Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glaukom-induserende prosedyre i en Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Grønn stær er en sykdom i sentralnervesystemet som påvirker gangliecelle (RGCs). RGC aksoner som utgjør synsnerven bære visuelle input til hjernen for visuell persepsjon. Skade på RGCs og deres aksoner fører til synstap og / eller blindhet. Selv om den spesifikke årsaken til glaukom er ukjent, er den primære risikofaktoren for sykdommen er en forhøyet intraokulært trykk. Glaukom-induserende prosedyrer i dyremodeller er et verdifullt verktøy for forskere som studerer mekanismen av RGC død. Slik informasjon kan føre til utvikling av effektive nevrobeskyttende behandlinger som kan hjelpe til å forebygge synstap. Protokollen i dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for å indusere glaukom - lignende forhold i en in vivo rottemodell hvor 50 pl av 2 M hypertonisk saltløsning injiseres inn i episcleral venous plexus. Blanchering av fartøyene indikerer vellykket injeksjon. Denne prosedyren fører til tap av RGCs å simulere glaukom. En måned etterinjeksjon, blir dyrene avlivet og øynene er fjernet. Deretter blir hornhinnen, linsen og glasslegemet fjernes for å gjøre en øyemusling. Netthinnen er deretter skrelles fra baksiden av øyet og festet på Sylgard retter med kaktus nåler. På dette punktet, kan nevroner i netthinnen bli farget for analyse. Resultater fra dette laboratoriet viser at ca 25% av RGCs er tapt innen en måned etter inngrepet i forhold til internkontroll. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for kvantitativ analyse av gangliecelle død i en in vivo-rottemodellen glaukom.

Introduction

Grønn stær er en gruppe av øyesykdommer som påvirker nervecellene i netthinnen, spesifikt, gangliecelle 1-2. Aksonene av disse cellene konvergerer til å bli den optiske nerven bære visuell informasjon til hjernen hvor synet oppfattes. Skade på RGCs og deres aksoner fører derfor visuelle defekter.

Den primære egenskaper knyttet til glaukom lidelser er RGC degenerasjon og død, økt intraokulært trykk (IOP), og optisk disk kopping og atrofi. Disse funksjonene føre til tap av synsfelt eller fullstendig, irreversibel blindhet. Foreløpig har glaukom forårsaket blindhet i 70 millioner mennesker verden over 3. Som sådan, er det verdens tredje største årsaken til blindhet 4.

Den eksakte mekanismen for RGC død i glaukom er ukjent. Mye forskning har blitt gjort for å løse mysteriet. Det er imidlertid kjent at den primære risikofaktoren av glaukom er en økning in intraokulært trykk på grunn av uregelmessig sirkulasjon av vandig humor (AH) i det fremre kammer av øyet. AH fungerer som en gjennomsiktig og fargeløst erstatning for blod i avascular fremre kammer av øyet. Det gir næring til omkringliggende cellene, fjerner utskilte avfallsprodukter fra stoffskiftet, transporterer nevrotransmittere, og tillater sirkulasjon av narkotika og inflammatoriske celler i øyet under patologiske tilstander 1.

Vedlikehold av kammer sirkulasjon innebærer ciliarkropp og trabekelverket. Vandig humor er produsert av ciliarkropp. Den strømmer deretter inn i det fremre kammer for å opprettholde den generelle helsen til okulært vev. 75 - 80% av vandig humor utstrømning aktivt utskilt gjennom ikke-pigmentært ciliarepitelet når fluidet filtreres gjennom tre lag av svampaktig vev i siliærmuskel. Væsken ut gjennom trabekelverket og gjennom Schlemm Canal som gripertallet inn i blodsystemet fem sikret resterende 20 - 25% av utstrømming forbigår trabekelverket og passivt skilles ut av ultrafiltrering og spredning gjennom uveo-skleral veien. Denne reaksjonsvei synes å være forholdsvis uavhengig av intraokulært trykk 1.

Når vandig humor produksjon og utstrømning er ute av balanse, trykket bygger i øyet. Som nevnt, er denne økningen i intraokulært trykk den primære risikofaktor i utviklingen av grønn stær. Slikt trykk forårsaker skade på intrikate lag av nevroner i netthinnen ved den bakre del av øyet. Skader på gangliecelle aksoner av synsnerven får hjernen til å ikke lenger motta nøyaktig visuell informasjon. Som et resultat, er oppfatningen av syn tapt og fullstendig blindhet kan forekomme.

Til dags dato er det ingen kur for glaukom. Ulike behandlingsmetoder finnes som først og fremst tar sikte på å redusere intraokulært trykk. Disse inkluderer aktuellmedisinering klasser som beta1-adrenerge reseptorblokkere, eller aktuelle prostaglandinanaloger. Betablokkere reduserer intraokulært trykk ved å redusere produksjon av vandig humor 7. Prostaglandiner fungere for å redusere IOP ved å øke drenasjen av kammervann 8-14. Alfa-adrenerge agonister og karboanhydrasehemmere blir også brukt som sekundære fremgangsmåter for behandling. Alpha adrenerge agonister øke utstrømningen gjennom uveoskleral vei 15-17. Karboanhydrasehemmere redusere produksjonen av AH ved enzymatisk inhibering 18. Mye mer invasive prosedyrer blir også brukt til å behandle glaukom. Laser tabekuloplasti brukes til å øke utstrømningen av vandig humor 19. En annen kirurgisk behandling, kalt trabeculectomy, skaper en alternativ drenerings området for å filtrere AH når den tradisjonelle trabekulært veien er blokkert 20-21.

Disse behandlingsalternativene har vært kjent for å effectively redusere IOP. Men opp til 40% av glaukom pasientene viser normale IOP nivåer indikerer et behov for mer komplette terapeutiske metoder. 22,23 tillegg er gangliecelle død sett i glaukom irreversibel når den begynner og nåværende behandlinger ikke stoppe utviklingen av sykdommen 24-28. Dette har aktualisert behovet for effektive nervecellene behandlinger som er rettet mot overlevelse av nevronene selv. Utvikling av glaukom modeller er avgjørende for denne utviklingen.

I denne studien viser vi en fremgangsmåte for å indusere glaukom-lignende effekter hos voksne Long Evans-rotter ved anvendelse av en modifisert prosedyre som opprinnelig er beskrevet av Morrison 29. I denne prosedyren, injeksjoner med 2 M hypertonisk saltløsning inn i episcleral venøse pleksus induserer glaukom-lignende betingelser ved arr vev for å redusere vannvæske utstrømning i trabekelverket som fører til en økning i intraokulært trykk og et betydelig tap av RGCs wTVen på en måned av prosedyren 30-31. Glaukom-induserende prosedyrer, slik som den er beskrevet her, kan være nøkkelen til å låse opp nye utbygginger i glaukom behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som bruker dyr fag har vært i samsvar med kravene i den Institute of Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Western Michigan University.

1. Dyr

  1. Bruk hann- og hunnrotter 3 måneders alder i denne studien.
  2. Holde dyr i en 12 timers lys / mørke syklus med fri tilgang til mat og vann.

2. Utarbeidelse av KAX Cocktail for Animal Anesthesia

  1. Oppløs 50 mg xylazin (20 mg / ml) i 5 ml ketamin (100 mg / ml) med 1 ml acepromazin (10 mg / ml) og 3 ml destillert vann. Bland grundig.
  2. Sterilisere med et sprøytefilter og lagre denne oppløsning inn i en 10 ml serumflaske.

3. KAX Injection

  1. Vei dyr (g) og gå tilbake til buret før du er klar for injeksjon.
  2. Injiser 0,1 ml KAX / 100 g dyrekroppsvekt intraperitonealt anvendelse av en 1 ml insulinsprøyte med en 28 G nål.
  3. Tillatefor dyr til å bli bevisstløs. Sjekk reflekser ved å knipe føtter og hale.
  4. Hold alle dyrene trygt i laboratoriet for varigheten av operasjonen.
  5. Post-kirurgi, erstatte dyr i burene sine og holde komfortabel i RT til bevissthet er gjenvunnet. Bare returnere dyr til dyr anlegget når dyrene vekke og gjenoppta normal oppførsel.

4. Forberedelse til kirurgi og Microneedle Assembly

  1. Lag en steril 2 M NaCl-løsning.
  2. Bruk en microelectrode avtrekker (figur 1C) å trekke en 0,86 mm indre diameter tung polert standard og tynne vegger borosilikat rør inn i to fint koniske glassmikronåler (figur 1D, figur 1E).
  3. Fylling en Microneedle fra forrige trinn med 2 M saltvann ved hjelp av en tilbakefylling sprøyte nål og en 1 ml sprøyte (figur 1B). Trykk ut luftbobler fra spissen av elektroden.
  4. Fyll en andre en ml sprøyte med 2 MNaCl. Koble en 18 G nål og deretter legge en lengde (ca 10 inches) av polyetylen rør (figur 1A). Bruk sprøytestempelet for å fylle polyetylen rør med saltvann gjennom nålen.
  5. Når både Microneedle og slangen er fylt med saltvann, koble de to nøye. Eliminere enhver luft i forbindelsen mellom dem (figur 2).
  6. Fint bevel tuppen av Microneedle ved å skrape det veldig lett mot korn av et kurs papirhåndkle.
  7. Kontroller motstanden i Microneedle ved å skyve stempelet i sprøyten til en fin strøm av væske kan ses på papirhåndkle. Strømmen av væske bør ikke være bredere enn 0,5 mm.

5. Utarbeidelse av Animal

  1. Påfør 1 - 2 dråper lokalanestetikum i hornhinnen (Proparacaine hydroklorid øyedråper, USP, 0,5%). Vent til ingen okulær refleks oppstår.
  2. Trim værhår med saks.
  3. Saturate en bomullstupp applikator med Betadine løsning og pinne området rundt den eksperimentelle øyet.
  4. Ved hjelp av et mikroskop, feste en pinsetten til å klemme den nederste øyelokket til å bule øyet, utsett episcleral venen og begrense øyebevegelser. (Figur 3, pilspiss)

6. Glaukom-induserende Saline Injection

  1. Når Microneedle montering og dyret er forberedt, begynner injeksjoner.
  2. Når dyret er bekreftet å være ikke svarer til fot / hale knipe, nøye pierce episcleral vene med Microneedle ved å komme til en lav vinkel mellom 10 og 20 grader til venen (Figur 3, hvit pil). En vellykket punktering i venen er tydelig når blod kommer inn i spissen av Microneedle (figur 3, sort pil).
  3. Sakte og manuelt injisere ca 50 mL saltvann inn i venen. Dette bør ta ca 10 sek. Venene vil forvelle hvite som salt sirkulerer through blodkar (figur 4, pilspiss). Noen regioner kan opprettholde et blodrødt utseende (figur 4, pil).
    1. Utfør en andre injeksjon i venen, motsatt side av den første, for å sikre grundig retinal skade hele gangliecelle lag.
      Merk: I løpet av minutter, bør man se en tydelig skyet utseende gjennom iris i øyet som salt sirkulerer gjennom karsystemet.
  4. La det motsatte øye ubehandlet for bruk som en intern kontroll.

7. Animal Recovery

  1. Ta pinsetten.
  2. Bruk en bomulls applikator å søke trippel antibiotisk salve (Bacitracin sink, neomycin sulfate, polymysin B sulfat) til området klemt av pinsetten og til injeksjonssteder. Vevsskade rundt øyet forekommer ikke ved hjelp av pinsetten.
  3. > Plasser bedøvet dyr i burene på en sirkulerende varmt vann teppe til prevent nedkjøling. Holde dyr under observasjon til bevissthet og normal oppførsel er gjenvunnet. Transportere våken dyrene tilbake til dyret kolonien. Dyr forblir i kolonien frem til tidspunktet for offer.

8. Animal Sacrifice og Retina fjerning

  1. En måned etter inngrepet for å indusere glaukom, blir dyrene avlivet ved CO 2 kvelning og videregående thorax punktering.
    1. Plasser dyret i kammeret og sette lokket på en sikker måte.
    2. Åpne CO 2 og gass regulator ventiler slik at 20% volum / min CO 2 forskyvning av oksygen i kammeret.
    3. Tillat fire til fem minutter for dyret å utløpe.
    4. Slå av begge ventiler.
    5. Fjern dyr fra kammeret og utføre en sekundær bryst punktering med en steril skalpell.
  2. Etter dødshjelp, bruk en skalpell til å kutte bindevevet i orbital hulrom rundt øyet, being forsiktig med å skjære inn i øyeeplet selv.
  3. bruke forsiktig buede kanten saks for å klippe den optiske nerven og eventuelle gjenværende vev til å trekke den intakte øyeeplet. Plasser ekstrahert øyeeplet i et sterilt 60 mm x 15 mm engangs petriskål som inneholdt frisk PBS.
  4. Lag en øyemusling fra øyeeplet. For å gjøre dette, gjør et lite snitt med skalpell bare posterior til grensen mellom iris og sclera. Følge av dette innsnitt rundt omkretsen av øyet med små fjær saks for å fjerne hornhinnen halvkule fra øyeeplet. Den halvkule som er koblet til den optiske nerven gjenstår.
  5. Finn den svært tynn rosa / beige hinnen inne i øyemusling fra avlives dyret. Hold pigmentert lag av netthinnen med avstumpet tang for å stabilisere eyecup. Bruke et annet par av lukkede tang til meget forsiktig erte hele intakte hinnen ut av baksiden av øyet. Unngå å knipe, dra, eller rykke netthinnen direkte.
  6. Bruk små våren saks for å klippeOmrådet der synsnerven er fortsatt festet til netthinnen.
  7. Pass på å skjære vekk eventuelle gjenværende pigment epitel eller scleral vev fra netthinnen.
  8. Ved hjelp av en overføring pipette, meget forsiktig overføre den isolerte netthinnen til en ren Sylgard belagt 35 mm x 10 mm petriskål som inneholdt frisk PBS.

9. Hel-Mount Retina Forberedelse

  1. En gang i Sylgard fatet Bruk pinsett og en kaktus nål for å feste netthinnen på plass. Hold gangliecelle lag vender opp og synsnerven ned. Netthinnen er halvkuleform er bemerkelsesverdig, selv etter fiksering. Krumningen på netthinnen vil krølle mot taket når gangliecelle laget er i ønsket retning.
  2. Bruk liten saks til å klippe netthinnen i fire kvadranter, noe som gjør formen på en fire firkløver stråler fra synsnervehodet.
  3. Pin kvadrantene i netthinnen med flere kaktus nåler for å gjøre netthinnen så flat som mulig withoUT stretching (figur 5).
  4. Fest låste netthinne i Sylgard parabolen med 3 ml 4% paraformaldehyde O / N på RT.

10. Antistoff Farging av Retina

Merk: Stain faste netthinne med primære og sekundære antistoffer for visning nevroner i netthinnen (figur 6).

  1. Skyll faste, flate montert netthinne tre ganger for 2 min hver i PBS.
  2. Permeabilize netthinne med 1% Triton X-100 med 1% føtalt bovinserum i PBS i 60 min.
  3. Skyll netthinne tre ganger, to minutter hver, i PBS.
  4. Skyll to ganger med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 minutter per vask.
  5. Skyll to ganger med PBS, 5 minutter per vask.
  6. Inkuber med 1% Triton X-100 og 1% føtalt bovint serum i PBS ved romtemperatur i 45 min.
  7. Skyll to ganger med 0,1% Triton X-100 i PBS, 5 minutter per vask.
  8. Skyll to ganger med PBS, 5 minutter per vask.
  9. Inkuber hver netthinnen i 3 ml 1% føtalt bovint serum i PBSmed renset mus anti-rotte CD90 / mus CD90.1 (1: 300 fortynning) O / N på RT.
  10. Skyll netthinne en gang med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  11. Skyll to ganger med PBS, 5 minutter per vask.
  12. Inkuber hver netthinnen i 3 ml PBS (uten FBS) med sekundære Alexa Fluor 594 geit-anti-mus IgG (1: 300) O / N ved RT.
  13. Vask netthinne med PBS liberalt.
  14. Ved hjelp av en dissekere mikroskop, forsiktig fjerne kaktus nåler fra netthinnen.
  15. Forsiktig overføre netthinne på objektglass med en overføring pipette. Sørg for å opprettholde orientering med gangliecelle lag vendt mot taket. Netthinnen er halvkuleform er bemerkelsesverdig, selv etter fiksering. Krumningen på netthinnen vil krølle mot taket når gangliecelle laget er i ønsket retning.
  16. Absorbere overflødig PBS med Kimwipe eller andre slike absorberende materiale. Vær forsiktig med å absorbere netthinnen.
  17. Tilsett 5 dråper ½ glyserol og ½ PBS vekt som amounting medier.
  18. Dekk retina med dekkglass, unngå luftbobler.
  19. Sikker dekk bruker klar neglelakk, lim eller andre lim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette avsnittet illustrerer apparatet komponenter og prosedyre som brukes til å indusere glaukom lignende forhold i en in vivo rotte glaukom modell. Vi viser de enkelte verktøy og utstyr som brukes til å utføre en hyperton saltvanns injeksjon som fører til en økning i intraokulært trykk. Vi viser injeksjon i episcleral venous plexus med sin karakteristiske bleking effekt og uklart utseende av den fremre kammer som resultat. Vi beskriver også prosessen med retina fjerning og flatskjerm-montering for analyse av tapte RGCs. Til slutt viser vi effektene av injeksjons på gangliecelle overlevelse. Som fordelingen av RGCs er ujevn i ulike regioner av rotte netthinnen, er bilder hentet fra fire 200 mikrometer 2 regioner i hvert hinnen, 4 mm fra sentrum av synsnervehodet. Det totale antall Thy 1.1 merkede RGCs i hver del telles, gjennomsnitt og sammenlignet i eksperimentell og kontr ol netthinne 31. Ved hjelp av denne metoden, RGC teller endret fra et gjennomsnitt på 225 i et bilde av kontroll ubehandlede forhold til 168 en måned etter inngrepet for å indusere glaukom-lignende tilstander (N = 30). Til sammen kan de prosedyrene som er beskrevet her følges trinn for trinn for å analysere død gangliecelle organer og aksoner.

Figur 1
Figur 1. Microneedle Components. (A) sprøyte med polyetylen rør brukes til saltvann injeksjon. (B) fylling sprøyte brukes til å etterfylle borosilicate Microneedle. (C) Narishige elektrode avtrekker brukes til å lage borosilicate mikronåler. (D) borsilikatglass elektroder før og etter blir dratt i elektroden avtrekker. (E) Forstørret visning av microelectrode nålespissen etter å ha blitt trukket.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Komplett Microneedle forsamlingen. Microneedle festet til polyetylen rør festet til sprøyten med hyperton saltvannsoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Glaukom-induserende Saline Injeksjon i Episcleral Venøs Plexus. Bilde av saltvann injeksjon i episcleral åre av en levende, bedøvet Long Evans rotte. Pilspissen angir plasseringen av pinsetten som brukes til å bule øyet og hindre dens bevegelse. Den hvite pilen viser plassering av den injiserte vene. Den svarte pilen viser blod tilbake strømmer inn i Microneedle tips indikerer vellykket vene punktering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Blanche Effekt av Hyperton Saline Injection. Bilde av rotte øyet blir injisert med hyperton saltvannsoppløsning. Pilspissen viser karakteristiske blanche effekten av saltvann i episcleral venøs plexus. Pilen viser en del av episcleral venous plexus som ennå ikke har forvellet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Figur 5. Flat-mount av Rat Retina. Bilde av hele mount hinnen fjernet fra rotte øyet og festet flatt i en Sylgard rett med kaktus nåler. Den svarte pilen indikerer synsnervepapillen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Skade på gangliecelle etter Glaukom-induserende kirurgi. Sammenligning av kontroll ubehandlede øye (A) til eksperimentelle øye (B) en måned etter å ha fått glaukom indusere saltvann injeksjon. Netthinne ble merket med et antistoff mot RGC markør, Thy 1,1 (CD90). Tynne piler indikerer individuelle RGCs i både kontroll og eksperimentelle forhold. Fremgangsmåten fører til en reduksjon i antallet RGCs, DELeamus av aksonene utenfor hoved axon bunter, og forvrengning til sirkularitet av gjenværende RGCs. Blokk piler indikerer de karakteristiske defasciculating aksoner som følge av saltvann injeksjon. Pilspissen viser en blodåre inne i netthinnen. Dobbelt ended piler label axon bunter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å indusere glaukom lignende forhold i en in vivo-rottemodellen. Denne fremgangsmåten bruker en injeksjon av hyperton saltvannsoppløsning for å indusere arrdannelse i trabekelverket 29, 32. Utvikling arrvev tetter utløpet av kammervann som øker trykket i fremre kammer. Med redusert strøm og trykkoppbygging, linsen opphengt ved hjelp av elastiske ligamenter skyver tilbake inn i glasskammeret. Glasslegemet gjelder da press på netthinnen skade den skjøre netthinnens nerveceller. Våre resultater ved hjelp av denne prosedyren viser at gangliecelle tallene begynner å synke på 2 uker med betydelig tap av ganglion celle tap på en måned etter prosedyren.

Denne protokollen er bare en metode til å indusere glaukom hos gnagere. Det er mange andre eksperimentelle modeller i hvilke skader på gangliecelle skjer enten ved en økning i intraokulært trykk eller ved direkte damage på synsnerven 30. Ofte har disse fremgangsmåter er utviklet i større dyr og modifisert for anvendelse på mus og rotter 33. Intraokulære injeksjoner av giftstoffer som staurosporin 34 og NMDA, den ikke-hydrolyserbare analoge glutamat 35 indusere hurtig gangliecelle død. Studier har imidlertid vist at slike toksiner følger en dose-responskurve hos mus og på andre deler enn de target-gangliecellene 35 celler. I tillegg er skade på gangliecelle i denne modellen er mye mer direkte enn den gradvis progresjon av menneskelig glaukom.

Direkte skade på synsnerven kan også bli påført. Laser aksotomi er en vanlig måte å kutte axoner som utgjør synsnerven i mus 36. Men, presenterer denne metoden noen komplikasjoner. Den lille størrelsen på gnagere baner gjør det vanskelig å nøyaktig skade på synsnerven uten å påvirke blodstrøm gjennom den sentrale retinal arterieog vene. For å overvinne dette, noen forskere benytte en mer invasiv metode involverer fjerning av en liten del av hjernen for å gi bedre tilgang til den optiske nerven 37. Optic nerve knuse modeller tilgang til synsnerven intraorbitally også. I denne modellen er det nerve i klem av selvlukkende pinsett og okulær blodstrømmen ikke er svekket. Denne prosedyren gir en umiddelbar fornærmelse og synkron død gangliecelle. Studier ved hjelp av denne modellen viser betydelig tap av RGCs 38. Men noen hevder at det kan indusere mer skade enn det som forårsakes av forhøyet IOP alene 39. I tillegg er glaukom preget av langsom, kronisk, asynkron tap av gangliecelle 33, 39-42 .Derfor, tidsforløpet og underliggende mekanisme for skader påført med synsnerven knuse kan være ganske annerledes enn det som forekommer i menneskelig glaukom. I motsetning til modellen beskrevet i dette dokumentet unngår behovet for direkte tilbess på synsnerven, eliminerer disseksjon av hjernevev, og åpner for gradvis gangliecelle skade.

Mikro okklusjon modeller av glaukom bruk polystyren eller magnetiske kuler injisert inn i fremre kammer av rotter eller mus for å heve IOP. Mesteparten av dette arbeidet har blitt gjort på mus, og de ​​viser bare en lav til moderat grad av skader i synsnerven med stor variasjon i resultatene og inkonsekvente data 43-50. Ved bruk av rotter, varighet av forhøyet intraokulært trykk var for kort til å forårsake nok skade på celler 48. Selv med modifikasjoner av fremgangsmåten, modellen fremdeles forårsaket alvorlige skader på kort varighet som tilsvarer en akutt nevropatisk modell i stedet for en kronisk grønn stær modell 51. Smedowski et al 43 har nylig utviklet en ytterligere modifisert mikro prosedyren med en ekstra start 'høytrykksskade "for å oppnå lengre holdbarhet IOP høyde med kronisk skade som does lovende. Flere studier som anvender denne teknikken er nødvendig for å ytterligere bekrefte denne modellen.

Alle modeller av kronisk okulær hypertensjon som mål å hindre kammer strøm. Laser fotokoagulasjon av episcleral og limbale vener 52 og episcleral veneokklusjon 53 er to slike metoder. Imidlertid har det også blitt vist at laserablasjon teknikkene produserer bare forbigående IOP oppriss og et moderat nivå av selve mobil tap 36, 54-55.

Grønn stær er en kronisk sykdom som følge av skade og tap av gangliecelle hvis axoner utgjør synsnerven. Mekanismen for dette tapet er ukjent. Mens en økning i intraokulært trykk er kjennetegnet risikofaktor, er det foreslått å involvering av andre faktorer. Slike faktorer inkluderer inflammatoriske prosesser, oksidativt stress, metabolske uregelmessigheter, eller blodstrømsforstyrrelser 56-58. For å avdekke den nøyaktige mekanismen for cell død i denne sykdommen, forskere trenger enkle, repeterbare, og funksjonelle måter å nøyaktig etterligne forholdene som vises i menneskelig glaukom. Bare da kan forskerne håper å tenke ut en måte å beskytte gangliecelle fra å dø. Prosedyren er beskrevet i denne artikkelen bruker en kunstig indusert heving av IOP for å produsere en gradvis, irreversible tap av gangliecelle lignende som hos glaukom pasienter 31. Prosedyren er minimal invasiv. Betydelig gangliecelle tapet måles innen en måned etter operasjonen. Denne metoden er en viktig verktøy for studier av glaucoma. En potensiell begrensning ved denne metode er den manuelle injeksjon av hypertonisk saltløsning. På grunn av denne manuelle metoden, er det mulig å forvente stor variasjon i resultatene. Vi har imidlertid funnet at blanche virkning i venen for å være et kritisk trinn. Ved bleking inntreffer, er gangliecelle tap alltid mellom 18 og 29%. For å støtte dette, kunne alle fremtidige studier modify prosedyren til å omfatte rutine IOP målinger for å sikre at disse injeksjoner føre til en målbar økning i IOP. 29,31. Kanskje denne modellen av RGC død vil føre til utvikling av en mer fullstendig nervecellene behandling som bekjemper den ødeleggende synstap rammer millioner av mennesker over hele verden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Medisin rotte glaukom injeksjon, retina hel-mount flat-mount nevrovitenskap gangliecelle okulær hypertensjon øyesykdommer
Glaukom-induserende prosedyre i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter