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Medicine

Glaucoma de indução de Procedimento em um Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831

Abstract

O glaucoma é uma doença do sistema nervoso central que actua nas células ganglionares da retina (RGCs). axônios RGC que compõem o nervo óptico carregam informação visual ao cérebro para a percepção visual. Danos para CGR e seus axónios leva a perda de visão e / ou cegueira. Embora a causa específica do glaucoma é desconhecida, o factor de risco principal para a doença é uma pressão intra-ocular elevada. procedimentos de indução de glaucoma em modelos animais são uma ferramenta valiosa para os investigadores que estudam o mecanismo da morte das CGR. Tal informação pode levar ao desenvolvimento de tratamentos neuroprotectores eficazes que podem auxiliar na prevenção da perda de visão. O protocolo no presente documento descreve um método de indução de glaucoma - como condições em um modelo de rato in vivo, onde 50 ul de 2 M solução salina hipertônica é injetado na plexo venoso episcleral. Descascamento dos vasos indica injecção bem sucedida. Este procedimento causa a perda de CGR para simular o glaucoma. Um mês seguinteinjecção, os animais são sacrificados e os olhos são removidos. Em seguida, a córnea, lente, e são removidos do vítreo para fazer uma ocular. A retina é então desenrolada a partir da parte posterior do olho e fixado em placas de Sylgard utilizando agulhas cacto. Nesta altura, os neurónios da retina pode ser corada para análise. Os resultados deste laboratório mostram que aproximadamente 25% dos RGCs são perdidos dentro de um mês do procedimento em relação aos controles internos. Este procedimento permite a análise quantitativa da morte das células ganglionares retinais num modelo de glaucoma em ratos in vivo.

Introduction

O glaucoma é um grupo de doenças dos olhos que afectam os neurónios da retina, em particular, as células ganglionares da retina 1-2. Os axónios dessas células convergem para tornar-se o nervo óptico que transporta a informação visual para o cérebro onde a visão é percebida. Danos para CGR e seus axónios, por conseguinte, provoca defeitos visuais.

As principais características associadas a distúrbios de glaucoma são degeneração RGC e da morte, aumento da pressão intra-ocular (PIO) e escavação do disco óptico e atrofia. Estas características levam a perda de campo visual ou completa, cegueira irreversível. Atualmente, o glaucoma tem causado cegueira em 70 milhões de pessoas em todo o mundo 3. Como tal, é a terceira maior causa mundial de cegueira 4.

O mecanismo exato da morte RGC em glaucoma permanece desconhecida. Muita investigação tem sido feito para desvendar o mistério. Sabe-se, no entanto, que o factor de risco primário de glaucoma é um aumento iN pressão intra-ocular devido à circulação irregular de humor aquoso (AH) na câmara anterior do olho. AH actua como um substituto transparente e incolor para o sangue na câmara anterior avascular do olho. Ela alimenta as células vizinhas, remove os resíduos segregadas a partir de processos metabólicos, transporta neurotransmissores, e permite a circulação de drogas e células inflamatórias dentro do olho durante estados patológicos 1.

A manutenção da circulação de humor aquoso envolve o corpo ciliar e a malha trabecular. O humor aquoso é produzido pelo corpo ciliar. Em seguida, flui para a câmara anterior para manter a saúde geral do tecido ocular. 75-80% do fluxo de humor aquoso é segregado activamente através do epitélio ciliar não pigmentada, quando o fluido é filtrado através de três camadas de tecido esponjoso no músculo ciliar. As saídas de fluido através da malha trabecular e através do canal de Schlemm que apropriaçãos para o sistema sanguíneo 5 .A restantes 20 - 25% do escoamento ignora a malha trabecular e é passivamente segregada por ultrafiltração e a difusão através da via uveo-escleral. Esta via parece ser relativamente independente da pressão intra-ocular 1.

Quando a produção de humor aquoso e saída estão fora de equilíbrio, a pressão aumenta dentro do olho. Como foi dito, este aumento na pressão intra-ocular é o principal factor de risco no desenvolvimento do glaucoma. Essa pressão faz com que dano para as camadas intrincadas de neurónios na retina na parte posterior do olho. Danos aos axônios de células ganglionares da retina do nervo óptico leva o cérebro a não receber mais informação visual precisa. Como resultado, a percepção de visão é perdida e pode ocorrer cegueira completa.

Até à data, não existe cura para o glaucoma. Existem métodos de tratamento diferentes que visam principalmente para reduzir a pressão intra-ocular. Estes incluem tópicaclasses de medicamentos, tais como bloqueadores do receptor beta 1-adrenérgicos, ou análogos de prostaglandinas tópicos. Bloqueadores beta reduzem a pressão intra-ocular através da diminuição da produção de humor aquoso 7. Prostaglandinas funcionar para reduzir a pressão intra-ocular através do aumento da drenagem do humor aquoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa e inibidores da anidrase carbónica, também são utilizados como métodos de tratamento secundário. Alfa agonistas adrenérgicos aumentar a vazão através da via uveoscleral 15-17. Inibidores da anidrase carbónica reduzem a produção de AH por inibição enzimática 18. Muito mais procedimentos invasivos, também estão a ser usadas para tratar o glaucoma. Trabeculoplastia a laser é usado para aumentar a drenagem do humor aquoso a 19. Outra terapia cirúrgica, chamada trabeculectomia, cria um local de drenagem alternativa para filtrar AH quando a via trabecular tradicional está bloqueada 20-21.

Estas opções de tratamento têm sido conhecida a EFFectively reduzir a PIO. No entanto, até 40% dos pacientes de glaucoma mostram níveis normais de PIO que indica uma necessidade para métodos terapêuticos mais completos. 22,23 Além disso, de células ganglionares da retina morte visto no glaucoma é irreversível uma vez que começa e tratamentos actuais não parar a progressão da doença 24-28. Este pôs em evidência a necessidade de terapias neuroprotetoras eficazes que visam a sobrevivência dos próprios neurônios. Desenvolvimento de modelos de glaucoma é fundamental para esse desenvolvimento.

Neste estudo, estão a demonstrar um método de induzir efeitos glaucoma semelhante em ratos Long Evans adultos utilizando um procedimento modificado descrito originalmente por Morrison 29. Neste procedimento, as injecções de 2 M de solução salina hipertónica no plexo venoso episcleral induz condições glaucoma semelhante por tecido cicatricial para reduzir a saída de humor aquoso na malha trabecular que conduz a um aumento na pressão intra-ocular e uma significativa perda de CGR Within de um mês após o procedimento 30-31. procedimentos de indução de glaucoma, como o aqui descrito, pode ser a chave para desvendar novos desenvolvimentos em tratamentos de glaucoma.

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Protocol

Todos os procedimentos que utilizam indivíduos animais têm sido de acordo com as normas do Institute of Animal Care e Use Committee (IACUC) na Western Michigan University.

1. Os animais

  1. Utilizar ratos do sexo masculino e feminino de 3 meses de idade no presente estudo.
  2. Manter os animais em um 12 hr ciclo de luz / escuro, com livre acesso a comida e água.

2. Preparação de KAX Cocktail para anestesia animal

  1. Dissolve-se 50 mg de xilazina (20 mg / ml) em 5 ml de cetamina (100 mg / ml) com 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) e 3 ml de água destilada. Homogeneizar.
  2. Esterilizar com um filtro de seringa e armazenar desta solução para um frasco de soro de 10 ml.

3. Injeção KAX

  1. Pesar animais (g) e de regresso ao compartimento até que esteja pronto para a injecção.
  2. Injectar 0,1 mL KAX / 100 g de peso corporal do animal intraperitonealmente, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 28 g.
  3. Permitirpara animal a ficar inconsciente. Verifique reflexos por beliscar os pés e cauda.
  4. Mantenha todos os animais de forma segura em laboratório para a duração da cirurgia.
  5. Pós-cirurgia, substituir animais em suas jaulas e manter confortável em RT até que a consciência é recuperada. retornar apenas animais para a instalação de animal quando os animais despertar e retomar o comportamento normal.

4. Preparação para a cirurgia e Montagem Microneedle

  1. Adicione uma solução 2 M de NaCl estéril.
  2. Use um extrator de microeletrodos (Figura 1C) para puxar um diâmetro interno de 0,86 mm padrão polido pesado e fino tubo de borosilicato murada em duas microagulhas de vidro finamente cônicos (Figura 1D, Figura 1E).
  3. Backfill uma micro-agulha do passo anterior com 2 M de soro fisiológico usando uma agulha de seringa de aterro e uma seringa de 1 ml (Figura 1B). Toque as bolhas de ar a partir da ponta do eletrodo.
  4. Encha uma segunda seringa de 1 ml com 2 MNaCl. Ligue uma agulha G 18 e, em seguida, anexar um comprimento (aproximadamente 10 polegadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilizar o êmbolo da seringa para encher o tubo de polietileno com uma solução salina através da agulha.
  5. Quando tanto a micro-agulha e o tubo são cheios com uma solução salina, ligar cuidadosamente os dois. Eliminar qualquer ar na ligação entre os mesmos (figura 2).
  6. Finamente bisel a ponta do microneedle raspando muito levemente contra o grão de uma toalha de papel claro.
  7. Verificar a resistência da micro-agulha empurrando suavemente o êmbolo da seringa até um bom fluxo de líquido pode ser visto na toalha de papel. O fluxo de líquido não deve ser maior do que 0,5 mm.

5. Preparação de animais

  1. Aplicar 1 - 2 gotas de anestésico tópico à córnea (Anestalcon Solução Oftálmica, USP, 0,5%). Espere até que não ocorra nenhum reflexo ocular.
  2. Aparar bigodes com uma tesoura.
  3. Saturate um aplicador de ponta de algodão com solução de betadine e área de cotonete ao redor do olho experimental.
  4. Usando um microscópio, anexar uma pinça hemostática para apertar a pálpebra inferior a protuberância do olho, expor a veia episcleral e restringir o movimento dos olhos. (Figura 3, seta)

6. Injecção salina de indução de glaucoma

  1. Quando o conjunto de microagulhas eo animal são preparados, começam injeções.
  2. Quando o animal está confirmado para ser insensível à pitada pés / cauda, ​​perfurar cuidadosamente a veia episcleral com a micro-agulha, vindo em um ângulo baixo entre 10 e 20 graus para a veia (Figura 3, seta branca). Um punção de sucesso na veia é aparente quando o sangue entra na ponta da micro-agulha (Figura 3, seta preta).
  3. Lenta e manualmente injetar cerca de 50 salinas ul na veia. Isso deve levar cerca de 10 segundos. As veias vai branco blanch como o sal circula through a vasculatura (Figura 4, ponta de seta). Algumas regiões podem manter uma aparência vermelhas do sangue (Figura 4, seta).
    1. Executar uma segunda injecção na veia, do lado oposto ao local da primeira, para assegurar a completa danos na retina para a camada de células ganglionares da retina completa.
      Nota: Dentro de minutos, deve-se ver um aspecto turvo distinta através da íris do olho como o sal circula através do sistema vascular.
  4. Deixar o olho contralateral não tratado para ser utilizado como um controlo interno.

7. Recuperação de Animais

  1. Remover a pinça hemostática.
  2. Use um aplicador de algodão para aplicar pomada antibiótica tripla (bacitracina de zinco, sulfato de neomicina, B sulfato de polymysin) para o site preso pela pinça hemostática e locais de injecção. danos nos tecidos ao redor dos olhos não ocorre usando a pinça hemostática.
  3. > Place anestesiados animais em suas jaulas em um cobertor água morna de circulação para prevhipotermia ent. Manter os animais sob observação até que a consciência eo comportamento normal são recuperou. Transporte de animais acordados para a colônia animal. Animais permanecem na colônia até o momento do sacrifício.

8. O Sacrifício de Animais e Retina Remoção

  1. Um mês após o procedimento para induzir glaucoma, os animais são sacrificados por asfixia com CO2 e punção torácica secundária.
    1. Colocar o animal na câmara e colocar a tampa em forma segura.
    2. Abrir as válvulas CO 2 e regulador de gás para permitir volume de 20% / min de CO 2 deslocamento de oxigênio na câmara.
    3. Permitir que quatro a cinco minutos para que o animal a expirar.
    4. Desligue ambas as válvulas.
    5. Remover animal a partir da câmara e realizar uma punção torácica secundária com um bisturi estéril.
  2. Após a eutanásia, usar um bisturi para cortar o tecido conjuntivo no interior da cavidade orbital em torno do olho, being cuidado para não cortar na própria globo ocular.
  3. Cuidadosamente utilize uma tesoura para cortar borda curva do nervo óptico e qualquer tecido restante para extrair o globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraído em um x 15 mm placa de Petri estéril 60 milímetros descartável contendo PBS fresco.
  4. Faça um ocular do globo ocular. Para fazer isso, fazer uma pequena incisão com o bisturi apenas posterior à fronteira entre a íris e esclera. Seguir esta incisão em torno da circunferência do olho com uma tesoura pequena mola para remover o hemisfério da córnea do globo ocular. O hemisfério ligado ao nervo óptico permanece.
  5. Encontre a retina muito fina rosa / bege dentro da ocular do animal sacrificados. Segurar a camada pigmentado da retina com uma pinça embotadas para estabilizar a ocular. Use outro par de pinças fechadas de provocar muito suavemente toda a retina intacta fora da parte posterior do olho. Evite beliscar, puxar, ou puxando a retina diretamente.
  6. Use pequenas tesouras para cortar a molaa área onde o nervo óptico ainda está ligado à retina.
  7. Certifique-se de cortar qualquer epitélio pigmentar residual ou tecido escleral da retina.
  8. Usando uma pipeta de transferência, muito gentilmente transferir a retina isolado a um Sylgard limpo revestido 35 milímetros x 10 mm placa de Petri contendo PBS fresco.

9. Retina Preparação Whole-Mount

  1. Uma vez no prato Sylgard, utilize uma pinça e uma agulha de cacto para fixar a retina no lugar. Manter a camada de células ganglionares da retina para cima e para baixo do nervo óptico. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada.
  2. Use pequenas tesouras para cortar a retina em quatro quadrantes, fazendo a forma de um trevo de quatro folhas irradiando a partir da cabeça do nervo óptico.
  3. Pin os quadrantes da retina com agulhas de cactos adicionais para tornar a retina o mais plano possível withoUT alongamento (Figura 5).
  4. Fixar as retinas fixados no prato Sylgard com 3 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente.

10. Coloração de anticorpos de Retina

Nota: as retinas mancha fixas com anticorpos primários e secundários para a visualização de neurónios da retina (Figura 6).

  1. Lavar, retinas planas montadas fixas três vezes para 2 min cada em PBS.
  2. Permeabilizar as retinas com 1% de Triton X-100 com soro bovino fetal a 1% em PBS durante 60 min.
  3. Enxaguar retinas três vezes, 2 minutos cada, com PBS.
  4. Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem.
  5. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
  6. Incubar com 1% de Triton X-100 e soro fetal de bovino a 1% em PBS à temperatura ambiente durante 45 min.
  7. Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem.
  8. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
  9. Incubar cada retina em soro fetal bovino a 3 ml de 1% em PBScom rato purificada anti-rato CD90 / rato CD90.1 (diluição 1: 300) O / N à temperatura ambiente.
  10. Lavar uma vez com retinas 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min.
  11. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
  12. Incubar cada retina em 3 ml de PBS (sem FBS) com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho secundário (1: 300) O / N à temperatura ambiente.
  13. Lavar as retinas com PBS liberalmente.
  14. Usando um microscópio de dissecação, remover cuidadosamente agulhas cacto da retina.
  15. Gentilmente transferir retinas em lâminas de microscópio com uma pipeta de transferência. Certifique-se de manter a orientação com a camada de células ganglionares da retina de frente para o teto. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada.
  16. Absorve o excesso de PBS com Kimwipe ou outro material, tais absorvente. Tenha cuidado para não absorver a retina.
  17. Adicione 5 gotas de ½ glicerol e ½ PBS em peso, como ammedia ONTAGEM.
  18. Cubra retina com lamela, evitando bolhas de ar.
  19. Seguro lamela usando clara polonês prego, cola, ou outro adesivo.

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Representative Results

Esta seção ilustra os componentes do aparelho e procedimento utilizados para induzir condições de glaucoma-like em um modelo de glaucoma in vivo de ratos. Mostramos as ferramentas individuais e o equipamento usado para realizar uma injecção de solução salina hipertónica, que provoca um aumento na pressão intra-ocular. Mostramos a injecção no plexo venoso episcleral com o seu efeito de branqueamento característica e o aspecto turvo do que resulta da câmara anterior. Descrevemos também o processo de remoção de retina e de montagem plana para análise de RGCs perdidos. Por último, que mostram os efeitos da injecção sobre a sobrevivência de células ganglionares da retina. Dado que a distribuição das CGR é irregular em diferentes regiões da retina de rato, as imagens são obtidas a partir de quatro regiões 2 200 um em cada retina, 4 mm de distância a partir do centro da cabeça do nervo óptico. O número total de Thy 1.1 CGRs marcadas em cada secção são contadas, e a média em comparação experimental e contr ol retinas 31. Usando este método, as contagens de RGC mudou de uma média de 225 numa imagem de controlo não tratadas para as condições de 168 um mês após o procedimento para induzir condições de glaucoma semelhante (n = 30). Tomados em conjunto, os procedimentos aqui descritos pode ser seguido passo a passo para analisar a morte de organismos de células ganglionares da retina e axónios.

figura 1
Figura 1. Componentes microagulhas. (A) Seringa com tubo de polietileno usado para injeção de solução salina. (B) Backfill seringa usado para aterrar a micro-agulha de borosilicato. (C) Narishige eletrodo extrator usado para fazer microagulhas borosilicato. (D) eletrodos de vidro de borosilicato antes e depois de ser puxado no eletrodo extrator. (E) Magnified vista da ponta da agulha de microeletrodos depois de ser puxado.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Completa Microneedle Assembleia. Microneedle ligado ao tubo de polietileno ligado a seringa com solução salina hipertônica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3.-Glaucoma induzir Saline Injection no episcleral venoso Plexus. Imagem de injeção de solução salina na veia episcleral de um ao vivo, anestesiados Long Evans rato. A seta indica a localização da pinça hemostática utilizada para inchar o olho e impedir o seu movimento. A seta branca indica o localização da veia injectado. A seta preta mostra volta do sangue que flui para a ponta microneedle indicando punção da veia bem sucedida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. O branqueamento Efeito da hipertônica salina Injection. Imagem do olho de ratos sendo injetado com solução salina hipertônica. A seta mostra o efeito de branqueamento característica de solução salina no plexo venoso episcleral. A seta indica uma porção do plexo venoso episcleral que ainda não tenha empalideceu. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. Plano de montagem de Rat Retina. Imagem de toda montagem retina removida do olho do rato e preso plana em um prato Sylgard uso de agulhas do cacto. A seta preta indica cabeça do nervo óptico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. danos nas células ganglionares da retina, depois da cirurgia de glaucoma de indução. Comparação de olho não tratado de controlo (A) para o olho experimental (B) um mês após a indução de injecção de soro fisiológico do glaucoma. As retinas foram marcadas com um anticorpo contra o marcador de RGC, Thy 1.1 (CD90). setas finas indicam RGCs individuais, tanto no controlo e às condições experimentais. O procedimento leva a uma redução no número de CGRs, defasciculation dos axônios fora das principais feixes de axônios, e distorção para a circularidade do CGR restantes. setas largas indicam os axônios defasciculating característicos resultantes da injeção de solução salina. A seta mostra um vaso sanguíneo dentro da retina. Dois casquilhos etiqueta setas feixes de axônios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um método de induzir condições de glaucoma semelhante em um modelo de rato in vivo em. Este procedimento utiliza uma injecção de solução salina hipertónica para induzir a formação de cicatrizes na malha trabecular 29, 32. O desenvolvimento de tecido de cicatriz oclui o escoamento do humor aquoso, que aumenta a pressão na câmara anterior. Com a diminuição da vazão e pressão construir, a lente suspensa por ligamentos elásticos empurra de volta para a câmara vítrea. humor vítreo, em seguida, aplica uma pressão sobre a retina danificar os neurônios da retina frágeis. Nossos resultados usando este procedimento mostram que o número de células ganglionares da retina começam a diminuir em 2 semanas com perda significativa de perda de células ganglionares no pós-procedimento 1 mês.

Este protocolo é apenas um método de induzir glaucoma em roedores. Há muitos outros modelos experimentais, em que o dano para as células ganglionares da retina é realizado tanto por um aumento da pressão intra-ocular ou por Da directaMage o nervo óptico 30. Muitas vezes, estes métodos têm sido desenvolvidos em animais maiores e modificados para aplicação em ratinhos e ratos 33. Injecções intra-ocular de toxinas, tais como a estaurosporina e 34 de NMDA, o glutamato análogo não-hidrolizável 35 induzir a morte das células ganglionares da retina rápida. Os estudos mostraram, no entanto, que tais toxinas siga uma curva de dose-resposta em ratinhos e outros do que as células alvo células ganglionares 35 efeito. Além disso, o dano para as células ganglionares da retina neste modelo é muito mais directa do que a progressão gradual de glaucoma humano.

dano direto ao nervo óptico também pode ser infligido. Axotomia Laser é uma forma comum para cortar os axônios que formam o nervo óptico em ratos 36. No entanto, este método apresenta algumas complicações. O tamanho pequeno das órbitas de roedor torna-se difícil para danificar o nervo óptico com precisão, sem afectar o fluxo sanguíneo através da artéria central da retinae veia. Para superar este problema, alguns investigadores utilizam uma abordagem mais invasiva que envolve a remoção de uma pequena porção do cérebro, de modo a proporcionar um melhor acesso ao nervo óptico 37. modelos esmagamento do nervo óptico acessar o nervo óptico intraorbitalmente também. Neste modelo, o nervo é comprimido por uma pinça de fecho automático e fluxo sanguíneo ocular não seja comprometida. Este procedimento resulta em um insulto imediata e morte síncrona de células ganglionares da retina. Estudos utilizando este modelo mostram uma perda significativa de RGCs 38. No entanto, alguns argumentam que ela pode induzir mais danos do que a causada por PIO elevada sozinho 39. Além disso, o glaucoma caracteriza-se pela perda lenta crónica,, assíncrona de células ganglionares da retina 33, 39-42 .Portanto, o curso do tempo e o mecanismo subjacente de dano infligido com esmagamento do nervo óptico pode ser muito diferente do que a que ocorre no glaucoma humano. Em contraste, o modelo discutido neste artigo evita a necessidade de acce diretass ao nervo óptico, elimina qualquer dissecção do tecido cerebral, e permite o dano de células ganglionares da retina gradual.

modelos de oclusão microbead de uso glaucoma poliestireno ou esferas magnéticas injetadas nas câmaras anteriores de ratos ou camundongos para elevar a PIO. A maior parte deste trabalho foi feito em camundongos e eles mostram apenas num nível baixo a moderado de danos no nervo óptico com grande variação nos resultados e dados inconsistentes 43-50. Ao usar ratos, a duração da pressão intra-ocular elevada foi demasiado curto para causar dano suficiente para as células 48. Mesmo com modificações para o procedimento, o modelo ainda causou danos graves em curta duração que representa um modelo neuropática aguda, em vez de um modelo de glaucoma crônico 51. Smedowski et al 43 desenvolveram recentemente um procedimento microbead ainda modificado usando uma 'lesão de alta pressão' inicial adicional para alcançar maior aumento da PIO com lesão crônica que doe duradouras mostram a promessa. Mais estudos utilizando esta técnica são necessárias para validar adicionalmente este modelo.

Todos os modelos de hipertensão ocular crônica visam obstruir o escoamento do humor aquoso. Fotocoagulação a laser da episcleral e veias do limbo 52 e oclusão da veia episcleral 53 são dois desses métodos. No entanto, também tem sido demonstrado que as técnicas de ablação a laser produzir apenas o aumento da PIO e transiente um nível moderado de perda real da célula 36, 54-55.

O glaucoma é uma doença crônica resultante de danos e perda de células ganglionares da retina cujos axônios formam o nervo óptico. O mecanismo desta perda é desconhecido. Embora um aumento na pressão intra-ocular é o factor de risco indicação, alguns sugeriram o envolvimento de outros factores. Tais fatores incluem processos inflamatórios, estresse oxidativo, irregularidades metabólicas, ou distúrbios do fluxo sanguíneo 56-58. A fim de descobrir o mecanismo exacto de cell morte nesta doença, os pesquisadores precisam de maneiras simples, repetitivos e funcionais para com precisão as condições imitam que aparecem nas glaucoma humano. Só então os pesquisadores esperam encontrar uma maneira de proteger as células ganglionares da retina de morrer. O procedimento descrito neste artigo usa uma elevação induzida artificialmente da PIO para produzir uma perda gradual e irreversível das células ganglionares da retina semelhante ao observado em pacientes com glaucoma 31. O procedimento é minimamente invasivo. perda de células ganglionares da retina significativa é medido no prazo de um mês de cirurgia. Este método é uma ferramenta importante para o estudo do glaucoma. Uma limitação potencial deste método é a injeção manual de solução salina hipertônica. Devido a este método manual, é possível esperar uma grande variabilidade nos resultados. No entanto, foram identificados o efeito do branqueamento na veia a ser um passo crítico. Se ocorrer branqueamento, a perda de células ganglionares da retina é sempre entre 18 e 29%. Para apoiar este processo, todos os estudos futuros podem modify o procedimento para incluir medidas de PIO de rotina para garantir que estas injecções levar a um aumento mensurável na PIO. 29,31. Talvez este modelo de morte das CGR irão levar ao desenvolvimento de um tratamento neuroprotector mais completa que combate a perda visual devastador que afecta milhões de pessoas em todo o mundo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

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Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

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