Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Systembiologi i Metabolic forordning ved østrogen-receptor signalering i Breast Cancer

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832

Abstract

Med fremkomsten af ​​de -omik nærmer vores forståelse af de kroniske sygdomme som kræft og metabolisk syndrom er forbedret. Men effektiv udvinding af oplysningerne i de store datasæt, der er fremstillet af genekspression microarrays, dybe sekventering eksperimenter eller metabolisk profilering er afgørende for at afdække og derefter effektivt målrette de kritiske regulatorer af syge celle fænotyper. Østrogen-receptor α (ERa) er en af ​​de store transkriptionsfaktorer der regulerer genprogrammer der er vigtige for østrogen-responsive brystkræft. For at forstå at rolle ERa signalering i brystkræft metabolisme udnyttede vi transkriptom, cistromic og metabolomisk data fra MCF-7-celler behandlet med østradiol. I denne rapport beskrev vi generation af prøver til RNA-Seq, chip-Seq og metabolomik eksperimenter og integrativ beregningsmæssige analyse af de opnåede data. Denne fremgangsmåde er nyttig til afgrænsning hidtil ukendte molCULAR mekanismer og gen-regulerende kredsløb, der er reguleret af en bestemt transskription faktor, som påvirker metabolisme af normale eller syge celler.

Introduction

Østrogener er vigtige regulatorer af mange fysiologiske processer i både kvinder og mænd, herunder reproduktive væv, metaboliske væv, hjerne og knogler 1. Ud over gavnlige virkninger i disse væv, østrogener også køre kræft, der opstår fra brystkirtler og reproduktive væv. Østrogener hovedsageligt arbejde gennem ER'er at fremkalde celle typespecifikke effekter. Deep sekventering af udskrifter reguleret af ERa hjælp RNA-Seq og genom-dækkende ERa DNA bindingssteder analyse ved hjælp chip-Seq vist sig at være nyttigt at forstå, hvordan ERa arbejder i forskellige væv og kræft, der opstår fra dem. Vi og andre har publiceret genekspression profiler forbundet med forskellige receptorer (ERa vs ERP) 2,3, forskellige ligander 3-5 og forskellige coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq er den vigtigste metode til at undersøge transkriptomet, der tilbyder større præcision og effektivitet i forhold til microarray based genekspression analyse 8. RNA opnået fra cellelinjer 2-4,7, væv eller tumor prøver sekventeret, mappes til rådighed genomiske forsamlinger og varierende regulerede gener identificeres. Kromatin Immunpræcipitation (chip) er ansat til at dissekere transskription faktor og coregulator kromatin binding til kendte regulatoriske bindingssteder. Chip-Seq (chip efterfulgt af high throughput sekventering) giver uvildig påvisning af globale bindingssteder. Metabolomics er en anden mere og mere anvendt system biologi tilgang, som kvantitativt foranstaltninger, dynamisk multiparametric respons levende systemer på forskellige stimuli, herunder kemikalier og genetiske forstyrrelser.

Ved at udføre global metabolisk profilering, kan en funktionel udlæsning opnås fra celler, væv og blod. Hertil kommer, at oplysninger fra transkriptom eksperimenter ikke altid afspejler de faktiske ændringer i niveauet af enzymer, der bidrager til biokemiske veje. Kombineretanalyse af transkriptom og metabolomet data gør det muligt at identificere og korrelere ændringer i genekspression med faktiske metabolit ændringer. Udnyttelse af oplysninger fra alle disse store skala datasæt give mekanistiske detaljer for at forstå betydningen af ​​transkriptionsfaktorer, der regulerer komplekse biologiske systemer, især dem, der vedrører menneskelig udvikling og sygdomme som kræft og diabetes.

Den komplekse karakter af pattedyrs genom gør det udfordrende at integrere og fuldt fortolke data fra transkriptom, cistrome og metabolomet eksperimenter. Identifikation funktionelle bindende begivenheder, der ville føre til ændringer i ekspression af målgener er vigtig, fordi når funktionelle bindingssteder er identificeret; efterfølgende analyse, herunder transkription binding (TF) motiv analyse kunne udføres med større nøjagtighed. Dette fører til identifikationen af ​​biologisk meningsfulde TF kaskader og mekanismer. Også direkte comparispå af RNA-Seq og chip-Seq eksperimenter er ikke altid muligt, da dataene fra hvert eksperiment har forskellige skalaer og lyde og i nogle tilfælde meningsfulde signaler tilsløret af befolkningen støj. Vi er ikke bekendt med nogen undersøgelse, der integrerede oplysninger fra disse tre uafhængige, men beslægtede tilgange til at forstå den direkte metabolisk regulering af ERa i brystkræft. Derfor er vores overordnede mål i dette papir er at relatere produktive bindende begivenheder til genekspression og metabolit ændringer. For at nå dette mål, integrerede vi data fra RNA-Seq, CHIP-Seq og metabolomik eksperimenter og identificerede dem østrogen induceret ERa bindende begivenheder, der ville føre til genekspression ændringer i metaboliske veje. For første gang, giver vi et komplet sæt af protokoller (figur 1) til at generere chip-Seq, RNA-Seq og metabolomics profilering og udføre integrativ analyse af data for at afdække nye gen kredsløb regulerer stofskiftet af brystkræftcancercellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af RNA-Seq Prøver

  1. Celledyrkning og behandling
    1. Kultur de MCF7-celler i forbedret MEM (IMEM) plus phenol-rød medium med 10% Heat inaktivt FBS, 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C i befugtet 5% CO2-atmosfære.
      Bemærk: Samme cellelinie og cellekultur tilstand anvendes i hele undersøgelsen.
    2. Seed 100.000 MCF7-celler per brønd i plader med 6 brønde. Har triplikater for hver behandling. På dag 3 fjernes mediet, og der tilsættes 2 ml frisk medium med eller uden 10 -8 M E2 til hver brønd. Pladerne inkuberes i 24 timer i 37 ° C i befugtet 5% CO2-atmosfære.
    3. At høste cellerne, tilsættes 1 ml RNA-isolering reagens (syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform) til hver brønd og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Så indsamle cellelysatet reagens ved pipettering og indbetaler til 1,5 ml rør
  2. RNA-isolering
    1. Tilføj 200 pi chloroform til 1 ml cellelysat reagens (1.1.3) og vortex i 10 sek. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuger prøverne ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering overføres den vandige fase (øverst) til et nyt rør uden at forstyrre de øvrige faser.
    2. Tilføj 500 pi 100% isopropanol til et nyt rør til den overdragne-vandige fase, og blandes ved at vende. Inkuber ved -20 ° C natten over. Centrifugeres prøverne ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en pellet i bunden af ​​røret. Supernatanten kasseres, og vask bundfaldet med 750 pi RNase-fri 70% ethanol ved kort vortex.
    3. Centrifuger prøverne ved 6000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og centrifugeres prøven ved 16.000 x g i 1 min ved 4 ° C for at indsamle alle de resterende ethanol. Fjern de resterende ethanol ved pipettering med en gel-loading spids og indstille rørene op nedad lufttørre i 10 minutter. Opløs pellet i 20-50 pi DEPC behandlet vand DEPENding af størrelsen af ​​disse pellets.
  3. Oprens RNA ved anvendelse af RNA clean-up kit følge protokollen 4. Mål RNA koncentration på en fluorometri baseret assaykit følge protokollen 9.
    BEMÆRK: OD ved 260 nm udtages til bestemmelse af RNA-koncentrationen og forholdet mellem OD ved 260 nm og 280 nm anvendes til at bestemme renheden af ​​prøven. Det anbefales at kontrollere RNA kvalitet ved hjælp af Bio-analysator assay.
  4. Tage ca. 0,5 til 1 ug oprenset RNA til sekventering.
    BEMÆRK: Biotech center forbereder sekventering biblioteker og udfører parret ende læser sekventering ved anvendelse af fremgangsmåder beskrevet tidligere 2.

2. Udarbejdelse af chip-Seq Sample

  1. Celledyrkning og behandling
    1. Seed 500.000 MCF7 celler pr 10 cm plade i vækstmedium.
      BEMÆRK: For hver trække ned 16 plader blev anvendt. På dag 3 fjernes mediet, og der tilsættes 5 ml frisk medium med eller uden 10 -8 M E2 til hverplade. Behandl cellerne i 45 minutter (37 ° C i befugtet 5% CO2-atmosfære).
  2. Crosslink og Cell Harvest
    1. Tilsæt 250 pi 37% formaldehyd i 5 ml medium til tværbinding kromatin, inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Stop tværbinding ved at vaske celler med 5 ml iskold 1x MEM.
    2. Cellerne høstes i 250 pi Cell Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCI, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-aminoxid) pr plade.
  3. Opsplitning af Kromatin
    1. Sonikeres cellerne i 30 sekunder x 8 ved amp på 30 at opnå de krævede kromatin størrelser. Afkøle hver prøve på is efter en sonication af 30 sek.
    2. Der centrifugeres ved 16, 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C, og omhyggeligt pipetteres supernatanten uden at forstyrre pelleten i bunden.
    3. Tag en 5 pi alikvot af supernatanten, og tjekke DNA størrelse ved elektroforese gennem 1,5% agarosegel som tidligere 10 beskrevet. Den ideelle størrelseDNA skal være mellem 200-500 bp.
  4. chromatin Immunpræcipitation
    1. Spar 25 pi cellelysat som input. I et 50 ml rør, blandes 4 ml cellelysat med 20 ml IP puffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI og 0,5% Triton X), ERa antistof (500 pi F10 og 500 pi HC- 20), og 500 pi ProtA og ProtG protein overtrækning magnetiske perler. Inkuber blandingen ved rotation ved 4 ° C natten over for at tillade dannelse af chromatin- antistofkompleks.
  5. Vasker og Reverse-krydsbinding
    1. Brug et magnetisk stativ til at indsamle de magnetiske perler på den magnetiserede side at fjerne vaskepufferen.
    2. Vask de magnetiske perler i 25 ml vaskebuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, 01% SDS, 1% Triton X, og 150 mM NaCl). Vask efterfølgende de magnetiske perler uden at forstyrre DNA-Protein komplekser, tilsættes 25 ml vaskebuffer langsomt til røret langs siden vend dernæst rørene, indtil alle de magnetiske perler blandes godt with vaskebufferen uden at virke som en pille. Som et alternativ, kan du bruge rotator at invertere røret. Undlad at slynge prøverne. Vask de magnetiske perler ved brug af samme metode i de følgende trin.
    3. Vask de magnetiske perler i 25 ml Wash-puffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, 01% SDS, 1% Triton X, og 500 mM NaCl).
    4. Vask de magnetiske perler i 25 ml Wash-buffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, 1% NP-40, 1% Dexycholate og 250 mM LiCI).
    5. Vask de magnetiske perler i 25 ml 1x TE-buffer (1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCI) to gange.
    6. Eluere DNA i 500 ul elueringspuffer (1% SDS og 10 mM NaHCO3) og derefter tildele 500 pi DNA eluering i 4 rør. For DNA fra input, eluering DNA i 125 pi Elution buffer.
    7. Inkuber rørene ved 65 ° C natten over på en varmeblok. Dæk rør på varmeblokken med aluminiumfolie for at holde varmen selv over alle rørene. Placer en vægt på rørene for at holde dem fra at åbne. </ Li>
  6. DNA Isolation
    1. Afkøle rørene ved stuetemperatur i 5 minutter. Isoler DNA fra pull down prøver ved hjælp af chip-DNA isolation kit. Følg anvisningerne fra producenten.
      1. Varm op elueringspufferen ved 65 ° C. Tilføj 625 pi bindingsbuffer til hvert rør. Hvis bundfald, tilføje en anden 250 pi bindingsbuffer, indtil opløsningen er klar.
      2. Indlæse prøven på søjlen og centrifugeres ved 16.000 xg i 30 sek. Vask prøven med 250 pi vaskebuffer. Husk at tilføje ethanol til vaskebufferen når første gang du bruger det. Gentag vask.
      3. Eluering af DNA'et i 15 pi Elueringsbuffer. Kombiner DNA samme trække ned fra 4 rør til at nå omkring 55 pi DNA.
    2. Isoler Input DNA under anvendelse af en DNA Purification Kit.
      1. Varm op elueringspufferen ved 65 ° C. Tilføj 625 pi bindingsbuffer i hvert rør og inkuberes i 10 min. Læg prøven på kolonnen i et 2 ml Collectipå røret.
      2. Vask prøven med 750 pi vaskebuffer, centrifugeres ved 16.000 xg i 1 min. Gentag centrifugering for at fjerne eventuelt resterende buffer. Eluering af DNA'et i 30 pi EB.
    3. Mål DNA Koncentration Ved hjælp af en kommerciel Fluorokrom Assay med Modifikation 11.
      1. Fortynd 20x TE-buffer i 1x TE som assaypufferen til fortynding reagens- og DNA-prøver. Tag 5 pi isoleret DNA og fortynde det i 50 pi i 1x TE.
      2. Fra 2 ug / ml DNA stamopløsning gøre et DNA standard i området fra tomt til 1, 10, 100, 1000 ug / ml. I en plade 96, afsætte 25 pi hver standard samt DNA fortynding i to eksemplarer. (Anbefales tredobbelte til standard.)
      3. Forbered arbejder reagens ved at lave en 200 gange fortynding fra dsDNA reagens i 1x TE-buffer i plastrør. Dæk arbejder reagensopløsning med aluminiumfolie for at undgå lys. Tilsæt 200 pi arbejder reagens i hver prøve. Icubate ved stuetemperatur i 5 min. Dæk pladen med aluminiumfolie for at undgå lys.
      4. Mål fluorescens af prøverne ved anvendelse af en fluorescenspladelæser (excitation ved 480 nm, emission 520 nm). Generer DNA standard kurve af fluorescens versus DNA-koncentrationen. Bestemme koncentrationerne af prøverne baseret på det genererede DNA standardkurve.
  7. Verifikation af chip Experiment Brug qPCR
    1. Tag 2 pi isoleret DNA og fortyndet i 20 pi i vand. Opsæt qPCR reaktion i tre eksemplarer ved at blande 2,5 pi DNA fortynding, 5 pi Green I PCR Master mix, 1 pi primer, og 1,5 ul nuklease frit vand.
    2. Kør qPCR med Fast Real-Time PCR systemet ved hjælp af følgende program: Trin 1: 95 ° C i 60 sek, trin 2: 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 60 sek Gentag trin 2 39 gange.
  8. Send 10 ng DNA-prøve til Biotech center for sekventering.
    BEMÆRK: Biotech center forbereder chip DNA i bibliotekerne ifølge instruktion, og udfører single-læse sekventering ved brug af metoder beskrevet tidligere to.

3. Metabolomics Assay Prøveforberedelse

  1. Celledyrkning og behandling
    1. Seed 400.000 MCF7 celler pr 10 cm plade i vækstmedium. For hver behandling forberede tre prøver. Brug to plader i hver prøve for at modtage nok celler til påvisning. På dag 3 fjernes mediet, og der tilsættes 5 ml frisk medium med eller uden 10 -8 M E2 til cellerne. Behandl cellerne i 24 timer (37 ° C i befugtet 5% CO2-atmosfære).
  2. Prøvetagning
    1. Tilsæt 5 ml iskold 1x PBS til pladen, opsug PBS efter kortvarigt at vippe pladen flere gange. Gentag to gange, og fjerne så meget PBS som muligt efter den sidste vask.
    2. Tilføj 750 pi af præ-kold acetone til hver plade og skrabe cellerne. Kombiner cellerne i acetone fra to plader itil et 2 ml rør på is.
    3. Celletal til normalisering
      1. For hver behandling, bruge to ekstra plader til celle kvantificering. At de-vedhæfte cellerne fra pladen, tilsættes 2 ml HE Buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3 og 1 mM EDTA) i hver plade og inkuber i 5 minutter.
      2. Indsamle og bland godt cellerne ved pipettering celler i HE puffer. Brug alt 20 pi celle løsning til at tælle antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer.
  3. Opbevar prøverne ved -80 ° C, før du sender til Metabolomics centret til at identificere og kvantificere de metabolitter hjælp Gaskromatografi massespektrometri (GC-MS) analyse.

4. Integrativ Analyse

  1. RNA-Seq Dataanalyse:
    1. Udfør Kvalitet kontrol af FASTQ filer ved hjælp FastQC: Læs QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Vælg FastQC: Læs under værktøjet af NGS: QC og manipulation. Upload den rå datafil fra aktuelle history.
        BEMÆRK: Det anbefales at give en titel til output filen for at minde dig, hvad jobbet var for da der kan være flere udgange.
    2. Udfør og output filen vises under historik. Gentag samme procedure for hver sekvens fil. Trim adaptere bruger Clip under NGS: FASTX Toolkit.
    3. Juster læser til hg19 bruger Tophat2 med RefSeq genom henvisning annotation 12 (standardværdier).
      1. Vælg Tophat2 under værktøjet af NGS: RNA-analyse. Angiv biblioteket parrede type (single-end vs parret ende).
      2. Upload input FASTQ fil af det aktuelle historie. Vælg henvisningen genomet. Vælg standardindstillingerne. Eller brug den fulde parameter listen for at ændre.
      3. Udfør og det vil producere to output-filer: Den ene er UCSC BED styr på kryds; en anden er en liste over læste linjeføringer i BAM-format.
    4. Upload BAM filer til sekventering dataanalyseværktøj. Beregn udtryk værdier ved hjælp Quantification Tool.
    5. Identificer differentielt up-regulerede gener ved hjælp af Expression Analysis Tool hjælp standardværdier og fold forandring> 2 og p-værdi <0,05. Ligeledes identificere differentielt ned-regulerede gener ved hjælp af Expression Analysis Tool hjælp standardværdier og fold forandring <0,5 og p-værdi <0,05.
  2. Chip-Seq Dataanalyse:
    1. Juster FASTQ Læser til hg19 bruger Bowtie2 13 (standardværdier) i Galaxy.
      1. Vælg Bowtie2 under værktøjet af NSC: Mapping. Kontroller, at biblioteket er mate-parret (single-end vs parret ende). Upload FASTQ fil fra aktuelle historie.
      2. Vælg henvisningen genomet. Brug standardindstillingerne parameter. Udfør og det vil producere output-fil med kortlagt sekvens lyder BAM-fil. Gentag proceduren for hver sekvens fil.
    2. Identificer toppe ved hjælp MACS 14 en p-værdi cutoff på 6.0e-7 og FDR på 0,01, som tidligere beskrevet 2.
    3. Metabolomics Dataanalyse:
      1. Konverter kemiske navne af metabolitter til KEGG_IDs.
      2. Identificere differentielt regulerede metabolitter ved at sammenligne niveauer detekteret i Vehicle vs. E2-behandlede prøver (a 2 fold cut-off blev anvendt i denne undersøgelse).
    4. Integrative Analyse:
      1. Identificere gener, der har ERa- bindingssteder hjælp sekventering dataanalyseværktøj. Oversæt Regioner til gener funktion ved hjælp af 20 kb som afstand cut-off.
      2. Identificere differentielt op- og ned-regulerede gener fra RNA-Seq dataanalyse under anvendelse fold-change> 2 og fold ændring <0,5, henholdsvis med p-værdi <0,05 som afskåret. Sammenlign med listen over ERa- bindende websted indeholder gener ved hjælp af Venn-diagram sammenligning.
      3. Brug denne liste til at identificere E2 modulerede metaboliske veje ved hjælp Metscape 15 modul af Cytoscape.
        1. Ved at vælge Metscape modul fra apps, vælge Byg netværk og derefter pathway-based mulighed.
        2. Vælg Organisme (Human). Vælg datafil af E2 ureguleret sammensatte liste (Kegg ID) samt E2 opreguleret gen listen.
        3. Vælg Compound -reaktion -Enzyme-Gene som Network type. Vælg sammensatte / gener som forespørgslen.
        4. Opbygge netværk. Gentag dette med E2 nedreguleret forbindelse og gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

transcriptomics
At analysere differentielt udtrykte gener af E2 behandling, valgte vi at udføre en RNA-Seq eksperiment. Ud over at tilvejebringe information om mRNA-niveauer, kan RNA-Seq data også anvendes til at overvåge ændringer i ikke-kodende RNA (lange ikke-kodende RNA'er, microRNA) og alternativ splejsning events. Vi har ikke givet oplysninger om analysen af ​​ikke-kodende RNA eller alternativt transskriberede gener, da omfanget af vores undersøgelse er at identificere protein kodning gener, der er vigtige for metabolisk regulering. Men RNA-Seq er en glimrende måde at få oplysninger om differentierede genekspression begivenheder.

For at opnå høj kvalitet læser, er det vigtigt at få høj renhed RNA. Efter isolering RNA oprenset vi RNA under anvendelse af en RNA rense kit. Desværre næsten 50% af RNA'et går tabt under denne proces og bør tages mængde udgangsmateriale RNA til consideration at opnå nødvendige mængde (100-500 ng) ved udgangen af ​​oprensningstrin.

Vi kvantificerede RNA udbytter under anvendelse fluorometer RNA HS-assay, hvilket er meget præcis og er foretrukken metode til kvantificering af lav overflod RNA. Derefter blev integriteten og den samlede kvalitet af de RNA-prøver undersøgt under anvendelse bioanlayzer, som er et bæredygtigt alternativ til gelelektroforese under anvendelse af en minimal mængde RNA. Analysen viser alle prøver har skarpe og rene bånd af 18S og 28S rRNA angiver integritet og renhed af prøverne (figur 2B). RNA Integrity Number (RIN) blev anvendt som en standard for RNA kvalitetskontrol. RIN 10 indikerer intakt RNA, RIN 6 delvist nedbrudt og RIN3 kraftigt nedbrudt 16.

Det anbefales, at RIN at være mindst 7 til sekventering eksperiment. Alle vores RNA-prøver modtaget RIN værdi mellem 9,6-9,9 <strong> (figur 2A). Sekventeringsreaktioner biblioteker blev konstrueret fra 500 ng af høj kvalitet RNA fra hver prøve ved anvendelse ultra-high-throughput sekventering system som Illumina 2500. I gennemsnit 18.000.000 Høj kvalitet sekventering læser blev opnået for hver prøve (tabel 1), som var klar til nedstrøms analyse. For at kontrollere den generelle kvalitet af high-throughput sekvens rå data blev FastQC kørt for hver prøves læser. En repræsentativ FastQC rapport for ét køretøj RNA-Seq data blev vist (figur 3). Sekvensen længde mest læser var omkring 100 bp (figur 3A). For hver læsning, kvaliteten score var 32-34 for de første 5 bp og 36-38 fra 6-100bp (figur 3B). Blandt 17.990.863 lyder genereret fra denne prøve, de fleste af dem havde kvalitet scorer højere end 34 (figur 3C). Indholdet GC pr læst i sekvensen fulgte også normalfordelingen med et gennemsnit på 48% GC. Samlet kvalitetenresultat læser var meget høj.

Cistromic analyse af ERa- bindingssteder
For at opnå en effektiv dyb sekventering opnå DNA-fragmenter på ønskelig størrelse er en af ​​de vigtige faktorer. Aktuelle sekventering tilgange kan have forskellige krav til DNA-fragmenterne, fx 300-600 bp for ultra-high-throughput sekventering systemet, 100-200 bp for AB / SOLID 17. I dette eksperiment fleste af DNA-fragmenterne er mellem 300 bp og 600 bp som vist på gel (figur 4). Som et alternativ, kan læserne valgte at forberede deres kromatin hjælp MNase fordøjelsen, men vi føler vores etablerede protokol giver de nødvendige prøver med høj kvalitet og giver reproducerbare resultater. Ti ng af DNA fra hver behandling og dens tilsvarende input prøve blev fremstillet i EB buffer. The Chip DNA var single-læse sekventeret ved anvendelse ultra-high-throughput sekventering system. Chip DNA-prøver gav om20.000.000 læser mens indført DNA gav mere end 35.000,000 læser (tabel 1).

metabolomics
For at kvantificere metabolitterne i pattedyrceller ved hjælp GCMS, mindst 10 ug cellemasse er påkrævet. Vi startede med 400.000 MCF7 celler med forsøgene. På tidspunktet for høst, var der omkring 500.000 celler i hver plade. Oversigten af metabolitterne repræsenteret ved toppe blev sammenlignet mellem kontrollen og estradiol behandlede prøve (figur 5). Omkring 100 metabolitter blev identificeret, som tæller for 60% af den samlede kendte i pattedyr. Her præsenterer vi en liste over de 10 bedste metabolitter, som viser væsentlige ændringer i E2-behandling (Tabel 2). Samlet, E2 opreguleret veje, herunder fructose og mannose metabolisme, histidin metabolisme, purin metabolisme, cholesterolbiosyntese og vitamin B3 metabolisme. De nedreguleret veje var butanoat metabolism, de novo fedtsyrebiosyntese, pentosephosphatvejen, urinstof-cyklus og metabolisme af arginin (tabel 3).

Dataanalyse og integration
Dataene fra RNA-Seq, chip-Seq og GC-MS blev behandlet og analyseret gennem en række trin (figur 6). Efter sammenligningen mellem gener identificeret i RNA-Seq og chip-Seq, et sæt opreguleret og ét sæt nedregulerede gener ved estradiol blev ekstraheret. Fra de metaboliske data, vi opnåede to sæt op- og nedreguleres forbindelser af Estradiolbehandling. Næste vi brugte Metscape, en app til Cytoscape, at visualisere og fortolke genekspression og metaboliske data i forbindelse med menneskets stofskifte 15. Først valgte vi at indeholde elementer af forbindelsen, reaktion, enzym og gen i netværket. Vi valgte forbindelser / gener som forespørgslen og to netværk i E2 opregulering (figur 7A) og ned-forordning (figur 7B) blev vist. Den Metscape giver også en mulighed for at opbygge netværk på selektive veje. For eksempel ved anvendelse af det samme sæt data som bygge nedreguleret samlede net, blev et undernetværk af androgen-østrogenbiosyntese og metabolisme pathway genereres ved at skifte forespørgslen fra forbindelsen / genet til specifik pathway. Generne eller forbindelser med signifikante ændringer blev fremhævet i lysere farver. Udover at vælge en bestemt vej fra drop-down-vinduet, som beskrevet, kan man også oprette en sub-netværk ved at anvende "skabe subnetværket" funktion til det valgte område. Som vist i figur 6A og B, ERa aktivering og direkte binding til regulatoriske regioner gen påvirket mange metaboliske veje i brystcancerceller. Vores integrativ analyse viste, at ERa direkte binder til og regulerer ekspression af FASN genet, hvilket er vigtigt for de novo fedtsyrebiosyntese pathway (Figur 7C). Desuden E2 behandling nedreguleret androgen-østrogenbiosyntesen veje ved at undertrykke ekspression af CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 og GSTM2 i disse veje.

figur 1
Figur 1: Workflow i forberedelsen af prøver af RNA, DNA og cellelysater for RNA-Seq, chip-Seq, og metabolomiske analyse.

Figur 2
Figur 2:. En repræsentant elektroferogram af de analyserede med Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Integritet Number (RIN), indikator for RNA kvalitet RNA, blev givet af analysen som 9.9. (A) På en virtuel gel billede af RNA prøve begge bånd af 26S og 18S er skarpe. (B) Fluorescenssignaler af individuelle spor i than RNA viser, at intensiteten af 28S top er større end 18S højdepunkt og ingen forurening ses. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Et repræsentativt kvalitet kontrol af RNA-Seq rådata En af køretøjets stikprøvens sekvensdata blev analyseret ved hjælp FastQC. (A) Sekvens længdefordelingen af biblioteket, som er 100 bp. (B) Kvaliteten score langs position i læse. (C) Kvaliteten score pr sekvens viste universelle høje kvalitet af alle sekvenser. (D) Den GC-indhold pr læse matchede den teoretiske fordeling. Klik her for at se a larger version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Gel elektroforese af sonikerede kromatin fragmenterne 5 pi af cellelysatet fra hver prøve blev kørt på en 1,5% agarosegel med et 1.000 bp plus stigen på den første bane.. De fleste af fragmenterne er mellem 300 og 600 bp. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Oversigten over toppe repræsenterer nedbrydningsprodukter fra GC-MS Den øverste panel viser toppene identificeret i E2 behandlede prøver, mens det nederste panel fra kontrollen. Det område, der afgrænses blev værelses i at vise den nøjagtige metabolit repræsenteret af hver p EAK. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: rutediagram over Integrativ klyngedannelse metode.

Figur 7
Figur 7: visualisering af de integrerede gen-metabolit data i Metscape (A) Netværket af veje opreguleret af E2.. (B) Netværket af veje nedreguleres af E2. (C) E2 stimuleret ERa rekruttering til den nærliggende region FASN, som viser sig at være reguleret i de novo fedtsyrebiosyntese netværk genereret ved at anvende undernetværk funktion.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Sammenfatning af ultra-high-throughput sekventering af RNA-Seq og chip-Seq.

tabel 2
Tabel 2: Liste over top 10 metabolitter med væsentlige ændringer med E2 behandling.

tabel 3
Tabel 3: Pathways op- og nedreguleret af E2 behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir, beskrev vi generering og integrativ analyse af RNA-Seq, chip-Seq og metabolomics data fra MCF-7-celler, der er behandlet med E2. Vi udviklede et sæt protokoller Strategizing at udnytte de mest effektive metoder og brugervenlige bløde varer, som producerer biologisk relevant opdagelse. Til vores viden, vores er den første undersøgelse til at integrere genomenbaserede data fra tre forskellige analyser og identificerede nye metaboliske veje, som ERa direkte reguleret i brystkræftceller.

transcriptomics
Det er afgørende at starte med høj kvalitet RNA'er for en vellykket transkriptomisk analyse. God praksis vil eliminere risikoen for RNA-nedbrydning, herunder oprettelse RNase-fri bænk, skiftende handsker ofte, lagring i -80 ° C og holde på is i brug. Tilsætning af inkubation natten over ved -20 ºC forbedrer RNA opsving. For at undgå nedfrysning og optøning RNA gentagne gange, kan man tildele de RNA for downstream procedures upon isolering og oprensning. For eksistensen af ​​sekventeringsfejl, er QRT-PCR under anvendelse af cDNA fra prøverne udføres ofte til at kontrollere de differentielt udtrykte gener identificeret i RNA-Seq. Derfor bør nok RNA reserveres til dette formål. Vi udfører parret-end-sekvensering, der gør os i stand til at analysere splejsningsvarianter, ikke-kodende RNA og miRNA. For at undgå høj-sekventering omkostninger, kan single-end sekventering udføres så godt. Sammenlignet med mikroarrays, RNA-Seq er mere følsom og er ikke begrænset til proberne tilvejebragt på chippen. Vi får ikke kun oplysninger om kodende sekvenser, men også på ikke-kodende gener og forskelligt splejsede udskrifter. Vi er i øjeblikket ved hjælp af denne teknik til at analysere transcriptomes af forskellige cellelinjer efter ligand behandlinger samt væv fra mus eksperimenter.

Cistromics
Den ultra-high-throughput sekventering metode kræver minimal 5 ng chip DNA til bibliotekskonstruktion. I standard ChIP-Seq protokol 18, anbefales det at have mindst 10 ng. Kvantificering med fluorometri er kritisk. I denne protokol anvendte vi dobbeltstrenget DNA-detektion assay til bestemmelse af DNA-koncentrationen. Man kan også bruge fluorometer assay for præcis DNA kvantificering. For forskellene i udstyr og materialer, er det meget vigtigt for hver lab at etablere deres egen lydbehandling protokol, som genererer ønskelige DNA-fragmenter størrelser. Over-klipning chip DNA kan medføre tab af berigelse af target DNA mens chip DNA af store størrelser skabe problemer for effektiv sekventering. Inden indgivelse af DNA til sekventering, er det altid vigtigt at kontrollere berigelse af nogle kendte regioner ved qPCR. Teknikken er stadig begrænset af effektiviteten og specificiteten af ​​antistoffet, der anvendes til immunfældninger. For at få bindingssted oplysninger, der kan bruges som pålideligt i sammenlignende analyser, vi validere vores reagenser efter Encode chip-Seq standarder, 19 og brug standardized protokoller, der giver os konsistente datasæt. Kombineret med stillingen transkriptionsfaktor bindingssted berigelse analyse, chip-Seq er stadig en af ​​de bedste metoder til at bestemme direkte binding af transkriptionsfaktorer til kromatin. Vi er i øjeblikket ved hjælp af denne protokol til at studere rekruttering kinaser, coregulators og andre transkriptionsfaktorer til kromatin i andre cellelinjer samt østrogen reagerende mus væv.

metabolomics
For en succesfuld metabolisk profilering i humane brystkræftceller, en omhyggelig forberedelse prøve er kritisk. Mængden af ​​celler i brug og cellekultur betingelse i denne protokol er optimal for MCF7-celler. Andre cellelinjer kan kræve mere eller mindre celler til påvisning af et betydeligt antal metabolitter. Vi får omkring 100 metabolitter i hvert forsøg. Denne fremgangsmåde er begrænset til detektering af kortlivede metabolitter eller metabolitter, der er til stede i lave koncentrationer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for nem USIng en enkelt prøve prep at identificere flere metabolitter. Vi er i øjeblikket ved hjælp af denne teknik til at identificere østrogen regulerede metabolitter i serum og forskellige væv fra mus.

data Integration
Talrige transcriptomics og cistromics undersøgelser blev udført for at undersøge østrogen signalering og genregulering i brystkræftceller, herunder MCF7-celler 2,5-7,20. I denne undersøgelse for første gang, har vi tilføjet metabolomik data og forsøgte at udlede metaboliske netværk, der er direkte reguleret af ERa upon ligand tilsætning. Denne nye fremgangsmåde muligt for os at pin punkt molekylære kredsløbssystemer reguleres af østrogener, der påvirker cellulær metabolisme. Samlet set vores resultater støtter rolle ERa som en mester regulator af brystkræft biologi.

Sammenfattende vi givet et detaljeret kompendium af protokoller til generering af RNA-Seq, CHIP-Seq og metabolomik prøver fra brystkræftceller efter østrogen behandlinger og integrtiv analyse af data fra disse genomenbaserede tilgange. Disse protokoller vil gøre det muligt for forskerne at gøre lignende analyse for andre transkriptionsfaktorer, nukleare receptor ligander og næringsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

University of Illinois modtaget en investigator-indledte bevilling fra Pfizer Inc. ZME og YCZ fik støtte løn fra dette tilskud.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det nationale institut for fødevarer og landbrug, US Department of Agriculture, tildeling Illu-698-909 (ZME) og Pfizer, Inc. (ZME). Dens indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle udsigt over amerikanske landbrugsministerium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

Medicin RNA-Seq transkriptom chip-Seq cistrome metabolomics østrogen brystkræft
Systembiologi i Metabolic forordning ved østrogen-receptor signalering i Breast Cancer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter