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Medicine

Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Mit dem Aufkommen der -omics nähert sich unser Verständnis der chronischen Krankheiten wie Krebs und metabolische Syndrom hat sich verbessert. Allerdings effektive Abbau von den Informationen in den großen Datenmengen, die von Genexpression Microarrays, deep sequencing Experimente oder metabolischen Profils erhalten werden ist wichtig, zu entdecken und dann effektiv die kritischen Regulatoren der erkrankten Zelle Phänotypen Ziel. Estrogen Receptor α (ERa) ist einer der Master-Transkriptionsfaktoren, die Gen-Programme regulieren, die für Östrogen-responsiven Brustkrebs wichtig sind. Um Rolle von ERa Signalisierung bei Brustkrebs Stoffwechsel zu verstehen, verwendeten wir transkriptomischen, cistromic und Metabolom-Daten aus MCF-7 mit Östradiol behandelten Zellen. In diesem Bericht beschrieben wir Generation von Proben für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und die integrative Computeranalyse der erhaltenen Daten. Dieser Ansatz ist nützlich bei der Abgrenzung Roman Maulwurfdere Mechanismen und genregulatorischen Schaltungen, die durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor, der Auswirkungen auf den Stoffwechsel von normalen oder erkrankten Zellen reguliert werden.

Introduction

Östrogene sind wichtige Regulatoren von vielen physiologischen Prozessen in beiden Frauen und Männern einschließlich der reproduktiven Gewebe, metabolischen Gewebe, Gehirn und Knochen 1. Neben positiven Auswirkungen in diesen Geweben, treiben Östrogene auch Krebserkrankungen, die aus Brust und reproduktive Gewebe entstehen. Östrogene vor allem durch ERs arbeiten zelltypspezifische Effekte zu induzieren. Tief Sequenzierung von Transkripten von ERa geregelt unter Verwendung von RNA-Seq und genomweite ERa DNA-Bindungsstellen-Analyse ChIP-Seq Verwendung erwies sich als nützlich, um zu verstehen, wie ERa in verschiedenen Geweben und Krebsarten arbeitet, die aus ihnen entstehen. Wir und andere haben Profile veröffentlicht Genexpression assoziiert mit verschiedenen Rezeptoren (ER & agr; vs ER & bgr;) 2,3, verschiedene Liganden 3-5 und verschiedene Koregulatoren 2,4,6,7.

RNA-Seq ist die wichtigste Methode, um die Transkriptom zu untersuchen, bietet eine höhere Präzision und Effizienz im Vergleich zu Microarray-based Genexpressionsanalyse 8. RNA , die aus Zelllinien 2-4,7, Geweben oder Tumorproben werden sequenziert, abgebildet erhältlich genomischen Baugruppen und unterschiedlich regulierte Gene identifiziert werden. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) verwendet, um den Transkriptionsfaktor und coregulator Chromatin Bindung an bekannten regulatorischen Bindungsstellen zu sezieren. ChIP-Seq (ChIP durch hohe Durchsatzsequenzierung gefolgt) bietet unvoreingenommene Erfassung des globalen Bindungsstellen. Metabolomics ist ein weiterer zunehmend verbreitetes System biologischen Ansatz, der quantitativ Maßnahmen, dynamische multiparametrischer Reaktion lebender Systeme auf verschiedene Reize einschließlich Chemikalien und genetischen Störungen.

Durch globale metabolischen Profils durchgeführt wird, kann eine funktionelle Auslesen aus Zellen, Geweben und Blut erhalten werden. Darüber hinaus werden Informationen von Transkriptom Experimente spiegeln nicht immer tatsächlichen Veränderungen in der Höhe von Enzymen, die auf biochemischen Wege beitragen. KombinierteAnalyse von Daten Transkriptom und Metabolom ermöglicht es uns, mit den tatsächlichen Metaboliten Veränderungen Veränderungen in der Genexpression zu identifizieren und zu korrelieren. Die Nutzung der Informationen aus all diesen großen Maßstab Datensätze die mechanistischen Details liefern die Rolle von Transkriptionsfaktoren regulieren komplexer biologischer Systeme, vor allem diejenigen, die beziehen sich auf die menschliche Entwicklung und Krankheiten wie Krebs und Diabetes zu verstehen.

Die komplexe Natur des Säugetiergenoms macht es schwierig, zu integrieren und zu interpretieren, in vollem Umfang die von den Transkriptom erhaltenen Daten, cistrome und Metabolom Experimente. Identifizieren funktionelle Bindungsereignisse, die, weil, sobald Bindungsstellen funktionell sind identifiziert Veränderungen in der Expression von Zielgenen ist wichtig, führen würde; anschließenden Analyse, einschließlich Transkriptionsbindungs ​​(TF) Motivanalyse, konnte mit einer höheren Genauigkeit durchgeführt werden. Dies führt zur Identifizierung von biologisch sinnvoll TF Kaskaden und Mechanismen. Auch direkte comparisauf der RNA-Seq und ChIP-Seq Versuche sind nicht immer möglich, da die Daten von jedem Experiment unterschiedlichen Skalen und Geräusche haben, und in einigen Fällen sinnvolle Signale werden von Bevölkerungs Rauschen verdeckt. Wir sind keine Kenntnis von einer Studie, die Informationen aus diesen drei unabhängigen, aber miteinander verbundene Ansätze integriert, um die direkte Stoffwechselregulation durch ERa bei Brustkrebs zu verstehen. Deshalb ist unser übergeordnetes Ziel in dieser Arbeit ist produktive Bindungsereignisse zu Genexpression und Metaboliten Veränderungen zu beziehen. Um dieses Ziel zu erreichen, integriert wir Daten von RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und identifiziert jene Östrogen ERa Bindungsereignisse induziert, die zu Veränderungen der Genexpression in Stoffwechselwege führen würde. Zum ersten Mal bieten wir einen kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1) zur Erzeugung von ChIP-Seq, RNA-Seq und Metabolomik Profilierung und Durchführung integrative Analyse der Daten neue Gen - Schaltungen aufzudecken Stoffwechsel der Brust RegulierungKrebszelllinien.

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Protocol

1. Herstellung von RNA-Proben Seq

  1. Zellkultur und Behandlung
    1. Kultur die MCF7 - Zellen in einer verbesserten MEM (IMEM) und Phenol-rot - Medium mit 10% Hitze inaktiv FBS, 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre.
      Hinweis: Der gleiche Zelllinie und Zellkulturbedingung wird während der gesamten Studie verwendet.
    2. Seed 100.000 MCF7-Zellen pro Well in 6-Well-Platten. Haben Sie für jede Behandlung Triplikaten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 2 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platten für 24 h in 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre.
    3. Um die Zellen zu ernten, 1 ml RNA-Isolierung Reagenz (Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform) in jede Vertiefung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Dann sammeln Sie die Zelle Lysatreagens durch Pipettieren und Ablagerung in 1,5-ml-Röhrchen
  2. RNA-Isolierung
    1. In 200 ul chloroform in 1 ml Zelllysat Reagenz (1.1.3) und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation übertragen die wßrige Phase (oben) in ein neues Röhrchen, ohne die anderen Phasen zu stören.
    2. Hinzufügen, 500 & mgr; l 100% Isopropanol in ein neues Röhrchen mit der übertragenen wässrigen Phase und durch Invertieren mischen. Inkubieren bei -20 ° C über Nacht. Zentrifugiere die Proben bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Beobachten ein Pellet am Boden des Röhrchens. Überstand verwerfen und waschen Sie das Pellet mit 750 & mgr; l RNase-freiem 70% Ethanol durch kurze Wirbel.
    3. Zentrifuge Proben bei 6.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Zentrifugieren der Probe bei 16.000 × g für 1 min bei 4 ° C die gesamte verbleibende Ethanol zu sammeln. Entfernen Sie die verbleibende Ethanol mit einer Pipette mit einem Gel-Ladespitze und legen Sie die Rohre nach oben Seite nach unten an der Luft trocknen für 10 min. Man löst das Pellet in 20-50 ul DEPC behandeltem Wasser DEPENding von der Größe der Pellets.
  3. Reinige die RNA unter Verwendung von RNA clean-up - Kit nach dem Protokoll 4. Messen Sie die RNA - Konzentration einen Fluorometrie basierten Assay - Kit nach dem Protokoll 9.
    HINWEIS: OD bei 260 nm wird getroffen, um die RNA-Konzentration und das Verhältnis von OD bei 260 nm und 280 nm werden verwendet, um zu bestimmen, um die Reinheit der Probe zu bestimmen. Es wird empfohlen, die RNA-Qualitätsprüfung Bio-Analysator Assay.
  4. Nehmen Sie etwa 0,5 bis 1 ug gereinigte RNA für die Sequenzierung.
    HINWEIS: Biotech - Center bereitet die Sequenzierungsbibliotheken und führt Paired-End - Sequenzierung lesen Methoden bisher 2 detailliert mit.

2. Herstellung von ChIP-Seq Probe

  1. Zellkultur und Behandlung
    1. Seed 500.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium.
      HINWEIS: Bei allen Pull-Down-16 Platten verwendet wurden. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeTeller. Behandlung der Zellen für 45 min (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre).
  2. Cross und Zellernte
    1. In 250 ul 37% Formaldehyd in 5 ml Medium Chromatin zu vernetzen, Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Vernetzung von Zellen mit 5 ml eiskaltem 1x MEM Waschen.
    2. Ernte der Zellen in 250 ul Zelllyse-Puffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-Aminoxid) pro Platte.
  3. Fragmentation von Chromatin
    1. Beschallen die Zellen für 30 sec x 8 bei amp von 30 bis erforderlichen Chromatin Größen erreichen. Kühlen Sie jede Probe auf Eis nach einer Beschallung von 30 sec.
    2. Zentrifuge bei 16 000 xg für 10 min bei 4 ° C, und den Überstand vorsichtig pipettieren, ohne an der Unterseite des Pellets zu stören.
    3. Nehmen Sie ein 5 - ul - Aliquot des Überstandes, und überprüfen Sie die DNA - Größe durch Elektrophorese durch 1,5% Agarose - Gel , wie zuvor 10 beschrieben. Die ideale Größevon DNA sollte zwischen 200-500 bp sein.
  4. Chromatin Immunopräzipitation
    1. Sparen Sie 25 ul Zelllysat als Eingabe. In einem 50-ml-Röhrchen, mischen 4 ml Zelllysat mit 20 ml IP-Puffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl und 0,5% Triton X), ERa-Antikörper (500 & mgr; l F10 und 500 & mgr; l HC- 20), und 500 & mgr; l ProtA und protg Proteinbeschichtung magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Mischung durch Rotation bei 4 ° C über Nacht, die Bildung von Chromatin- Antikörper-Komplexes zu ermöglichen.
  5. Wäscht und Reverse-Vernetzung
    1. Verwenden Sie einen magnetischen stehen die magnetischen Kügelchen auf der magnetisierten Seite zu sammeln, um die Waschpuffer zu entfernen.
    2. Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 150 mM NaCl). Um gründlich die magnetischen Kügelchen waschen, ohne DNA-Protein-Komplexe zu stören, werden 25 ml Waschpuffer langsam auf das Rohr an der Seite dann die Rohre umkehren, bis alle magnetischen Kügelchen gemischt gut wi sindth die Waschpuffer ohne als Pellet erscheinen. Als Alternative verwenden Sie den Rotator das Rohr zu invertieren. Sie nicht die Proben verwirbeln. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen die gleiche Methode in den folgenden Schritten.
    3. Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 500 mM NaCl).
    4. Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate und 250 mM LiCl).
    5. Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml 1x TE-Puffer (1 mM EDTA und 10 mM Tris HCl) zweimal.
    6. Eluieren der DNA in 500 & mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 10 mM NaHCO 3) und dann zuzuteilen , die 500 & mgr; l DNA - Elution in 4 Röhrchen. Für die DNA von den Eingängen, DNA in 125 & mgr; l Elutionspuffer eluiert.
    7. Die Röhrchen bei 65 ° C über Nacht auf einem Heizblock. Decken Sie die Rohre auf dem Heizblock mit Aluminiumfolie die Wärme auch über alle Rohre zu halten. Legen Sie ein Gewicht auf den Rohren, damit sie nicht zu öffnen. </ Li>
  6. DNA-Isolierung
    1. Kühlen Sie die Röhrchen bei RT für 5 min. Isolieren von DNA aus den Pull-Down-Proben unter Verwendung von ChIP DNA-Extraktions-Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      1. Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. Hinzufügen, 625 & mgr; l zu jedem Röhrchen Bindungspuffer. Wenn der Niederschlag bildet, fügen Sie eine weitere 250 & mgr; l Bindungspuffer, bis die Lösung klar ist.
      2. Legen Sie die Probe auf die Säule und Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 Sekunden. Waschen Sie die Probe mit 250 ul Waschpuffer. Denken Sie daran, Ethanol zu dem Waschpuffer hinzuzufügen, wenn es erstmals zu verwenden. Wiederholen Sie die Wäsche.
      3. Eluieren der DNA in 15 & mgr; l Elutionspuffer. Kombinieren Sie die DNA von derselben nach unten ziehen von 4 Röhrchen etwa 55 & mgr; l DNA zu erreichen.
    2. Isolieren Sie die Input-DNA eine DNA Purification Kit.
      1. Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. In 625 & mgr; l Bindungspuffer in jedes Röhrchen und Inkubation für 10 min. Legen Sie die Probe auf die Säule in einem 2 ml collectiauf dem Rohr.
      2. Waschen Sie die Probe mit 750 & mgr; l Waschpuffer, Zentrifuge bei 16.000 xg für 1 min. Wiederholen Zentrifugieren alle verbleibenden Puffer zu entfernen. Eluieren der DNA in 30 ul EB.
    3. Messen Sie die DNA - Konzentration unter Verwendung eines kommerziellen Fluorochrom Assay mit Modification 11.
      1. Verdünnen Sie den 20x TE-Puffer in 1x TE als Assay-Puffer zur Verdünnung der Reagenzien und DNA-Proben. Nehmen Sie 5 ul isolierte DNA und verdünnen Sie es in 50 & mgr; l in 1x TE.
      2. Von 2 ug / ml DNA-Stammlösung mit einer DNA-Standard von leer auf 1, 10, 100, 1000 & mgr; g / ml bis hin zu machen. In einer 96-Well-Platte, weisen 25 ul jeder Standard sowie DNA-Verdünnung in zweifacher Ausfertigung. (Dreifacher Ausführung für Standard empfohlen.)
      3. Bereiten Sie die Arbeits Reagenz durch eine 200-fache Verdünnung von dsDNA Reagenz in 1x TE-Puffer in Kunststoffrohr zu machen. Decken Sie die Arbeits Reagenzlösung mit Aluminiumfolie zu Licht zu vermeiden. In 200 ul Arbeits Reagenz in jeder Probe. Imcubate für 5 min bei Raumtemperatur. Die Platte mit Aluminiumfolie Licht vermeiden.
      4. Messen Sie die Fluoreszenz der Proben eines Fluoreszenzplattenleser (Anregung bei 480 nm, Emission 520 nm) verwendet wird. Generieren Sie die DNA-Standardkurve der Fluoreszenz im Vergleich zu DNA-Konzentration. Bestimmung der Konzentrationen der Proben auf der erzeugten DNA-Standardkurve berechnet.
  7. Überprüfung von ChIP Experiment Mit qPCR
    1. Nehmen Sie 2 ul isolierte DNA und in 20 & mgr; l in Wasser verdünnt. Stellen Sie die qPCR Reaktion in dreifacher Ausfertigung bis 2,5 & mgr; l DNA-Verdünnung Mischen, 5 ul Green I PCR Master-Mix, 1 ul Primer und 1,5 ul Nuclease freies Wasser.
    2. Führen Sie die qPCR mit dem Fast Real-Time-PCR-System mit dem folgenden Programm: Schritt 1: 95 ° C für 60 sec, Schritt 2: 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 60 Sekunden, wiederholen Sie Schritt 2 39 mal.
  8. Senden 10 ng DNA-Probe zu Biotech Zentrum für die Sequenzierung.
    HINWEIS: Die Biotech Zentrum bereitet die ChIP DNA in Bibliotheken nach Anweisung und führt Einzel lesen Sequenzierungsverfahren detailliert zuvor 2.

3. Metabolomics Assay Probenvorbereitung

  1. Zellkultur und Behandlung
    1. Seed 400.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium. Für jede Behandlung vorbereiten drei Proben. Verwenden zwei Platten in jeder Probe genug Zellen zum Nachweis zu erhalten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu den Zellen. Behandlung der Zellen für 24 h (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre).
  2. Beispielsammlung
    1. 5 ml eiskaltem 1x PBS an die Platte absaugen PBS nachdem die Platte mehrmals kurz zu kippen. Wiederholen Sie zweimal, und entfernen Sie so viel PBS wie möglich nach der letzten Wäsche.
    2. In 750 ul vorge kaltem Aceton zu jeder Platte und die Zellen kratzen. Kombinieren der Zellen in Aceton aus zwei Platten inin ein 2-ml-Röhrchen auf Eis.
    3. Zellzahl für die Normalisierung
      1. Für jede Behandlung, verwenden Sie zwei zusätzliche Platten für die Zell Quantifizierung. DE-befestigen Sie die Zellen von der Platte, 2 ml HE - Puffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 und 1 mM EDTA) in jeder Platte und Inkubation für 5 min.
      2. Sammeln und gut mischen die Zellen durch Zellen in der HE-Puffer pipettiert. Verwenden Sie insgesamt 20 ul Zell-Lösung die Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer zu zählen.
  3. Lagern Sie die Proben bei -80 ° C vor zum Metabolomics Zentrum schicken zu identifizieren und zu quantifizieren, die Metaboliten Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse.

4. Integrative Analyse

  1. RNA-Seq Datenanalyse:
    1. Führen Sie Qualitätsprüfung von fastq Dateien mit FastQC: Lesen QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Wählen Sie FastQC: Lesen unter dem Werkzeug von NGS: QC und Manipulation. Laden Sie die Rohdatendatei von der aktuellen history.
        HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Titel zu geben, für die Ausgabedatei Sie daran zu erinnern, was der Job für war, da es möglicherweise mehrere Ausgänge sein.
    2. Ausführen und die Ausgabedatei unter der Geschichte erscheinen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Sequenz-Datei. Trim-Adapter mit Clip unter NGS: FastX Toolkit.
    3. Richten Sie liest hg19 Tophat2 Verwendung mit RefSeq Genom Referenz Anmerkung 12 (Standardwerte).
      1. Wählen Sie Tophat2 unter Werkzeug von NGS: RNA-Analyse. Geben Sie die Bibliothek gepaart Typ (Single-End vs Paired-End).
      2. Laden Sie die Eingabe fastq Datei aus der aktuellen Geschichte. Wählen Sie das Referenzgenom. Wählen Sie Standardeinstellungen. Oder Sie verwenden die Vollparameterliste zu ändern.
      3. Führen und es wird zwei Ausgabedateien erzeugen: Die eine ist UCSC Planum von Kreuzungen; eine andere ist eine Liste von Leseausrichtungen in BAM-Format.
    4. Laden Sie BAM-Dateien Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool. Berechnen Expressionswerte mit Quantifizierung Werkzeug.
    5. Identifizieren unterschiedlich up-regulierte Gene mithilfe von Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung> 2 und p-Wert <0,05. Ebenso identifizieren differentiell nach unten reguliert Gene Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung <0,5 und p-Wert <0,05.
  2. ChIP-Seq Datenanalyse:
    1. Richten Sie fastq Liest zu hg19 mit Bowtie2 13 (Standardwerte) in der Galaxie.
      1. Wählen Sie Bowtie2 unter dem Werkzeug von NSC: Mapping. Überprüfen Sie, ob die Bibliothek Mate-paarigen (Single-End vs Paired-End). Laden Sie die fastq Datei aus der aktuellen Geschichte.
      2. Wählen Sie das Referenzgenom. Verwenden Sie die Standard-Parametereinstellungen. Ausführen und es wird die Ausgabedatei erzeugen mit zugeordneten Sequenz als BAM-Datei liest. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Folge-Datei.
    2. Identifizieren Peaks unter Verwendung von MACS 14 ein p-Wert Cutoff von 6.0e-7 und FDR von 0,01, wie zuvor 2 beschrieben.
    3. Metabolomics Datenanalyse:
      1. Konvertieren chemischen Namen von Metaboliten KEGG_IDs.
      2. Identifizieren unterschiedlich reguliert Metaboliten von Ebenen erfasst Fahrzeug Vergleich vs. E2 behandelten Proben (eine 2 - fach cut-off in dieser Studie verwendet wurde).
    4. Integrative Analyse:
      1. Identifizieren Gene, die ERa-Bindungsstellen mit Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool haben. Übersetzen Regions Gene Funktion unter Verwendung von 20 kb als Abstands cut-off.
      2. Identifizieren differentiell Up- und Down-regulierte Gene von RNA-Seq - Daten - Analyse unter Verwendung fache Änderung> 2 und mehrfache Änderung <0,5, jeweils mit dem p-Wert <0,05 als abgeschnitten. Vergleichen Sie die Liste der ERa-Bindungsstelle enthält Gene mit Venn-Diagramm Vergleich.
      3. Mit Metscape 15 Modul von Cytoscape Verwenden Sie diese Liste E2 moduliert Stoffwechselwege zu identifizieren.
        1. Metscape Modul von Anwendungen Durch die Auswahl, wählen Sie Netzwerk aufbauen und dann bas-Weged Option.
        2. Wählen Sie den Organismus (Mensch). Wählen Sie Datendatei von E2 ungeregelte Verbindung Liste (KEGG ID) und E2 hochreguliert Gen-Liste.
        3. Wählen Sie -Reaktion -Enzym-Gene als Netzwerk-Typ-Verbindung. Wählen Sie Verbindung / Gene wie die Abfrage.
        4. Bauen Netzwerk. Wiederholen Sie die E2 herunterreguliert Verbindung und Gene verwendet.

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Representative Results

Transcriptomics
Zur Analyse differentiell exprimierten Gene durch E2-Behandlung, wählten wir einen RNA-Seq-Experiment durchzuführen. Darüber hinaus Ebenen Informationen über mRNA zur Bereitstellung, RNA-Seq-Daten können auch in nicht-kodierende RNA (lange nicht-kodierenden RNAs, microRNAs) und alternative Spleißen Ereignisse zu überwachen Änderungen verwendet werden. Wir haben keine Informationen über die Analyse von nicht-kodierenden RNAs oder alternativ Gene transkribiert, da Rahmen unserer Studie ist Protein-kodierenden Gene zu identifizieren, die für Stoffwechselregulation wichtig sind. Allerdings RNA-Seq ist eine hervorragende Möglichkeit, Informationen über die differentiellen Genexpression Ereignisse zu erhalten.

Um eine hohe Qualität liest zu erhalten, ist es wichtig, hochreine RNA zu erhalten. Nach Isolierung von RNA gereinigt wir die RNA eine RNA aufzuräumen Kit. Leider fast 50% der RNA wird während dieses Verfahrens verloren, und die Menge des Startens RNA sollte in c genommen werdenonsideration auf erforderliche Menge (100-500 ng) bis zum Ende des Reinigungsschritt erhalten.

Wir quantifiziert die RNA-Ausbeuten Fluorometer RNA HS-Test unter Verwendung, die sehr genau und ist bevorzugte Methode zur Quantifizierung von Low-Fülle-RNA. Als nächstes wurden die Integrität und die allgemeine Qualität der RNA-Proben unter Verwendung bioanlayzer untersucht, die einer Gelelektrophorese unter Verwendung einer minimalen Menge an RNA eine gangbare Alternative. Die Analyse zeigt , alle Proben haben scharfe und saubere Bänder von 18S und 28S rRNA , welche die Integrität und Reinheit der Proben (2B). RNA Integrity Number (RIN) wurde als Standard für RNA Qualitätskontrolle eingesetzt. 10 RIN intakte RNA zeigt, RIN 6 teilweise abgebaut und RIN3 abgebaut stark 16.

Es wird empfohlen, dass das RIN mindestens 7 zur Sequenzierung Experiment. Alle unsere RNA-Proben erhalten RIN-Wert zwischen 9,6 bis 9,9 <strong> (2A). Sequencing - Bibliotheken wurden von 500 ng von qualitativ hochwertigen RNA aus jeder Probe unter Verwendung von Ultra-Hochdurchsatz - Sequenzierung System wie Illumina 2500. Im Durchschnitt 18.000.000 Hochwertige Sequenzierung konstruiert liest für jede Probe (Tabelle 1) erhalten, die für Downstream bereit war , Analyse. Um zu überprüfen, um die Gesamtqualität der Hochdurchsatz-Sequenz Rohdaten wurde FastQC für jede Probe laufen gelassen liest. Ein Vertreter FastQC Bericht für ein Fahrzeug RNA-Seq Daten wurde gezeigt (Abbildung 3). Die Sequenzlänge der am liest betrug etwa 100 bp (3A). Für jeden zu lesen, war die Qualität der Gäste 32-34 für den ersten 5 bp und 36-38 von 6-100bp (3B). Unter 17.990.863 aus dieser Probe erzeugt liest, die meisten von ihnen hatten den Qualitätsfaktor höher als 34 (3C). Der GC-Gehalt pro Lese in der Sequenz folgt auch der Normalverteilung mit einem Mittelwert von 48% GC. Insgesamt ist die QualitätScore von der liest war sehr hoch.

Cistromic Analyse von ERa-Bindungsstellen
Um die effiziente tiefe Sequenzierung erreichen, DNA-Fragmente an gewünschten Größe zu erhalten, ist einer der wichtigen Faktoren. Stromsequenzierungsansätze unterschiedliche Anforderungen an die DNA - Fragmente können beispielsweise 300-600 bp für ultra-Hochdurchsatz - Sequenzierungssystem, 100-200 bp für AB / Fest - 17. In diesem Experiment die meisten der DNA - Fragmente zwischen 300 bp und 600 bp , wie auf dem Gel gezeigt (Abbildung 4). Als Alternative könnten die Leser wählten ihre Chromatin mit MNase Verdauung vorzubereiten, jedoch fühlen wir unser etabliertes Protokoll die erforderlichen Proben mit hoher Qualität liefert und liefert reproduzierbare Ergebnisse. Zehn ng der DNA aus jeder Behandlung und ihre entsprechenden Eingangs Probe wurde in EB Puffer hergestellt. Die Chip-DNA war Single-Leseultrahochdurchsatz-Sequenzierung System sequenziert. ChIP DNA-Proben ergaben über20000000 liest , während die Eingangs DNA ergab mehr als 35.000,000 liest (Tabelle 1).

Metabolomics
Um die Stoffwechselprodukten in Säugerzellen unter Verwendung von GCMS, mindestens 10 & mgr; g Zellmasse quantifizieren erforderlich. Wir begannen mit 400.000 MCF7-Zellen mit den Experimenten. Zum Zeitpunkt der Ernte gab es etwa 500.000 Zellen in jeder Platte. Die Übersicht über die von Gipfeln vertreten Metaboliten wurden zwischen der Steuerung und dem Estradiol behandelten Probe (Abbildung 5) verglichen. Über 100 Metaboliten wurden identifiziert, die für 60% der gesamten in Säugetieren bekannt zählen. Hier präsentieren wir eine Liste der Top - 10 - Metaboliten, die in E2 Behandlung signifikante Veränderungen zeigen (Tabelle 2). Insgesamt upregulated E2 Wege einschließlich Fructose und Mannose Stoffwechsel, Histidin Stoffwechsel, Purinstoffwechsel, die Cholesterin-Biosynthese und Vitamin B3 Stoffwechsel. Die downregulated Wege waren butanoate metabolism, de novo - Fettsäure - Biosynthese, Pentosephosphatweg, Harnstoffzyklus und den Stoffwechsel von Arginin (Tabelle 3).

Datenanalyse und Integration
Die Daten von RNA-Seq, ChIP-Seq und GC-MS wurden durch eine Reihe von Schritten (Abbildung 6) verarbeitet und analysiert. Nach dem Vergleich zwischen den identifizierten Gene in RNA-Seq und ChIP-Seq, einen Satz von hochreguliert und einen Satz nach unten reguliert Gene, die durch Estradiol extrahiert wurden. Aus den Stoffwechseldaten, erhalten wir zwei Sätze von Aufwärts- und Abwärts geregelt Verbindungen durch die Östradiol-Behandlung. Als nächstes haben wir Metscape, eine App für Cytoscape, die Genexpression und metabolischen Daten im Zusammenhang mit der menschlichen Stoffwechsel 15 zu visualisieren und zu interpretieren. Zuerst haben wir Elemente der Verbindung, Reaktion, ein Enzym, und Gen in dem Netzwerk umfassen. Wir haben für Sie die Verbindungen / Gene als Abfrage und zwei Netzwerke der E2 - Hochregulation (7A) und unten-Regelung (7B) wurden gezeigt. Die Metscape bietet auch eine Option Netzwerke auf selektive Wege zu bauen. Zum Beispiel wurde die gleiche Menge von Daten wie den Bau des herunterreguliert Gesamtnetz, ein Teilnetz von Androgen-Östrogen-Biosynthese und Stoffwechselweg unter Verwendung der durch die Abfrage aus der Verbindung / Gen spezifischen Signalweg schalten. Die Gene oder Verbindungen mit signifikanten Veränderungen wurden in heller Farbe hervorgehoben. Neben der Auswahl als einen bestimmten Weg aus dem Drop-Down-Fenster beschrieben, kann man schaffen auch ein Sub-Netzwerk von "erstellen Subnetz" -Funktion auf den gewählten Bereich Anwendung. Wie in 6A und B, ERa Aktivierung und die direkte Bindung an regulatorische Regionen Gen gezeigt beeinflusst viele Stoffwechselwege in Brustkrebszellen. Unsere integrative Analyse zeigte , dass, ERa direkt bindet und reguliert die Expression von FASN - Gen, das für die De - novo - Fettsäure-Biosynthese (F wichtig istild 7C). Zusätzlich Androgen-Östrogen-Biosynthese Wege durch noch Expression von CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 und GSTM2 in diesen Bahnen E2 Behandlung nach unten reguliert.

Abbildung 1
Abbildung 1: Workflow der Vorbereitung von Proben von RNA, DNA und Zelllysate für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomische Analyse.

Figur 2
Abbildung 2:. Ein repräsentatives Elektropherogramm der analysierten RNAs mit Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Integrity Number (RIN), Indikator für die RNA - Qualität wurde durch die Analyse als 9,9 gegeben. (A) auf einem virtuellen Gel Bild von der RNA - Probe beide Bands von 26S und 18S sind scharf. (B) Fluoreszenzsignale einzelner Spuren in ter RNA - zeigt , dass die Intensität des 28S - Spitze größer ist als 18S Spitze und keine Verschmutzung zu sehen ist . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Eine repräsentative Qualitätskontrolle der RNA-Seq Rohdaten Eine der Sequenzdaten des Fahrzeugs Probe wurde mit FastQC analysiert. (A) Die Sequenzlängenverteilung der Bibliothek , die 100 bp ist. (B) Die Qualität der Gäste entlang der Position im Lese. (C) Die Qualität der Gäste pro Sequenz zeigte die universelle hohe Qualität aller Sequenzen. (D) Der GC - Gehalt pro Lese die theoretische Verteilung abgestimmt. Bitte klicken Sie hier um ein la anzuzeigenrger Version dieser Figur.

Abbildung 4
Abbildung 4: Gelelektrophorese der beschallten Chromatin Fragmente 5 & mgr; l des Zelllysats von jeder Probe auf einem 1,5% Agarosegel mit einem 1000 bp und Leiter auf der ersten Spur ausgeführt wurde.. Die Mehrzahl der Fragmente sind zwischen 300 und 600 bp. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5:. Die Übersicht der Peaks , welche Metaboliten aus dem GC-MS Das obere Feld zeigt die identifizierten Peaks in den E2 behandelten Proben während die untere Platte von der Steuerung. Das Gebiet wurde Zimmer eingeschlossen in den genauen Metabolit von jedem p dargestellt um zu zeigen, EAK. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Ablaufplan der Integrative Clustering - Verfahren.

7
Abbildung 7: Die Visualisierung der integrierten Gen-Metabolit Daten in Metscape (A) Das Netzwerk von Wegen hochreguliert durch E2.. (B) Das Netzwerk von Wegen nach unten reguliert durch E2. (C) E2 stimulierte ERa Rekrutierung in die nahe gelegene Region FASN, die durch Anwendung Subnetz Funktion erzeugt in der de novo Fettsäurebiosynthese Netzwerk geregelt werden gefunden wird.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Zusammenfassung der ultra-Hochdurchsatz - Sequenzierung von RNA-Seq und ChIP-Seq.

Tabelle 2
Tabelle 2: Liste der Top - 10 - Metaboliten mit signifikanten Veränderungen mit E2 - Behandlung.

Tabelle 3
Tabelle 3: Wege nach oben und nach unten reguliert durch E2 - Behandlung.

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Discussion

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, Erzeugungs- und integrative Analyse von RNA-Seq, ChIP-Seq und metabolomics Daten von MCF-7-Zellen, die mit E2 behandelt werden. Wir entwickelten eine Reihe von Protokollen, die effizientesten Methoden und benutzerfreundlichen Soft-Ware zu verwenden strategizing, die biologisch relevante Entdeckung produzieren. Um unser Wissen, unsere ist die erste Studie -omics Daten aus drei verschiedenen Analysen und identifiziert neue Stoffwechselwege, die ERa direkt geregelt in Brustkrebszellen zu integrieren.

Transcriptomics
Es ist wichtig, mit hoher Qualität RNAs für eine erfolgreiche transkriptomischen Analyse zu starten. Gute Praxis wird die Wahrscheinlichkeit von RNA-Abbau zu beseitigen, einschließlich der Erstellung von RNase-freie Bank, wechselnde Handschuhe oft, Lagerung in -80 ° C und halten auf dem Eis im Einsatz. Die Zugabe von Inkubation über Nacht bei -20 ° C verbessert die RNA-Gewinnung. Um zu vermeiden, Einfrieren und Auftauen RNA wiederholt, kann man die RNAs für nachgeschaltete procedur zuweisenes auf die Isolierung und Reinigung. Für die Existenz von Sequenzierungsfehlern, qRT-PCR die cDNA aus den Proben verwendet wird oft ausgeführt, um die differentiell exprimierten Gene in RNA-Seq identifiziert zu verifizieren. Daher sollte ausreichend RNA für diesen Zweck reserviert. Wir führen Paired-End-Sequenzierung, die uns Splice-Varianten, nicht-kodierenden RNAs und miRNAs zu analysieren. Zur Vermeidung von Hochsequenzierungskosten, Sequenzierung Single-End kann auch durchgeführt werden. Im Vergleich zu Mikroarrays ist RNA-Seq empfindlicher und ist nicht auf die Sonden auf dem Chip vorgesehen begrenzt. Wir erhalten nicht nur Informationen über kodierenden Sequenzen, sondern auch auf nicht-kodierenden Gene und differentiell gespleißten Transkripte. Wir sind derzeit mit dieser Technik Transkriptomen von verschiedenen Zelllinien nach Ligand-Behandlungen sowie Gewebe aus Mausexperimenten erhalten zu analysieren.

Cistromics
Die ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung Methode erfordert nur einen minimalen 5 ng ChIP-DNA für die Konstruktion der Bibliothek. Im Standard-ChIP-Seq - Protokoll 18 ist es empfehlenswert , mindestens 10 ng haben. Quantifizierungs mit Fluorometrie ist kritisch. In diesem Protokoll verwendeten wir Doppelstrang DNA-Nachweis-Assay der DNA-Konzentration zu bestimmen. Man kann auch Fluorometer-Assay für die präzise DNA Quantifizierung verwenden. Für die Unterschiede in Ausrüstung und Materialien, ist es sehr wichtig, für jedes Labor eigene Beschallungs Protokoll einzurichten, die Größen wünschenswert DNA-Fragmente erzeugt. Über Scheren der ChIP DNA könnte Verlust der Anreicherung von Ziel-DNAs verursachen, während ChIP DNA von großen Größen Problem für die effiziente Sequenzierung erstellen. Bevor die DNA-Sequenzierung einreichen, ist es immer wichtig, die Anreicherung von einigen bekannten Regionen von qPCR zu überprüfen. Die Technik wird durch die Effizienz und Spezifität des Antikörpers verwendet für Immunpräzipitationen noch begrenzt. Um Bindungsstelle Informationen zu erhalten , die zuverlässig in vergleichenden Analysen verwendet werden könnten, zu validieren wir unsere Reagenzien folgende ENCODE ChIP-Seq - Standards, 19 und Verwendung standarsierten Protokolle, die uns mit konsistenten Datensätzen zur Verfügung stellen. In Verbindung mit dem Post-Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle Anreicherungsanalyse, ChIP-Seq ist immer noch eine der besten Methoden, die direkte Bindung von Transkriptionsfaktoren an das Chromatin zu bestimmen. Wir sind derzeit dieses Protokoll Rekrutierung Kinasen, Koregulatoren und andere Transkriptionsfaktoren an das Chromatin in anderen Zelllinien sowie Östrogen ansprechenden Geweben der Maus zu untersuchen.

Metabolomics
Für eine erfolgreiche metabolischen Profils in menschlichen Brustkrebszellen, eine sorgfältige Probenvorbereitung ist kritisch. Die Menge der Zellen in Verwendung und Zellkulturbedingung in diesem Protokoll ist für die MCF7-Zellen optimal. Andere Zelllinien könnten mehr oder weniger Zellen für die Erfassung einer signifikanten Anzahl von Stoffwechselprodukten erfordern. Wir erhalten rund 100 Metaboliten in jedem Experiment. Dieses Verfahren ist zum Nachweis von kurzlebigen Metaboliten oder Metaboliten beschränkt, die in niedrigen Konzentrationen vorhanden sind. Dieses Verfahren bietet die einfache usimehrere Metaboliten zu identifizieren, die eine einzelne Probenvorbereitung ng. Wir sind derzeit mit dieser Technik zu Östrogen reguliert Metaboliten in Serum und verschiedenen Geweben von der Maus zu identifizieren.

Datenintegration
Zahlreiche Transcriptomics und cistromics Studien wurden durchgeführt , um Östrogen - Signalisierung und Genregulation in Brustkrebszellen, einschließlich MCF7 Zellen 2,5-7,20 untersuchen. In dieser Studie zum ersten Mal, haben wir Daten Metabolomik und versuchte metabolischer Netzwerke zu schließen, die durch ERa auf Ligand zusätzlich direkt reguliert werden. Dieser neuartige Ansatz konnten wir zeigen molekulare Schaltkreise durch Östrogene reguliert Stift, der Zellstoffwechsel beeinflussen. Insgesamt sind unsere Ergebnisse unterstützen die Rolle von ERa als Master-Regulator der Brustkrebsbiologie.

Zusammengefasst, wenn wir ein detailliertes Kompendium von Protokollen zur Erzeugung von RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomics-Proben von Brustkrebszellen nach der Behandlung Östrogen und integrtive Analyse der aus diesen -omics Ansätzen gewonnenen Daten. Diese Protokolle ermöglichen es den Forschern ähnliche Analyse für andere Transkriptionsfaktoren, Kernrezeptorliganden und Nährstoffbedingungen zu tun.

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Disclosures

University of Illinois erhielt einen Investigator Initiated Zuschuss von Pfizer Inc. ZME und YCZ erhielt Gehalts Unterstützung von diesen Zuschuss.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft, US Department of Agriculture, preis ILLU-698-909 (ZME) und Pfizer, Inc (ZME) unterstützt. Sein Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht zwangsläufig die offizielle Einstellung der US-Landwirtschaftsministerium vertreten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

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References

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Medizin Heft 109 RNA-Seq Transkriptom ChIP-Seq cistrome Metabolomik Östrogen Brustkrebs
Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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