Abstract
Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi - bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25'i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.
Introduction
Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre 1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur.
glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın 3 körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük 4 dünyanın en büyük üçüncü nedenidir.
Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin 1 sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar.
Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 - Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi 5 hayranlarıyla içine ler - çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı 1 nispeten bağımsız olduğu görülmektedir.
aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir.
Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah 7 üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah 8-14 akışını artırarak GİB'in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun 15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon 18 ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah 19 çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu 20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur.
Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40'a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. 22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez 24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir.
Bu çalışmada, ilk olarak Morrison 29 ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür 30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan denekleri kullanan tüm işlemler Western Michigan Üniversitesi'nde Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Enstitüsü standartlarına uygun olmuştur.
1. Hayvanlar
- Bu çalışmada, erkek ve dişi sıçanlarda 3 aylık kullanın.
- yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları tutun.
Hayvan Anestezi için KAX Kokteyli 2. Hazırlık
- 1 mi asepromazin (10 mg / ml) damıtılmış su, 3 ml ile 5 mi, ketamin (100 mg / ml) içinde ksilazin (20 mg / ml), 50 mg eritin. İyice karıştırın.
- bir şırınga filtresi ile sterilize ve 10 mi, serum şişeye bu çözüm saklayın.
3. KAX Enjeksiyon
- hayvan (g) tartılır ve enjeksiyon için hazır olana kadar kafesin geri dönün.
- 28 G iğne ile 1 ml insülin şırıngası kullanılarak, intraperitonal 0.1 mi KAX / 100 g hayvan vücut ağırlığına enjekte edilir.
- İzin vermekhayvan için bilinçsiz olmak. ayak ve kuyruk kısma refleksleri kontrol edin.
- Ameliyat süresince güvenle laboratuarında tüm hayvanları tutun.
- Post-cerrahi, kafeslerine hayvanlar yerine ve bilinç sağlanıncaya kadar RT rahat tutun. Sadece hayvanlar uyandırmak zaman hayvan tesisine hayvanları dönmek ve normal davranış devam edin.
Cerrahi ve Microneedle Meclisi 4. Hazırlık
- Steril 2 M NaCl çözeltisi olun.
- İki ince konik cam microneedles (Şekil 1D, Şekil 1E) içine bir 0.86 mm iç çap ağır cilalı standart ve ince duvarlı borosilikat tüp çekmek için bir mikroelektrot çektirmesi (Şekil 1C) kullanın.
- 2 M tuz, bir dolgu şırınga iğnesi ve 1 ml şırınga (Şekil 1B) kullanılarak önceki adımda elde edilen bir mikroiğne Dolgu. elektrot ucu hava kabarcıklarını dışarı dokunun.
- 2 M ile ikinci 1 ml şırınga doldurunNaCI ile yıkanmıştır. 18 G iğne bağlayın ve sonra polietilen boru (Şekil 1A) bir uzunluğa (yaklaşık 10 inç) ekleyin. iğne ile tuzlu su ile polietilen boru doldurmak için şırınga pistonu kullanın.
- microneedle ve tüp hem de tuzlu su ile dolu olduğunda, dikkatli bir şekilde birbirine bağlamak. Aralarında bağlantı (Şekil 2) herhangi bir havayı ortadan kaldırın.
- İnce bir ders kağıt havlu tahıl karşı çok hafifçe kazıyarak Mikroiğnenin ucu konik.
- yavaşça sıvının ince bir dere kağıt havlu üzerine görülebilir kadar şırınga pistonu iterek Mikroiğnenin direncini kontrol ediniz. sıvı akıntısı 0.5 mm daha büyük olmalıdır.
Animal 5. hazırlanması
- 2 damla kornea topikal anestetik (Proparakain hidroklorür Oftalmik Solüsyon USP,% 0.5) - 1 uygulayın. Hiçbir göz refleks oluşuncaya kadar bekleyin.
- makasla bıyıkları kesin.
- SDeneysel göz çevresinde betadin çözüm ve çubukla alanına sahip bir pamuk uçlu aplikatör aturate.
- Bir mikroskop kullanarak, göz şişkinliği Episkleral ven ortaya çıkarmak ve göz hareketi kısıtlamak için alt göz kapağı kelepçe bir hemostat ekleyin. (Şekil 3, ok başı)
6. Glokom uyaran Tuzlu Enjeksiyon
- microneedle montaj ve hayvan hazırlandıkları zaman, enjeksiyon başlar.
- Hayvan ayak / kuyruk tutam tepkisiz olması teyit edildiğinde, dikkatlice ven (Şekil 3, beyaz ok) 10 ve 20 derece arasında düşük bir açıda gelerek microneedle ile Episkleral ven delin. Kan mikroiğne (Şekil 3, siyah ok) ucu girer damar içine başarılı bir lastik belirgindir.
- Yavaş ve el damar içine yaklaşık 50 ul tuzlu su enjekte edilir. Bu, yaklaşık 10 sn almalıdır. Damarlar olacak tuz uçtan bir uca dolaşır olarak mazur beyazugh damar (Şekil 4, ok başı). Bazı bölgeler kan kırmızı bir görünüm (Şekil 4, ok) muhafaza edebilir.
- tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin.
Not: Tuz damar sistemi aracılığıyla dolaşır olarak dakika içinde, bir gözün iris yoluyla ayrı bir bulutlu bir görünüm görmelisiniz.
- tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin.
- Bir iç kontrol olarak kullanılmak üzere muamele edilmemiş karşı gözü terk.
7. Hayvan Kurtarma
- hemostat çıkarın.
- hemostatla tarafından ve enjeksiyon sitelere kenetlenmiş siteye üçlü antibiyotik merhem (basitrasin çinko, neomisin sülfat, polymysin B sülfat) uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Göz çevresinde doku hasarı hemostat kullanarak oluşmaz.
- > Bir dolaşan sıcak su battaniye kafeslerine Place anestezi hayvanların prev içinent hipotermi. bilinç ve normal bir davranış kazanmış kadar gözlem altında hayvanları tutun. geri hayvan koloniye uyanık hayvan taşıyın. Hayvanlar kurban zamanına kadar koloni kalır.
8. Hayvan Kurban ve Retina Kaldırma
- Glokom ikna etmek için prosedürü izleyerek Bir ay, hayvanlar CO 2 boğulma ve ikincil göğüs ponksiyon ile ötenazi.
- odasında hayvan koyun ve güvenli kapağı koydu.
- % 20 hacmi / dk CO 2 deplasman izin CO 2 ve gaz regülatörü vanaları açın odasındaki oksijen.
- Hayvan sona erecek dört ila 5 dakika bekleyin.
- Her iki vanaları kapatın.
- odasından gelen hayvan çıkarın ve steril bir bisturi ile ikincil göğüs delik gerçekleştirin.
- Ötenazi sonra, göz, bei çevreleyen orbita boşluğuna bağ dokusu kesmek için bir neşter kullanabilirsinizng dikkatli küresi kendi içine kesmek için değil.
- Dikkatle sağlam gözü ayıklamak için optik siniri ve kalan doku kesmek için kavisli kenar makas kullanın. Taze PBS içeren steril bir 60 mm x 15 mm atılabilir bir petri ekstre gözün yerleştirin.
- göz küresi bir göz yuvasını yapın. Bunu yapmak için, neşter ile küçük bir kesi sadece iris ve sklera arasındaki sınır posterior olun. göz küresi kornea yarımkürede kaldırmak için küçük yaylı makas ile göz çevresine bu kesi izleyin. optik sinir bağlı hemisfer kalır.
- ötenazi hayvandan Göz yuvası içinde çok ince pembe / bej retina bulun. Göz yuvası stabilize etmek için körleşmiş forseps ile retinanın pigmentli tabakası tutun. çok yavaşça gözün arka kapalı bütün dokunulmamış retina kızdırmak için kapalı forseps başka bir çift kullanın. , Kısma çekerek, ya da doğrudan retinaya asılarak kaçının.
- kesmek için küçük yaylı makas kullanınOptik sinir hala retinaya bağlı olduğu alan.
- retinadan herhangi bir kalıntı pigment epitel ya da skleral doku kesip emin olun.
- Bir transfer pipet kullanarak, çok yavaşça taze PBS içeren 35 mm x 10 mm petri kaplı temiz bir sylgard izole retina aktarın.
9. Tüm Montaj Retina Hazırlık
- Bir kez Sylgard çanak, yerinde retina pin forseps ve bir kaktüs iğne kullanın. yukarı bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası tutun ve aşağı optik sinir. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır.
- optik sinir başı yayılan dört yapraklı yonca şeklini verme, dört parçaya bölünür retina kesmek için küçük bir makas kullanın.
- Mümkün witho olarak retina gibi düz hale getirmek için ek kaktüs iğne ile retina kadran pingerme ut (Şekil 5).
- % 4 paraformaldehid O / oda sıcaklığında N 3 ml Sylgard çanak tutturulmuş retina sabitleyin.
Retina 10. Antikor Boyama
Not: Birincil ve ikincil antikorlar ile Leke sabit retina retina (Şekil 6) nöronların görüntüleme için.
- PBS içinde sabit, düz monte retina 2 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- 60 dakika boyunca PBS içinde% 1 fetal bovin serumu ile% 1 Triton X-100 ile retina geçirgenliği.
- Durulama PBS içinde üç kez 2 dakika her biri, retina.
- PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
- PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
- 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 Triton X-100 ve% 1 fetal inek serumu ile inkübe edin.
- PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
- PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
- PBS içinde 3 mi% 1 fetal inek serumu, her retina inkübesaflaştırılmış fare anti-fare CD90 / fare CD90.1 (1: 300 seyreltme) O / oda sıcaklığında N.
- 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile bir kez retina durulayın.
- PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
- İkincil Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG'si ile 3 ml PBS (Resim FBS) her bir retina inkübe (1: 300) O / oda sıcaklığında N.
- liberal PBS ile retina yıkayın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dikkatli bir şekilde retinanın kaktüs iğneleri çıkarın.
- Yavaşça bir transfer pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine retina aktarın. tavana bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası ile yönünü korumak için emin olun. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır.
- KimWipe ya da diğer emici madde ile herhangi bir aşırı PBS emer. retina emmek için dikkatli olun.
- ½ gliserol 5 damla ilave edin ve am ağırlık olarak PBS ½tutarlı medya.
- hava kabarcıkları kaçınarak, lamel ile retina örtün.
- net oje, tutkal veya başka bir yapıştırıcı kullanarak güvenli lamel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm, bir in vivo sıçan glokom modelinde glokom gibi koşullar uyarılması için kullanılan aygıt bileşenlerini ve prosedürü görüntülemektedir. Biz göz içi basıncı bir artışa neden bir hipertonik salin enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bireysel araç ve gereçleri gösterir. Biz onun karakteristik haşlama etkisi ve sonuçları ön kamara bulutlu görünümü ile episkleral venöz pleksus içine enjeksiyon göstermektedir. Biz de retina kaldırma ve kayıp RGCs analizi için düz montaj sürecini açıklar. Son olarak, retinal ganglion hücre hayatta kalması ile ilgili enjeksiyon etkilerini göstermektedir. RGCs dağılımı fare retina farklı bölgelerinde eşit olduğu için, resim 4 mm uzaklıkta optik sinir başı merkezinden her retina, dört 200 mikron 2 bölgelerinden elde edilir. Her bölümde Thy 1.1 etiketli RGCs sayısı deneysel ve Contr olarak sayılır ortalaması ve karşılaştırılmıştır ol 31 Retinaların. Bu yöntemi kullanarak, RGC sayımları (n = 30) glokom gibi koşullar uyarılması için işlem sonrası 168 bir ay muamele edilmemiş kontrol koşulları görüntüde 225 ortalama olarak değiştirildi. Birlikte ele alındığında, burada özetlenen işlemler retina ganglion hücre gövdeleri ve aksonlar ölümü analiz etmek adım adım takip edilebilir.
1. Microneedle Bileşenleri Şekil. Önce ve elektrotta çekildikten sonra tuzlu su, enjeksiyon için kullanılan polietilen boru (A) şırınga. (B), borosilikat mikroiğne doldurmak için kullanılan Dolgu şırınga. Borosilikat microneedles yapmak için kullanılan (C) Narishige elektrot çekici. (D) Borosilikat cam elektrotlar çektirmenin. (E) çekildikten sonra mikroelektrot iğne ucu görünümünü Büyütülmüş.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tam Microneedle Meclisi. Microneedle hipertonik tuzlu su ile şırınga bağlı polietilen boruya bağlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Canlı bir Episkleral ven içine tuzlu enjeksiyon Şekil 3. Glokom uyaran içine Tuzlu Enjeksiyon episkleral Venöz Plexus. Görüntü, Long Evans sıçan anestezi. ok ucu göz çıkıntı ve onun hareket etmesini önlemek için kullanılan hemostat konumunu belirtir. beyaz ok gösterir Enjekte damarın yeri. Siyah ok başarılı ven ponksiyonu belirten microneedle ucu akan kan arka gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Haşlama Etkisi Hipertonik Salin enjeksiyonu. Sıçan gözün görüntü hipertonik salin enjekte ediliyor. Ok başı episkleral venöz pleksustaki tuz karakteristik haşlama etkisini gösterir. Ok henüz blanched henüz episkleral venöz pleksusun bir kısmını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
31 / 53831fig5.jpg "/>
Bütün montaj retina Şekil 5. Düz montaj Rat Retina. Görüntü sıçan göz çıkarılır ve kaktüs iğneler kullanılarak bir Sylgard çanak düz tutturulmuş. Siyah ok optik sinir başını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Glokom uyaran Cerrahisi Sonrası Retina Ganglion Hücreleri Şekil 6. Hasar. Deneysel göz (B) bir ay kontrol işlenmemiş göz (A) Karşılaştırılması tuzlu enjeksiyon uyaran glokom aldıktan sonra. Retinaları RGC işaretleyici, Thy 1.1 (CD90) karşı bir antikor ile etiketlenmiş. İnce oklar Deney ve kontrol koşullarında, hem de tek tek RGCs göstermektedir. Prosedür RGCs sayısında bir azalmaya yol açar, deKalan RGCs dairesellikte ana akson demetleri kapalı akson fasikülasyon ve bozulma. Blok Oklar tuzlu enjeksiyonundan kaynaklanan karakteristik defasciculating aksonlar göstermektedir. ok ucu retina içinde kan damarını gösterir. Çift uçlu oklar etiket akson demetleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür 29, 32. Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uygular. Bu yordamı kullanarak elde ettiğimiz sonuçlar retina ganglion hücre sayıları 1 ay sonrası prosedür de ganglion hücre kaybı önemli bir kayıp ile 2 hafta azalmaya başladığını göstermektedir.
Bu protokol, kemirgenlerde glokom uyarılması, sadece bir yöntemdir. retinal bez hücrelerin hasar Göz basıncında bir artış ile ya da doğrudan Da yoluyla gerçekleştirilir olan birçok deney modelleri vardıroptik sinir 30 Mage. Genellikle, bu yöntemler, daha büyük hayvanlar için geliştirilmiş ve fareler ve sıçanlar 33 uygulama için modifiye edilmiştir. Bu staurosporin 34 ve NMDA gibi toksinler göz içi enjeksiyonları, hidrolize olmayan glutamat analogunun 35 hızlı bir retinal ganglion hücre ölümünü teşvik. Çalışmalar Bu tür toksinler, farelerde ve hedef ganglion hücrelerinin 35 dışındaki etki hücrelerinde bir doz-yanıt eğrisini takip Bununla birlikte, göstermiştir. Buna ek olarak, bu modelde, retinal ganglion hücrelerinin hasar daha doğrudan insan glokom yavaş ilerlemesi daha uzundur.
optik sinir doğrudan hasar da verdirdiler edilebilir. Lazer Aksotomiyi farelerde 36 optik siniri oluşturan aksonlar sever için ortak bir yoldur. Ancak bu yöntem bazı komplikasyonlar sunar. kemirgen yörüngelerin küçük boyutlu doğru santral retinal arter yoluyla kan akışını etkilemeden görme sinirine zarar zorlaştırırve ven. Bunun üstesinden gelmek için, bazı araştırmacılar, optik sinir 37 daha iyi erişim sağlamak amacıyla beyin küçük bir kısmının çıkarılmasını kapsayan daha invaziv bir yaklaşım kullanır. Optik sinir ezilme modelleri göz çukuru içine de optik sinir erişin. Bu modelde, sinir tehlikeye değil kendiliğinden kapanan forseps ve oküler kan akımı ile kısılmıştır. Bu prosedür, bir anında hasara ve retinal ganglion hücre senkron ölümü ile sonuçlanır. Bu modeli kullanılarak yapılan çalışmalar RGCs 38 önemli bir kayıp göstermektedir. Ancak, bazı tek başına 39 GİB yükselmesi nedeniyle daha fazla zarar neden olabilir savunuyorlar. Ayrıca, glokom insan glokom meydana gelen bu oldukça farklı olabilir retina ganglion hücrelerinin 33, 39-42 .Bu nedenle, zaman ders ve optik sinir ezmek ile hasarın altında yatan mekanizma yavaş, kronik, asenkron kaybı ile karakterizedir. Buna karşılık, bu yazıda ele alınan model, doğrudan ACCE ihtiyacını ortadan kaldırıroptik sinir p, beyin dokusunun herhangi diseksiyon ortadan kaldırır, ve kademeli retinal ganglion hücre hasar verir.
sıçan veya fare ön odalarına enjekte glokom kullanım polistiren veya manyetik boncuk microbead tıkanıklığı modelleri göz içi basıncı yükseltmek için. Bu çalışmaların çoğu farelerde yapılmıştır ve sadece sonuçların geniş varyasyon ve tutarsız verileri 43-50 ile optik sinir hasarı orta düzeyde düşük gösteriyor. Fareler kullanırken, yüksek GİB süresi hücreleri 48 kadar zarar çok kısaydı. Hatta prosedüre değişikliklerle, modeli hala kronik glokom modeli 51 yerine akut nöropatik modeli temsil kısa süre içinde ciddi hasara yol açtı. Smedowski ve arkadaşları 43 en son doe kronik hasarın ile IOP yükseklik uzun ömürlü elde etmek için ilave bir başlangıç 'yüksek basınç yaralanması yöntemi kullanılarak bir başka tadil edilmiş microbead prosedürünü geliştirdiks gösterisi söz. Bu tekniği kullanarak daha fazla çalışmalar, bu modeli doğrulamak için gereklidir.
Kronik oküler hipertansiyon modelleri aköz hümör çıkışı engellemek için hedefliyoruz. Episkleral ve limbal venler 52 ve episkleral ven tıkanıklığı 53 lazer fotokoagülasyon gibi iki yöntem vardır. Bununla birlikte, aynı zamanda lazer teknikleri, sadece geçici IOP yükselmesine ve gerçek hücre kaybı 36, 54-55 orta düzeyde üretmek gösterilmiştir.
Glokom hasar ve aksonlar optik siniri oluşturan retina ganglion hücrelerinin kaybından kaynaklanan kronik bir hastalıktır. Bu zarar mekanizması bilinmemektedir. Göz basıncında bir artış, ayırt edici bir risk faktörü olmasına rağmen, başka bir etmenlerin sürmüşlerdir. Bu faktörler inflamatuvar süreçleri, oksidatif stres, metabolik düzensizlikler ya da kan akımı bozuklukları 56-58 arasındadır. cel kesin mekanizması ortaya çıkarmak içinBu hastalıkta l ölüm, araştırmacılar, insan glokom görünen doğru mimik koşullar, basit, tekrarlanabilir ve fonksiyonel yollar gerekir. Ancak bundan sonra araştırmacılar ölen retina ganglion hücreleri korumak için bir yol bulmak için umut olabilir. Bu yazıda anlatılan prosedür glokom hastalarında 31 görülen benzer retina ganglion hücrelerinin yavaş yavaş, geri dönüşü olmayan zarar üretmek için GİB bir yapay yükselmesine kullanır. Prosedür minimal invaziv. Önemli retina ganglion hücre kaybı cerrahi bir ay içinde ölçülür. Bu yöntem, glokom çalışma için bir önemli bir araçtır. Bu yöntemin önemli bir dezavantaj hipertonik salin el enjeksiyondur. Bu nedenle manuel yöntem, sonuçlarda büyük farklılıklar beklemek mümkündür. Ancak, biz kritik bir adım olarak ven haşlama etkisini belirledik. haşlama oluşursa, retina ganglion hücre kaybı 18 ile% 29 arasında her zaman. Bunu desteklemek için, gelecekteki tüm çalışmalar Modi olabilirfy prosedürü bu enjeksiyonlar GİB'in. 29,31 ölçülebilir bir artışa yol sağlamak için rutin GİB ölçümü dahil etmek. Belki RGC ölüm bu model, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen yıkıcı görme kaybı ile mücadele daha eksiksiz bir nöroprotektif tedavi gelişmesine yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
| Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 ml bottle |
| Acepromazine Maleate, 10mg/ml | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 ml bottle |
| Serum bottle, 10 ml | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
| 1 ml insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 G needle |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
| Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
| Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
| Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
| 18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
| Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
| Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 ml sterile bottle |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
| Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
| Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| 3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 ml graduations |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Cactus Needles | |||
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100 ml | Made into both a 1% and 0.1% solution |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
| Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
| Microscope Slides | Corning | 2948-75x25 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100 ml | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
| Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
| Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |
References
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
- Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
- Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
- Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
- McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
- Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
- Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
- Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
- Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
- Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
- Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
- Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
- Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
- Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
- Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
- Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
- Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
- Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
- Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
- Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
- Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
- Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
- Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
- Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
- Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
- Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
- Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
- Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
- Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
- Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
- Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
- Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
- Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
- Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
- Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
- Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
- Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
- Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
- Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
- Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
- Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).
