網膜の損傷を確実にするために、対向する第1の部位に、静脈に二回目の注射を実行します。
      注:塩は、血管系を循環するように数分以内に、1は、目の虹彩を通じて明確な曇った外観が表示されるはずです。
  4. 内部コントロールとして使用するための未処理の反対の目を​​残します。

7.動物の回復

  1. 止血剤を削除します。
  2. 止血剤によって、および注射部位にクランプサイトに三重の抗生物質軟膏(バシトラシン亜鉛、硫酸ネオマイシン、polymysin B硫酸塩)を適用するために綿棒を使用してください。目の周りの組織の損傷は、止血剤を使用して発生しません。
  3. > PREVする循環温水毛布の上にケージ内麻酔動物を配置しますENT低体温。意識と通常の動作が回復するまで観察下に動物を保管してください。バック動物コロニーに目を覚まし、動物を輸送します。動物は屠殺時まで植民地に残ります。

8.動物の犠牲と網膜の取り外し

  1. 緑内障を誘発する手順を、次の1ヶ月、動物をCO 2窒息と二胸椎穿刺によって安楽死させます。
    1. チャンバー内に動物を置き、しっかりとふたを置きます。
    2. 20%体積/分でCO 2の変位を可能にするために、CO 2ガス調整弁を開き チャンバー内の酸素。
    3. 期限切れに動物のために4〜5分を許可します。
    4. 両方のバルブをオフにします。
    5. チャンバーから動物を削除し、滅菌メスで二胸椎穿刺を行います。
  2. 安楽死の後、目の周囲の眼窩内の結合組織を切断するためにメスを使用して、BEI眼球自体に切らないように注意してくださいngの。
  3. 慎重に無傷の眼球を抽出するために視神経と残りの組織を切断するために湾曲した縁部のはさみを使用しています。新鮮なPBSを含む滅菌60ミリメートルX 15ミリメートルの使い捨てペトリ皿に抽出された眼球を配置します。
  4. 眼球からアイカップを作ります。これを行うには、メスで小切開を行うだけで、虹彩と強膜との境界に後方。眼球から角膜半球を除去するために、小さな春のハサミで目の周囲に、この切開に従ってください。視神経に接続された半球が残ります。
  5. 安楽死させた動物からのアイカップの内側に非常に薄いピンク/ベージュ網膜を探します。アイカップを安定化させるために鈍化鉗子で網膜色素上皮層を保持します。非常に優しく、目の奥のオフ全体無傷の網膜をいじめるために、閉じた鉗子の別のペアを使用してください。 、ピンチ引っ張り、または直接網膜を引っ張ることは避けてください。
  6. カットする小さな春のはさみを使用視神経がまだ網膜に装着されているエリア。
  7. 網膜から残留色素上皮または強膜組織を切り取るようにしてください。
  8. トランスファーピペットを使用して、非常に静かに新鮮なPBSを含む35ミリメートル×10ミリメートルペトリ皿を被覆したクリーンなシルガードに孤立した網膜を転送します。

9.ホールマウント網膜準備

  1. いったんシルガード皿で、場所で網膜を固定する鉗子と1サボテンの針を使用します。上向きに網膜神経節細胞層を維持し、ダウン視神経。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。
  2. 視神経乳頭から放射状に四つ葉のクローバーの形を作り、4つの象限に網膜をカットするために、小さなはさみを使用してください。
  3. 可能なwithoとして網膜は限り平坦にするために追加のサボテンの針を持つ網膜の象限をピンストレッチUT( 図5)。
  4. RTで4%パラホルムアルデヒドO / Nの3ミリリットルとのSylgard皿で固定網膜を修正しました。

網膜の10抗体染色

注:ステインが( 図6)網膜におけるニューロンを表示するための一次および二次抗体を用いた網膜を固定。

  1. 固定、フラットマウントされた網膜をPBS中で2分間、3回洗浄します。
  2. 60分間、PBS中の1%ウシ胎児血清、1%トリトンX-100で網膜を透過。
  3. すすぎは、PBS中で3回、2分毎に、網膜。
  4. PBS中0.1%トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。
  5. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
  6. 45分間室温でPBS中の1%トリトンX-100および1%ウシ胎児血清をインキュベートします。
  7. PBS中0.1%トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。
  8. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
  9. PBSで3ミリリットルの1%ウシ胎児血清中の各網膜をインキュベート精製したマウス抗ラットCD90 /マウスCD90.1(1:300希釈)O / RTでN。
  10. 5分間、PBS中の0.1%トリトンX-100で一回網膜をすすぎます。
  11. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
  12. 二アレクサフルオロ594ヤギ抗マウスIgGを用いて3 mlのPBS(無FBS)の各網膜をインキュベートし(1:300)O / RTでN。
  13. 気前PBSで網膜を洗ってください。
  14. 解剖顕微鏡を使用して、慎重に網膜からサボテンの針を削除します。
  15. 静かに転送ピペットを用いて顕微鏡スライド上に網膜を転送します。天井に直面している網膜神経節細胞層との方向を維持するようにしてください。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。
  16. キムワイプまたは他のこのような吸収性材料を用いて余分なPBSを吸収します。網膜を吸収しないように注意してください。
  17. 1/2グリセリン5滴を追加し、午前のように重量PBS 1/2ountingメディア。
  18. 気泡を避け、カバーガラスと網膜をカバーしています。
  19. 明確なマニキュア、接着剤、または他の接着剤を用いてカバーガラスを固定します。

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Representative Results

このセクションでは、 インビボでラット緑内障モデルにおける緑内障のような状態を誘導するために使用される装置部品及び手順を示します。我々は、眼圧の上昇を引き起こす高張食塩水の注入を実行するために使用される個々のツールおよび機器を示します。私たちは、その特徴的なブランチング効果と結果前房の曇った外観を持つ強膜上静脈叢への注入を示しています。我々はまた、網膜の除去とフラットマウント失われたRGCの分析のための方法が記載されています。最後に、我々は、網膜神経節細胞の生存に対する注入の効果を示します。 RGCの分布は、ラットの網膜の異なる領域で不均一であるように、画像が4ミリメートル離れた視神経乳頭の中心から各網膜の4つの200μmの2つの領域から得られます。各セクション内のThy 1.1ラベルされたRGCの合計数がカウントされ、実験とCONTRで平均と比較オールは31を網膜。この方法を使用して、RGC数は緑内障のような条件を誘導するための手順の後に168 1月にコントロール未処理の状態の画像225の平均値から変更された(N = 30)。まとめると、ここで説明する手順は、網膜神経節細胞体と軸索の死を分析するために、段階的に追跡することができます。

図1
図1.マイクロニードルコンポーネント。前電極に引っ張られた後、生理食塩水注入のために使用されるポリエチレン管を有する(A)シリンジ(B)ホウケイ酸マイクロニードルを埋め戻すために使用されるバックフィルシリンジ。ホウケイ酸マイクロニードルを製造するために使用される(C)ナリシゲ電極プラー(D)は、ホウケイ酸ガラス電極プラー。(E)は、引っ張られた後に微小針先端のビューに拡大します。ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.完全なマイクロニードルアセンブリ。マイクロニードル高張生理食塩水でシリンジに取り付けられたポリエチレンチューブに取り付けられている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
ライブの強膜上の静脈に生理食塩水の注入の図3.緑内障誘導に生理食塩水注射を上強膜静脈叢。イメージは、ロングエバンスラットを麻酔しました。矢印は目に膨出し、その移動を防止するために使用される止血剤の位置を示します。白い矢印が示します注入された静脈の場所。黒い矢印は、成功した静脈穿刺を示すマイクロニードルチップ内に流れる血液の背面を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
高張食塩水注入の4ブランチング効果図。高張食塩水を注射されたラットの眼の画像を。矢印が上強膜静脈叢中の生理食塩水の特徴的な白化効果を示しています。矢印はまだ湯通ししていない強膜上静脈叢の一部を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

31 / 53831fig5.jpg "/>
ラット網膜の図5.フラットマウント。全マウント網膜のイメージは、ラットの眼から除去され、サボテンの針を使用して、シルガード皿に平らに固定。黒い矢印は、視神経乳頭を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
緑内障誘導手術後の網膜神経節細胞へ図6.被害。コントロール未処理の眼(A)の比較実験目(B)1ヶ月に生理食塩水注射を誘導緑内障を受け取った後。網膜は、RGCマーカー、Thyの1.1(CD90)に対する抗体で標識しました。細い矢印は制御および実験条件の両方で個々のRGCを示しています。手順は、RGCの数の減少をもたらす、デメイン軸索の束オフ軸索の束状、および残りのRGCの円形に歪み。ブロック矢印は、生理食塩水の注入に起因する特性defasciculating軸索を示しています。矢じりは、網膜内の血管を示しています。ダブルエンドの矢印ラベルの軸索の束。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルは、 インビボのラットモデルにおける緑内障のような状態を誘導する方法を記載しています。この手順は、小柱網29、32に瘢痕化を誘導するために高張食塩水の注入を使用しています。瘢痕組織を開発する前房に圧力を増加させ、房水の流出を閉塞します。減少した流出圧力が構築して、弾性靱帯によって吊り下げレンズはバック硝子体腔内に押し込みます。硝子体液は、その後、脆弱な網膜神経細胞に損傷を与える網膜上に圧力を加えます。この手順を使用して、我々の結果は、網膜神経節細胞数は、1ヶ月後手順で神経節細胞の損失の大幅な損失で、2週間で漸減し始めることを示しています。

このプロトコルは、げっ歯類において、緑内障を誘発する1つの方法だけです。網膜神経節細胞への損傷は、眼内圧の増加によって、または直接DAのいずれかによって達成されている他の多くの実験モデルであります視神経30メイジ。しばしば、これらの方法は、より大きな動物で開発され、マウスおよびラット33への適用のために修飾されています。このようなスタウロスポリン34およびNMDA、非加水分解性グルタミン酸アナログ35などの毒素の眼内注射は、急速な網膜神経節細胞死を誘導します。研究は、そのような毒素は、マウスおよび標的神経節細胞35以外の効果細胞における用量反応曲線に従うことが示されています。さらに、このモデルにおける網膜神経節細胞への損傷は、より直接的なヒトの緑内障の緩やかな進行よりなります。

視神経への直接のダメージも与えたことができます。レーザー軸索切断は、マウス36で視神経を構成する軸索を切断するための一般的な方法です。しかし、この方法は、いくつかの合併症を提示します。げっ歯類の軌道の小さいサイズは、正確に網膜中心動脈を通る血流に影響を与えることなく、視神経を損傷することが困難そして、静脈。これを克服するために、いくつかの研究は、視神経37へのより良いアクセスを提供するために、脳の小部分の除去を含む、より侵襲的なアプローチを利用します。視神経挫滅モデルは、同様に眼窩内視神経にアクセスします。このモデルでは、神経は、自己閉鎖鉗子により挟持され、眼の血流が損なわれません。この手順では、即時の侮辱と網膜神経節細胞の同期死をもたらします。このモデルを用いた研究は、網膜神経節細胞38の有意な損失を示します。しかし、いくつかは、それが単独で39 IOP上昇に起因するよりも損傷を誘発することができると主張しています。さらに、緑内障は、ヒトの緑内障で生じるものよりもかなり異なる可能性網膜神経節細胞33、39-42 .Therefore、時間経過と視神経挫滅と被害の根底にあるメカニズムのゆっくりとした、慢性、非同期の損失によって特徴付けられます。これとは対照的に、本論文で議論したモデルは、直接ACCEの必要性を回避します視神経へのssは、脳組織の任意の解剖を排除し、漸進的な網膜神経節細胞の損傷を可能にします。

IOPを上昇させるために、ラットやマウスの前室に注入緑内障使用ポリスチレンまたは磁気ビーズのマイクロビーズ閉塞モデル。この作業のほとんどは、マウスにおいて行われていると、彼らは結果のみで幅広いバリエーションと一貫性のないデータ43-50と視神経の被害の適度なレベルに低い表示されます。ラットを用いた場合に、上昇したIOPの持続時間は、セル48に十分な損傷を与えるには短すぎました。でも手順に変更を加えて、このモデルはまだ急性神経因性モデルではなく、慢性緑内障モデル51を表す短い期間で深刻な被害をもたらしました。 Smedowski 43最近、DOE慢性損傷でIOP上昇を長持ち達成するために追加の初期の「高圧傷害'を用いてさらに修飾マイクロビーズの手順を開発しましたsのショー約束。この技術を用いてより多くの研究が、さらにこのモデルを検証するために必要です。

慢性高眼圧症のモデルは、房水流出を妨害することを目指しています。上強膜と角膜輪部の静脈52と上強膜静脈閉塞53のレーザー光凝固は、そのような2つの方法です。しかし、また、レーザアブレーション技術のみ過渡IOP上昇と実際のセル損失36、54-55の適度なレベルを産生することが示されています。

緑内障は、損傷および軸索視神経を構成する網膜神経節細胞の喪失に起因する慢性疾患です。この損失のメカニズムは不明です。眼圧の上昇が特徴的な危険因子であるが、いくつかの他の因子の関与が示唆されています。このような要因は、炎症過程、酸化ストレス、代謝不規則性、または血流の乱れ56-58が含まれます。セル画の正確なメカニズムを解明するために、この疾患におけるリットル死、研究者は正確に人間の緑内障に現れる条件を模倣するために、単純な反復可能、かつ機能的な方法を必要としています。そうして初めて、研究者は、死んでから網膜神経節細胞を保護する方法を考案することを期待することができます。このホワイトペーパーで説明する手順は、31緑内障患者に見られるものと同様の網膜神経節細胞の漸進的、不可逆的な損失を生成するためにIOPの人為的に誘導された高度を使用しています。手順は、低侵襲性です。重要な網膜神経節細胞の損失は、手術の1ヶ月以内に測定されます。この方法は、緑内障の研究のための1つの重要なツールです。この方法の潜在的な制限は、高張食塩水の手動注入です。このため、手動による方法のために、結果に大きな変動を期待することが可能です。しかし、我々は重要なステップであると静脈内湯通し効果を同定しました。ブランチングが発生した場合は、網膜神経節細胞の損失は18と29%の間に常にあります。これをサポートするために、すべての将来の研究では、モディ可能性がありこれらの注射はIOPの測定可能な増加につながることを確実にするためにルーチンIOP測定を含めることがfyの手順。29,31。おそらくRGC死のこのモデルは、世界中の何百万人もの人々に影響を与える壊滅的な視覚的な損失を戦うより完全な神経保護治療の開発につながります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

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