Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glaucoom-inducerende Procedure in een Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Glaucoom is een ziekte van het centrale zenuwstelsel die retinale ganglioncellen (RGC's). RGC axonen die deel uitmaken van de oogzenuw te voeren visuele input naar de hersenen voor visuele waarneming. Schade aan RGC en hun axonen leidt tot verlies van het gezichtsvermogen en / of blindheid. Hoewel de specifieke oorzaak van glaucoom is niet bekend, de belangrijkste risicofactor voor de ziekte een verhoogde intraoculaire druk. Glaucoom inducerende procedures in diermodellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers bestuderen van het mechanisme van RGC dood. Dergelijke informatie kan leiden tot de ontwikkeling van effectieve neuroprotectieve behandelingen die kunnen helpen bij het voorkomen van gezichtsverlies. Het protocol in dit document beschrijft een werkwijze voor het induceren glaucoom - achtige omstandigheden in een in vivo rattenmodel wanneer 50 gl 2 M hypertone zoutoplossing wordt geïnjecteerd in de episclerale veneuze plexus. Blancheren van de schepen geeft succesvolle injectie. Deze procedure veroorzaakt verlies van RGCs glaucoom simuleren. Een maand nainjectie worden de dieren opgeofferd en ogen verwijderd. Next, het hoornvlies, lens en glasvocht worden verwijderd om een ​​oogschelp te maken. Het netvlies wordt dan afgepeld van de achterzijde van het oog en vastgemaakt op Sylgard gerechten met cactusnaalden. Op dit punt kunnen neuronen in het netvlies worden gekleurd voor analyse. De resultaten van dit lab blijkt dat ongeveer 25% van RGC verloren binnen een maand na de procedure in vergelijking met interne controles. Deze procedure maakt de kwantitatieve analyse van retinale ganglion celdood in een in vivo rat model glaucoom.

Introduction

Glaucoom is een groep van oogziekten invloed neuronen in het netvlies, in het bijzonder, de retinale ganglioncellen 1-2. De axonen van deze cellen convergeren naar de oogzenuw uitvoering visuele informatie naar de hersenen waar het zicht wordt waargenomen worden. Schade aan RGC en hun axonen veroorzaakt daarom visuele gebreken.

De belangrijkste kenmerken die geassocieerd worden met glaucoom aandoeningen zijn RGC degeneratie en dood, verhoogde intra-oculaire druk (IOP) en optische schijf cupping en atrofie. Deze kenmerken leiden tot gezichtsveld verlies of volledige, onomkeerbare blindheid. Op dit moment, glaucoom heeft blindheid veroorzaakt in 70 miljoen mensen wereldwijd 3. Als zodanig is het 's werelds derde grootste oorzaak van blindheid 4.

Het exacte mechanisme van RGC dood in glaucoom blijft onbekend. Er is veel onderzoek gedaan om het mysterie te ontgrendelen. Het is echter bekend dat de primaire risicofactor glaucoom verhoging in intraoculaire druk door onregelmatige circulatie van waterig lichaamsvocht (AH) in de voorste kamer van het oog. AH fungeert als een transparante en kleurloze vervanging voor bloed in de avasculaire voorste kamer van het oog. Het voedt de omringende cellen, verwijdert uitgescheiden afvalproducten uit metabolische processen, transporten neurotransmitters, en maakt de verspreiding van drugs en ​​inflammatoire cellen in het oog tijdens pathologische toestanden 1.

Het onderhoud van waterige humor omloop betreft het ciliaire lichaam en het trabeculaire netwerk. Kamerwater wordt geproduceerd door het corpus ciliare. Vervolgens stroomt in de voorste kamer naar de algehele gezondheid van het oogweefsel handhaven. 75-80% van de waterige humor uitstroom actief uitgescheiden via niet-pigment ciliaire epitheel wanneer het fluïdum wordt gefiltreerd door drie lagen sponsachtige weefsel in de ciliaire spier. De vloeistof verlaat via de trabeculaire netwerk en via het kanaal van Schlemm die emptven in het bloedsysteem 5 .De resterende 20-25% van uitstroom omzeilt het trabeculaire netwerk en passief uitgescheiden door ultrafiltratie en diffusie door de uveo-sclerale route. Deze route lijkt relatief onafhankelijk van de intraoculaire druk 1 zijn.

Wanneer waterige humor productie en uitstroom uit balans zijn, druk opbouwt in het oog. Zoals gezegd, deze toename van de intraoculaire druk is de belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van glaucoom. Dergelijke druk veroorzaakt schade aan de ingewikkelde lagen van neuronen in het netvlies aan de achterkant van het oog. Beschadiging van de retinale ganglioncellen axonen van de oogzenuw veroorzaakt de hersenen om nauwkeurige visuele informatie niet meer ontvangen. Hierdoor wordt de perceptie van het gezichtsvermogen verloren en volledige blindheid kan optreden.

Tot op heden is er geen behandeling voor glaucoom. Verschillende behandelmethoden bestaan ​​die in de eerste plaats gericht zijn op de intra-oculaire druk te verminderen. Deze omvatten actueelmedicatie klassen zoals beta1-adrenerge receptorblokkers of topische prostaglandinederivaten. Bèta blokkers verlagen de intraoculaire druk door het verlagen van de productie van kamerwater 7. Prostaglandinen functie om IOP te verminderen door de afvoer van kamerwater 8-14. Alfa- adrenergische agonisten en koolzuuranhydraseremmers worden ook gebruikt als secundaire behandelingsmethoden. Alpha adrenerge agonisten verhogen uitstroom door de uveosclerale route 15-17. Koolzuuranhydraseremmers vermindering van de productie van AH door enzymatische remming 18. Veel meer invasieve procedures worden ook gebruikt voor de behandeling van glaucoom. Lasertrabeculoplastie wordt gebruikt om de uitstroom van waterige humor 19 verhogen. Andere chirurgische therapie, genaamd trabeculectomie, creëert een alternatieve drainage site AH filteren wanneer de traditionele trabeculaire route geblokkeerd 20-21.

Deze behandelingen zijn bekend om effectief verminderen IOP. Echter, tot 40% van glaucoom patiënten vertonen normale IOP niveaus en de noodzaak van vollediger therapeutische werkwijzen. 22,23 Bovendien retinale ganglion celdood waargenomen bij glaucoom is onomkeerbaar wanneer het begint en de huidige behandelingen niet de progressie van de ziekte te stoppen 24-28. Dit heeft gewezen op de noodzaak van effectieve neuroprotectieve therapieën die het overleven van de neuronen zelf richten. Ontwikkeling van glaucoom modellen is cruciaal voor deze ontwikkeling.

In deze studie demonstreren een werkwijze voor het induceren glaucoom-achtige effecten in volwassen Long Evans ratten onder toepassing van een gemodificeerde werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Morrison 29. In deze procedure injecties van 2 M hypertone zoutoplossing in de episclerale veneuze plexus induceert glaucoom-achtige omstandigheden door littekens weefsel waterige humor uitstroom verlagen in het trabeculaire netwerk leidt tot een toename van intraoculaire druk en een aanzienlijk verlies van RGC within een maand na de procedure 30-31. Glaucoom inducerende procedures, zoals hier beschreven, kan de sleutel tot nieuwe ontwikkelingen in glaucoom behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met behulp van proefdieren zijn in overeenstemming met de normen van het Institute for Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan Western Michigan University geweest.

1. Dieren

  1. Gebruik mannelijke en vrouwelijke ratten leeftijd van 3 maanden in deze studie.
  2. Houd dieren in een 12 uur licht / donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.

2. Voorbereiding van de KAX Cocktail for Animal Anesthesie

  1. Los 50 mg xylazine (20 mg / ml) in 5 ml ketamine (100 mg / ml) met 1 ml acepromazine (10 mg / ml) en 3 ml gedestilleerd water. Meng goed.
  2. Steriliseren met een spuitfilter en bewaar deze oplossing in een 10 ml serum flessen.

3. KAX Injection

  1. Weeg dier (g) en opnieuw kooi tot klaar voor injectie.
  2. Injecteer 0,1 ml KAX / 100 g lichaamsgewicht van het dier intraperitoneaal, onder toepassing van een 1 ml insulinespuit met een 28 G naald.
  3. Toestaanvoor dier bewusteloos raken. Controleer reflexen door knijpen de voeten en staart.
  4. Houd alle dieren veilig lab voor de duur van de operatie.
  5. Na de operatie, dieren te vervangen in hun kooien en in RT houden comfortabele tot bewustzijn herwonnen. Alleen dieren terug te keren naar het dier faciliteit wanneer de dieren ontwaken en weer normaal gedrag.

4. voorbereiding op een operatie en Microneedle Assembly

  1. Maak een steriele 2 M NaCl-oplossing.
  2. Gebruik een micro-elektrode trekker (figuur 1C) trekken een 0,86 mm binnendiameter zware gepolijste standaard en dunwandige borosilicaat buis in twee fijn taps toelopende glazen micronaalden (figuur 1D, figuur 1E).
  3. Backfill een micronaald van de voorgaande stap met 2 M zoutoplossing met een opvullen injectienaald en een 1 ml injectiespuit (Figuur 1B). Kraan uit luchtbellen vanaf de punt van de elektrode.
  4. Vul een tweede 1 ml spuit met 2 MNaCl. Sluit een 18 G naald en sluit vervolgens een lengte (ongeveer 10 inch) van polyethyleen buis (figuur 1A). Gebruik de zuiger om de polyethyleen buis met een zoutoplossing te vullen door de naald.
  5. Wanneer zowel de micronaald leidingen zijn gevuld met zoutoplossing zorgvuldig de twee verbinden. Verwijder eventuele lucht in hun samenhang (figuur 2).
  6. Fijn bevel het topje van de microneedle door schrapen het erg licht tegen de nerf van een cursus papieren handdoek.
  7. Weerstand van de micronaald diept de zuiger van de spuit totdat een fijne vloeistofstroom te zien op de papieren handdoek. De stroom vloeistof mag niet breder dan 0,5 mm.

5. Voorbereiding van de Animal

  1. Toepassen 1-2 druppels topisch verdovingsmiddel hoornvlies (proparacaïne hydrochloride oogdruppels, USP, 0,5%). Wacht tot er geen oculaire reflex optreedt.
  2. Trim snorharen met een schaar.
  3. Saturate een katoenen tip applicator met betadine oplossing en swab gebied rond de experimentele oog.
  4. Met behulp van een microscoop, voeg een hemostaat naar de bodem ooglid klem voor het oog uitpuilen, bloot de ader episclerale en oogbeweging te beperken. (Figuur 3, pijlpunt)

6.-Glaucoom inducerende Saline Injection

  1. Wanneer de micronaald montage en de dieren worden bereid, beginnen injecties.
  2. Wanneer het dier wordt bevestigd reageert voeten / staartknijptest worden voorzichtig doorboren ader de episclerale de micronaald door te komen onder een kleine hoek tussen 10 en 20 graden om de ader (figuur 3, witte pijl). Een succesvolle punctie in de ader is duidelijk wanneer bloed in de punt van de micronaald (figuur 3, zwarte pijl).
  3. Langzaam en handmatig injecteren ongeveer 50 pi zoutoplossing in de ader. Dit duurt ongeveer 10 seconden duren. De aderen zal blancheer wit als het zout circuleert through het vaatstelsel (Figuur 4, pijlpunt). Sommige regio's kunnen een bloedrode uiterlijk (figuur 4, pijl) te handhaven.
    1. Voer een tweede injectie in de ader, tegenover de plaats van de eerste, grondig retinale schade aan totale retinale ganglion cellaag waarborgen.
      Opmerking: Binnen minuten, moet men een duidelijk troebel uiterlijk door de iris van het oog te zien als het zout circuleert door het vasculaire systeem.
  4. Laat het tegenovergestelde oog onbehandeld voor gebruik als een interne controle.

7. Animal Recovery

  1. Verwijder de hemostaat.
  2. Gebruik een katoenen applicator triple antibiotische zalf (Zinkbacitracine, neomycine sulfaat, polymysin B sulfaat) van toepassing zijn op de plaats geklemd door de hemostaat en injectieplaatsen. Weefselbeschadiging rond de ogen niet optreedt met de hemostaat.
  3. > Plaats verdoofde dieren in hun kooien op een circulerende warm water deken om prevent onderkoeling. Houd dieren onder observatie tot het bewustzijn en normaal gedrag worden herwonnen. Vervoeren wakker dieren terug naar het dier kolonie. Dierlijke oorsprong in de kolonie tot het moment van opoffering.

8. Animal Sacrifice en Retina Removal

  1. Een maand na de procedure om glaucoom te induceren, worden de dieren gedood door CO 2 stikken en secundaire thoracale punctie.
    1. Plaats het dier in de kamer en doe de deksel op stevig.
    2. Open de CO 2 en gas regelkleppen tot 20% volume / min CO 2 verplaatsing van toelaten zuurstof in de kamer.
    3. Laat vier tot 5 min voor het dier te vervallen.
    4. Schakel beide kleppen.
    5. Verwijder dier uit de kamer en het uitvoeren van een secundaire thoracale punctie met een steriele scalpel.
  2. Na euthanasie Gebruik een scalpel om het bindweefsel in de orbitale holte rond het oog, bei gesnedenng voorzichtig niet te snijden in de oogbol zelf.
  3. Gebruik gebogen rand schaar voorzichtig naar de oogzenuw en het resterende weefsel gesneden om de intacte oogbol extraheren. Plaats gewonnen oogbol in een steriele 60 mm x 15 mm wegwerp petrischaal met vers PBS.
  4. Maak een oogdop van de oogbol. Om dit te doen, maak een kleine incisie met de scalpel juist achter bij de grens tussen de iris en de sclera. Volg de insnijding rond de omtrek van het oog met spring schaar om het hoornvlies van de oogbol hemisfeer verwijderen. De halve bol verbonden met de oogzenuw blijft.
  5. Vind de zeer dunne roze / beige retina in de oogschelp van de geëuthanaseerd dier. Houd de gepigmenteerde laag van het netvlies met stompe tang om de oogschelp stabiliseren. Met een paar gesloten tang om zachtjes plagen de gehele intacte retina weg van de achterkant van het oog. Vermijd knijpen, trekken, of direct trekken het netvlies.
  6. Gebruik maken van kleine lente schaar om de knippenwaar de oogzenuw nog aan het netvlies.
  7. Zorg ervoor dat u weg te snijden eventueel resterende pigment epitheel of sclerale weefsel van het netvlies.
  8. Met behulp van een overdracht pipet zachtjes de geïsoleerde retina brengen naar een schone Sylgard beklede 35 mm x 10 mm petrischaaltje met vers PBS.

9. Whole-Mount Retina Voorbereiding

  1. Eenmaal in de Sylgard schotel, een tang en een cactus naald aan het netvlies pin op zijn plaats. Houd de retinale ganglion cellaag naar boven en de oogzenuw naar beneden. halfronde vorm van het netvlies is opmerkelijk, zelfs na fixatie. De kromming van het netvlies zal krullen naar het plafond bij de retinale ganglion cellaag in de gewenste oriëntatie.
  2. Gebruik maken van kleine schaar om het netvlies te snijden in vier kwadranten, waardoor de vorm van een klavertje vier uitlopen van de oogzenuw hoofd.
  3. Speld de kwadranten van het netvlies met extra cactusnaalden de retina zo plat mogelijk maken without strekken (figuur 5).
  4. Bevestig de gespelde netvlies in de Sylgard schotel met 3 ml 4% paraformaldehyde O / N bij kamertemperatuur.

10. Antilichaam kleuring van de Retina

Opmerking: Stain vaste netvlies met primaire en secundaire antilichamen voor het bekijken van neuronen in de retina (Figuur 6).

  1. Spoel vast, een flatscreen-gemonteerde netvliezen drie keer gedurende 2 minuten elk in PBS.
  2. Permeabilize het netvlies met 1% Triton X-100 met 1% foetaal bovien serum in PBS gedurende 60 min.
  3. Spoel netvlies driemaal 2 minuten elk met PBS.
  4. Spoel tweemaal met 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  5. Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  6. Incuberen met 1% Triton X-100 en 1% foetaal runderserum in PBS bij kamertemperatuur gedurende 45 min.
  7. Spoel tweemaal met 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  8. Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  9. Incubeer elke retina in 3 ml 1% foetaal runderserum in PBSmet gezuiverd muis-anti-rat CD90 / muis CD90.1 (1: 300 verdunning) O / N bij RT.
  10. Spoel netvlies eenmaal met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten.
  11. Spoel tweemaal met PBS, 5 minuten per wasbeurt.
  12. Incubeer elke retina in 3 ml PBS (zonder FBS) met secundaire Alexa Fluor 594 geit anti-muis IgG (1: 300) O / N bij kamertemperatuur.
  13. Was netvliezen met PBS royaal.
  14. Met behulp van een microscoop ontleden, verwijder voorzichtig cactus naalden van het netvlies.
  15. Voorzichtig overdracht netvliezen op microscoopglaasjes met een transfer pipet. Zorg ervoor dat u oriëntatie retinale ganglion cellaag gericht naar het plafond te behouden. halfronde vorm van het netvlies is opmerkelijk, zelfs na fixatie. De kromming van het netvlies zal krullen naar het plafond bij de retinale ganglion cellaag in de gewenste oriëntatie.
  16. Absorberen overtollige PBS met KimWipe of andere dergelijke absorberend materiaal. Wees voorzichtig het netvlies niet te absorberen.
  17. Voeg 5 druppels ½ glycerol en ½ PBS per gewicht als ochtendtijdounting media.
  18. Bedek retina met dekglaasje, het vermijden van luchtbellen.
  19. Secure dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak, lijm of andere lijm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit gedeelte van de inrichting onderdelen en procedure voor glaucoom-achtige omstandigheden in een in vivo ratten glaucoom te induceren. We tonen de afzonderlijke gereedschappen en apparatuur die een hypertone zoutoplossing of een stijging van de intraoculaire druk veroorzaakt voeren. We tonen de injectie in de episclerale veneuze plexus met zijn karakteristieke blancheren effect en de vertroebeling van de voorste kamer dat resulteert. We beschrijven ook het proces van het netvlies te verwijderen en een flatscreen-montage voor de analyse van verloren RGC. Tenslotte tonen de effecten van de injectie op retinale overleving ganglioncellen. De verdeling van RGC is ongelijk in verschillende regio's van de rat retina, worden afbeeldingen verkregen van vier 200 urn 2 regio's in elke retina, 4 mm van het centrum van de optische zenuwkop. Het totale aantal gelabelde RGCs Thy 1,1 in elke sectie geteld, gemiddeld en vergeleken in experimentele en contr ol netvliezen 31. Bij deze methode RGC tellingen veranderd van gemiddeld 225 in een beeld van onbehandelde voorwaarden 168 één maand na de glaucoom-achtige omstandigheden induceren (N = 30). Bij elkaar genomen, kan de hier geschetste procedures te volgen stap voor stap naar de dood van retinale ganglion cellichamen en axonen analyseren.

Figuur 1
Figuur 1. Microneedle Components. (A) Spuit met polyethyleen buis gebruikt voor zout injectie. (B) Backfill spuit gebruikt om de borosilicaat microneedle opvulling. (C) Narishige elektrode puller gebruikt om borosilicaat micronaalden te maken. (D) Borosilicaatglas elektroden voor en na wordt getrokken in de elektrode trekker. (E) Vergrote weergave van de micro-elektrode naaldtip na wordt getrokken.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Compleet Microneedle Vergadering. Microneedle verbonden aan polyethyleen buis verbonden met spuit met hypertone zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Glaucoom-inducerende Saline Injectie in de episclerale Veneuze Plexus. Afbeelding van een zoutoplossing injectie in de ader episclerale van een levend, verdoofd Long Evans rat. De pijlpunt geeft de locatie van de hemostaat gebruikt om de ogen zwellen en zijn beweging te voorkomen. De witte pijl geeft de locatie van de geïnjecteerde ader. De zwarte pijl geeft bloed terug stroomt in de microneedle tip aangeeft succesvolle ader punctie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Blancheren effect van hypertone zoutoplossing Injectie. Afbeelding van de rat oog wordt geïnjecteerd met hypertone zoutoplossing. De pijlpunt toont het karakteristieke blancheren effect van zout in de episclerale veneuze plexus. De pijl geeft een deel van de episclerale veneuze plexus die nog niet heeft geblancheerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Figuur 5. Flat-mount van Rat Retina. Beeld van de hele mount netvlies van de rat oog verwijderd en speldde flat in een Sylgard schotel met behulp van cactus naalden. De zwarte pijl geeft de oogzenuw hoofd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Schade aan retinale ganglioncellen na glaucoom-inducerende Surgery. Vergelijking van onbehandelde oog (A) experimentele oog (B) één maand na glaucoom induceren saline injectie. Netvliezen werden gemerkt met een antilichaam tegen het marker RGC, Thy 1,1 (CD90). Dunne pijlen geven individuele RGC in de controlegroep en experimentele omstandigheden. De procedure leidt tot een vermindering van het aantal RGC, defasciculatie van de axonen uit de belangrijkste axon bundels, en verstoring van de circulariteit van de resterende RGC. Blok pijlen geven de karakteristieke defasciculating axonen voortvloeit uit de saline injectie. De pijlpunt toont een bloedvat in de retina. Double-ended pijlen label axon bundels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het induceren glaucoom-achtige omstandigheden in een in vivo rattenmodel. In deze procedure wordt een injectie van hypertone zoutoplossing om littekenvorming te induceren in het trabeculaire netwerk 29, 32. Ontwikkeling littekenweefsel afsluit de uitstroom van waterige humor waardoor de druk in de voorste kamer toeneemt. Met een verminderde uitstroom en drukopbouw, de lens opgehangen aan elastische ligamenten duwt terug in het glasvocht kamer. Glasvocht geldt dan de druk op het netvlies schade aan het kwetsbare netvlies neuronen. Onze resultaten met deze procedure blijkt dat retinale ganglion cel aantallen beginnen te slinken in 2 weken met aanzienlijk verlies van ganglion cel verlies op 1 maand na de procedure.

Dit protocol is slechts één werkwijze voor het induceren glaucoom bij knaagdieren. Er zijn vele andere experimentele modellen waarin schade aan retinale ganglioncellen wordt bereikt hetzij door een toename van intraoculaire druk of door directe damage aan de oogzenuw 30. Vaak zijn deze werkwijzen ontwikkeld in grotere dieren en aangepast voor toediening aan muizen en ratten 33. Intraoculaire injecties van toxinen zoals staurosporine 34 en NMDA, de niet-hydrolyseerbare analogon 35 glutamaat induceren snelle retinale ganglion celdood. Studies hebben echter aangetoond dat dergelijke toxinen volgen een dosis-response curve in muizen en andere dan de beoogde ganglioncellen 35 effect cellen. Bovendien, de schade aan retinale ganglioncellen in dit model is veel directer dan de geleidelijke progressie van humaan glaucoom.

Directe schade aan de oogzenuw kan ook worden toegebracht. Laser axotomy is een veel voorkomende manier om de axonen die deel uitmaken van de oogzenuw in muizen 36 te verbreken. Deze werkwijze geeft een aantal complicaties. De geringe omvang van knaagdier banen bemoeilijkt de oogzenuw nauwkeurig beschadigen zonder dat de bloedstroom door de centrale retinale arterieen ader. Daarom maken sommige onderzoekers gebruiken een meer invasieve benadering die het verwijderen van een klein deel van de hersenen om beter toegang tot de oogzenuw 37 verschaffen. Oogzenuw verpletteren modellen toegang tot de oogzenuw intraorbitally ook. In dit model wordt de zenuw geknepen door zelfsluitende pincet en oculaire bloedstroom niet wordt aangetast. Deze procedure leidt tot een directe belediging en synchrone dood van retinale ganglion cel. Studies met behulp van dit model tonen een significant verlies van RGC 38. Echter, sommige mensen beweren dat het meer schade dan dat veroorzaakt door verhoogde IOP alleen 39 kunnen veroorzaken. Bovendien wordt glaucoom gekenmerkt door een langzame, chronische asynchrone verlies van retinale ganglioncellen 33, 39-42 .Daarom, het tijdsverloop en de onderliggende mechanismen van schade toegebracht met oogzenuw verpletteren heel anders dan die voorkomt in de menselijke glaucoom zijn. In tegenstelling, het model beschreven in dit document voorkomt de noodzaak van directe access aan de oogzenuw, elimineert dissectie van hersenweefsel, en zorgt voor een geleidelijke retinale ganglion celbeschadiging.

Microbead occlusie modellen van glaucoom gebruik polystyreen of magnetische bolletjes geïnjecteerd in de voorste kamers van ratten of muizen te verheffen IOP. Deze werkzaamheden zijn verricht in muizen en zij laten slechts een laag tot matig niveau van schade in de oogzenuw met grote verschillen in de resultaten en inconsistente gegevens 43-50. Bij gebruik van ratten, de duur van verhoogde IOP te kort om genoeg schade aan cellen 48 veroorzaakt. Zelfs met aanpassingen aan de procedure, het model nog steeds ernstige schade aangericht in korte duur wat neerkomt op een acute neuropathische model in plaats van een chronisch glaucoom model 51. Smedowski et al 43 hebben onlangs een verder gewijzigd microbead procedure ontwikkeld met behulp van een extra initiële 'hoge druk schade "om langer te bereiken duurzame IOP verhoging met chronische schade die does tonen belofte. Meer studies gebruik van deze techniek zijn nodig om dit model verder te valideren.

Modellen van chronische oculaire hypertensie gericht op waterige humor uitstroom belemmeren. Laser fotocoagulatie van de limbale en episclerale venen 52 en episclerale veneuze occlusie 53 zijn twee dergelijke werkwijzen. Er is echter ook aangetoond dat laser ablatie technieken produceren slechts tijdelijke IOP aanzicht en een matig werkelijke celverlies 36, 54-55.

Glaucoom is een chronische ziekte als gevolg van beschadiging en verlies van retinale ganglion cellen waarvan de axonen deel uitmaken van de oogzenuw. Het mechanisme van dit verlies is niet bekend. Terwijl een toename van de intraoculaire druk is kenmerkend risicofactor, hebben sommigen de betrokkenheid van andere factoren voorgesteld. Dergelijke factoren omvatten ontstekingsprocessen, oxidatieve stress, metabolische onregelmatigheden of bloedstroming stoornissen 56-58. Om het precieze mechanisme van cel blootl dood in deze ziekte, onderzoekers nodig eenvoudige, reproduceerbare en functionele wijze nauwkeurig nabootsen voorwaarden vermeld in menselijke glaucoom. Alleen dan kunnen onderzoekers hopen een manier vinden om retinale ganglion cellen te beschermen uit te sterven bedenken. De in dit document beschreven procedure maakt gebruik van een kunstmatig opgewekte verhoging van IOP tot een geleidelijke, onomkeerbaar verlies van retinale ganglioncellen vergelijkbaar met dat bij glaucoompatiënten 31 te produceren. De procedure is minimaal invasief. Aanzienlijke retinale ganglion cel verlies wordt gemeten binnen een maand na de operatie. Deze werkwijze is een belangrijk hulpmiddel voor de studie van glaucoom. Een mogelijke beperking van deze methode is de handmatige injectie van hypertonische zoutoplossing. Hierdoor handmatige methode, kan men verwachten grote variatie in resultaten. Toch hebben wij het blancheermedium effect in de ader die een kritische stap. Als blancheren gebeurt, retinale ganglion cel verlies is altijd tussen de 18 en 29%. Om dit te ondersteunen, zou alle toekomstige studies Modify de procedure routine IOP metingen omvatten opdat deze injecties leiden tot een meetbare toename van de IOP. 29,31. Misschien is dit model van RGC dood zal leiden tot de ontwikkeling van een volledige neuroprotectieve behandeling die de verwoestende gezichtsverlies die miljoenen mensen wereldwijd bestrijdt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Geneeskunde rat glaucoom injectie, Retina whole-mount flat-mount neurowetenschappen retinale ganglioncellen oculaire hypertensie oogziekten
Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter