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Medicine

Glaucoma auslösende Verfahren in ein Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Das Glaukom ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems retinale Ganglionzellen (RGCs). RGC Axone des Sehnervs führen für die visuelle Wahrnehmung an das Gehirn visuelle Eingabe bilden. Schäden an RGCs und ihre Axone führt zu Verlust der Sehkraft und / oder Blindheit. Obwohl die spezifische Ursache des Glaukoms nicht bekannt ist, ist der Hauptrisikofaktor für die Erkrankung ein erhöhter Augeninnendruck. Glaucoma-induzierende Verfahren in Tiermodellen sind ein wertvolles Werkzeug für Forscher, den Mechanismus der RGC Tod studieren. Diese Informationen können zur Entwicklung von wirksamen neuroprotektiven Behandlungen führen, die bei der Prävention von Verlust der Sehkraft unterstützen könnte. Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt ein Verfahren Glaukom induzieren - ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell , bei dem 50 ul von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in das episkleralen venösen Plexus injiziert. Blanchieren der Gefäße zeigt die erfolgreiche Injektion. Dieses Verfahren führt zu einem Verlust von RGCs Glaukom zu simulieren. Einen Monat nachInjektion werden die Tiere getötet und die Augen entfernt. Als nächstes werden die Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt, um eine Okularmuschel zu machen. Die Netzhaut wird dann von der Rückseite des Auges geschält und auf Sylgard Gerichte mit Kaktus Nadeln festgesteckt. An diesem Punkt Neuronen in der Netzhaut kann zur Analyse gefärbt werden. Die Ergebnisse aus diesem Labor zeigen, dass etwa 25% der RGCs innerhalb eines Monats nach dem Verfahren, wenn die interne Kontrolle im Vergleich verloren. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Retinal Ganglion Zelltod in einem in vivo Rattenmodell Glaukoms.

Introduction

Glaukom ist eine Gruppe von Augenkrankheiten , Nervenzellen in der Netzhaut zu beeinflussen, insbesondere die retinalen Ganglionzellen 1-2. Die Axone dieser Zellen konvergieren der Sehnerv visuelle Information tragenden zum Gehirn zu werden, wo die Sicht wahrgenommen wird. Schäden an RGCs und ihre Axone führt daher zu Sehfehler.

Die primären Merkmale im Zusammenhang mit Glaukom-Erkrankungen sind RGC Degeneration und Tod, erhöhter Augeninnendruck (IOP) und Papille Schröpfen und Atrophie. Diese Eigenschaften führen zu Gesichtsfeldausfällen oder vollständige, irreversible Blindheit. Derzeit hat 3 Blindheit in 70 Millionen Menschen weltweit Glaukom verursacht. Als solches ist es die drittgrößte Ursache für Erblindung 4 der Welt.

Der genaue Mechanismus der RGC Tod in Glaukom bleibt unbekannt. Viel Forschung wurde das Geheimnis zu entsperren getan. Es ist jedoch bekannt, dass der primäre Risikofaktor für Glaukom ist eine Zunahme in intraokularen Drucks aufgrund unregelmäßiger Zirkulation von wässrigem Humor (AH) in der Vorderkammer des Auges. AH dient als transparent und farblos Ersatz für Blut in der avaskulären Vorderkammer des Auges. Es nährt die umliegenden Zellen, entfernt sekretiertes Abfallprodukte aus Stoffwechselprozesse, transportiert Neurotransmitter und ermöglicht die Verbreitung von Drogen und Entzündungszellen innerhalb des Auges während der pathologischen Zustände 1.

Die Aufrechterhaltung der wässrigen Humor Zirkulation beinhaltet die Ziliarkörper und das Trabekelwerk. Wässrige Humor wird durch den Ziliarkörper produziert. Es fließt dann in die vordere Kammer, die allgemeine Gesundheit des Augengewebes zu halten. 75-80% der wässrigen Abflusses wird aktiv durch nichtpigmentären Ciliarepithel sezerniert, wenn die Flüssigkeit durch drei Schichten des schwammigen Gewebe im Ziliarmuskel gefiltert wird. Das Fluid tritt durch das Trabekelwerk und durch den Schlemmschen Kanal, empties in das Blutsystem 5 .Die restlichen 20 - 25% der Abfluss umgeht das Trabekelwerk und wird passiv durch Ultrafiltration und Diffusion durch die uveo-skleralen Weg abgesondert. Dieser Weg scheint relativ unabhängig von den intraokularen Druck 1 zu sein.

Wenn Kammerwasserproduktion und Abfluss aus dem Gleichgewicht geraten sind, baut den Druck im Auge. Wie bereits erwähnt, diese Erhöhung des intraokularen Drucks ist der primäre Risikofaktor bei der Entwicklung von Glaukom. Ein solcher Druck bewirkt, dass eine Beschädigung der komplizierten Schichten von Neuronen in der Netzhaut auf der Rückseite des Auges. Eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen Axone des Sehnervs verursacht das Gehirn nicht mehr präzise visuelle Informationen zu erhalten. Als Ergebnis ist die Wahrnehmung des Sehvermögens verloren und vollständige Blindheit auftreten können.

Bis heute gibt es keine Heilung für Glaukom. Verschiedene Behandlungsmethoden gibt, die in erster Linie den intraokularen Druck zu reduzieren wollen. Dazu gehören die topischeMedikamente Klassen wie Beta1-Rezeptorenblocker oder topische Prostaglandin-Analoga. Betablocker reduzieren die intraokulare Druck durch die Produktion von Kammerwasser 7 abnimmt. Prostaglandine fungieren IOP zu reduzieren , indem der Abfluss von Humor aquosus 8-14 erhöhen. Alpha-adrenergen Agonisten und Carboanhydrasehemmer sind auch als sekundäre Behandlungsmethoden verwendet werden. Alpha - adrenergen Agonisten erhöhen Abfluss durch den uveosklerale Weg 15-17. Carboanhydrasehemmer reduzieren die Produktion von AH durch enzymatische Hemmung 18. Viel mehr invasive Verfahren werden auch zur Behandlung von Glaukom verwendet wird. Lasertrabekuloplastik wird verwendet , 19 , um den Abfluss des Kammerwassers zu erhöhen. Eine weitere chirurgische Therapie, die so genannte Trabekulektomie schafft eine alternative Entwässerung Website AH zu filtern , wenn der traditionelle trabekulären Weg wird 20-21 blockiert.

Diese Behandlungsoptionen wurden zu eff bekanntektiv IOP verringern. Jedoch bis zu 40% der Glaukompatienten für vollständigere therapeutischen Verfahren eine Notwendigkeit , den normalen IOP Ebenen zeigen anzeigt. 22,23 Zusätzlich ist Retinal Ganglion Zelltod in Glaukom gesehen irreversible sobald es und aktuellen Behandlungen beginnt nicht das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen 24-28. Dies hat die Notwendigkeit einer wirksamen neuroprotektiven Therapien hervorgehoben, dass das Überleben der Neuronen selbst ausrichten. Entwicklung von Glaukom-Modelle ist für diese Entwicklung entscheidend.

In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Induzierung von Glaukom-ähnliche Effekte in erwachsenen Long Evans - Ratten mit einem modifizierten Verfahren unter Verwendung von ursprünglich umrissenen von Morrison 29. In diesem Verfahren werden Injektionen von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in dem episkleralen venösen Plexus induziert Glaukom ähnlichen Bedingungen durch Gewebe Vernarbung wässrigen Abflusses in das Trabekelwerk zu einem Anstieg des intraokularen Drucks und einem signifikanten Verlust an RGCs was zu reduzieren within eines Monats nach dem Verfahren 30-31. Glaucoma-induzierenden Verfahren, wie das hier beschrieben ist, kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Entwicklungen in Glaukombehandlung.

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Protocol

Alle Verfahren tierischen Patienten verwendet haben in Übereinstimmung mit den Standards des Instituts für Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Western Michigan University.

1. Tiere

  1. Verwenden männlichen und weiblichen Ratten Alter von 3 Monaten in dieser Studie.
  2. Halten Sie Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.

2. Herstellung von KAX Cocktail für Tier Anesthesia

  1. Man löst 50 mg Xylazin (20 mg / ml) in 5 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1 ml Acepromazin (10 mg / ml) und 3 ml destilliertes Wasser. Gründlich durchmischen.
  2. Sterilisieren mit einem Spritzenfilter und speichern diese Lösung in eine 10 ml Serumflasche.

3. KAX Injection

  1. Wiegen Tier (g) und zurück zum Käfig, bis sie bereit zur Injektion.
  2. Injizieren von 0,1 ml KAX / 100 g Körpergewicht des Tieres intraperitoneal, eine 1 ml Insulinspritze mit einer 28 G Nadel.
  3. Zulassenfür Tier zu werden bewusstlos. Überprüfen Reflexe durch die Füße und Schwanz einklemmen.
  4. Bewahren Sie alle Tiere sicher im Labor für die Dauer der Operation.
  5. Post-Chirurgie, ersetzen Tiere in ihren Käfigen und halten bequem in RT, bis das Bewusstsein wiedererlangt wird. Nur Rückkehr Tiere in die Tierhaltung, wenn die Tiere erwachen und ein normales Verhalten fortzusetzen.

4. Vorbereitung für Chirurgie und Microneedle Versammlung

  1. Machen Sie eine sterile 2 M NaCl-Lösung.
  2. Verwenden Sie einen Mikroelektroden - Abzieher (1C) ein 0,86 mm Innendurchmesser schwer poliert Standard und dünnwandige Borosilikat Rohr zu ziehen , in zwei fein verjüngte Glasmikronadeln (1D, 1E).
  3. Verfüllung eines microneedle aus dem vorhergehenden Schritt mit 2 M Kochsalzlösung eine Verfüllung Spritzennadel und einer 1 ml Spritze (1B). Tippen Sie aus Luftblasen aus der Spitze der Elektrode.
  4. Füllen Sie eine zweite 1 ml Spritze mit 2 MNaCl. Schließen Sie eine 18 G - Nadel und legen dann eine Länge (etwa 10 Zoll) von Polyethylenschlauch (Abbildung 1A). Verwenden Sie den Spritzenkolben das Polyethylenschlauch mit Kochsalzlösung durch die Nadel zu füllen.
  5. Wenn sowohl die Mikronadeln und Schläuche mit Kochsalzlösung gefüllt sind, sorgfältig die beiden verbinden. Beseitigen jegliche Luft in der Verbindung zwischen ihnen (Figur 2).
  6. Fein Fase die Spitze des microneedle, indem sie es sehr leicht gegen den Strich eines Kurses Papiertuch Schaben.
  7. Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadeln durch den Kolben vorsichtig auf die Spritze, bis ein feines Flüssigkeitsstrom drückt auf dem Papiertuch zu sehen. Der Strom der Flüssigkeit sollte nicht breiter als 0,5 mm sein.

5. Herstellung von Tier

  1. Tragen Sie 1-2 Tropfen Lokalanästhetikum zu Hornhaut (Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung, USP, 0,5%). Warten Sie, bis kein Augenreflex auftritt.
  2. Trim-Whisker mit einer Schere.
  3. Saturate ein Wattestäbchen mit Betadin Lösung und Tupfer Bereich um den experimentellen Auge.
  4. Mit Hilfe eines Mikroskops befestigen Sie eine hemostat den unteren Augenlid zu klemmen, um das Auge zu wölben, die episklerale Vene aussetzen und Augenbewegung beschränken. (Abbildung 3, Pfeilspitze)

6. Glaucoma auslösende Saline Injection

  1. Wenn die microneedle Montage und das Tier hergestellt werden, beginnen Injektionen.
  2. Wenn das Tier zu Fuß / Schwanz Prise nicht mehr zu reagieren bestätigt wird, sorgfältig die episklerale Vene mit dem microneedle gewaltsam öffnen , indem sie zwischen 10 und 20 Grad zur Ader (Abbildung 3, weißer Pfeil) in einem niedrigen Winkel kommen. Eine erfolgreiche Einstich in die Vene ist offensichtlich , wenn Blut die Spitze der Mikronadeln (Abbildung 3, schwarzer Pfeil) eintritt.
  3. Langsam und manuell ca. 50 & mgr; l Kochsalzlösung in die Vene injiziert. Dies sollte etwa 10 Sekunden dauern. Die Venen werden blanch weiß wie das Salz zirkuliert throigitt das Gefäßsystem (Abbildung 4, Pfeilspitze). In einigen Regionen kann eine blutrot Aussehen (Abbildung 4, Pfeil) halten.
    1. Durchführen einer zweiten Injektion in die Vene, gegenüber dem Ort der ersten, gründliches retinale Schädigung des vollständigen retinalen Ganglienzellschicht zu gewährleisten.
      Hinweis: Innerhalb von Minuten, sollte man eine deutliche trübes Aussehen durch die Iris des Auges zu sehen, wie das Salz das Gefäßsystem zirkuliert durch.
  4. Lassen Sie das andere Auge unbehandelt für die Verwendung als interne Kontrolle.

7. Tierrettung

  1. Entfernen Sie die hemostat.
  2. Verwenden Sie einen Wattedreifach antibiotische Salbe (Zink-Bacitracin, Neomycin-Sulfat, polymysin B Sulfat) auf die Website von der hemostat und an Injektionsstellen geklemmt anzuwenden. Gewebeschäden um das Auge tritt nicht auf die hemostat verwenden.
  3. > Platz narkotisierten Tieren auf einer zirkulierenden Warmwasserdecke in ihren Käfigen zu prevent Hypothermie. Halten Sie Tiere unter Beobachtung, bis das Bewusstsein und ein normales Verhalten wiedergewonnen werden. Transport wach Tiere zurück in die Tierkolonie. Tiere bleiben in der Kolonie bis zum Zeitpunkt des Opfers.

8. Tieropfer und Retina Removal

  1. Einen Monat nach dem Verfahren zur Glaukom induzieren, Tiere werden durch CO 2 Ersticken und sekundäre Thorax - Stich eingeschläfert.
    1. Legen Sie das Tier in der Kammer und legte den Deckel auf sicher.
    2. Öffnen Sie die CO 2 und Gasregelventile 20% Volumen / min CO 2 Verschiebung zu ermöglichen , Sauerstoff in der Kammer.
    3. Lassen Sie vier bis fünf Minuten für das Tier zu verfallen.
    4. Schalten Sie beide Ventile ab.
    5. Entfernen Tier aus der Kammer und führen Sie eine sekundäre Thorax-Stich mit einem sterilen Skalpell.
  2. Nach Euthanasie, mit einem Skalpell das Bindegewebe in der Augenhöhle zu schneiden bei rund um das Auge,ng vorsichtig, nicht in den Augapfel selbst zu schneiden.
  3. Verwenden Sie sorgfältig gekrümmten Rand Schere, um den Sehnerv und alle verbleibenden Gewebe zu schneiden die intakte Augapfel zu extrahieren. Legen Sie extrahiert Augapfel in einem sterilen 60 mm x 15 mm Einweg-Petrischale mit frischem PBS.
  4. Machen Sie eine Okularmuschel vom Augapfel. Um dies zu tun, stellen ein kleiner Schnitt mit dem Skalpell posterior nur an der Grenze zwischen der Iris und der Sklera. Folgen Sie dieser Einschnitt um den Umfang des Auges mit kleinen Feder Schere, um die Hornhaut Hemisphäre aus dem Augapfel zu entfernen. Die Halbkugel mit dem Sehnerv verbunden bleibt.
  5. Finden Sie die sehr dünne rosa / beige Retina innerhalb des Okulars vom eingeschläfert Tier. Halten Sie die pigmentierte Schicht der Netzhaut mit abgestumpften Pinzette die Augenmuschel zu stabilisieren. Verwenden Sie ein anderes Paar geschlossener Zange sehr sanft die ganze intakte Retina necken weg von der Rückseite des Auges. Vermeiden Sie Kneifen, ziehen, oder die Netzhaut direkt zerren.
  6. Verwenden Sie kleine Feder Schere die zu schneidenBereich, in dem der Sehnerv noch an der Netzhaut angebracht wird.
  7. Achten Sie darauf, restliche Pigmentepithel oder Skleralgewebe von der Retina wegzuschneiden.
  8. Mit Hilfe einer Transferpipette, Transfer sehr sanft die isolierte Retina zu einem sauberen Sylgard beschichtet 35 mm x 10 mm Petrischale mit frischem PBS.

9. Whole-Mount-Retina-Vorbereitung

  1. Einmal in der Sylgard Schüssel, verwenden Pinzette und ein Kaktus Nadel, um die Netzhaut an Ort und Stelle zu fixieren. Halten Sie die retinalen Ganglienzellschicht nach oben und Sehnerv nach unten. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist.
  2. Verwenden Sie kleine Schere, um die Netzhaut in vier Quadranten zu schneiden, die Form eines vier Kleeblatt machen von dem Sehnervenkopf ausstrahlen.
  3. Pin den Quadranten der Netzhaut mit zusätzlichen Kaktus Nadeln der Retina so flach wie möglich zu machen without Streckung (Abbildung 5).
  4. Befestigen Sie die gemerkte Retinae in der Sylgard Schale mit 3 ml 4% Paraformaldehyd O / N bei RT.

10. Antikörper-Färbung von Retina

Anmerkung: Stain fixiert Retinae mit primären und sekundären Antikörpern zur Betrachtung Neuronen in der Netzhaut (6).

  1. Spülen Sie fixiert, flach montierten Retinae dreimal für jeweils 2 Min in PBS.
  2. Permeabilisieren die Retinas mit 1% Triton X-100 mit 1% fötalem Rinderserum in PBS für 60 min.
  3. Rinse Retinae dreimal 2 min jeweils in PBS.
  4. Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung.
  5. Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch.
  6. Inkubieren mit 1% Triton X-100 und 1% fötalem Rinderserum in PBS bei RT für 45 min.
  7. Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung.
  8. Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch.
  9. Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml 1% fötalem Rinderserum in PBSmit gereinigtem Maus-anti-Ratte CD90 / Maus CD90.1 (1: 300 Verdünnung) O / N bei RT.
  10. Spülen Retinae einmal mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min.
  11. Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch.
  12. Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml PBS (ohne FBS) mit sekundären Alexa Fluor 594 Ziege-Anti-Maus-IgG (1: 300), O / N bei RT.
  13. Waschen Sie Retinae mit PBS liberal.
  14. Mit einem Binokular, entfernen Sie vorsichtig Kaktus Nadeln von der Netzhaut.
  15. übertragen vorsichtig Retinae auf Mikroskop-Objektträger mit einer Transferpipette. Achten Sie darauf, Orientierung mit retinalen Ganglienzellschicht zu halten an der Decke gegenüber. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist.
  16. Absorbieren überschüssiges PBS mit Kimwipe oder ein anderes derartiges Material aufnehmen. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut zu absorbieren.
  17. 5 Tropfen ½ Glycerin und ½ PBS Gewichts als amontage Medien.
  18. Decken Sie Retina mit Deckglas, Luftblasen vermeiden.
  19. Sichere Deck mit klarem Nagellack, Klebstoff oder andere Kleber.

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Representative Results

Dieser Abschnitt stellt die Gerätekomponenten und Verfahren verwendet , um Glaukom ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Ratten Glaukom Modell induzieren. Wir zeigen die einzelnen Werkzeuge und Geräte mit einer hypertonen Kochsalzlösung-Injektion auszuführen verwendet, die eine Erhöhung des intraokularen Druckes bewirkt. Wir zeigen die Injektion in den episkleralen venösen Plexus mit seinen charakteristischen Blanchierung Effekt und die trübes Aussehen der vorderen Kammer, der sich ergibt. Wir beschreiben auch den Prozess der Retina Entfernung und Flachmontage für die Analyse der verlorenen RGCs. Schließlich zeigen wir die Auswirkungen der Einspritzung auf das Überleben retinaler Ganglionzellen. Da die Verteilung von RGCs in den verschiedenen Regionen der Ratte Retina uneben ist, werden die Bilder von vier 200 & mgr; m - 2 - Regionen in jeder Netzhaut erhalten, 4 mm von der Mitte des Sehnervenkopfes entfernt. Die Gesamtzahl der Thy 1.1 markierten RGCs in jedem Abschnitt gezählt werden, gemittelt und verglichen in experimentellen und contr ol Retinae 31. Unter Verwendung dieses Verfahrens verändert RGC Zählwerte von durchschnittlich 225 in einem Bild der unbehandelten Kontrollbedingungen 168 einen Monat nach dem Verfahren Glaukom ähnlichen Bedingungen (N = 30) zu induzieren. Zusammengenommen können die hier beschriebenen Verfahren kann Schritt für Schritt verfolgt werden, um den Tod von retinalen Ganglienzellkörper und Axone zu analysieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Microneedle Komponenten. (A) Die Spritze mit Polyethylenschlauch für Salz Injektion verwendet. (B) Verfüllung Spritze verwendet , um die Borosilikat microneedle zu verfüllen. (C) Narishige Elektrode Abzieher verwendet Borosilikat - Mikronadeln zu machen. (D) Borosilikat - Glaselektroden vor und nach dem in der Elektrode gezogen wird Puller. (E) Ansicht von Mikroelektroden Nadelspitze Vergrößerte nach gezogen wird.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Vollständige Microneedle Montage. Microneedle an Polyethylenschlauch angebracht angebracht mit hypertonen Kochsalzlösung auf die Spritze. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Glaucoma auslösenden Saline Injektion in die Episklerale Venenplexus. Das Bild von Salzinjektion in die episklerale Vene eines lebenden, narkotisierten Ratten Long Evans. Die Pfeilspitze gibt die Position des hemostat verwendet, um das Auge wölben und ihre Bewegung zu verhindern. Der weiße Pfeil zeigt die Lage der injizierten vein. Der schwarze Pfeil zeigt Blut zurück in die microneedle Spitze fließt , über die erfolgreiche Venenpunktion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Blanchieren Wirkung von Hypertone Saline Injektion. Das Bild von Rattenauge mit hypertonen Kochsalzlösung injiziert. Die Pfeilspitze zeigt die charakteristische Abblassen Wirkung von Kochsalzlösung in den episklerale Venenplexus. Der Pfeil zeigt einen Teil des episklerale Venenplexus, der noch nicht blanchiert hat. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Flach Berg der Ratte Retina. Das Bild der ganze Berg Netzhaut von der Ratte Auge entfernt und merken Wohnung in einem Sylgard Gericht mit Kaktus Nadeln. Der schwarze Pfeil zeigt den Sehnervenkopf. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Schäden an retinalen Ganglienzellen nach Glaucoma auslösende Chirurgie. Vergleich von unbehandelten Kontroll Auge (A) zu experimentellen Auge (B) einen Monat nach Glaukom Empfang Kochsalzinjektion induziert wird . Retinae wurden mit einem Antikörper gegen das RGC Marker markiert, Thy 1.1 (CD90). Dünne Pfeile zeigen einzelne RGCs sowohl in der Kontroll- und experimentellen Bedingungen. Das Verfahren führt zu einer Reduktion in der Anzahl von RGCs, defasciculation der Axone aus den wichtigsten Axon-Bundles und Verzerrung der Zirkularität der verbleibenden RGCs. Blockpfeile zeigen die charakteristischen defasciculating Axone aus der Salzinjektion führt. Die Pfeilspitze zeigt ein Blutgefäß in der Netzhaut. Doppelpfeile Label Axon - Bundles. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Glaukom-ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell induzieren. Dieses Verfahren verwendet eine Injektion von hypertonischer Kochsalzlösung Vernarbung in das Trabekelwerk zu induzieren 29, 32. Die Entwicklung Gewebenarben den Abfluss von Kammerwasser okkludiert , die Druck in der vorderen Kammer erhöht. Mit verminderten Abfluss und Druck aufzubauen, wird die Linse durch elastische Bänder suspendiert schiebt wieder in den Glaskörperraum. Vitreous Humor gilt dann Druck auf die Netzhaut die empfindlichen Netzhautneuronen zu beschädigen. Unsere Ergebnisse mit diesem Verfahren zeigen, dass retinalen Ganglienzellzahlen beginnen nach 2 Wochen mit erheblichen Verlust von Ganglionzellen Verlust nach 1 Monat nach dem Eingriff zu schwinden.

Dieses Protokoll ist nur ein Verfahren des Glaukoms bei Nagetieren induziert. Es gibt viele andere experimentelle Modelle, bei denen eine Beschädigung retinalen Ganglionzellen erfolgt entweder durch eine Erhöhung des intraokularen Drucks oder durch direkte daMagier auf den Sehnerv 30. Oft haben diese Verfahren wurden in 33 größeren Tieren und modifiziert für Anwendung an Mäuse und Ratten entwickelt. Intraokulare Injektionen von Toxinen wie Staurosporin 34 und NMDA, die nicht hydrolysierbaren Glutamat analog 35 schnellen Tod retinaler Ganglionzellen induzieren. Studien haben jedoch gezeigt, dass solche Toxine eine Dosis-Wirkungs-Kurve in Mäusen und Wirkung anderen Zellen als den Ziel Ganglionzellen 35 folgen. Zudem ist der Schaden an retinalen Ganglionzellen in diesem Modell sehr viel direkter als die allmähliche Fortschreiten der menschlichen Glaukomen.

Die direkten Schäden des Sehnervs können auch zugefügt werden. Laser Axotomie ist ein gemeinsamer Weg die Axone zu durchtrennen 36 den Sehnerven bei Mäusen bilden. Jedoch stellt dieses Verfahren einige Komplikationen. Die geringe Größe von Nagetieren Bahnen macht es schwierig, genau den Sehnerv beschädigen, ohne den Blutfluss durch die zentrale Netzhautarterie zu beeinflussenund Vene. Um dies zu überwinden, nutzen einige Forscher eine invasive Ansatz , der die Entfernung eines kleinen Teils des Gehirns , um 37 einen besseren Zugang zu den Sehnerv zu liefern. Optic Nervenquetschung Modelle zugreifen den Sehnerv intraorbital als auch. In diesem Modell wird der Nerv durch selbstschließenden Zange gequetscht und Augenblutung nicht beeinträchtigt wird. Dieses Verfahren führt zu einer sofortigen Beleidigung und synchronen Tod von retinalen Ganglienzellen. Studien dieses Modell zeigen einen signifikanten Verlust von RGCs 38. Jedoch argumentieren einige, dass es , dass mehr Schaden verursachen können , als durch erhöhten IOP allein 39 verursacht. Zusätzlich Glaukom wird durch eine langsame, chronische, asynchrone Verlust von retinalen Ganglienzellen 33, gekennzeichnet 39-42 .Daher der zeitliche Verlauf und die zugrunde liegenden Mechanismus der Schaden mit Sehnerv Crush zugefügt ganz anders sein könnte als die in der menschlichen Glaukom auftritt. Im Gegensatz dazu vermeidet das Modell in diesem Papier die Notwendigkeit einer direkten Zubess an den Sehnerv, beseitigt jede Präparation von Hirngewebe und ermöglicht eine allmähliche retinaler Ganglionzellen Schäden.

Microbead Okklusion Modelle von Glaukom Verwendung Polystyrol oder magnetische in den vorderen Kammern von Ratten oder Mäuse injiziert Perlen zu IOP erhöhen. Die meisten dieser Arbeiten wurde in Mäusen durchgeführt , und sie zeigen nur eine geringe bis mäßige Höhe des Schadens im Sehnerven mit großen Unterschiede in den Ergebnissen und inkonsistente Daten 43-50. Bei Ratten verwendet wurde, wurde die Dauer der erhöhten IOP 48 zu kurz genug , Schäden an Zellen zu verursachen. Auch bei Änderungen an dem Verfahren, das Modell verursacht noch schwere Schäden in kurzer Dauer eine akute neuropathische Modell darstellt und nicht als chronische Glaukom Modell 51. Smedowski et al 43 haben eine weitere modifizierte Mikrobead Verfahren unter Verwendung eines zusätzlichen anfänglichen "Hochdruck - Verletzung" vor kurzem entwickelt länger anhaltende IOP Erhebung mit chronischen Schäden zu erreichen , die Hirschkuhs sind vielversprechend. Weitere Studien mit dieser Technik sind notwendig, um weiter dieses Modell zu validieren.

Modelle der chronischen Augenüberdruck Ziel wässrigen Abflusses zu behindern. Laser - Photokoagulation der episklerale und Limbus Adern 52 und episklerale Venenverschluss 53 sind zwei solche Methoden. Es hat sich aber auch , dass Laserablationstechniken 36, nur transient IOP Ansicht und eine moderate Level der tatsächlichen Zellverlust 54-55 erzeugen gezeigt.

Das Glaukom ist eine chronische Erkrankung, die durch Beschädigung und Verlust von retinalen Ganglienzellen, deren Axone den Sehnerv bilden. Der Mechanismus dieser Verlust ist nicht bekannt. Während eine Erhöhung des intraokularen Drucks das Markenzeichen Risikofaktor ist, haben einige die Beteiligung anderer Faktoren vorgeschlagen. Zu diesen Faktoren zählen entzündliche Prozesse, oxidativer Stress, Stoffwechselstörungen, oder Durchblutungsstörungen 56-58. Um den genauen Mechanismus von cel aufzudeckenl Tod bei dieser Krankheit, brauchen die Forscher einfach, wiederholbar und funktionelle Möglichkeiten, um genau Bedingungen Mimik in menschlichen Glaukom erscheinen. Erst dann können die Forscher hoffen, einen Weg zu finden, vor dem Absterben retinaler Ganglienzellen zu schützen. Das Verfahren in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet eine künstlich induzierte Erhöhung des IOP eine graduelle, irreversible Verlust von retinalen Ganglionzellen zu erzeugen ähnlich zu 31 in Glaukom - Patienten gesehen. Das Verfahren ist minimal-invasiv. Signifikante retinaler Ganglionzellen Verlust wird innerhalb eines Monats nach der Operation gemessen. Dieses Verfahren ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung des Glaukoms. Eine potentielle Beschränkung dieses Verfahrens ist die manuelle Injektion von hypertonischer Salzlösung. Aufgrund dieser manuellen Methode ist es möglich, eine große Variabilität in Ergebnisse zu erwarten. Jedoch haben wir die Wirkung Blanchierens in der Vene identifiziert ein kritischer Schritt. Wenn Blanchierung auftritt, retinaler Ganglionzellen Verlust immer zwischen 18 und 29%. Um dies zu unterstützen, werden alle zukünftigen Studien könnte modify die Prozedur Routine IOP - Messungen umfassen , um sicherzustellen , dass diese Injektionen zu einer messbaren Erhöhung des IOD führen. 29,31. Vielleicht ist dieses Modell von RGC Tod wird zur Entwicklung einer vollständigeren neuroprotektive Behandlung führen, die die verheerenden Sehverlust bekämpft weltweit Millionen von Menschen betreffen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

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References

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Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung
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Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

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