Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

עם כניסתו של -omics גישות הבנתנו את המחלות הכרוניות כמו סרטן ותסמונת מטבולית השתפרה. עם זאת, כריית יעיל של המידע המערך הנתונים גדול בקנה המידה כי מתקבלים microarrays ביטוי גנים, ניסויי רצף עמוקים או פרופיל מטבולים חיונית לחשוף ולאחר מכן למקד בצורה יעילה הרגולטורים הקריטיים של פנוטיפים תא פגועים. קולטן אסטרוגן α (ERα) הוא אחד הגורמים מאסטר תמלול הסדרת תוכניות הגן שחשוב סרטן שד תגובת אסטרוגן. על מנת להבין את תפקידו של ERα איתות במטבוליזם סרטן השד השתמשנו נתונים transcriptomic, cistromic ו metabolomic מתאי MCF-7 שטופלו אסטרדיול. בדו"ח זה תארנו דור של דגימות RNA-seq, שבב Seq וניסויי metabolomics ועל ניתוח חישובית אינטגרטיבית של הנתונים המתקבלים. גישה זו שימושית המגדירה שומה רומןמנגנוני cular ומעגלי רגולטוריות גן מוסדר על ידי גורם שעתוק מסוים אשר משפיע חילוף חומרים של תאים נורמלים או חולים.

Introduction

אסטרוגנים הם הרגולטורים החשובים של תהליכים פיזיולוגיים רבים בשתי נקבות וזכרים כולל רקמות הרבייה, רקמות מטבולית, המוח ועצמות 1. בנוסף השפעות מועילות ברקמות אלה, אסטרוגנים גם לנהוג סרטן עולה חלב ורקמות רבייה. אסטרוגנים בעיקר לעבוד דרך למיונים להשרות סוג תא השפעות ספציפיות. רצף עמוק של תמלילי מוסדר על ידי ERα באמצעות RNA-seq ו הגנום כולו ניתוח אתרי הקישור ERα DNA באמצעות שבב Seq הוכיח להיות שימושי כדי להבין כיצד ERα עובד ברקמות וסוגי סרטן שונים שעולים מהם. אנחנו ואחרים פרסמנו פרופילי ביטוי גנים הקשורים קולטנים שונים (ERα vs ERβ) 2,3, הליגנדים שונים 3-5 ו coregulators השונה 2,4,6,7.

RNA-seq הוא השיטה העיקרית לבחון את transcriptome, מציע דיוק גבוה ויעילות לעומת ba microarrayניתוח ביטוי גנים SED 8. RNA המתקבל שורות תאים 2-4,7, רקמות או דגימות גידולים הם רצף, ממופה מכלולי גנומי זמינים וגנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי מזוהים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא מועסק לנתח את גורם שעתוק coregulator הכרומטין מחייב לאתרים מחייב רגולטוריות ידוע. שבב Seq (שבב ואחריו רצף קצב העברת נתונים גבוה) מספק זיהוי משוחדת של אתרי קישור העולמיים. Metabolomics היא גישה אחרת ביולוגיה מערכתית משמשת יותר ויותר, אשר מודדת באופן כמותי, בתגובת multiparametric הדינמית של מערכות חיות לגירויים שונים, כוללים כימיקלי הפרעות גנטיות.

על ידי ביצוע פרופיל מטבולים עולמי, הודעה תפקודית ניתן המתקבל תאים, רקמות, ודם. בנוסף, מידע מניסויים transcriptome לא תמיד משקפים שינויים בפועל ברמת אנזימי שתורמים הביוכימיים. מְשׁוּלָבניתוח של נתוני transcriptome ו metabolome מאפשר לנו לזהות לתאם שינויים בביטוי גנים עם שינויים המטבוליט בפועל. רתימת מידע מכל מערכי נתונים בקנה מידה גדול אלה מספקים את הפרטים מכניסטית כדי להבין את התפקיד של גורמי שעתוק ויסות מערכות ביולוגיות מורכבות, במיוחד אלה הנוגעים להתפתחות אנושית ומחלות כמו סרטן וסוכרת.

האופי המורכב של הגנום היונק מהווה אתגר לשלב באופן מלא לפרש את הנתונים שהתקבלו מניסויי transcriptome, cistrome ו metabolome. זיהוי אירועים מחייבים פונקציונליים שיובילו שינויים בביטוי של גני היעד חשוב כי אתרי קישור פונקציונליים פעם מזוהות; שהתפתח ניתוח, כולל ניתוח מוטיב שעתוק מחייבים (TF), יכול להתבצע עם דיוק גבוה. זה מוביל לזיהוי מפלים ומנגנוני TF משמעות ביולוגית. כמו כן comparis ישירהעל ניסויים RNA-seq ו-Seq שבב הם לא תמיד אפשרי מאחר שהנתונים כל ניסוי יש שונות קשקשים ורעשים ובמקרים מסוימים להיות מעורפלים ומטושטשים אותות משמעותיים על ידי רעש האוכלוסייה. אנחנו לא מודעים לכל מחקר המשלב את המידע על שלוש גישות עצמאיות אלא קשורות להבין את ויסות חילוף חומרים הישירה ידי ERα בסרטן השד. לכן, המטרה הכללית שלנו במאמר זה היא להתייחס אירועים מחייבים פרודוקטיבי ביטוי גנים ושינויים המטבוליט. על מנת להשיג מטרה זו, אנו משולבים נתוני RNA-seq, שבב Seq ו metabolomics ניסויים וזיהינו אלה אסטרוגן מושרה ERα מחייב אירועים שיגרמו לשינויי ביטוי גני מסלולים מטבוליים. בפעם הראשונה, אנו מספקים מערך שלם של פרוטוקולים (איור 1) להפקת שבב Seq, RNA-seq ו פרופיל metabolomics וביצוע ניתוח אינטגרטיבי של הנתונים לחשוף מעגלי גן רומן ויסות חילוף חומרים של שדשורות תאים סרטניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דוגמאות RNA-seq

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. התרבות התאים MCF7 ב משופר MEM (IMEM) בתוספת אדום בינוני-פנול עם FBS פעיל מקצה 10%, 1% פניצילין / סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2.
      הערה: שורת תאי Same ומצבו תרבית תאים משמשים לאורך כל תקופת המחקר.
    2. זרע 100,000 תאים MCF7 לכל היטב 6 צלחות היטב. יש triplicates עבור כל טיפול. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 2 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 היטב כל אחד. דגירה צלחות עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 2 humidified 5% CO.
    3. כדי לקצור את התאים, להוסיף מגיב בידוד RNA 1 מ"ל (guanidinium חומצה thiocyanate-פנול, כלורופורם) לכל היטב דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). ואז לאסוף מגיב lysate התא על ידי pipetting והפיקדונות לתוך צינורות 1.5 מ"ל
  2. בידוד RNA
    1. הוסף 200 μl chlorofoRM ל מגיב התא lysate 1 מ"ל (1.1.3) ו מערבולת למשך 10 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.. בעקבות צנטריפוגה, ולהעביר את השלב מימית (העליון) לצינור חדש מבלי להפריע בשלבים אחרים.
    2. הוסף 500 μl 100% isopropanol לצינור חדש עם השלב שהועבר-מימי, ומערבב על ידי היפוך. לדגור לילה -20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. שים לב גלול בחלק התחתון של הצינור. בטל supernatant לשטוף את הכדור עם 750 אתנול μl RNase ללא 70% על ידי מערבולת קצרה.
    3. צנטריפוגה דגימות ב 6000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant, צנטריפוגות מדגם ב XG 16,000 עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את כל אתנול הנותרים. הסר את אתנול הנותר על ידי pipetting עם קצה ג'ל טעינה ולהגדיר את הצינוריות בצד למטה אוויר יבש למשך 10 דקות. ממס את הגלולה ב 20-50 מי μl DEPC שטופל depenדינג בגודל של הכדורים.
  3. לטהר את RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA בעקבות פרוטוקול 4. למדוד את ריכוז RNA באמצעות ערכת assay מבוסס fluorometry בעקבות פרוטוקול 9.
    הערה: OD ב 260 ננומטר הוא נלקח על מנת לקבוע את ריכוז RNA ויחס של OD ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר משמשים כדי לקבוע את הטוהר של מדגם. מומלץ לבדוק את איכות RNA באמצעות assay Bio-מנתח.
  4. קח על 0.5 עד 1 מיקרוגרם RNA מטוהרים על רצף.
    הערה: מרכז ביוטק מכין את ספריות רצף ומבצע-סוף לזווג לקרוא רצף בשיטות שפורטו בעבר 2.

2. הכנת מדגם שבב Seq

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. זרע 500,000 תאים MCF7 לכל צלחת 10 ס"מ במדיום הגידול.
      הערה: עבור כל לנתץ 16 צלחות שימשו. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 5 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 לכלצַלַחַת. פנקו את התאים במשך 45 דקות (37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2).
  2. קציר Crosslink ו- Cell
    1. הוסף 250 μl 37% פורמלדהיד לתוך מדיום 5 מ"ל ל crosslink הכרומטין, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. עצור crosslinking ידי שטיפת התאים עם 5 מ"ל קרח קר 1x MEM.
    2. קציר התאים ב 250 תא μl חיץ תמוגה (10 mM EDTA, 50 מ"מ Tri HCl, 1% SDS, 0.5% N, תחמוצת N-dimethyldodecan-1-אמין) לכל צלחת.
  3. פיצול של הכרומטין
    1. Sonicate התאים למשך 30 שניות x 8 ב המגבר של 30 להגיע בגדלים הכרומטין הנדרש. מגניב כל דגימה על קרח לאחר sonication של 30 שניות.
    2. צנטריפוגה ב 16, 000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C, ובזהירות פיפטה supernatant מבלי להפריע גלולה בחלק התחתון.
    3. קחו aliquot 5 μl של supernatant, ולבדוק את גודל ה- DNA על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל 1.5% agarose כפי שתואר לעיל 10. הגודל האידיאלישל ה- DNA צריך להיות בין 200-500 נ"ב.
  4. הכרומטין immunoprecipitation
    1. שמור 25 μl של lysate התא כקלט. בתוך צינור 50 מ"ל, לערבב 4 מ"ל של lysate התא עם 20 מ"ל חיץ IP (2 מ"מ EDTA, 100 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס- HCl, ו -0.5% טריטון X), נוגדן ERα (500 μl F10 ו 500 μl HC- 20), ו -500 μl ProtA ו ProtG חלבון ציפוי חרוזים מגנטיים. דגירה את התערובת על ידי סיבוב ב לילה 4 ° C. כדי לאפשר ההיווצרות של הרכב נוגדן chromatin-.
  5. מתרחץ-crosslinking הפוך
    1. השתמש עמדה מגנטית לאסוף את החרוזים המגנטיים בצד הממוגנט להסיר את החיץ לשטוף.
    2. שטפו את החרוזים המגנטי 25 חיץ מ"ל לשטוף לי (2 מ"מ EDTA, 20 מ"מ טריס HCl, 01% SDS, 1% טריטון X, ו -150 מ"מ NaCl). כדי לשטוף את החרוזים המגנטיים ביסודיות מבלי להפריע מתחמים-חלבון ה- DNA, להוסיף 25 מיליליטר החיץ לשטוף לאט אל הצינור בצד ואז להפוך את הצינורות עד שכל החרוזים המגנטיים הם wi המעורב היטבth למאגר לשטוף מבלי להיראות כמו גלולה. כחלופה, השתמש המסובב כדי להפוך את הצינור. אל מערבולת הדגימות. שטוף את החרוזים המגנטיים תוך שימוש באותה השיטה בשלבים הבאים.
    3. שטפו את החרוזים המגנטי 25 מ"ל Wash חיץ השנייה (EDTA מ"מ 2, 20 מ"מ טריס HCl, 01% SDS, 1% טריטון X, ו- 500 מ"מ NaCl).
    4. שטפו את החרוזים המגנטי 25 מ"ל Wash חיץ III (1.6 mM EDTA, 10 מ"מ טריס HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate ו -250 מ"מ LiCl).
    5. שטפו את החרוזים המגנטי 25 חיץ מ"ל 1x TE (1 mM EDTA, ו -10 מ"מ טריס HCl) פעמיים.
    6. Elute DNA חיץ Elution 500 μl (1% SDS, ו -10 מ"מ NaHCO 3) ולאחר מכן להקצות 500 elution DNA μl לתוך 4 צינורות. עבור DNA מ תשומות, elute DNA ב 125 חיץ Elution μl.
    7. דגירת הצינורות ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה על גוש חימום. מכסים את הצינורות על בלוק חימום ברדיד אלומיניום כדי לשמור על החום אפילו על כל הצינורות. מניחי משקל על הצינורות כדי למנוע מהם הפתיחה. </ Li>
  6. בידוד DNA
    1. מצנן את הצינורות ב RT במשך 5 דקות. לבודד דנ"א דגימות לנתץ באמצעות ערכת בידוד DNA שבב. פעל על פי ההנחיות של היצרן.
      1. לחמם את הצפת elution על 65 מעלות צלזיוס. להוסיף 625 μl חיץ מחייבים על צינור אחד. אם הצורות המשקעות, להוסיף עוד חיץ 250 μl מחייב עד הפתרון הוא ברור.
      2. טען המדגם על הטור צנטריפוגות ב XG 16,000 למשך 30 שניות. לשטוף את המדגם עם 250 חיץ לשטוף μl. זכור להוסיף אתנול למאגר לשטוף כאשר בפעם הראשונה להשתמש בו. חזור על לשטוף.
      3. Elute את ה- DNA ב 15 חיץ Elution μl. מערבבים את הדנ"א של אותה ומורידה מ 4 צינורות להשיג כ -55 DNA μl.
    2. לבודד את ה- DNA קלט באמצעות ערכת טיהור DNA.
      1. לחמם את הצפת elution על 65 מעלות צלזיוס. להוסיף 625 μl חיץ מחייב צינור כל דגירה במשך 10 דקות. טען את המדגם על עמודה collecti 2 מ"לעל הצינור.
      2. לשטוף את המדגם עם 750 חיץ לשטוף μl, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1. חזור על צנטריפוגה כדי להסיר כל חיץ נותר. Elute את ה- DNA לתוך 30 μl של EB.
    3. למדוד את ריכוז ה- DNA באמצעות Assay מסחרי Fluorochrome עם שינוי 11.
      1. לדלל את חיץ TE 20x לתוך 1x TE כמו חיץ assay על דילול הדגימות המגיבות ו- DNA. קחו 5 μl DNA שבודד לדלל אותו לתוך 50 μl ב 1x TE.
      2. מ 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNA פתרון המניות לבצע תקן ה- DNA החל ריק עד 1, 10, 100, 1000 מיקרוגרם / מ"ל. בצלחת 96 היטב, להקצות 25 μl של תקן זה וכן דילול DNA בשני עותקים. (בשלושה עותקים עבור תקן מומלץ.)
      3. כן מגיב עובד על ידי ביצוע דילול פי 200 מן מגיב dsDNA במאגר 1x TE בצינור פלסטיק. מכסה את הפתרון מגיב עובד עם נייר אלומיניום כדי למנוע אור. הוסף 200 μl עובד מגיב לתוך מדגם זה. בcubate בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, כדי למנוע אור.
      4. מדוד את בתפרחת של דגימות באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (עירור ב 480 ננומטר, פליטת 520 ננומטר). צור את עקומת סטנדרט DNA של בתפרחת לעומת ריכוז ה- DNA. קביעת הריכוזים של הדגימות מבוססות על עקומת סטנדרט DNA שנוצרה.
  7. אימות של ניסוי שבב באמצעות qPCR
    1. קח 2 μl מבודד DNA ומדולל לתוך 20 μl במים. הגדר את התגובה qPCR בשלושה עותקים על ידי ערבוב 2.5 דילול DNA μl, 5 μl תערובת אמן גרין ואני PCR, 1 פריימר μl, ו -1.5 מים חינם nuclease μl.
    2. הפעל את qPCR עם המערכת המהירה Real-Time PCR באמצעות התכנית הבאה: שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, חזור על שלב 2 39 פעמים.
  8. שלח 10 ng דגימת DNA למרכז ביוטק עבור סידור.
    הערה: BIOTECמרכז h מכין את ה- DNA שבב לתוך ספריות על פי הוראה, ומבצע רצף חד לקרוא בשיטות שפורטו בעבר 2.

3. Assay Metabolomics הכנת דוגמאות

  1. תרבות טיפול בתאים
    1. זרע 400,000 תאים MCF7 לכל צלחת 10 ס"מ במדיום הגידול. עבור כל טיפול להכין שלוש דוגמאות. השתמש בשתי צלחות בכל מדגם לקבל מספיק תאים לצורך זיהוי. ביום 3, להסיר את בינונית ומוסיפים 5 מ"ל בינוני טרי עם או בלי 10 -8 M E2 אל התאים. פנקו את התאים למשך 24 שעות (37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2).
  2. אוסף דוגמאות
    1. הוסף 5 מ"ל קר כקרח 1x PBS לצלחת, לשאוב את PBS לאחר הטיית בקצרה את הצלחת כמה פעמים. חזור פעמיים, להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר לאחר לשטוף האחרון.
    2. הוסף 750 μl של אצטון טרום קר על כל צלחת לגרד את התאים. מערבבים את התאים אצטון משתי צלחותלצינור 2 מ"ל על הקרח.
    3. תא ספירה לנורמליזציה
      1. עבור כל טיפול, להשתמש בשתי צלחות נוספות עבור כימות תא. לדה-לצרף התאים מהצלחת, להוסיף 2 מ"ל של HE חיץ (1x HBSS, 10 HEPES מ"מ, 0.075% NaHCO 3, ו 1 mM EDTA) אל כל צלחת דגירה במשך 5 דקות.
      2. אסוף ומערבב היטב את התאים על ידי pipetting תאי חיץ HE. מסך השימושים 20 פתרון התא μl לספור את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
  3. אחסן את דגימות ב -80 ° C לפני שליחת למרכז Metabolomics לזהות ולכמת את מטבוליטים באמצעות ספקטרומטריית מסה גז כרומטוגרפיה (GC-MS) ניתוח.

4. ניתוח אינטגרטיבי

  1. RNA-seq ניתוח נתונים:
    1. הפעילו את איכות קבצי FASTQ באמצעות FastQC: קרא QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. בחר FastQC: קרא תחת הכלי של NGS: QC ומניפולציה. העלה את קובץ הנתונים הגולמי histor הנוכחיy.
        הערה: מומלץ לתת כותרת עבור קובץ הפלט כדי להזכיר לך מה את העבודה הייתה שכן יכול להיות במספר יציאות.
    2. Execute ואת קובץ הפלט יופיע תחת ההיסטוריה. חזור על אותו התהליך עבור כל קובץ רצף. מתאמים לקצץ בעזרת קליפ תחת NGS: Toolkit FASTX.
    3. יישר מקריא hg19 באמצעות Tophat2 עם ביאור התייחסות הגנום RefSeq 12 (ערכי ברירת מחדל).
      1. בחר Tophat2 תחת כלי של NGS: ניתוח RNA. ציין את סוג הספרייה לזווג (סוף יחיד vs-סוף לזווג).
      2. העלה קובץ הקלט FASTQ מההיסטוריה הנוכחית. בחר את הגנום התייחסות. בחר את הגדרות ברירת המחדל. או להשתמש ברשימת הפרמטרים המלאה לשנות.
      3. Execute וזה יהיה לייצר שני קבצי פלט: אחד הוא מסלול BED UCSC של צמתים; עוד אחד הוא רשימה של מערכים לקריאה בפורמט BAM.
    4. העלאת קבצי BAM לכלי ניתוח נתוני רצף. חישוב ערכי ביטוי באמצעות קוואנטכלי ification.
    5. לזהות באופן דיפרנציאלי גנים למעלה מוסדרים באמצעות ביטוי כלי ניתוח ערכי ברירת מחדל ומקפל שינוי> 2 ו p-value <0.05. כמו כן, לזהות באופן דיפרנציאלי גנים למטה מוסדרים באמצעות ביטוי כלי ניתוח ערכי ברירת מחדל ומקפל שינוי <0.5 ו- p-value <0.05.
  2. ניתוח נתוני השבב Seq:
    1. יישר FASTQ מקריא hg19 באמצעות 13 Bowtie2 (ערכי ברירת מחדל) בגלקסיה.
      1. בחר Bowtie2 תחת הכלי של המל"ל: מיפוי. אמת, אם הספרייה עצמה לזווג זוג (יחיד-end vs-סוף לזווג). העלה את קובץ FASTQ מההיסטוריה הנוכחי.
      2. בחר את הגנום התייחסות. השתמש בהגדרות ברירת המחדל פרמטר. Execute וזה יהיה לייצר קובץ פלט עם רצף ממופה קורא כקובץ BAM. חזור על התהליך עבור כל קובץ רצף.
    2. לזהות פסגות באמצעות MACS 14 הפסקת p-value של 6.0e-7 ו- FDR של 0.01, כפי שתואר לעיל 2.
    3. Metabolomics ניתוח נתונים:
      1. המרה שמות כימיים של מטבוליטים כדי KEGG_IDs.
      2. לזהות מטבוליטים מוסדר באופן דיפרנציאלי על ידי השוואת רמות זוהה רכב vs. E2 שטופלו דגימות (א 2 לקפל חתוכים נעשה שימוש במחקר זה).
    4. ניתוח אינטגרטיבי:
      1. זיהוי גנים שיש להם אתרי קישור ERα באמצעות כלי ניתוח נתונים רצף. תרגום אזורים לתפקד גנים באמצעות 20 kb כמו מרחק חתוך.
      2. זיהוי הגנים למעלה ולמטה מוסדר באופן דיפרנציאלי מניתוח נתוני Seq RNA באמצעות שינוי לקפל> 2 ומקפלים שינוי <0.5, בהתאמה עם ערך p <0.05 כפי מנותקים. השוואה לרשימת גנים המכילים חייב אתר ERα באמצעות השוואה דיאגרמת ון.
      3. השתמש ברשימה זו כדי לזהות מסלולי מטבוליים מווסתים E2 באמצעות מודול 15 Metscape של cytoscape.
        1. על ידי בחירת מודול Metscape מיישומים, לבחור בניית רשת ולאחר מכן-bas המסלולאפשרות ed.
        2. בחר את האורגניזם (אדם). קובץ נתונים בוחר רשימה מתחמת מוסדרת E2 (KEGG ID) וכן E2 למעלה מוסדר רשימת גן.
        3. בחר מתחם -Reaction -Enzyme-ג'ין כסוג הרשת. בחר מתחם / גנים כמו השאילתה.
        4. בניית רשת. חזור באמצעות E2 למטה מוסדרת מתחם וגנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

transcriptomics
כדי לנתח גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על ידי טיפול E2, בחרנו לבצע ניסוי RNA-seq. בנוסף לאספקת מידע על רמות ה- mRNA, נתוני Seq RNA יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר שינויים ללא קידוד RNA (RNAs ללא קידוד ארוך, מיקרו-רנ"א) ואירועים שחבור חלופי. אנחנו לא מספקים מידע על ניתוח של RNAs ללא קידוד או לחילופין עיבד גנים, מאז היקף המחקר שלנו היא לזהות גנים המקודדים חלבונים שחשובים וויסות חילוף חומרים. עם זאת, RNA-seq הוא דרך מצוינת של קבלת מידע על אירועי ביטוי גני הפרש.

על מנת לקבל איכות גבוהה קוראה, חשוב לקבל RNA הטוהר גבוה. לאחר בידוד RNA אנו טהרנו את RNA באמצעות ערכת RNA לנקות. למרבה הצער כמעט 50% של ה- RNA הוא איבד במהלך תהליך זה וכמות החל RNA צריך להילקח גonsideration להשיג הסכום הנדרש (100-500 ng) עד סוף שלב טיהור.

אנחנו לכמת תשואות RNA באמצעות fluorometer RNA HS assay, וזה מאוד מדויק הוא שיטה מועדפת עבור כימות של רנ"א נמוך שפע. לאחר מכן, על שלמות ועל האיכות הכוללת של דגימות רנ"א נבחנו באמצעות bioanlayzer, המהווה חלופה ג'ל אלקטרופורזה באמצעות כמות מזערית של RNA. הניתוח מראה לכולם יש את הדגימות להקות חדות ונקיות של 18S ו -28 rRNAs המציינות את התקינות וטוהרת של הדגימות (איור 2 ב). Integrity RNA מספר (רין) שימש כאמת מידה בקרת איכות RNA. RIN 10 מציין RNA ללא פגע, RIN 6 מושפל חלקית RIN3 מושפל מאוד 16.

מומלץ כי RIN להיות לפחות 7 עבור ניסוי רצף. כל דגימות רנ"א שלנו קיבל ערך RIN בין 9.6-9.9 <(איור 2 א) strong>. רצף ספריות נבנו 500ng של רנ"א איכותיים מכל מדגם באמצעות מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה כגון Illumina 2500. בממוצע 18,000,000 רצף תפוקה גבוהה באיכות קורא התקבלו עבור כל דגימה (טבלה 1), אשר היה מוכן במורד הזרם אָנָלִיזָה. כדי לבדוק את האיכות הכוללת של הנתונים הגולמיים רצף תפוקה גבוהה, FastQC נדרס עבור כל דגימה של קורא. דו"ח FastQC נציג נתוני Seq RNA רכב אחד הוצג (איור 3). אורך הרצף של רוב הקורא היה כ -100 נ"ב (איור 3 א). עבור כל קריאה, ציון האיכות היתה 32-34 עבור BP 5 הראשון 36-38 מ 6-100bp (איור 3 ב). בין 17,990,863 כניסות המופק מדגם זה, רובם היו באיכות ציון גבוה יותר מ -34 (איור 3 ג). התוכן GC לכל קריאה ברצף גם בעקבות התפלגות נורמלית עם ממוצע של GC 48%. האיכות הכוללתהציון של הקורא היה מאוד גבוה.

ניתוח Cistromic של אתרי קישור ERα
כדי להשיג את הרצף העמוק ביותר, קבלת שברי DNA בגודל רצוי הוא אחד הגורמים החשובים. גישות רצף נוכחיות עשויות להיות צורכים שונים על קטעי דנ"א, למשל 300-600 נ"ב עבור מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה, 100-200 נ"ב עבור AB / מוצקה 17. בניסוי זה רוב קטעי דנ"א הם בין 300 נ"ב ו -600 נ"ב כפי שמוצג על ג'ל (איור 4). כחלופה, קוראים עלולים בוחרים להכין הכרומטין שלהם באמצעות עיכול MNase, אולם אנו חשים הפרוטוקול הוקם שלנו מספק את הדגימות הנדרשות עם באיכות גבוהה ומספק תוצאות לשחזור. עשרה ng של DNA מכל טיפול מדגם הקלט המקביל שלה הוכן חיץ EB. ה- DNA השבב היה חד לקריאת רצף באמצעות מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה. דגימות שבב DNA הניב כ20,000,000 קורא בעוד DNA קלט הניב יותר מ 35.000,000 קורא (טבלה 1).

metabolomics
כדי לכמת את מטבוליטים בתאי יונקים באמצעות GCMS, לפחות 10 מיקרוגרם של מסת תאים נדרשים. התחלנו עם 400,000 תאים MCF7 עם הניסויים. עד קציר, היו כ 500,000 תאים כל צלחת. בראייה כוללת של מטבוליטים מיוצגים על ידי פסגות הושוותה בין מלא המדגם שטופל אסטרדיול (איור 5). כ -100 מטבוליטים זוהו, אלה יש משקל 60% מכלל תושבי העיר ידועה mammalians. כאן אנו מציגים רשימה של 10 מטבוליטים העליונים, אשר מראים שינויים משמעותיים בטיפול E2 (טבלה 2). בסך הכל, E2 שהוגברו מסלולים כולל פרוקטוז ומטבוליזם מנוז, מטבוליזם היסטידין, מטבוליזם purine, ביוסינתזה כולסטרול ומטבוליזם ויטמין B3. מסלולי downregulated היו butanoate metabolisמ ', דה נובו ביוסינתזה של חומצות שומן, מסלול פוספט pentose, מעגל האוריאה וחילוף החומרים של ארגינין (לוח 3).

ניתוח נתונים ואינטגרציה
נתוני RNA-seq, שבב Seq ו- GC-MS עובדו ונותחו באמצעות סדרה של צעדים (איור 6). לאחר השוואה בין גנים שזוהו RNA-seq ו שבב Seq, קבוצה אחת של עד-מוסדר קבוצה אחת של גנים מוסדרים על ידי אסטרדיול חולצה. מהנתונים מטבולית, השגנו שני סטים של תרכובות למעלה ולמטה מוסדרות על ידי טיפול אסטרדיול. הבא השתמשנו Metscape, אפליקציה cytoscape, לדמיין ולפרש את ביטוי הגנים ונתונים מטבולית בהקשר של חילוף החומרים האנושי 15. ראשית בחרנו לכלול אלמנטים של מתחם, תגובה, אנזים, וג'ין ברשת. בחרנו מתחמים / גנים כמו שאילתא שתי רשתות של up-regulation E2 (איור 7 א) ומטה-regulation (איור 7 ב) הוצג. Metscape מספקת גם אפשרות לבנות רשתות על מסלולים סלקטיבית. לדוגמה, באמצעות אותה קבוצה של נתונים כמו בבניית רשת הכוללת מוסדר למטה, subnetwork של מסלול ביוסינתזה ומטבוליזם-אסטרוגן אנדרוגן נוצר על ידי החלפת שאילתה מהמתחם / הגן מסלול ספציפי. הגנים או תרכובות עם שינויים משמעותיים היו מודגשים בצבע בהיר יותר. מלבד בחירת מסלול ספציפי מהחלון הנפתח כמתואר, אפשר גם ליצור רשת תת-ידי החלה "ליצור subnetwork" פונקציה לאזור הנבחר. כפי שניתן לראות בתרשים 6A ו- B, ERα הפעלה ישירה מחייב לאזורים רגולטוריים הגן השפיעו רבות מסלולים מטבוליים בתאי סרטן השד. ניתוח אינטגרטיבי שלנו הצביעו על כך, ERα נקשר ישירות ומסדירה הביטוי של גן FASN, שהינה חשובה מסלול ביוסינתזה דה נובו של חומצות שומן (Figure 7C). בנוסף E2 טיפול downregulated מסלולים ביוסינתזה אסטרוגן-אנדרוגן על ידי דיכוי הביטוי של CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 ו GSTM2 במסלולים אלה.

איור 1
איור 1: Workflow של הכנת דגימות של RNA, DNA ו- lysates תא עבור RNA-seq, שבב Seq, וניתוח metabolomic.

איור 2
איור 2:. Electropherogram נציג RNAs נותח עם 2100 Agilent Bioanalyzer RNA יושר מספר (רין), אינדיקטור של איכות RNA, ניתן על ידי הניתוח כמו 9.9. (א) על תמונת ג'ל וירטואלית של RNA לדגום שני הלהקות של 26s ו 18S חדות. (ב) אותות פלורסנט של עקבות בודדות tהוא RNA עולה כי עוצמת שיא 28S עולה 18S שיא וללא זיהום נתפס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. בדיקת איכות תציג את הנתונים הגולמיים-Seq RNA אחד נתוני הרצף של רכב המדגם נותח באמצעות FastQC. (א) חלוקת אורך הרצף של הספרייה שהיא 100 נ"ב. (ב) ציון האיכות לאורך העמדה לקרוא. (C) ציון האיכות לכל רצף הראה את האיכות גבוהה האוניברסלית של כל הרצפים. (ד) תוכן GC לכל קריאה תאם את ההתפלגות התיאורטית. אנא לחץ כאן כדי להציג להגרסת rger של נתון זה.

איור 4
איור 4: ג'ל אלקטרופורזה של שברי הכרומטין sonicated 5 μl של lysate התא מכל מדגם נדרס על ג'ל agarose 1.5% עם 1,000 נקודות בסיס בתוספת הסולם על הנתיב הראשון.. רוב המקטעים הנם בין 300 ל 600 נ"ב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. הסקירה של פסגות מייצג מטבוליטים מן GC-MS הפנל העליון מציגה את הפסגות מזוהות דגימות מטופלי E2 בעוד הפנל התחתון מהשלט. המתחם היה ושכרתי חדר להראות המטבוליט המדויק המיוצגות על ידו p eak. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: תרשים זרימה של שיטת אשכולות אינטגרטיבית.

איור 7
איור 7: ויזואליזציה של נתוני גני המטבוליט המשולבים Metscape (א) הרשת של שבילים למעלה מוסדרים על ידי E2.. (ב) רשת של מסלולים למטה מוסדר על ידי E2. (C) E2 מגורה גיוס ERα לאזור הסמוך FASN, אשר יימצא תחת פיקוח ברשת ביוסינתזה דה נובו חומצות שומן שנוצר על ידי יישום פונקציה subnetwork.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלה 1: סיכום של רצף אולטרה תפוקה גבוהה של RNA-seq ו שבב Seq.

טבלה 2
טבלה 2: רשימת 10 מטבוליטים העליונים עם שינויים משמעותיים עם טיפול E2.

טבלה 3
טבלה 3: משעול למעלה ולמטה מוסדר על ידי E2 טיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה תיארנו הדור וניתוח אינטגרטיבי של RNA-seq, שבב Seq ונתונים metabolomics מתאי MCF-7 כי מטופלים עם E2. פתחנו סדרה של פרוטוקולים האסטראטגי כדי לנצל את השיטות היעילות ביותר ואת מרכולתם רכה ידידותית למשתמש אשר מייצרות גילוי ביולוגי רלוונטי. למיטב ידיעתנו, ושלנו הוא המחקר הראשון לשלב נתוני -omics משלושה ניתוח שונה מסלולי מטבוליים חדשים זיהו כי ERα מוסדר ישירות בתאי סרטן השד.

transcriptomics
זה קריטי כדי להתחיל עם RNAs באיכות גבוהה עבור ניתוח transcriptomic מוצלח. תרגול טוב יבטל את הסיכוי של השפלה RNA, כולל יצירת ספסל RNase ללא, שינוי כפפות לעתים קרובות, אחסון ב -80 ° C ושמירה על קרח בשימוש. תוספת של דגירת הלילה ב -20 ºC משפרת התאוששות RNA. כדי למנוע קפיאה ו- RNA הפשרת שוב ושוב, אפשר להקצות את RNAs עבור procedur במורד הזרםes על בידוד וטיהור. לעניין קיומו של טעויות רצף, qRT-PCR באמצעות cDNA ממדגמים מתבצע לעיתים קרובות כדי לוודא את הגנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי מזוהים RNA-seq. לכן, מספיק RNA יש שמור למטרה זו. אנו מבצעים לזווג סוף-רצף המאפשר לנו לנתח וריאנטים אחוי, RNAs ללא קידוד ו miRNAs. כדי להימנע מעלויות גבוהה רצף, רצף חד קצה יכול להתבצע גם כן. לעומת microarrays, RNA-seq הוא יותר רגיש אינו מוגבל החלליות הניתנות על השבב. אנו משיגים מידע לא רק על רצפי קידוד, אלא גם על גנים ללא קידוד תעתיקי שחבור דיפרנציאלי. כרגע אנחנו שימוש בטכניקה זו כדי לנתח transcriptomes של שורות תאים שונות לאחר טיפולים ליגנד כמו גם רקמות שהתקבלו מניסויי עכבר.

Cistromics
שיטת רצף אולטרה תפוקה גבוהה דורשת DNA שבב מינימאלי 5 ng לבניית ספרייה. בתקן ChIP-Seq פרוטוקול 18, מומלץ שיהיו לפחות 10 ng. כימות עם fluorometry הן קריטיות. בפרוטוקול זה השתמשנו assay זיהוי הדנ"א הכפול גדיל כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA. אפשר גם להשתמש assay fluorometer כימות DNA מדויק. להבדלי ציוד וחומרים, חשוב מאוד עבור כל מעבדה להקים פרוטוקול sonication משלהם, אשר מייצר בגדלי קטעי דנ"א רצויים. יתר גז הדנ"א השבב עלול לגרום לאובדן של העשרת DNAs היעד תוך DNA השבב במידות גדולות ליצור בעיה עבור סידור יעיל. לפני הגשת DNA כדי רצף, זה תמיד חשוב לוודא העשרה כמה אזורים ידועים על ידי qPCR. הטכניקה עדיין מוגבלת על ידי היעילות ואת הספציפיות של הנוגדן המשמש immunoprecipitations. כדי להשיג מידע אתר הקישור שיכול לשמש באופן אמין ניתוחים השוואתיים, אנו לאמת ריאגנטים שלנו על פי תקני שבב Seq לקודד, 19 והשימוש standarפרוטוקולי dized המספקים לנו עם ערכות נתונים עקביות. אם נוסיף לכך את ניתוח העשרה אתר הקישור גורם שעתוק פוסט, שבב Seq היא עדיין אחת השיטות הטובות ביותר כדי לקבוע ישירה מחייב של גורמי שעתוק כדי הכרומטין. אנחנו כרגע באמצעות פרוטוקול זה ללמוד קינאזות גיוס, coregulators וגורמים שעתוק אחרים כדי הכרומטין שורות תאים אחרים כמו גם רקמות העכבר מגיבים לאסטרוגן.

metabolomics
במשך פרופיל מטבולים מוצלח תאים סרטניים אנושיים שד, הכנת מדגם זהירה היא קריטית. כמות התאים בשימוש ומצבו תרבית תאים בפרוטוקול זה הוא אופטימלי עבור תאים MCF7. שורות תאים אחרות עשויות לחייב יותר או פחות תאים לגילוי של מספר לא מבוטל של מטבוליטים. אנו משיגים סביב 100 מטבוליטים בכל ניסוי. שיטה זו מוגבלת לגילוי של מטבוליטים וקצר טווח או מטבוליטים שנמצאים בריכוזים נמוכים. שיטה זו מציעה את הקלות של using הכנה מדגם יחיד לזהות מטבוליטים מרובים. כרגע אנחנו שימוש בטכניקה זו כדי לזהות מטבוליטים מוסדרים אסטרוגן בסרום וברקמות שונות מעכבר.

שילוב נתונים
Transcriptomics ו cistromics מחקרים רבים נעשו כדי לחקור איתות אסטרוגן ויסות הגנים בתאי סרטן השד, כולל תאים MCF7 2,5-7,20. במחקר זה, בפעם הראשונה, הוספנו נתוני metabolomics וניסיתי להסיק רשתות מטבולית מוסדרות ישירות על ידי ERα על תוספת ליגנד. גישה חדשנית זו אפשרה לנו להצמיד circuitries המולקולרית נקודה מוסדרת על ידי אסטרוגנים המשפיעים חילוף חומרים תאיים. באופן כללי, הממצאים תומכים התפקיד ERα בתור רגולטור של ביולוגית סרטן השד.

לסיכום, סיפקנו מצבור מפורט של פרוטוקולים עבור הדור של RNA-seq, שבב Seq ו metabolomics דגימות מתאי סרטן שד לאחר אסטרוגן טיפולים בקר מובנהניתוח ative של נתונים המתקבלים גישות -omics אלה. פרוטוקולים אלה ייאפשרו לחוקרים לעשות ניתוח דומה לגורמי תעתיק אחרים, הליגנדים ותנאי מזין רצפטור גרעיניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אוניברסיטת אילינוי קיבל מענק החוקר שהופעלו מתוך פייזר ZME ו YCZ קיבל תמיכה משכורת מענק זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של המכון הלאומי המזון והחקלאות, משרד החקלאות של ארה"ב, פרס ILLU-698-909 (ZME) ופייזר, Inc (ZME). תוך הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של משרד החקלאות האמריקאי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

רפואה גיליון 109 RNA-seq transcriptome שבב Seq cistrome metabolomics אסטרוגן סרטן השד
ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter