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Medicine

Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Avec l'avènement des -omiques approches notre compréhension des maladies chroniques comme le cancer et le syndrome métabolique est améliorée. Cependant, l'exploitation minière efficace de l'information dans les ensembles de données à grande échelle qui sont obtenus à partir des microarrays d'expression des gènes, des expériences de séquençage profondes ou le profilage métabolique est indispensable pour découvrir et cibler efficacement les régulateurs critiques de phénotypes cellulaires malades. Estrogen Receptor α (ERa) est l'un des facteurs de transcription maître régissant les programmes de gènes qui sont importants pour les cancers du sein sensibles aux œstrogènes. Afin de comprendre au rôle du ERa de signalisation dans le métabolisme du cancer du sein, nous avons utilisé des données transcriptomiques, cistromic et métabolomique de MCF-7 cellules traitées avec l'estradiol. Dans ce rapport, nous avons décrit la génération d'échantillons pour l'ARN-Seq, ChIP-Seq et expériences de métabolomique et l'analyse informatique intégrative des données obtenues. Cette approche est utile pour délimiter roman taupemécanismes culaire et circuits de gènes de régulation qui sont réglementés par un facteur de transcription particulier qui a une incidence métabolisme des cellules normales ou malades.

Introduction

Les estrogènes sont des régulateurs importants de nombreux processus physiologiques chez les femmes et les hommes , y compris les tissus reproducteurs, les tissus métaboliques, le cerveau et les os 1. En plus des effets bénéfiques dans ces tissus, les œstrogènes conduisent aussi des cancers qui découlent de mammaires et les tissus reproducteurs. Les estrogènes travaillent principalement par RÉ pour induire des effets spécifiques de type cellulaire. séquençage profond des transcrits régulés par ERa en utilisant l'ADN ERa analyse des sites de liaison ARN-Seq et l'ensemble du génome en utilisant ChIP-Seq avéré être utile de comprendre comment fonctionne ERa dans différents tissus et les cancers qui en découlent. Nous et d' autres ont publié des profils de gènes d'expression associés aux différents récepteurs (ERa vs ERß) 2,3, différents ligands 3-5 et différents corégulateurs 2,4,6,7.

ARN-Seq est la principale méthode pour examiner le transcriptome, offrant une précision et une plus grande efficacité par rapport à ba microarraygène sed analyse de l' expression 8. ARN obtenu à partir des lignées cellulaires 2-4,7, des tissus ou des échantillons de tumeur sont séquences, mis en correspondance avec les ensembles génomiques disponibles et les gènes régulés de manière différentielle sont identifiés. Immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est utilisé pour disséquer le facteur de transcription et de co-régulateur se liant à des sites de liaison connus de régulation de la chromatine. ChIP-Seq (ChIP suivi par séquençage à haut débit) fournit une détection impartiale des sites de liaison mondiaux. La métabolomique est une autre approche de la biologie des systèmes de plus en plus utilisé, ce qui quantitativement les mesures, la réponse multiparamétrique dynamique des systèmes vivants à divers stimuli, y compris les produits chimiques et les perturbations génétiques.

En effectuant le profilage métabolique global, une lecture fonctionnelle peut être obtenue à partir de cellules, les tissus et le sang. En outre, des informations à partir d'expériences de transcriptome ne reflètent pas toujours les changements réels dans le niveau des enzymes qui contribuent à des voies biochimiques. Combinéanalyse des données de transcriptome et métabolome nous permet d'identifier et de corréler les changements dans l'expression des gènes avec des changements de métabolites réels. Exploiter l'information de tous ces grands ensembles de données à grande échelle fournissent les détails mécanistiques pour comprendre le rôle des facteurs de transcription régulant les systèmes biologiques complexes, en particulier ceux qui ont trait au développement humain et des maladies comme le cancer et le diabète.

La nature complexe du génome de mammifère, il est difficile d'intégrer et pleinement interpréter les données obtenues à partir des expériences transcriptomiques, cistrome et métabolome. L'identification des événements de liaison fonctionnels qui conduisent à des changements dans l'expression des gènes cibles est important parce que les sites de liaison une fois fonctionnels sont identifiés; qui a suivi l'analyse, y compris la liaison transcription (TF) analyse de motif, pourrait être réalisée avec une plus grande précision. Cela conduit à l'identification des cascades et des mécanismes de TF biologiquement significatives. comparis Aussi directssur des expériences d'ARN-Seq et ChIP-Seq ne sont pas toujours possible, car les données de chaque expérience ont différentes échelles et des bruits et dans certains cas des signaux significatifs sont obscurcis par le bruit de la population. Nous ne sommes pas au courant d'aucune étude qui a intégré les informations de ces trois approches distinctes, mais pour comprendre la régulation métabolique directe par ERa dans le cancer du sein. Par conséquent, notre objectif global de cet article est de rapporter des événements de liaison productifs à l'expression des gènes et des changements de métabolites. Afin d'atteindre cet objectif, nous avons intégré des données à partir d'ARN-Seq, ChIP-Seq et métabolomique expériences et identifié les œstrogènes induite ERa événements qui conduirait à des changements d'expression des gènes dans les voies métaboliques de liaison. Pour la première fois, nous fournissons un ensemble complet de protocoles (figure 1) pour générer ChIP-Seq, ARN-Seq et métabolomique profilage et effectuer une analyse intégrative des données pour découvrir de nouveaux circuits de gènes régulant le métabolisme du cancer du seindes lignées cellulaires de cancer.

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Protocol

1. Préparation des échantillons d'ARN-Seq

  1. Culture cellulaire et traitement
    1. La culture des cellules MCF7 par une amélioration MEM (IMEM) plus le milieu de rouge de phénol avec 10% de FBS chaleur inactive, 1% de pénicilline / streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%.
      Remarque: lignée cellulaire même et l'état de culture cellulaire est utilisé tout au long de l'étude.
    2. Semences 100.000 cellules MCF7 par puits dans des plaques 6 puits. Avoir triplicats pour chaque traitement. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 2 ml de milieu frais avec ou sans puits 10 -8 M E2 à chacun. Laisser incuber les plaques pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%.
    3. Pour récolter les cellules, ajouter 1 ml de réactif d'isolement d'ARN (thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme acide) dans chaque puits et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante (TA). Ramassez ensuite le réactif de lysat cellulaire par pipetage et le dépôt en tubes de 1,5 ml
  2. Isolement de l'ARN
    1. Ajouter 200 pi chloroform 1 ml de réactif de lysat cellulaire (1.1.3) et vortexer pendant 10 secondes. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Après centrifugation, transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un nouveau tube sans déranger les autres phases.
    2. Ajouter 500 ul de 100% d'isopropanol dans un nouveau tube à la phase aqueuse transférée, et mélanger par retournement. Incuber à -20 ° C pendant une nuit. Centrifuger les échantillons à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Observer un culot au fond du tube. Jeter le surnageant et laver le culot avec 750 ul de 70% d'éthanol sans RNase par une brève vortex.
    3. Centrifuger les échantillons à 6000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et centrifuger l'échantillon à 16.000 xg pendant 1 min à 4 ° C pour recueillir tout l'éthanol restant. Retirer l'éthanol restant par pipetage avec une pointe de gel de chargement et de fixer les tubes à l'envers sécher à l'air pendant 10 minutes. Dissoudre le culot dans 20-50 DEPC eau traitée ul dépending de la taille des pellets.
  3. Purifier l'ARN en utilisant l' ARN kit de nettoyage suivant le protocole 4. Mesurer la concentration d'ARN en utilisant un kit de dosage par fluorimétrie à la base selon le protocole 9.
    REMARQUE: DO à 260 nm est prélevé pour déterminer la concentration de l'ARN et le rapport de DO à 260 nm et 280 nm sont utilisés pour déterminer la pureté de l'échantillon. Il est recommandé de vérifier la qualité de l'ARN en utilisant un dosage Bio-analyseur.
  4. Prenez environ 0,5 à 1 pg d'ARN purifié pour le séquençage.
    NOTE: Centre Biotech prépare les bibliothèques de séquençage et effectue apparié-end lire le séquençage en utilisant des méthodes décrites précédemment 2.

2. Préparation de ChIP-Seq Sample

  1. Culture cellulaire et traitement
    1. Seed 500.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance.
      NOTE: Pour chaque pull down 16 plaques ont été utilisées. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 -8 M E2 à chaqueassiette. Traiter les cellules pendant 45 min (37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère).
  2. Crosslink et Cell récolte
    1. Ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% dans 5 ml de milieu pour réticuler la chromatine, incuber à température ambiante pendant 15 min. Arrêtez de réticulation par lavage des cellules avec 5 ml de glace froide 1x MEM.
    2. Récolter les cellules dans 250 ul de tampon de lyse cellulaire (10 mM d'EDTA, 50 mM de Tri HCl, 1% de SDS, 0,5% de N, N-oxyde dimethyldodecan-1-amine) par plaque.
  3. Fragmentation de chromatine
    1. Soniquer les cellules pendant 30 secondes x 8 à ampli de 30 à atteindre des tailles de chromatine nécessaires. Refroidir chaque échantillon sur la glace après une sonication de 30 sec.
    2. Centrifuger à 16 000 g pendant 10 min à 4 ° C et avec précaution, pipeter le surnageant sans perturber le culot au fond.
    3. Prenez une aliquote de 5 ul du surnageant, et vérifier la taille de l' ADN par électrophorèse sur gel d' agarose à 1,5% comme décrit précédemment 10. La taille idéalede l'ADN doit être compris entre 200-500 pb.
  4. Immunoprécipitation de la chromatine
    1. Économisez 25 pi de lysat cellulaire en entrée. Dans un tube de 50 ml, mélanger 4 ml de lysat cellulaire avec 20 ml de tampon IP (2 mM d'EDTA, 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl et 0,5% de Triton X), un anticorps ERa (500 ul F10 et 500 ul HC- 20), et 500 ul ProtA et protg protéine revêtement des billes magnétiques. Incuber le mélange par rotation à 4 ° C pendant une nuit pour permettre la formation d'un complexe anticorps chromatin-.
  5. Washes et Inverse-réticulation
    1. Utilisez un support magnétique pour recueillir les billes magnétiques sur le côté aimanté pour enlever le tampon de lavage.
    2. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon de lavage I (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 150 mM). Pour se laver soigneusement les billes magnétiques sans perturber complexes ADN-protéines, ajouter 25 ml de tampon de lavage lentement vers le tube le long du côté puis inverser les tubes jusqu'à ce que toutes les billes magnétiques sont bien mélangés with le tampon de lavage sans apparaître comme une pastille. Comme alternative, utiliser le rotateur pour inverser le tube. Ne pas vortexer les échantillons. Laver les billes magnétiques en utilisant le même procédé dans les étapes suivantes.
    3. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage de tampon II (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 500 mM).
    4. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage-tampon III (mM EDTA 1,6, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate et 250 mM LiCl).
    5. Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon 1 x TE (EDTA 1 mM, et Tris-HCl 10 mM) à deux reprises.
    6. Éluer l' ADN dans 500 ul de tampon d'élution (SDS à 1%, et 10 mM NaHCO 3) puis répartir l'élution d'ADN à 500 ul dans 4 tubes. Pour l'ADN à partir des entrées, éluer l'ADN dans 125 ul de tampon d'élution.
    7. Incuber les tubes à 65 ° C pendant une nuit sur un bloc de chauffage. Couvrir les tubes sur le bloc de chauffage avec une feuille d'aluminium pour garder la chaleur même sur tous les tubes. Placer un poids sur les tubes pour les empêcher de l'ouverture. </ Li>
  6. Isolement de l'ADN
    1. Refroidir les tubes à température ambiante pendant 5 min. Isoler l'ADN à partir des échantillons déroulants en utilisant le kit d'isolement ChIP ADN. Suivez les instructions du fabricant.
      1. Réchauffer le tampon d'élution à 65 ° C. Ajouter 625 ul de tampon de liaison à chaque tube. Si le précipité se forme, ajouter un autre tampon de liaison 250 pi jusqu'à ce que la solution soit limpide.
      2. Charger l'échantillon sur la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant 30 secondes. Laver l'échantillon avec 250 pi de tampon de lavage. Pensez à ajouter de l'éthanol dans le tampon de lavage lors de la première fois à l'utiliser. Répétez le lavage.
      3. Éluer l'ADN dans 15 ul de tampon d'élution. Combinez l'ADN de même tirer vers le bas à partir de 4 tubes pour atteindre environ 55 ul d'ADN.
    2. Isoler l'ADN d'entrée en utilisant un kit de purification d'ADN.
      1. Réchauffer le tampon d'élution à 65 ° C. Ajouter un tampon de liaison 625 pl dans chaque tube et on incube pendant 10 min. Chargez l'échantillon sur la colonne dans un 2 ml collectisur le tube.
      2. Laver l'échantillon avec 750 pi de tampon de lavage, centrifuger à 16 000 xg pendant 1 min. Répétez centrifuger pour éliminer tout tampon restant. Éluer l'ADN dans 30 ul d'EB.
    3. Mesurer la concentration d'ADN en utilisant un Commercial Fluor Assay avec Modification 11.
      1. On dilue le tampon TE 20x dans 1 x TE comme le tampon d'essai pour la dilution des échantillons et des réactifs ADN. Prenez 5 ul d'ADN isolé et diluer dans 50 pi de TE 1x.
      2. De solution mère / ml d'ADN de 2 pg faire une norme d'ADN allant de blanc à 1, 10, 100, 1000 pg / ml. Dans une plaque de 96 puits, d'allouer 25 pi de chaque norme ainsi que l'ADN de dilution en double exemplaire. (Triplicate pour la norme est recommandée.)
      3. Préparer le réactif de travail en faisant une dilution de 200 fois de réactif dsDNA dans un tampon 1x TE dans un tube en plastique. Couvrir la solution de travail du réactif avec du papier d'aluminium pour éviter la lumière. Ajouter 200 pi de réactif de travail dans chaque échantillon. Danscubate à la température ambiante pendant 5 min. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium pour éviter la lumière.
      4. Mesurer la fluorescence des échantillons en utilisant un lecteur de plaque de fluorescence (excitation à 480 nm, émission 520 nm). Générer la courbe standard ADN de florescence fonction de la concentration de l'ADN. Déterminer les concentrations des échantillons en fonction de la courbe étalon de l'ADN généré.
  7. Vérification de ChIP Experiment Utilisation de qPCR
    1. Prendre 2 pl isolés ADN et dilués dans 20 ul dans l'eau. Mettre en place la réaction qPCR en triple en mélangeant 2,5 ul de dilution de l'ADN, 5 pi Green I PCR master mix, 1 ul d'amorce, et 1,5 eau exempte de nucléase ul.
    2. Exécutez le qPCR avec le système PCR en temps réel rapide en utilisant le programme suivant: Etape 1: 95 ° C pendant 60 secondes, Etape 2: 95 ° C pendant 10 secondes, 60 ° C pendant 60 secondes, répétez l'étape 2 39 fois.
  8. Envoyer 10 ng échantillon d'ADN au centre Biotech pour le séquençage.
    NOTE: Le bioteccentre h prépare l'ADN ChIP dans les bibliothèques selon l'instruction, et effectue le séquençage simple lecture en utilisant des méthodes décrites précédemment 2.

3. Metabolomics Assay Préparation d'échantillons

  1. Culture cellulaire et traitement
    1. Seed 400.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance. Pour chaque traitement préparer trois échantillons. Utilisez deux plaques dans chaque échantillon pour recevoir suffisamment de cellules pour la détection. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 -8 M E2 aux cellules. Traiter les cellules pendant 24 heures (37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère).
  2. Collecte d'échantillons
    1. Ajouter 5 ml glacé 1x PBS à la plaque, aspirez le PBS après basculement brièvement la plaque à plusieurs reprises. Répéter deux fois, et enlever le plus PBS que possible après le dernier lavage.
    2. Ajouter 750 ul d'acétone pré-froid à chaque plaque et gratter les cellules. Combiner les cellules dans de l'acétone à partir de deux plaques endans un tube de 2 ml sur de la glace.
    3. Nombre de cellules pour la normalisation
      1. Pour chaque traitement, en utilisant deux plaques supplémentaires pour la quantification des cellules. Pour dé-fixer les cellules de la plaque, ajouter 2 ml de HE tampon (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% NaHCO 3, et 1 mM EDTA) dans chaque plaque et incuber pendant 5 min.
      2. Recueillir et bien mélanger les cellules par pipetage des cellules dans le tampon HE. Utilisez total de 20 solution de cellules pi pour compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
  3. Conserver les échantillons à -80 ° C avant de l'envoyer au centre métabolomique pour identifier et quantifier les métabolites par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) analyse.

4. Analyse intégrative

  1. ARN-Seq Analyse de données:
    1. Effectuer une vérification de la qualité des fichiers FASTQ utilisant FastQC: Lire QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Sélectionnez FastQC: Lire sous l'outil de NGS: QC et la manipulation. Téléchargez le fichier de données brutes du histor couranty.
        NOTE: Il est recommandé de donner un titre pour le fichier de sortie pour vous rappeler ce que le travail était pour car il pourrait y avoir plusieurs sorties.
    2. Exécuter et le fichier de sortie apparaîtra sous l'Histoire. Répétez la même procédure pour chaque fichier de séquence. adaptateurs compensateurs à l'aide de clip sous NGS: FASTX Toolkit.
    3. Aligner la lecture à l' aide de hg19 Tophat2 avec génome de référence RefSeq annotation 12 (valeurs par défaut).
      1. Sélectionnez Tophat2 sous outil de NGS: analyse de l'ARN. Indiquez la bibliothèque de type jumelé (single-end vs apparié-end).
      2. Téléchargez le fichier d'entrée FASTQ de l'histoire actuelle. Sélectionnez le génome de référence. Choisissez paramètres par défaut. Ou utiliser la liste complète des paramètres à modifier.
      3. Exécuter et il produira deux fichiers de sortie: l'une est UCSC BED trace de jonctions; un autre est une liste des alignements de lecture au format BAM.
    4. Télécharger des fichiers BAM séquençage outil d'analyse de données. Calculer les valeurs d'expression en utilisant Quantification Tool.
    5. Identifier les gènes différentiellement régulés à la hausse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement> 2 et p <0,05. De même, d'identifier les gènes différentiellement régulés à la baisse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement <0,5 et p <0,05.
  2. ChIP-Seq Analyse des données:
    1. Alignez FASTQ Lit à hg19 utilisant Bowtie2 13 (valeurs par défaut) dans le Galaxy.
      1. Sélectionnez Bowtie2 sous l'outil de NSC: Mapping. Vérifiez si la bibliothèque est partenaire appariées (single-end vs apparié-end). Téléchargez le fichier FASTQ de l'histoire actuelle.
      2. Sélectionnez le génome de référence. Utilisez les paramètres par défaut. Exécuter et il va produire le fichier de sortie avec la séquence cartographiée lit comme fichier BAM. Répétez la procédure pour chaque fichier de séquence.
    2. Identifier les pics en utilisant MACS 14 Une coupure de 6.0E-7 p-valeur et de FDR de 0,01, comme décrit précédemment 2.
    3. Metabolomics Analyse des données:
      1. Convertir les noms chimiques des métabolites à KEGG_IDs.
      2. Identifier les métabolites différentiellement régulés en comparant les niveaux détectés dans le véhicule vs. E2 traités échantillons (2 fois coupure a été utilisé dans cette étude).
    4. Analyse intégrative:
      1. Identifier les gènes qui ont des sites de liaison ERa en utilisant l'outil d'analyse de données de séquençage. Traduire les régions à la fonction des gènes en utilisant 20 kb que la distance de coupure.
      2. Identifier les gènes différentiellement haut et bas-régulé de l' analyse de données ARN-Seq utilisant un facteur de changement> 2 et plier le changement <0,5, respectivement avec la valeur de p <0,05 coupée. Comparer à la liste des sites de liaison contenant des gènes ERa utilisant la comparaison de diagramme de Venn.
      3. Utilisez cette liste pour identifier E2 voies métaboliques modulées utilisant Metscape 15 module Cytoscape.
        1. En sélectionnant le module Metscape à partir d'applications, choisissez Générer réseau et puis voie-basl'option ed.
        2. Sélectionnez le Organism (Human). Sélectionnez le fichier de données E2 liste composé non réglementée (KEGG ID) ainsi E2 régulée à la hausse la liste des gènes.
        3. Choisissez Composé -réaction -Enzyme-Gene comme type de réseau. Choisissez composés / gènes comme la requête.
        4. Construire réseau. Répéter en utilisant l'E2 régulé à la baisse composé et les gènes.

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Representative Results

transcriptomique
Pour analyser les gènes exprimés de manière différentielle par traitement E2, nous avons choisi de réaliser une expérience d'ARN-Seq. En plus de fournir des informations sur les niveaux d'ARNm, les données d'ARN-Seq peuvent également être utilisés pour suivre l'évolution de (longs ARN non codants, microARN) non codantes de l'ARN et des événements d'épissage alternatif. Nous ne fournissons des informations sur l'analyse des gènes non codantes des ARN transcrits ou encore, étant donné que la portée de notre étude est d'identifier les gènes codant des protéines qui sont importantes pour la régulation métabolique. Cependant, l'ARN-Seq est un excellent moyen d'obtenir des informations sur les événements d'expression génique différentielle.

Afin d'obtenir de haute qualité lit, il est important d'obtenir l'ARN de haute pureté. Après avoir isolé l'ARN nous avons purifié l'ARN en utilisant un kit de nettoyage d'ARN. Malheureusement, environ 50% de l'ARN est perdue au cours de ce processus, et la quantité d'ARN de départ doit être pris en cXAMEN pour obtenir quantité requise (100-500 ng) à la fin de l'étape de purification.

Nous avons quantifié les rendements d'ARN en utilisant fluoromètre ARN HS test, ce qui est très précise et est la méthode préférée pour la quantification de l'ARN de faible abondance. Ensuite, l'intégrité et la qualité globale des échantillons d'ARN ont été examinés à l'aide bioanlayzer, qui est une alternative viable à une électrophorèse sur gel en utilisant une quantité minimale d'ARN. L'analyse montre tous les échantillons ont des bandes nettes et propres de 18S et 28S ARNr indiquant l'intégrité et la pureté des échantillons (figure 2B). ARN Nombre Integrity (RIN) a été utilisé comme standard pour le contrôle de la qualité de l'ARN. RIN 10 indique l' ARN intact, RIN 6 partiellement dégradé et RIN3 fortement dégradées 16.

Il est recommandé que le RIN soit d'au moins 7 pour l'expérience de séquençage. Tous nos échantillons d'ARN ont reçu la valeur RIN entre 09/06 à 09/09 <strong> (figure 2A). Bibliothèques de séquençage ont été construits à partir de 500 ng d'ARN de haute qualité à partir de chaque échantillon en utilisant le système de séquençage à ultra-haut débit tels que Illumina 2500. En moyenne séquençage 18.000.000 de haute qualité lectures ont été obtenues pour chaque échantillon (tableau 1), qui était prêt pour aval une analyse. Pour vérifier la qualité globale de la séquence à haut débit des données brutes, FastQC a été exécuté pour les lectures de chaque échantillon. Un rapport de FastQC représentant pour les données d' un véhicule ARN-Seq a été montré (Figure 3). La longueur de la séquence la plus lit était d' environ 100 pb (figure 3A). Pour chaque lecture, le score de qualité était 32-34 pour le premier 5 pb et 36-38 de 6-100bp (figure 3B). Parmi 17990863 lectures générées à partir de cet échantillon, la plupart d'entre eux avaient la qualité score supérieur à 34 (figure 3C). La teneur en GC par lecture dans la séquence a également suivi la distribution normale avec une moyenne de 48% GC. Globalement, la qualitéscore du lit était très élevé.

analyse Cistromic de sites de liaison ERa
Pour réaliser le séquençage profond efficace, obtenir des fragments d'ADN à la taille souhaitable est l'un des facteurs importants. Approches de séquençage actuels peuvent avoir des exigences différentes sur les fragments d'ADN, par exemple 300-600 pb pour le système de séquençage à ultra-haute-débit, 100-200 pb pour AB / SOLiD 17. Dans cette expérience , la plupart des fragments d'ADN sont comprises entre 300 pb et 600 pb , comme illustré sur gel (figure 4). Comme alternative, les lecteurs peuvent choisir de préparer leur chromatine en utilisant MNase digestion, mais nous pensons que notre protocole établi fournit les échantillons requis avec de haute qualité et fournit des résultats reproductibles. Dix ng d'ADN provenant de chaque traitement et de son échantillon d'entrée correspondant a été préparé dans du tampon EB. L'ADN ChIP était simple lecture séquence en utilisant le système de séquençage ultra-haut débit. échantillons ADN ChIP ont donné environ20000000 lit alors que l'ADN d'entrée a abouti à plus de 35.000,000 lit (tableau 1).

métabolomique
Pour quantifier les métabolites dans les cellules de mammifères en utilisant SMGC, au moins 10 pg de masse cellulaire sont nécessaires. Nous avons commencé avec 400.000 cellules MCF7 avec les expériences. Au moment de la récolte, il y avait environ 500 000 cellules dans chaque plaque. La vue d' ensemble des métabolites représentés par des pics ont été comparés entre le témoin et l'échantillon Estradiol traité (Figure 5). Environ 100 métabolites ont été identifiés, qui comptent pour 60% du total connu chez les mammifères. Nous présentons ici une liste des 10 meilleurs métabolites, qui présentent des changements significatifs dans le traitement E2 (tableau 2). Dans l'ensemble, y compris les voies E2 régulée positivement le métabolisme du fructose et du mannose, du métabolisme de l'histidine, le métabolisme de la purine, la biosynthèse du cholestérol et du métabolisme de la vitamine B3. Les voies downregulated étaient butanoate METABOLIm, de novo biosynthèse des acides gras, voie des pentoses phosphates, le cycle de l' urée et du métabolisme de l' arginine (tableau 3).

L'analyse des données et de l'intégration
Les données provenant de l' ARN-Seq, ChIP-Seq et GC-MS ont été traitées et analysées à travers une série d'étapes (figure 6). Après la comparaison entre les gènes identifiés dans l' ARN-Seq et ChIP-Seq, un ensemble de haut-réglementé et un ensemble de gènes régulés à la baisse par Estradiol ont été extraites. A partir des données métaboliques, nous avons obtenu deux ensembles de composés en amont et réglementés vers le bas par le traitement Estradiol. Ensuite , nous utilisons Metscape, une application pour Cytoscape, de visualiser et d' interpréter l'expression des gènes et des données métaboliques dans le contexte du métabolisme humain 15. Tout d'abord, nous avons choisi d'inclure des éléments du composé, la réaction, l'enzyme, et le gène dans le réseau. Nous avons choisi les composés / gènes comme requête et deux réseaux de la E2-régulation (Figure 7A) et vers le bas-Règlement (figure 7B) ont été présentés. Le Metscape fournit également une option de construire des réseaux sur les voies sélectives. Par exemple, en utilisant le même ensemble de données que la construction de l'ensemble du réseau régulé à la baisse, d'un sous-réseau de la biosynthèse et le métabolisme de la voie androgéno-oestrogène a été généré par la commutation de la requête à partir du composé / gène de voie spécifique. Les gènes ou des composés avec des changements importants ont été mis en évidence dans la couleur brillante. Outre la sélection d'une voie spécifique à partir de la fenêtre déroulante comme décrit, on peut aussi créer un sous-réseau en appliquant la fonction «créer sous-réseau" à la zone choisie. Comme on le voit sur ​​la figure 6A et B, ERa activation et la liaison directe à des régions régulatrices de gènes impacté de nombreuses voies métaboliques dans les cellules cancéreuses du sein. Notre analyse d' intégration a indiqué que, ERa se lie directement à et régule l' expression du gène FASN, ce qui est important pour gras de novo voie de biosynthèse de l' acide (Figure 7C). En outre le traitement E2 downregulated voies de biosynthèse des androgènes-œstrogènes en refoulant expression de CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 et GSTM2 dans ces voies.

Figure 1
Figure 1: Flux de la préparation d'échantillons d'ARN, d' ADN et les lysats cellulaires pour l'ARN-Seq, ChIP-Seq, et l' analyse métabolomique.

Figure 2
Figure 2:. Un électrophérogramme représentant des ARNs analysés avec Agilent 2100 Bioanalyseur ARN Nombre Integrity (RIN), indicateur de la qualité de l' ARN, a été donné par l'analyse comme 9.9. (A) Sur une image de gel virtuel de l'ARN échantillon les deux bandes de 26S et 18S sont tranchantes. (B) Les signaux fluorescents de trace individuelle en til ARN montre que l'intensité de la 28S crête est supérieure à 18S pic et aucune contamination est vu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Un contrôle de qualité représentant les données brutes d'ARN-Seq L' une des données de séquence de l'échantillon de véhicule a été analysé à l' aide FastQC. (A) La distribution de longueur de séquence de la bibliothèque qui est de 100 pb. (B) Le score de qualité le long de la position de lecture. (C) Le score de qualité par séquence a montré la qualité universelle de toutes les séquences. (D) La teneur en GC par lecture correspondait à la distribution théorique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir a laversion rger de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Une électrophorèse sur gel des fragments de chromatine soniquées 5 pi de lysat de cellules provenant de chaque échantillon a été placé sur un gel d'agarose à 1,5% avec 1000 pb , plus l' échelle sur la première voie.. La majorité des fragments sont entre 300 et 600 pb. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. La vue d' ensemble des pics représentant les métabolites de la GC-MS Le panneau supérieur montre les pics identifiés dans les échantillons E2 traités tandis que le panneau inférieur de la commande. L'espace clos a été pièces pour montrer le métabolite exact représenté par chaque p eak. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Organigramme de la méthode de clustering intégrative.

Figure 7
Figure 7: La visualisation des données génétiques-métabolite intégrées dans Metscape (A) Le réseau de voies régulé à la hausse par E2.. (B) Le réseau de voies régulé à la baisse par E2. (C) E2 stimulé le recrutement ERa dans la région voisine de FASN, qui se trouve être réglementée dans le réseau de la biosynthèse des acides gras de novo générée en appliquant la fonction de sous - réseau.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Résumé de séquençage à ultra-haute-débit d'ARN-Seq et ChIP-Seq.

Tableau 2
Tableau 2: Liste des 10 métabolites avec des changements importants avec le traitement E2.

Tableau 3
Tableau 3: Pathways up et down-régulé par un traitement E2.

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Discussion

Dans cet article, nous avons décrit la génération et l'analyse intégrative de l'ARN-Seq, ChIP-Seq et les données de métabolomique de cellules MCF-7 qui sont traités avec E2. Nous avons développé un ensemble de protocoles d'élaboration de stratégies à utiliser les méthodes les plus efficaces et les utilisateurs marchandises douce amicales qui produisent la découverte biologiquement pertinente. À notre connaissance, la nôtre est la première étude à intégrer -omique les données de trois différentes analyses et de nouvelles voies métaboliques identifiées que ERa directement régulée dans les cellules cancéreuses du sein.

transcriptomique
Il est essentiel de commencer avec des ARN de haute qualité pour une analyse transcriptomique réussie. Une bonne pratique permettra d'éliminer les risques de dégradation de l'ARN, y compris la création de banc sans RNase, changer de gants souvent, le stockage dans -80 ° C et de garder sur la glace en cours d'utilisation. Ajout d'une nuit d'incubation à -20 ° C améliore la récupération de l'ARN. Pour éviter la congélation et la décongélation ARN à plusieurs reprises, on peut répartir les ARNs pour procedur avales lors de l'isolement et de la purification. L'existence d'erreurs de séquençage, qRT-PCR en utilisant l'ADNc à partir des échantillons est souvent effectuée pour vérifier les gènes exprimés de manière différentielle identifiées dans l'ARN-Seq. Par conséquent, assez d'ARN doit être réservé à cet effet. Nous effectuons appariées fin séquençage qui nous permet d'analyser des variants d'épissage, des ARN non codantes et miARN. Pour éviter les frais de haute séquençage, séquençage unique fin peut être effectué aussi bien. Par rapport aux puces à ADN, l'ARN-Seq est plus sensible et ne se limite pas aux sondes prévues sur la puce. Nous obtenons des renseignements non seulement sur des séquences codantes, mais aussi sur les gènes non codantes et les transcriptions différentiellement épissés. Nous utilisons actuellement cette technique pour analyser transcriptome de diverses lignées cellulaires après des traitements ligand ainsi que les tissus obtenus à partir d'expériences de souris.

Cistromics
La méthode de séquençage ultra-haut débit nécessite un minimum d'ADN de ChIP 5 ng pour la construction d'une banque. Dans la norme ChIP-Seq protocole 18, il est recommandé d'avoir au moins 10 ng. Quantification avec fluorométrie est critique. Dans ce protocole, nous avons utilisé deux test de détection de brin d'ADN pour déterminer la concentration d'ADN. On peut également utiliser dosage fluoromètre pour la quantification précise de l'ADN. Pour les différences dans l'équipement et des matériaux, il est très important pour chaque laboratoire d'établir leur propre protocole de sonication, qui génère souhaitables fragments d'ADN de tailles. Over-cisaillement de l'ADN ChIP pourrait causer la perte de l'enrichissement d'ADN cibles en ChIP ADN de grandes tailles créer problème pour le séquençage efficace. Avant de soumettre l'ADN à un séquençage, il est toujours important de vérifier l'enrichissement de certaines régions connues par qPCR. La technique est encore limitée par l'efficacité et la spécificité de l'anticorps utilisé pour les immunoprécipitations. Pour obtenir des informations sur le site de liaison qui pourrait être utilisé de manière fiable dans des analyses comparatives, nous validons nos réactifs suivants normes ChIP-Seq ENCODE, 19 et l' utilisation standarprotocoles tionnés qui nous fournissent des séries de données cohérentes. Couplé avec le site de liaison analyse de l'enrichissement du facteur de transcription après, ChIP-Seq est toujours l'une des meilleures méthodes pour déterminer la liaison directe de facteurs de transcription à la chromatine. Nous utilisons actuellement ce protocole pour étudier les kinases de recrutement, corégulateurs et d'autres facteurs de transcription à la chromatine dans d'autres lignées cellulaires ainsi que les tissus de souris sensibles aux œstrogènes.

métabolomique
Pour un profil métabolique avec succès dans des cellules de cancer du sein humain, une préparation minutieuse de l'échantillon est critique. La quantité de cellules en cours d'utilisation et les conditions de culture cellulaire dans ce protocole est optimale pour les cellules MCF7. D'autres lignées cellulaires peuvent nécessiter plus ou moins de cellules pour la détection d'un nombre significatif de métabolites. On obtient environ 100 métabolites dans chaque expérience. Cette méthode est limitée pour la détection de métabolites de courte durée de vie ou des métabolites qui sont présents à de faibles concentrations. Cette méthode offre la facilité d'using une seule préparation d'échantillons pour identifier plusieurs métabolites. Nous utilisons actuellement cette technique pour identifier les œstrogènes métabolites réglementés dans le sérum et divers tissus de souris.

Intégration de données
De nombreuses transcriptomique et des études de cistromics ont été réalisées pour étudier la signalisation œstrogène et la régulation des gènes dans les cellules de cancer du sein, y compris les cellules MCF7 2,5-7,20. Dans cette étude, pour la première fois, nous avons ajouté des données métabolomiques et essayé de déduire des réseaux métaboliques qui sont directement réglementés par ERa lors de l'addition de ligand. Cette nouvelle approche nous a permis d'épingler circuitries moléculaire point réglementés par les œstrogènes qui influent sur le métabolisme cellulaire. Dans l'ensemble, nos résultats confirment le rôle du ERa en tant que régulateur maître de la biologie du cancer du sein.

En résumé, nous avons fourni un recueil détaillé des protocoles pour la production d'ARN-Seq, des échantillons de ChIP-Seq et métabolomique à partir de cellules de cancer du sein après oestrogène traitements et intégranalyse ative des données obtenues à partir de ces -omique approches. Ces protocoles permettront aux chercheurs de faire une analyse similaire pour d'autres facteurs de transcription, des ligands de récepteurs nucléaires et les conditions nutritives.

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Disclosures

Université de l'Illinois a reçu une subvention de chercheur initié de Pfizer Inc. ZME et YCZ reçu un soutien salarial de cette subvention.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national de l'alimentation et de l'agriculture, US Department of Agriculture, récompense ILLU-698-909 (ZME) et Pfizer, Inc (ZME). Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles du Département américain de l'Agriculture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

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References

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Médecine numéro 109 ARN-Seq transcriptome ChIP-Seq cistrome métabolomique l'œstrogène le cancer du sein
Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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