Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Systems Biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor Signalering in Borstkanker

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Met de komst van de -omics zal ons begrip van de chronische ziekten zoals kanker en metabool syndroom is verbeterd. Echter, effectieve winning van de informatie in de grootschalige datasets die worden verkregen van genexpressie microarrays, deep sequencing experimenten of metabool profiel is van essentieel belang om te ontdekken en vervolgens gerichter de kritische regulatoren van zieke cel fenotypes. Oestrogeen Receptor α (ERa) is een van de master transcriptiefactoren reguleren van het gen programma's die belangrijk zijn voor oestrogeen reagerende borstkanker zijn. Om te begrijpen om de rol van ERa signalering bij borstkanker metabolisme benut we transcriptomische, cistromic en metabolomic gegevens van MCF-7 cellen behandeld met estradiol. In dit rapport beschreven we generatie van monsters voor RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en de integratieve computationele analyse van de verkregen gegevens. Deze benadering is nuttig bij het afbakenen nieuwe molname op mechanismen en genregulerend circuits die worden geregeld door een bepaalde transcriptiefactor die gevolgen metabolisme van normale of zieke cellen.

Introduction

Oestrogenen zijn belangrijke regulatoren van vele fysiologische processen bij zowel vrouwen als mannen, waaronder reproductieve weefsels, metabole weefsels, de hersenen en bot 1. Naast gunstige effecten in deze weefsels, oestrogenen ook kankers die ontstaan ​​uit borstklier en reproductieve weefsels rijden. Oestrogenen voornamelijk werken via ERS om celtype specifieke effecten veroorzaken. Deep sequencing van transcripten gereguleerd door ERa behulp van RNA-Seq en genoom-brede ERa DNA bindingsplaatsen analyse met behulp van ChIP-Seq bleek nuttig te zijn om te begrijpen hoe ERa werkt in verschillende weefsels en kankers die ontstaan ​​uit hen. Wij en anderen hebben genexpressieprofielen in verband met verschillende receptoren (ERa vs ERP) 2,3, verschillende liganden 3-5 en verschillende Coregulatoren 2,4,6,7 gepubliceerd.

RNA-Seq is de belangrijkste methode om de transcriptoom onderzoeken met hogere precisie en efficiëntie ten opzichte van microarray based genexpressie analyse 8. RNA verkregen uit cellijnen 2-4,7, weefsels of tumor monsters worden gesequenced, toegewezen aan beschikbare genomische vergaderingen en differentieel gereguleerde genen geïdentificeerd. Chromatine Immunoprecipitatie (chip) wordt gebruikt om de transcriptiefactor en coregulator chromatine binding aan bekende regelgeving bindingsplaatsen ontleden. ChIP-Seq (chip, gevolgd door high throughput sequencing) biedt detectie van de wereldwijde binding sites. Metabolomics is nog steeds gebruikte systeembiologie aanpak, die kwantitatief maatregelen, dynamische Multiparametrische respons van levende systemen op verschillende stimuli, waaronder chemicaliën en genetische storingen.

Door het uitvoeren van globale metabool profilering kan een functionele aflezing worden verkregen uit cellen, weefsels en bloed. Daarnaast hebben informatie van transcriptoom experimenten niet altijd overeen met de werkelijke veranderingen in het niveau van enzymen die bijdragen aan de biochemische pathways. gecombineerdeanalyse van transcriptoom en metaboloom gegevens kunnen wij identificeren en correleren veranderingen in genexpressie met werkelijke veranderingen metaboliet. Benutten van de informatie uit deze grootschalige datasets over een mechanistische informatie om de rol van transcriptiefactoren reguleren van complexe biologische systemen, met name degenen die betrekking hebben op menselijke ontwikkeling en ziekten zoals kanker en diabetes begrijpen.

De complexe aard van het zoogdier genoom maakt het een uitdaging om te integreren en volledig de resultaten van het transcriptoom, cistrome en metaboloom experimenten gegevens te interpreteren. Identificatie van functionele bindende gebeurtenissen die zouden leiden tot veranderingen in de expressie van genen doelgroep is belangrijk, want zodra functionele bindingsplaatsen worden geïdentificeerd; daaropvolgende analyse, waaronder transcriptie binding (TF) motief analyse kan worden uitgevoerd met hogere nauwkeurigheid. Dit leidt tot de identificatie van biologisch betekenisvolle TF cascades en mechanismen. Ook directe comparisop RNA-Seq en ChIP-Seq experimenten niet altijd mogelijk omdat de data van elk experiment zijn verschillende schalen en geluiden en soms betekenisvolle signalen worden verhuld door ruis bevolking. We zijn niet bewust van enige studie die informatie uit deze drie onafhankelijke maar verwante benaderingen van het directe metabole regulatie van ERa bij borstkanker begrijpen geïntegreerd. Daarom is onze algemene doelstelling in dit document is te relateren productieve binding evenementen om genexpressie en metaboliet verandert. Om dit doel te bereiken, we geïntegreerd gegevens van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en geïdentificeerd die oestrogeen geïnduceerde ERa bindend gebeurtenissen die zouden leiden tot genexpressie veranderingen in de metabole routes. Voor de eerste keer, bieden we een complete set van protocollen (figuur 1) voor het genereren van ChIP-Seq, RNA-Seq en metabolomics profilering en het uitvoeren van integratieve analyse van de gegevens aan nieuwe gen circuits reguleren van het metabolisme van de borst bloot te leggenkanker cellijnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van RNA-Seq Monsters

  1. Celkweek en behandeling
    1. Cultuur MCF7 cellen Verbeterde MEM (IMEM) plus fenolrood-medium met 10% warmte inactief FBS, 1% penicilline / streptomycine bij 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
      Let op: Zelfde cellijn en celkweek voorwaarde is gedurende het onderzoek gebruikt.
    2. Zaad MCF7 100.000 cellen per putje in 6-well platen. Hebben drie exemplaren voor elke behandeling. Op dag 3 Verwijder het medium en voeg 2 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
    3. Om de cellen te oogsten, voeg 1 ml RNA-isolatie reagens (zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform) in elk putje en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT). verzamel dan het cellysaat reagentia door pipetteren en storting in 1,5 ml buisjes
  2. RNA Isolation
    1. Voeg 200 ul chloroform tot 1 ml cellysaat reagens (1.1.3) en vortex gedurende 10 seconden. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer monsters bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Na centrifugatie Breng de waterige fase (top) naar een nieuwe buis zonder de andere fasen.
    2. Voeg 500 pi 100% isopropanol naar een nieuwe buis overgebracht met de waterige fase, en meng door. Incuberen bij -20 ° C overnacht. Centrifugeer de monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zich aan een pellet op de bodem van de buis. Verwijder het supernatant en was het pellet met 750 gl RNase-vrij 70% ethanol korte vortex.
    3. Centrifugeer monsters bij 6000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om alle resterende ethanol te verzamelen. Verwijder het resterende ethanol door pipetteren met een gel-lading-punt en zet de buizen naar beneden aan de lucht drogen gedurende 10 min. Los de pellet in 20-50 pi DEPC behandeld water afhankelijk van de grootte van de pellets.
  3. Zuiver het RNA met behulp van RNA clean-up kit volgens het protocol 4. Meet de RNA-concentratie met een fluorometrie gebaseerde assay kit volgens het protocol 9.
    OPMERKING: OD bij 260 nm wordt verstaan ​​de RNA-concentratie en de verhouding van OD bepaald bij 260 nm en 280 nm worden gebruikt om de zuiverheid van het monster te bepalen. Het wordt aanbevolen het controleren van de kwaliteit van RNA met behulp van Bio-analyzer test.
  4. Neem ongeveer 0,5 tot 1 pg gezuiverd RNA voor sequentiebepaling.
    LET OP: Biotech centrum bereidt de sequencing bibliotheken en voert gepaarde-end sequencing lezen met behulp van methoden die eerder 2 beschreven.

2. Voorbereiding van ChIP-Seq Sample

  1. Celkweek en behandeling
    1. Seed 500.000 MCF7 cellen per 10 cm plaat in groeimedium.
      LET OP: Voor elke pull-down werden 16 platen gebruikt. Op dag 3, verwijder het medium en voeg 5 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 aan elkaarbord. Behandel de cellen gedurende 45 min (37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer).
  2. Verknopen en Cell Harvest
    1. Voeg 250 ul 37% Formaldehyde in 5 ml medium aan chromatine verknopen, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Stop het verknopen door het wassen cellen met 5 ml ijskoude 1x MEM.
    2. Oogst de cellen in 250 pi Cell Lysis buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCI, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-amine oxide) per plaat.
  3. Fragmentatie van chromatine
    1. Sonificeer de cellen gedurende 30 seconden x 8 aan versterker 30 van de vereiste grootte chromatine bereikt. Cool elk monster op het ijs na een ultrasoonapparaat van 30 sec.
    2. Centrifuge bij 16, 000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en voorzichtig pipet de bovenstaande vloeistof zonder de pellet onderin verstoren.
    3. Neem een 5 pl monster van de bovenstaande vloeistof en controleer de DNA grootte door elektroforese door 1,5% agarosegel zoals eerder 10 beschreven. De ideale grootteDNA moet tussen 200-500 bp.
  4. chromatine Immunoprecipitatie
    1. Bewaar 25 pl cellysaat als invoer. In een 50 ml buisje, meng 4 ml cellysaat met 20 ml IP buffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl en 0,5% Triton X), ERa antilichaam (500 pl F10 en 500 gl HC- 20), en 500 pl ProtA en ProtG eiwitbekleding magnetische korrels. Incubeer het mengsel door rotatie bij 4 ° C geïncubeerd om de vorming van chromatin- antilichaamcomplex mogelijk.
  5. Wast en Reverse-verknoping
    1. Gebruik een magnetische staan ​​om de magnetische korrels te verzamelen over de gemagnetiseerde kant aan het wassen buffer te verwijderen.
    2. Was de magnetische korrels in 25 ml wasbuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI, 01% SDS, 1% Triton X, en 150 mM NaCl). Grondig wassen magnetische beads zonder storende DNA-eiwit complexen, voeg 25 ml wasbuffer langzaam aan de buis langs de zijkant keer dan de buizen tot alle magnetische kralen zijn goed gemengd with het wassen buffer zonder dat het lijkt als een pellet. Als alternatief gebruikt de rotator aan de buis om. Laat de monsters niet vortex. Was de magnetische korrels op dezelfde manier in de volgende stappen.
    3. Was de magnetische korrels in 25 ml Wash-buffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI, 01% SDS, 1% Triton X, en 500 mM NaCl).
    4. Was de magnetische korrels in 25 ml Wash-buffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCI, 1% NP-40, 1% Dexycholate en 250 mM LiCl).
    5. Was de magnetische korrels in 25 ml 1 x TE-buffer (1 mM EDTA en 10 mM Tris HCl) tweemaal.
    6. Elueer DNA in 500 ui elutiebuffer (1% SDS en 10 mM NaHCOs 3) en vervolgens verdelen de 500 ul DNA-elutie in 4 buizen. Voor het DNA van ingangen, elueren DNA in 125 ui elutiebuffer.
    7. Incubeer de buizen bij 65 ° C geïncubeerd op een verwarmingsblok. Bedek de buizen op het verwarmingsblok met aluminiumfolie om de warmte ook over alle buizen te houden. Plaats een gewicht op de buizen te openen houden. </ Li>
  6. DNA-isolatie
    1. Koel de buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Isoleer DNA uit de pull-down monsters met behulp van ChIP DNA isolatie kit. Volg de aanwijzingen van de fabrikant.
      1. Warm de elutiebuffer bij 65 ° C. Voeg 625 ul bindingsbuffer aan elke buis. Als de neerslag vormen, voeg nog eens 250 ul bindingsbuffer totdat de oplossing helder is.
      2. Plaats het monster op de kolom en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 sec. Was het monster met 250 ui wasbuffer. Probeer ethanol toevoegen wasbuffer wanneer eerst te gebruiken. Herhaal het wassen.
      3. Elueer het DNA in 15 ui elutiebuffer. Combineer het DNA van dezelfde naar beneden trekken van 4 tubes tot ongeveer 55 pi DNA te bereiken.
    2. Isoleer de Input DNA Met behulp van een DNA Purification Kit.
      1. Warm de elutiebuffer bij 65 ° C. Voeg 625 ul bindingsbuffer in elke buis en incubeer gedurende 10 min. Laad het monster op de kolom in een 2 ml collectiop de buis.
      2. Was het monster met 750 ui wasbuffer, centrifuge bij 16.000 xg gedurende 1 minuut. Herhaal het centrifugeren om de resterende buffer te verwijderen. Elueer het DNA in 30 ui EB.
    3. Meet de DNA-concentratie met behulp van een commerciële Fluorochrome Assay met Wijziging 11.
      1. Verdun de 20x TE buffer in 1x TE als assay buffer voor het verdunnen van het reagens en DNA-monsters. Neem 5 pl DNA geïsoleerd en vul het in 50 ui in 1x TE.
      2. Van 2 ug / ml DNA stockoplossing maken DNA standaard bereik van blanco 1, 10, 100, 1000 ug / ml. In een plaat met 96, toewijzen 25 pi van elke standaard, evenals DNA verdunning in tweevoud. (Drievoud voor standaard aanbevolen.)
      3. Bereid het werken reagens door een 200-voudige verdunning van dsDNA reagens in 1x TE-buffer in plastic buis. Bedek de werkende reagens oplossing met aluminiumfolie om licht te vermijden. Voeg 200 ul werken reagens in elk monster. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Bedek de plaat met aluminiumfolie om licht te vermijden.
      4. Meet de bloei van de monsters met behulp van een fluorescentie plaatlezer (excitatie bij 480 nm, emissie 520 nm). Genereren DNA standaardcurve van fluorescentie versus DNA- concentratie. Bepaal de concentraties van de op basis van de gegenereerde DNA-standaard curve monsters.
  7. Verificatie van ChIP experiment met behulp van qPCR
    1. Take 2 pl DNA geïsoleerd en verdund in 20 ui in het water. Stel de qPCR reactie in drievoud door het mengen van 2,5 pl DNA verdunning, 5 pi Green I PCR master mix, 1 ui primer, en 1,5 ul nuclease vrij water.
    2. Voer het qPCR met Fast Real-Time PCR met behulp van de volgende programma: Stap 1: 95 ° C gedurende 60 sec Stap 2: 95 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 60 seconden Herhaal stap 2 39 keer.
  8. Stuur 10 ng DNA-monster te Biotech centrum voor sequencing.
    LET OP: De Biotech center bereidt de ChIP DNA in bibliotheken volgens instructie en voert enkel-lezen sequentiebepaling onder toepassing van werkwijzen die eerder 2 beschreven.

3. Metabolomics Assay Monstervoorbereidingstesten

  1. Celkweek en behandeling
    1. Seed 400.000 MCF7 cellen per 10 cm plaat in groeimedium. Voor elke behandeling bereiden drie monsters. Gebruik twee platen in elk monster voldoende cellen te ontvangen voor de detectie. Op dag 3 Verwijder het medium en voeg 5 ml vers medium met of zonder 10 -8 M E2 naar de cellen. Behandel de cellen gedurende 24 uur (37 ° C in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer).
  2. sample Collection
    1. Voeg 5 ml ijskoude 1x PBS op de plaat, zuig het PBS na meerdere malen kort het kantelen van de plaat. Herhaal dit twee keer, en verwijder zoveel PBS mogelijk na de laatste wasbeurt.
    2. Voeg 750 ul van pre-koude aceton om elke plaat en schraap de cellen. Combineer de cellen in aceton uit twee platen ineen 2 ml buisje op ijs.
    3. Celgetal voor normalisatie
      1. Voor elke behandeling, gebruik maken van twee extra borden voor mobiele kwantificering. Om de-hechten van de cellen van de plaat, voeg 2 ml van HE buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3, en 1 mM EDTA) in elke plaat en incubeer gedurende 5 minuten.
      2. Verzamelen en meng goed de cellen door pipetteren cellen in de HE buffer. Met in totaal 20 pi celoplossing het aantal cellen met een hemocytometer geteld.
  3. Bewaar de monsters bij -80 ° C vóór verzending naar het centrum Metabolomics te identificeren en kwantificeren van de metabolieten met behulp van analyse gaschromatografie massaspectrometrie (GC-MS).

4. Integratieve Analyse

  1. RNA-Seq data-analyse:
    1. Voer Kwaliteit controle van FASTQ bestanden met behulp van FastQC: Lees QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Selecteer FastQC: Lees in het kader van het instrument van NGS: QC en manipulatie. Upload het ruwe data bestand van de huidige History.
        LET OP: Het is raadzaam om een ​​titel te geven voor de output file om je te herinneren wat het werk was, omdat er mogelijk meerdere uitgangen.
    2. Uit te voeren en de output bestand zal verschijnen onder de Geschiedenis. Herhaal deze procedure voor elke reeks bestanden. Trim adapters met behulp van Clip onder NGS: FastX Toolkit.
    3. Align leest hg19 behulp Tophat2 met RefSeq genoom verwijzingsannotatie 12 (standaardwaarden).
      1. Selecteer Tophat2 onder instrument van NGS: RNA-analyse. Geef de bibliotheek gepaarde type (single-end versus gepaarde-end).
      2. Upload de input FASTQ bestand van het huidige geschiedenis. Selecteer de referentie-genoom. Kies standaard instellingen. Of gebruik de volledige lijst met parameters te wijzigen.
      3. Uit te voeren en het zal twee output-bestanden te produceren: de ene is UCSC BED spoor van knooppunten; een ander is een lijst van gelezen optimalisaties in BAM-formaat.
    4. Upload BAM bestanden naar sequencing data analyse-instrument. Bereken expressie waarden met Quantification Tool.
    5. Identificeer differentieel up-gereguleerde genen met Expression Analysis Tool met behulp van standaardwaarden en vouw verandering> 2 en p-waarde <0,05. Ook identificeren differentieel down-gereguleerde genen met Expression Analysis Tool met behulp van standaardwaarden en vouw verandering <0,5 en p-waarde <0,05.
  2. ChIP-Seq data-analyse:
    1. Lijn FASTQ leest aan hg19 behulp Bowtie2 13 (Default Values) in de Melkweg.
      1. Selecteer Bowtie2 onder het instrument van NSC: Mapping. Controleer of de bibliotheek-mate gepaarde (single-end versus gepaarde-end). Upload het FASTQ bestand van de huidige geschiedenis.
      2. Selecteer de referentie-genoom. Gebruik de standaard parameterinstellingen. Uit te voeren en het zal output file te produceren met in kaart gebrachte sequentie leest als BAM-bestand. Herhaal de procedure voor elke reeks bestanden.
    2. Identificeer pieken MACS met behulp 14 van een p-waarde cut-off van 6.0e-7 en FDR van 0,01, zoals hierboven beschreven 2.
    3. Metabolomics Data Analyse:
      1. Omzetten chemische namen van metabolieten te KEGG_IDs.
      2. Identificeer differentieel gereguleerde metabolieten door vergelijking niveaus gedetecteerd in Vehicle vs. E2 behandelde monsters (een 2 voudige cut-off werd gebruikt in deze studie).
    4. Integrative Analyse:
      1. Identificeer genen die ERa bindende plaatsen met behulp van sequencing data-analyse tool. Vertalen Regio's om genen functie met behulp van 20 kb als afstand cut-off.
      2. Identificeer differentieel omhoog en omlaag-gereguleerde genen van RNA-Seq analyse met behulp veelvoudverandering> 2 en fold change <0,5, respectievelijk de p-waarde <0,05 als afgesneden. Te vergelijken met de lijst van ERa bindingsplaats die genen bevatten met behulp van Venn diagram vergelijking.
      3. Gebruik deze lijst om E2 gemoduleerde metabole routes te identificeren met behulp van Metscape 15 module van Cytoscape.
        1. Door het selecteren van Metscape module van apps, kies Build netwerk en vervolgens pathway-based optie.
        2. Selecteer het organisme (Human). Kies een bestand van E2 ongereguleerde samengestelde lijst (KEGG ID) en E2 up-gereguleerd gen lijst.
        3. Kies Verbinding -Reaction -Enzyme-gen als het type netwerk. Kies verbinding / genen als de query.
        4. Build-netwerk. Herhaal met de E2 neerwaarts gereguleerd verbinding en genen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

transcriptomics
Om differentieel tot expressie van genen door E2 behandeling te analyseren, hebben we gekozen om een ​​RNA-Seq experiment uit te voeren. Naast het verschaffen informaties mRNA-niveaus kunnen RNA-Seq gegevens ook worden gebruikt om mutaties in niet-coderende RNA (lange niet-coderende RNA's microRNA) en alternatieve splicing gebeurtenissen bewaken. We hebben geen informatie over de analyse van niet-coderende RNA's of als alternatief getranscribeerd genen, aangezien kader van onze studie is eiwitcoderende genen die belangrijk zijn voor metabole regulatie identificeren. Echter, RNA-Seq is een uitstekende manier van het verkrijgen van informatie over de differentiële genexpressie evenementen.

Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit leest, is het belangrijk om zeer zuiver RNA te krijgen. Na isoleren van RNA gezuiverd we het RNA met een RNA opruimen kit. Nog bijna 50% van het RNA verloren gaat tijdens dit proces en hoeveelheid uitgangsmateriaal RNA moet worden genomen in consideration om benodigde hoeveelheid (100-500 ng) tegen het einde van zuiveringsstap te verkrijgen.

We gekwantificeerd de RNA opbrengst met behulp fluorometer RNA HS test, die zeer nauwkeurig en voorkeursmethode voor kwantificatie van lage abundantie RNA. Vervolgens worden de integriteit en kwaliteit van de RNA monsters werden onderzocht met behulp bioanlayzer, die een levensvatbaar alternatief voor gelelektroforese onder toepassing van een minimale hoeveelheid RNA. De analyse toont alle monsters scherpe en schone banden van 18S en 28S rRNA vermelding van de integriteit en zuiverheid van de monsters (figuur 2B). RNA integriteit Number (RIN) werd gebruikt als standaard voor RNA kwaliteitscontrole. RIN 10 duidt intact RNA, RIN 6 gedeeltelijk afgebroken en RIN3 sterk gedegradeerd 16.

Aanbevolen wordt de RIN tenminste 7 zijn voor sequencing experiment. Al onze RNA-monsters ontvangen RIN waarde tussen 9,6-9,9 <strong> (Figuur 2A). Sequencing bibliotheken werden geconstrueerd uit 500 ng hoogwaardige RNA uit elk monster met behulp van ultra-high-throughput sequentiebepaling systeem zoals Illumina 2500. Gemiddeld 18.000.000 Hoogwaardige sequentiebepaling leest werden verkregen voor elk monster (Tabel 1), die klaar is voor downstream analyse. Om de algehele kwaliteit van de high-throughput-sequentie ruwe gegevens te controleren, werd FastQC lopen voor elk monster leest. Een vertegenwoordiger FastQC rapport voor een voertuig RNA-Seq data werd getoond (figuur 3). De sequentielengte van de leest ongeveer 100 bp (Figuur 3A). Voor elk lezen, de kwaliteit score was 32-34 voor de eerste 5 bp en 36-38 van 6-100bp (Figuur 3B). Onder 17.990.863 leest gegenereerd uit deze steekproef, de meeste van hen hadden de kwaliteit score hoger dan 34 (figuur 3C). De GC-gehalte per boek in de reeks volgde de normale verdeling met een gemiddelde van 48% GC. Over het algemeen de kwaliteitscore van de leest was zeer hoog.

Cistromic analyse van ERa bindingsplaatsen
Neem voor de efficiënte diepe sequencing, verkregen DNA-fragmenten op de gewenste grootte is een van de belangrijke factoren. Huidige sequencing benaderingen kunnen verschillende eisen aan de DNA-fragmenten, bijvoorbeeld 300-600 bp voor ultra-high-throughput sequencing systeem, 100-200 bp voor AB / vast 17. In dit experiment de meeste van de DNA-fragmenten tussen 300 bp en 600 bp zoals op gel (figuur 4). Als alternatief kunnen de lezers kozen hun chromatine bereiden met behulp van MNase spijsvertering, maar we voelen ons gevestigde protocol voorziet in de benodigde monsters met een hoge kwaliteit en zorgt voor reproduceerbare resultaten. Tien ng DNA uit elke behandeling en de overeenkomstige ingang monster werd bereid in buffer EB. De ChIP DNA was single-read gesequenced met behulp van ultra-high-throughput sequentiebepaling systeem. ChIP DNA-monsters opgeleverd over20.000.000 leest terwijl de input DNA leverde meer dan 35.000,000 leest (tabel 1).

metabolomics
De metabolieten in zoogdiercellen kwantificeren volgens GCMS ten minste 10 ug celmassa vereist. We begonnen met 400.000 MCF7 cellen met de experimenten. Tegen de tijd van de oogst, waren er ongeveer 500.000 cellen in elke plaat. Het overzicht van de metabolieten vertegenwoordigd door pieken werden vergeleken tussen de controle en de Estradiol behandelde monster (figuur 5). Ongeveer 100 metabolieten geïdentificeerd, die meetellen voor 60% van de totale in zoogdieren bekend. Hier presenteren we een lijst van de top 10 metabolieten, die significante veranderingen in de E2 behandeling (tabel 2) te tonen. Overall, E2 opgereguleerd routes inclusief fructose en mannose metabolisme, histidine metabolisme, purine metabolisme, cholesterol biosynthese en vitamine B3 metabolisme. De downregulated paden waren butanoaat metabolism, de novo biosynthese van vetzuren, pentose fosfaat route, ureum cyclus en metabolisme van arginine (tabel 3).

Gegevensanalyse en integratie
De gegevens van RNA-Seq, ChIP-Seq en GC-MS werden verwerkt en geanalyseerd door een reeks stappen (figuur 6). Na de vergelijking tussen genen geïdentificeerd in RNA-Seq en ChIP-Seq, één set opwaarts gereguleerd en een set-down gereguleerde genen door estradiol werden geëxtraheerd. Uit de metabolische gegevens, verkregen we twee sets van op- en neerwaarts gereguleerd verbindingen door de behandeling Estradiol. Volgende gebruikten we Metscape, een app voor Cytoscape, te visualiseren en interpreteren van de genexpressie en metabole gegevens in het kader van de menselijke stofwisseling 15. Eerst kozen we elementen, reactielid, enzym en gen in het net. Wij selecteerden de verbindingen / genen als query en twee netwerken van de E2 up-regeling (figuur 7A) en omlaag-Verordening (Figuur 7B) werden getoond. De Metscape biedt ook een optie om netwerken op te bouwen op selectieve trajecten. Bijvoorbeeld met behulp van dezelfde set gegevens als de bouw-downgereguleerde volledige netwerk, een subnetwerk van androgeen-oestrogeen biosynthese en metabolisme pathway werd opgewekt door het schakelen van de vraag van de verbinding / gen specifieke route. De genen of verbindingen met significante veranderingen werden gemarkeerd in lichtere kleur. Naast het selecteren van een specifiek traject van de drop-down venster zoals beschreven, kan men ook een sub-netwerk te creëren door het toepassen van de functie "te creëren subnetwerk" om het gekozen gebied. Zoals getoond in figuur 6A en B, ERa activatie directe binding aan gen-regulatoire gebieden beïnvloed veel metabole routes in borstkankercellen. Deze geïntegreerde analyse gaf aan dat ERa direct bindt aan en reguleert de expressie van FASN gen, wat belangrijk is voor de novo vetzuur- biosyntheseroute (FIGUUR 7C). Daarnaast downregulated E2 behandeling androgeen-oestrogeen biosynthese routes door het onderdrukken van de expressie van CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 en GSTM2 in deze trajecten.

Figuur 1
Figuur 1: Workflow van de voorbereiding van monsters van RNA, DNA en cellysaten voor de RNA-Seq, ChIP-Seq en Metabolomic analyse.

figuur 2
Figuur 2:. Een vertegenwoordiger elektroferogram van de RNA geanalyseerd Agilent 2100 Bioanalyzer RNA integriteit Number (RIN), indicator RNA kwaliteit, is gegeven door de analyse als 9,9. (A) op een virtuele gel beeld van de RNA-monster beide banden van de 26S en 18S zijn scherp. (B) TL-signalen van de individuele sporen in thij RNA blijkt dat de intensiteit van de 28S piek is groter dan 18S piek en geen verontreiniging wordt gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Een vertegenwoordiger kwaliteitscontrole van het RNA-Seq ruwe data Een van sequence data van het voertuig monster werd geanalyseerd met behulp van FastQC. (A) De sequentie lengteverdeling van de bibliotheek die is 100 bp. (B) De kwaliteit score langs de positie in te lezen. (C) De kwaliteit score per reeks toonde de universele hoge kwaliteit van alle sequenties. (D) De GC-gehalte per lezen overeen met de theoretische verdeling. Klik hier om een la te bekijkenrger versie van deze figuur.

figuur 4
Figuur 4: Gel elektroforese van het gesoniceerd chromatine fragmenten 5 pl van het cellysaat van elk monster werd op een 1,5% agarosegel met een 1000 bp plus ladder aan de eerste baan.. De meerderheid van de fragmenten zijn tussen de 300 en 600 bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5:. Het overzicht van pieken van metabolieten uit de GC-MS Het bovenste paneel toont de pieken die in het E2-behandelde monsters terwijl het onderste paneel van de besturing. Het gebied werd ingesloten in roomed de exacte metaboliet vertegenwoordigd door elke p tonen eak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Stroomschema van de methode Integrative clustering.

figuur 7
Figuur 7: De visualisatie van het geïntegreerde gen-metaboliet data in Metscape (A) Het netwerk van wegen opgereguleerd door E2.. (B) Het netwerk van paden down-gereguleerd door E2. (C) E2 ERa gestimuleerde recrutering naar de nabijgelegen regio FASN, die blijkt te worden gereguleerd in de de novo biosynthese van vetzuren netwerk gegenereerd door het toepassen subnetwerk functie.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1: Samenvatting van de ultra-high-throughput sequencing van RNA-Seq en ChIP-Seq.

tabel 2
Tabel 2: Lijst van de top 10 metabolieten met belangrijke veranderingen met E2 behandeling.

tabel 3
Tabel 3: Pathways up- en down-gereguleerd door E2 behandeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel beschrijven we genereren en integratieve analyse van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics gegevens van MCF-7-cellen die zijn behandeld met E2. We ontwikkelden een reeks protocollen strategizing om de meest efficiënte methoden en gebruiksvriendelijke zachte waren die biologisch relevante ontdekking te produceren gebruiken. Voor zover wij weten, onze is de eerste studie om -omics data integreren uit drie verschillende analyses en geïdentificeerd nieuwe metabole routes die ERa direct gereguleerd in borstkankercellen.

transcriptomics
Het is cruciaal om te beginnen met een hoge kwaliteit voor een succesvolle RNA transcriptoom analyse. Goede praktijk de kans RNA degradatie, waaronder het maken van RNase-vrij bank, veranderen vaak handschoenen, opslag in -80 ° C en plaatsing op ijs in gebruik elimineren. Toevoeging van incubatie gedurende de nacht bij -20 ºC verbetert RNA herstel. Het bevriezen en ontdooien RNA herhaaldelijk voorkomen, kan men het RNA voor downstream procedur toewijzenes op de isolatie en zuivering. Voor het bestaan ​​van sequencingfouten wordt qRT-PCR met de cDNA van de monsters vaak uitgevoerd om differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd in RNA-Seq verifiëren. Derhalve moet voldoende RNA worden gereserveerd voor dit doel. Wij voeren gepaarde-end-sequencing, die ons in staat stelt om splice varianten, niet-coderende RNA's en miRNAs te analyseren. Om een ​​hoge-sequencing kosten te vermijden, kan single-end sequencing ook worden uitgevoerd. Vergeleken met microarrays, RNA-Seq is gevoeliger en is niet beperkt tot de probes die op de chip. We krijgen niet alleen informatie over coderende sequenties, maar ook niet-coderende genen en differentieel gesplitste transcripten. We zijn momenteel met behulp van deze techniek om transcriptomes van verschillende cellijnen na ligand behandelingen en weefsel van de muis experimenten te analyseren.

Cistromics
De ultra-high-throughput sequencing methode vergt minimaal 5 ng ChIP DNA voor bibliotheekconstructie. In standaard ChIP-Seq-protocol 18, is het raadzaam om ten minste 10 ng hebben. Kwantificering met fluorometrie kritisch. In dit protocol gebruiken we dubbelstrengs DNA detectietest de DNA concentratie te bepalen. Men kan ook gebruik maken van fluorometer test voor nauwkeurige DNA kwantificatie. De verschillen in apparatuur en materialen, is het zeer belangrijk voor elke lab eigen protocol sonicatie, hetgeen wenselijk DNA fragmenten afmetingen genereert stellen. Over-scheren de chip DNA zou het verlies van de verrijking van target DNA veroorzaken tijdens ChIP DNA van grote maten te creëren probleem voor efficiënt sequencing. Voor het indienen van de DNA sequencing, is het altijd belangrijk om de verrijking van enkele bekende regio's controleren door qPCR. De techniek is nog steeds beperkt door de efficiëntie en specificiteit van het antilichaam voor immunoprecipitaties. Bindende site informatie die betrouwbaar kunnen worden gebruikt in vergelijkende analyses te verkrijgen, we onze reagentia volgende ENCODE ChIP-Seq normen te valideren, 19 en gebruik standardized protocollen die ons te voorzien van consistente datasets. In combinatie met de post transcriptiefactor bindingsplaats verrijking analyse, ChIP-Seq is nog steeds een van de beste methoden om directe binding van transcriptiefactoren bepalen chromatine. We zijn momenteel met behulp van dit protocol om rekrutering kinases, Coregulatoren en andere transcriptiefactoren studeren om chromatine in andere cellijnen evenals oestrogeen reagerende muis weefsels.

metabolomics
Voor een succesvolle metabool profiel in menselijke borstkankercellen, een zorgvuldige monster voorbereiding is van cruciaal belang. De hoeveelheid cellen gebruikt en celkweek staat in dit protocol is optimaal voor MCF7 cellen. Andere cellijnen kunnen min of meer cellen voor detectie van een groot aantal metabolieten vereisen. We krijgen ongeveer 100 metabolieten in elk experiment. Deze werkwijze is beperkt voor de detectie van kortlevende metabolieten of metabolieten die aanwezig in lage concentraties. Deze werkwijze biedt het gemak van using een enkel monster prep meerdere metabolieten te identificeren. We zijn momenteel met behulp van deze techniek om oestrogeen-gereguleerde metabolieten te identificeren in het serum en verschillende weefsels van de muis.

data Integration
Talrijke transcriptomics en cistromics studies werden gedaan om oestrogeen signalering en genregulatie onderzoeken borstkankercellen, waaronder MCF7 cellen 2,5-7,20. In dit onderzoek, voor het eerst, voegden we metabolomics data en probeerde metabolisch netwerk rechtstreeks door ERa worden gereguleerd na toevoeging ligand afgeleid. Deze nieuwe benadering konden wij punt moleculaire circuits geregeld door oestrogenen die van invloed zijn celstofwisseling pin. Over het algemeen, onze bevindingen ondersteunen de rol van ERa als meester regulator van borstkanker biologie.

Kortom, op voorwaarde dat we een gedetailleerde compendium van protocollen voor het genereren van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics monsters van borstkankercellen na oestrogeen behandelingen en integrtieve analyse van de resultaten van deze -omics benaderingen gegevens. Deze protocollen zullen onderzoekers in staat om soortgelijke analyse te doen voor andere transcriptiefactoren, nucleaire receptorliganden en voedingsstoffen omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Universiteit van Illinois kreeg een investigator initiated subsidie ​​van Pfizer Inc. ZME en YCZ ontvangen salaris steun van deze subsidie.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw, US Department of Agriculture, award ILLU-698-909 (ZME) en Pfizer, Inc (ZME). De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

Geneeskunde RNA-Seq transcriptoom ChIP-Seq cistrome metabolomics oestrogeen borstkanker
Systems Biology van metabole regulatie van oestrogeenreceptor Signalering in Borstkanker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter