Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

גלאוקומה היא מחלה של מערכת העצבים המרכזית הפוגעת בתאי הגנגליון ברשתית (RGCs). אקסונים RGC המרכיבים את עצב הראייה לשאת קלט חזותי למוח עבור תפיסה חזותית. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם מובילה לאובדן ראייה ו / או עיוורון. למרות הגורם הספציפי של גלאוקומה אינו ידוע, גורם הסיכון העיקרי למחלה הוא לחץ תוך עיני מוגבר. גלאוקומה וישכנע נהלים במודלים של בעלי חיים הם כלים רבי ערך לחוקרים לחקור את מנגנון מות RGC. מידע כזה יכול להוביל לפיתוח טיפולים נוירו יעילים שיכולים לסייע במניעת אובדן ראייה. פרוטוקול במאמר זה מתאר שיטה של גרימת גלאוקומה - כמו תנאים במודל חולדה vivo ב שם 50 μl של 2 מלוחים היפרטוני M מוזרק לתוך מקלעת ורידית episcleral. לבנה של הכלי מציינת זריקה מוצלחת. הליך זה גורם לאובדן של RGCs לדמות גלאוקומה. החודש הבאזריקה, חיות מוקרבות ועיניים יוסרו. לאחר מכן, הקרנית, העדשה, זגוגי מוסרים לעשות עיינית. הרשתית היא מקולפת ואז מהחלק האחורי של העין והצמידה על מנות Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. בשלב זה, נוירונים ברשתית יכול להיות מוכתם לניתוח. תוצאות מהמעבדה זה מראים כי כ -25% RGCs הולכים לאיבוד בתוך חודש אחד של ההליך כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת הפנימית. הליך זה מאפשר ניתוח כמותי של מוות תאי הגנגליון ברשתית במודל גלאוקומה עכברוש in vivo.

Introduction

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות עיניים המשפיעות נוירונים ברשתית, במיוחד, התאים הגנגליון ברשתית 1-2. אקסונים של תאים אלה להתכנס על מנת להפוך את עצב הראייה נושא מידע חזותי אל המוח, שם לחזון נתפס. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם ולכן גורם פגמים חזותיים.

מאפייניו העיקריים הקשורים להפרעות גלאוקומה הם RGC ניוון ומוות, לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), וכוסות רוח דיסק אופטי וניוון. תכונות אלה להוביל לאובדן שדה ראייה או מלא, לעיוורון בלתי הפיך. נכון לעכשיו, גלאוקומה גרמה עיוורון ב -70 מיליון אנשים ברחבי העולם 3. ככזה, הוא הוא הגורם השלישי בגודלה בעולם של עיוורון 4.

המנגנון המדויק של מות RGC בגלאוקומה נותר עלום. מחקר רב נעשה כדי לפתוח את התעלומה. זה ידוע, עם זאת, כי גורם הסיכון העיקרי של גלאוקומה היא תגדילn לחץ תוך עיני עקב זרימה סדירה הומור מימי (AH) בחדר הקדמי של העין. AH פועל כתחליף שקוף וחסר צבע לדם בתא avascular הקדמי של העין. היא מזינה את התאים הסובבים אותו, מסיר פסולת המופרשים תהליכים מטבוליים, משלוחים נוירוטרנסמיטורים, ומתירה את זרימת סמי תאים דלקתיים בתוך העין במהלך מצבי פתולוגיים 1.

התחזוקה של זרימת הומור מימית כרוכה הגוף ריסי ואת meshwork trabecular. הומור מימי מיוצר על ידי הגוף ריסי. לאחר מכן הוא זורם לתוך החדר הקדמי כדי לשמור על הבריאות הכללית של רקמות העין. 75 - 80% יצוא הומור מימי מופרשים באופן פעיל באמצעות אפיתל ריסי הלא פיגמנט כאשר הנוזל מסונן דרך שלוש שכבות של מרקם ספוגי בשריר הריסים. יציאות הנוזל דרך meshwork trabecular ודרך התעלה של Schlemm אשר ולרומםies לתוך מערכת הדם 5 .the הנותרים 20 - 25% של יצוא עוקף את meshwork trabecular ומופרש באופן פסיבי על ידי אולטרה סינון ודיפוזיה דרך מסלול uveo-scleral. מסלול זה מופיע להיות עצמאי יחסי של לחץ תוך עיני 1.

כאשר ייצור הומור מימי ו יצוא נמצא מחוץ איזון, לחץ בונה בתוך העין. כאמור, זו עלייה בלחץ התוך עיני הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות גלאוקומה. לחץ כזו גורמת נזק שכבות סבוכה של נוירונים ברשתית בחלק האחורי של העין. פגיעת אקסונים תא גנגליון ברשתית של עצב הראייה גורמת למוח כבר לא מקבל מידע חזותי מדויק. כתוצאה מכך, תפיסת החזון אבדה עיוורון מוחלט יכול להתרחש.

נכון להיום, אין תרופה לגלאוקומה. שיטות טיפול שונות קיימות בעיקר שמטרתם להפחית לחץ תוך עיניים. אלה כוללים אקטואלייםכיתות תרופות כגון חוסמי הקולטן-אדרנרגיים beta1, או אנלוגים פרוסטגלנדין אקטואליים. חוסמי ביתא להפחית את הלחץ התוך עיני על ידי הפחתת הייצור של הומור מימית 7. פרוסטגלנדינים לתפקד להפחית IOP ידי הגדלת היצוא של הומור מימי 8-14. אגוניסטים אלפא אדרנרגיים ומעכבי anhydrase פחמתית משמשים גם כאמצעי משני של הטיפול. אגוניסטים אדרנרגיים אלפא להגדיל יצוא דרך מסלול uveoscleral 15-17. מעכבי anhydrase פחמן להפחית את ייצור AH ידי עיכוב אנזימטי 18. הרבה יותר פרוצדורות פולשניות גם נמצאות בשימוש לטיפול בגלאוקומה. Trabeculoplasty לייזר משמש כדי להגדיל את תזרים הומור מימית 19. עוד טיפול כירורגים, שנקרא trabeculectomy, יוצר אתר ניקוז אלטרנטיבה לסנן AH כאשר מסלול trabecular המסורתי חסום 20-21.

אפשרויות טיפול אלה היו ידועים EFFectively להפחית IOP. עם זאת, עד 40% של מחלת גלאוקומה להראות לרמות נורמליות IOP מה שמעידים על צורך בשיטות טיפוליות שלמות יותר. 22,23 בנוסף, מוות של תאי הגנגליון ברשתית לראות גלאוקומה הוא בלתי הפיך פעם זה מתחיל וטיפולים נוכחיים לא לעצור את התקדמות המחלה 24-28. זה הדגיש את הצורך טיפולים נוירו יעילים הממקדים ההישרדות של הנוירונים עצמם. פיתוח דגמי גלאוקומה הוא קריטי להתפתחות זו.

במחקר זה אנחנו מפגינים שיטה של גרימת תופעות כמו-גלאוקומת חולדות מבוגרות לונג אוונס באמצעות הליך שונה המפורטים במקור על ידי מוריסון 29. בהליך זה, זריקות של 2 M מלוחים היפרטוני לתוך מקלעת ורידית episcleral גורם תנאים כמו-גלאוקומה על ידי הצטלקות רקמת להפחית יצוא הומור מימית של meshwork trabecular מה שמוביל לעלייה בלחץ התוך עיני ואת אובדן משמעותי של RGCs within חודש של ההליך 30-31. גלאוקומה וישכנע נהלים, כגון זה המתואר כאן, עשויים להיות המפתח לפיצוח פיתוחים חדשים טיפולי גלאוקומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים באמצעות בנושאים בעלי חיים היו בהתאם לסטנדרטים של לשכת טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת מערב מישיגן.

1. בעלי חיים

  1. השתמש חולדות זכרים ונקבה גיל 3 חודשים במחקר זה.
  2. שמור חיות באור 12 hr / חושך מחזור עם גישה חופשית למזון ומים.

2. הכנת קוקטייל KAX עבור הרדמת בעלי החיים

  1. ממיסים 50 מ"ג xylazine (20 מ"ג / מ"ל) ב 5 מ"ל קטמין (100 מ"ג / מ"ל) עם 1 מ"ל acepromazine (10 מ"ג / מ"ל) ו 3 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב.
  2. לעקר עם מסנן מזרק לאחסן את הפתרון הזה לתוך בקבוק סרום 10 מ"ל.

3. הזרקת KAX

  1. לשקול בעלי חיים (ז) ולהחזיר לכלוב עד מוכן להזרקה.
  2. להזריק 0.1 מ"ל KAX / 100 גרם משקל גוף החיה intraperitoneally, באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28 G.
  3. להתירעבור החיה איבד את הכרתו. בדוק רפלקסים ידי צובט את הרגליים והזנב.
  4. שמור את כל החיות בשלום במעבדה למשך הניתוח.
  5. לאחר הניתוח, להחליף חיות לתוך הכלובים שלהם ולשמור נוח RT עד התודעה הוא חזר. רק לחזור חיות למתקן חיה כאשר החיות להתעורר ולחדש התנהגות נורמלית.

4. הכנה לכירורגיה ו microneedle אסיפה

  1. בצע פתרון 2 M NaCl סטרילי.
  2. השתמש חולץ microelectrode (תרשים 1C) כדי למשוך קוטר פנימי אחד 0.86 מ"מ סטנדרטי כבד מלוטשים צינור בורוסיליקט חומה דקה לשתי microneedles זכוכית קוני דק (איור 1D, איור 1E).
  3. למילוי microneedle אחד מהשלב הקודם עם 2 M מלוחים באמצעות מחט ומילוי מזרק מזרק 1 מ"ל (איור 1B). הקש החוצה בועות אוויר מהקצה של האלקטרודה.
  4. ממלאים מזרק השני 1 מ"ל עם 2 MNaCl. חבר מחט 18 G ולאחר מכן לצרף אורך (כ 10 אינץ ') של (איור 1 א) צינורות פוליאתילן. השתמש בוכנת המזרק כדי למלא את צינורות פוליאתילן עם מי מלח דרך המחט.
  5. כאשר הן microneedle הצינורות מלאים מלוח, בזהירות לחבר את השני. הוצא כל אוויר הקשר ביניהם (איור 2).
  6. דק שפוע קצה microneedle על ידי גירוד זה מאוד קל נגד הזרם של מגבת נייר כמובן.
  7. בדוק את ההתנגדות של microneedle ידי דחיפת הבוכנה בעדינות על המזרק עד זרם של נוזל בסדר ניתן לראות על מגבת נייר. זרם הנוזל צריך להיות לא יותר מ -0.5 מ"מ.

5. הכנת בעלי חיים

  1. החל 1 - 2 טיפות הרדמה מקומית כדי קרני (פתרון העיניים Hydrochloride Proparacaine, USP, 0.5%). מתן עד לא רפלקס עינית מתרחש.
  2. חתוך שפם עם מספריים.
  3. Saturate מוליך עצת כותנה עם פתרון בבטאדין ואזור ספוגי סביב העין הניסיונית.
  4. באמצעות מיקרוסקופ, לצרף hemostat כדי לצבוט את העפעף התחתון לתפוח העין, לחשוף את וריד episcleral ולהגביל תנועת העין. (איור 3, ראש חץ)

6. הזרקת גלאוקומה ותשכנע מלוחה

  1. כאשר הרכבת microneedle והחיה ערוכות, להתחיל זריקות.
  2. כאשר החיה אישר שלא להגיב על רגליו / זנב קמצוץ, לנקב את הווריד episcleral בזהירות עם microneedle ידי בא בזווית נמוכה בין 10 ל -20 מעלות אל הווריד (איור 3, חץ לבן). נקב מוצלח לווריד לעין בעת דם נכנס קצה microneedle (איור 3, חץ שחור).
  3. לאט באופן ידני להזריק כ 50 מלוחים μl לווריד. זה אמור לקחת בערך 10 שניות. הוורידים יהיה לבן מחוויר כמו מלח מפיצה throאיכס כלי הדם (איור 4, ראש החץ). אזורים מסוימים עשויים לשמור על חזות אדומה דם (איור 4, חץ).
    1. בצע זריקה שנייה לווריד, מול לאתר של הראשון, כדי להבטיח פגיעה ברשתית יסודית כדי שכבת תא גנגליון ברשתית השלמה.
      הערה: בתוך דקות, אחד צריך לראות עכירות ברורות דרך קשתית העין כמו המלח מפיץ באמצעות מערכת כלי הדם.
  4. השאר את העין מול מטופל לצורך הקמת בקרה פנימית.

7. שחזור בעלי חיים

  1. הסר את hemostat.
  2. השתמש מוליך כותנה ליישם משחה אנטיביוטית משולשת (אבץ Bacitracin, סולפט neomycin, סולפט B polymysin) לאתר הדק ידי hemostat וכדי מוזרקים. נזק לרקמות סביב העין אינה מתרחשת באמצעות hemostat.
  3. > חיות הרדימו מקום בכלובים שלהם על שמיכת מים חמה במחזור כדי קודמותהיפותרמיה אף אוזן גרון. לשמור על חיות תחת השגחה עד תודעת התנהגות נורמלית הם שהעלו. הובלת בעלי חיים ערים בחזרה למושבה החיה. בעלי החיים להישאר במושבה עד הזמן של קרבה.

8. קרבנות והסרה רשתית

  1. חודש לאחר ההליך לגרום גלאוקומה, בעלי חיים מומתים בחנק CO 2 ו לנקב החזי משנית.
    1. מניחים את החיה בחדר ולשים את המכסה על מאובטח.
    2. פתח את שסתומי CO 2 ו רגולטור גז כדי לאפשר נפח 20% / min CO 2 עקירה של חמצן בתא.
    3. אפשר ארבעה עד 5 דקות עבור החיה לפוג.
    4. כבה את השסתומים.
    5. הסר חיה מהאולם לבצע ניקור בית החזה משני עם אזמל סטרילי.
  2. לאחר המתת חסד, ובעזרת אזמל לחתוך את רקמת החיבור בתוך חלל מסלולית סביב העין, being להיזהר לא לחתוך לתוך גלגל העין עצמו.
  3. בזהירות להשתמש במספרי קצה מעוקלים לחתוך את עצב הראייה וכל רקמה הנותרים כדי לחלץ את גלגל העין השלמה. מניח גלגל עין חילוץ בצלחת פטרי הפנויה 60 מ"מ x 15 מ"מ סטרילי המכילה PBS הטרי.
  4. תן עיינית של גלגל העין. לשם כך, לעשות חתך קטן עם האזמל רק אחורי לגבול בין הקשתית בלובן העין. בצע חתך זה סביב ההיקף של העין עם מספריים באביב קטנים להסיר את האונה הקרנית של גלגל העין. ההמיספרה מחובר עצב הראייה נשאר.
  5. מצא רשתית ורודה / הבז 'דקה מאוד בתוך עיינית מן החיה המורדמת. החזק את שכבת פיגמנט של הרשתית עם מלקחיים קהים לייצב עיינית. השתמש עוד זוג מלקחיים סגורים מאוד להקניט הרשתית השלמה השלמה בעדינות מעל החלק האחורי של העין. הימנע צובט, מושך, או מושך הרשתית ישירות.
  6. השתמש במספרי מעיין קטנים כדי לחתוך אתהאזור שבו עצב הראייה עדיין מחוברת הרשתית.
  7. הקפידו לחתוך משם כל אפיתל הפיגמנט שיורית או רקמות scleral מהרשתית.
  8. בעזרת פיפטה העברה, בעדינות מאוד להעביר את הרשתית המבודדת על sylgard נקי מצופה 35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי המכילה PBS הטרי.

9. הכנת רשתית כל ההר

  1. לאחר בצלחת sylgard, להשתמש במלקחיים ומחט קקטוס אחד להצמיד את הרשתית במקום. שמור את שכבת התאים הגנגליון ברשתית פונה כלפי מעלה עצב הראייה למטה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי.
  2. השתמש במספריים קטנים לחתוך את הרשתית לארבעה רבעים, מה שהופך את הצורה של תלתן בעל ארבעה עלים קורן ראש עצב הראייה.
  3. הצמד את הרביעים של הרשתית עם מחטי קקטוס נוספות כדי להפוך את הרשתית שטוחה ככל האפשר without מתיחה (איור 5).
  4. תקן את הרשתיות הצמיד בצלחת Sylgard עם 3 מ"ל של 4% paraformaldehyde O / N ב RT.

10. נוגדן מכתים של הרשתית

הערה: רשתיות קבועות כתם עם נוגדנים ראשוניים ומשניים לצפייה נוירונים ברשתית (איור 6).

  1. לשטוף קבועים, רשתיות שטוחות רכוב שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד ב PBS.
  2. Permeabilize את הרשתיות עם 1% טריטון X-100 עם בסרום שור עוברי 1% ב PBS במשך 60 דקות.
  3. לשטוף רשתיות שלוש פעמים, 2 דקות כל אחד, ב- PBS.
  4. יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף.
  5. יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף.
  6. דגירה עם 1% טריטון X-100 ו בסרום שור עוברי 1% PBS ב RT במשך 45 דקות.
  7. יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף.
  8. יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף.
  9. דגירה כל רשתית בסרום שור 3 מיליליטר 1% עוברי ב- PBSעם CD90 אנטי עכברוש עכבר מטוהר / העכבר CD90.1 (1: 300 דילול) O / N ב RT.
  10. לשטוף רשתיות פעם עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 5 דקות.
  11. יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף.
  12. דגירה כל הרשתית ב 3 מ"ל PBS (לא FBS) עם IgG עז משנית אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכבר (1: 300) O / N ב RT.
  13. לשטוף רשתיות עם PBS בנדיבות.
  14. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר בזהירות מחטי קקטוס מהרשתית.
  15. בעדינות להעביר רשתיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם טפטפת העברה. הקפד לשמור על האוריינטציה עם שכבת תא גנגליון ברשתית מופנה כלפי התקרה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי.
  16. ספוג כל PBS עודף עם KimWipe או חומר סופג כגון אחרים. היזהר שלא לספוג את הרשתית.
  17. הוסף 5 טיפות של ½ גליצרול ½ PBS לפי משקל כמו בבוקרתקשורת ounting.
  18. מכסי רשתית עם coverslip, הימנעות בועות אוויר.
  19. coverslip מאובטח באמצעות לק ברור, דבק, או דבק אחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סעיף זה ממחיש את מרכיבי מנגנון הליך המשמשים כדי לעודד תנאים דמויי גלאוקומה במודל גלאוקומה in vivo חולדה. אנחנו מראים את הכלים הפרט וציוד המשמשים לבצע הזרקת סליין היפרטוני הגורמת לעלייה בלחץ התוך עיני. אנו מציגים את ההזרקה לתוך המקלעת ורידית episcleral עם האפקט הלבן המאפיין שלה ואת העכירות של הלשכה הקדמית שנוצרו כתוצאה מכך. כמו כן, אנו מתארים את התהליך של הסרת רשתית שטוחת הרכבת ניתוח הרכב אבד RGCs. לבסוף, אנו מראים את ההשפעות של ההזרקה על הישרדות תא גנגליון ברשתית. כמו חלוקת RGCs אינה אחידה באזורים שונים של רשתית העכברוש, תמונות מתקבלות ארבעה 200 מיקרומטר 2 אזורים בכל רשתית, 4 מ"מ מהמרכז של ראש עצב הראייה. המספר הכולל של RGCs שכותרתו 1.1 Thy בכל סעיף נספר, בממוצע ולעומת ב ניסיוני contr ol רשתיות 31. באמצעות שיטה זו, ספירות RGC השתנו מממוצע של 225 בתמונת תנאי קבוצת ביקורת של 168 חודש לאחר ההליך כדי לגרום תנאי גלאוקומה דמוית (N = 30). יחדיו, את ההנחיות המתוארות כאן ניתן בעקבות צעד אחר צעד כדי לנתח את מותו של גופים אקסונים תא גנגליון ברשתית.

איור 1
איור 1. רכיבי microneedle. (א) מזרק עם צינורות פוליאתילן המשמשים להזרקה מלוחה. (ב) מזרק מילוי חוזר בשימוש לבצע מילוי חוזר של microneedle בורוסיליקט. (C) Narishige אלקטרודה חולץ המשמש לייצור microneedles בורוסיליקט. (ד) אלקטרודות זכוכית בורוסיליקט לפני ואחרי שנגרר ב האלקטרודה חולץ. (E) יתגדל לאור קצה מחט microelectrode לאחר שנגרר."Target =" ftp_upload / 53,831 / 53831fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שלם microneedle עצרת. Microneedle מצורפת צינורות פוליאתילן מצורפים מזרק עם מי מלח היפרטוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. גלאוקומה ותשכנע הזרקת תמיסת מלח לתוך Episcleral ורידי מקלעת. תמונה של הזרקה מלוחה לוריד episcleral של חיה, מורדמת לונג אוונס חולדה. ראש החץ מצביע על מיקומו של hemostat בשימוש לתפוח העין ולמנוע את תנועתה. החץ הלבן מצביע על מיקומו של הווריד המוזרק. החץ השחור תערוכות בחזרה דם זורם לתוך קצה microneedle המציין לנקב וריד מוצלח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. לבנת שפעת היפרטוני מלוחה הזרקה. תמונה של עין עכברוש שהוזרק לו מלוחים היפרטוני. ראש החץ מראה את ההשפעה הלבנה אופייני מלוחים מקלעת ורידית episcleral. החץ מצביע על החלק של מקלעת ורידית episcleral שלא החוויר עדיין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

31 / 53831fig5.jpg "/>
איור 5. שטוח הר חולדת הרשתית. תמונה של רשתית הר שלמה הוסרה מן עין העכברוש וצמיד שטוח בצלחת Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. החץ השחור מציין את ראש עצב הראייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
נזק איור 6. לתאי גנגליון רשתית לאחר ניתוח וישכנע גלאוקומה. השוואה בין עין קבוצת הביקורת (א) בעין ניסיוני (B) חודש לאחר קבלת גלאוקומה התרמה הזרקת מי מלח. הרשתיות תויגו עם נוגדן כנגד סמן RGC, Thy 1.1 (CD90). חיצי Thin מצביעים RGCs הפרט הוא מלא תנאי ניסוי. ההליך מוביל לירידה במספר RGCs, דהfasciculation של אקסונים את חבילות האקסון הראשי, ועיוות את המעגליות של RGCs הנותרים. החיצים החלולים לציין את האקסונים מאפיין defasciculating הנובעים הזרקת מי מלח. ראש החץ מצביע על כלי דם בתוך הרשתית. חבילות האקסון תווית חיצי פעמים הסתיימו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה של גרימת תנאים כמו-גלאוקומה במודל חולדה vivo. הליך זה משתמש זריקה של תמיסת מלח היפרטוני לגרום הצטלקות של meshwork trabecular 29, 32. פיתוח רקמה צלקתית עלולות לחסום את יצוא הומור מימי אשר מגביר את הלחץ בלשכה הקדמית. עם יצוא ולחץ ירד להצטבר, העדשה מושעה על ידי רצועות אלסטי דוחפת חזרה לתוך תא זגוגי. הומור זגוגי אז המפעיל לחץ על הרשתית נזק נוירונים ברשתית שברירי. התוצאות שלנו באמצעות הליך זה להראות כי מספרי תא גנגליון ברשתית מתחילים להתדלדל ב 2 שבועות עם אובדן משמעותי של אובדן תא גנגליון ב-הליך פוסט 1 חודש.

פרוטוקול זה הוא רק שיטה אחת של גרימת גלאוקומה במכרסמים. ישנם דגמים ניסיוניים רבים אחרים בהם נזק לתאי הגנגליון ברשתית מושגת באמצעות לעלייה בלחץ התוך עיני או על ידי דה ישירהקוסם אל עצב הראייה 30. לעתים קרובות, שיטות אלו פותחו בבעלי חיים גדולים ו שונה עבור יישום לעכברים וחולדות 33. זריקות תוך-עיניות של רעלים כגון staurosporine 34 ו NMDA, הקבלת גלוטמט הלא hydrolyzable 35 לגרום למות תא גנגליון מהיר רשתית. מחקרים הראו, עם זאת, כי רעלים כגון לעקוב אחרי עקומת מנה-תגובה בעכברים ותאים השפעה מלבד תאי גנגליון היעד 35. בנוסף, הנזק לתאי הגנגליון ברשתית במודל זה הוא הרבה יותר ישיר מאשר התקדמות הדרגתית של גלאוקומה האדם.

נזק ישיר אל עצב הראייה יכול להיגרם גם. Axotomy הליזר הוא דרך נפוצה כדי לנתק את האקסונים המרכיבים את עצב הראייה בעכברים 36. עם זאת, שיטה זו מציגה כמה סיבוכים. גודלו הקטן של מסלולים מכרסם מקשה על נזק לעצב הראייה במדויק מבלי להשפיע זרימת הדם דרך העורק המרכזי של הרשתיתו וריד. כדי להתגבר על זה, כמה חוקרים לנצל גישה פולשנית יותר בנוגע להסרה של חלק קטן של המוח על מנת לספק גישה טובה יותר עצב הראייה 37. מודלים למחוץ עצב הראייה לגשת עצב הראייה intraorbitally גם כן. במודל זה, העצב הוא צבט ידי מלקחי סגירה עצמית ואת זרימת דם עיני לא נפגע. הליך זה גורם עלבון מיידי ומוות סינכרוני של תא גנגליון ברשתית. מחקרים שעשו שימוש במודל זה הראה אובדן משמעותי של RGCs 38. עם זאת, יש הטוענים כי היא עלולה לגרום יותר נזק מאשר לנזקים שנגרמו עקב IOP גבוהות לבד 39. בנוסף, גלאוקומה מאופיין איטי, מתמשך, אובדן אסינכרוני של תאי גנגליון ברשתית 33, 39-42 .לכן, במהלך זמן המנגנון הבסיסי של נזקים הנגרמים עם למחוץ עצב הראייה יכול להיות שונה לגמרי מזה המתרחשים גלאוקומה האדם. לעומת זאת, המודל שנדון במאמר זה ימנע את הצורך acce ישירהss בעצב הראייה, מבטל כל דיסקציה של רקמת המוח, ומאפשר ניזק תא גנגליון ברשתית הדרגתי.

מודלי חסימת Microbead קלקר גלאוקומת שימוש או חרוזים מגנטיים מוזרקים לתוך התאים הקדמיים של חולדות או עכברים לרומם IOP. רוב העבודה זה כבר נעשה בעכברים והם מראים רק נמוכים עד בינוניים של ניזקי עצב הראייה עם שונות גבוהות של התוצאות ונתונים עקביים 43-50. בעת שימוש חולדות, משך IOP מוגבה היה קצר מכדי לגרום מספיק נזק לתאים 48. אפילו עם שינויים הנוהל, המודל עדיין גרמה לנזק חמור משך קצר המייצג מודל נוירופתי חריפה מאשר מודל גלאוקומה כרונית 51. Smedowski ואח 43 לאחרונה פיתחנו תהליך microbead שופר עוד יותר באמצעות 'פגיעה בלחץ גבוה "הראשונית נוסף כדי להשיג יותר מתמיד העלאת IOP עם נזק כרוני כי איילהמופע הבטחה. מחקרים נוספים באמצעות טכניקה זו נחוצים נוסף כדי לאמת את המודל הזה.

מודלים של יתר לחץ דם עיניים כרוני שואפים להכשיל יצוא הומור מימי. Photocoagulation לייזר של episcleral וורידים לימבלית 52 ו חסימה בווריד episcleral 53 שתי שיטות כאלה. עם זאת, זה גם הוכח כי טכניקות אבלציה לייזר לייצר העלאת IOP חולף בלבד בעוצמה בינונית של אובדן התא בפועל 36, 54-55.

גלאוקומה היא מחלה כרונית כתוצאה מנזקים ואובדן תאי הגנגליון ברשתית אשר אקסונים שמרכיבים את עצב הראייה. המנגנון של הפסד זה אינו ידוע. בעוד לעלייה בלחץ התוך עיני הוא סימן ההיכר גורם הסיכון, טענו חלק מעורבותם של גורמים אחרים. גורמים אלה כוללים תהליכים דלקתיים, סטרס חמצוני, אי סדירות מטבולית, או הפרעות בזרימת הדם 56-58. על מנת לחשוף את המנגנון המדויק של cell מוות במחלה זו, חוקרים צריכים דרכים פשוטות, דיר, ופונקציונליות לתנאים לחקות במדויק המופיעים גלאוקומת אדם. רק אז יוכלו חוקרים למצוא דרך כדי להגן על תאים הגנגליון ברשתית מהמוות. ההליך המתואר במאמר זה משתמש העלאה שנגרמה באופן מלאכותי של IOP לייצר אובדן הדרגתי, בלתי הפיך של תאי גנגליון רשתית דומים לזו שנצפתה בקרב חולים בגלאוקומה 31. הנוהל הוא פולשנית. פסד תא גנגליון ברשתית משמעותי נמדד תוך חודש מיום הניתוח. שיטה זו היא כלי משמעותי אחד לחקר הגלאוקומה. מגבלה פוטנציאל של שיטה זו היא ההזרקה הידנית של מלוחים היפרטוני. בגלל שיטה ידנית זה, אפשר לצפות שונה גדול בתוצאות. עם זאת, זיהינו את האפקט הלבן בווריד להיות צעד קריטי. אם הלבנה מתרחשת, אובדן תא גנגליון ברשתית היא תמיד בין 18 ו -29%. כדי לתמוך בכך, כל המחקרים בעתיד יכולים מודיםפ.י. ההליך לכלול מדידות לחץ תוך עיני שגרתית על מנת להבטיח כי זריקות אלו להביא לעלייה למדידה בלחץ תוך עיני. 29,31. אולי המודל הזה של המוות RGC יוביל לפיתוח טיפול נוירו שלם יותר כי להילחם בתופעת אובדן ראייה הרסנית להשפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

רפואה גיליון 109 חולדה גלאוקומה זריקה, הרשתית כל הר שטוח הר מדעי המוח תאי הגנגליון ברשתית יתר לחץ דם עינית מחלות עיניים
גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter