Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Системная биология регулирования метаболическим путем эстрогеновых рецепторов Signaling при раке молочной железы

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832

Abstract

С появлением -omics подходов наше понимание хронических заболеваний, как рак и метаболического синдрома улучшилось. Тем не менее, эффективная добыча информации, содержащейся в крупномасштабных наборов данных, которые получаются из экспрессии генов микрочипов, глубоких экспериментов секвенирования или метаболического профилирования имеет важное значение для раскрытия и затем эффективно нацелены на критические регуляторы больных фенотипов клеток. Эстрогеновых рецепторов α (ERα) является одним из факторов транскрипции, регулирующих мастер программы генов, которые являются важными для эстрогеном рака молочной железы. Для того, чтобы понять, в роли сигнализации ERα в грудном метаболизма рака мы использовали транскриптомных, cistromic и метаболомики данные из клеток MCF-7, обработанных эстрадиола. В этом докладе мы описали поколение образцов для РНК-Seq, Обломок-Seq и экспериментов метаболомики и интегративной вычислительного анализа полученных данных. Этот подход полезен в разграничении новый мольмеханизмы и сосудистых генов регуляторных контуров, которые регулируются с помощью определенного фактора транскрипции, который влияет на метаболизм нормальных или патологических клетках.

Introduction

Эстрогены являются важными регуляторами многих физиологических процессов в обеих женщин и мужчин в том числе репродуктивных тканей, нарушения обмена веществ, тканей головного мозга и костей 1. В дополнение к благотворное влияние в этих тканях, эстрогены также диск раковых заболеваний, которые возникают из молочной железы и репродуктивных тканей. Эстрогены в основном работают через ОЭ, чтобы вызвать специфические эффекты типа клеток. Глубокое секвенирование транскриптов регулируемых ERα использованием ERα ДНК анализа сайты связывания РНК-Seq и генома с использованием Обломок-Seq оказалось полезным, чтобы понять, как работает ERα в различных тканях и раковых заболеваний, которые возникают из них. Мы и другие опубликовали профили экспрессии генов , связанных с различными рецепторами (ERα против ERβ) 2,3, различных лигандов 3-5 и различных coregulators 2,4,6,7.

Секвенирование РНК является основным методом для изучения транскриптом, предлагая более высокую точность и эффективность по сравнению с микрочипов баАнализ экспрессии гена СЕПГ 8. РНК , полученной из клеточных линий 2-4,7, тканей или образцов опухолей упорядочиваются, сопоставляются с имеющимися геномных сборок и дифференциально регулируемых генов идентифицированы. Иммунопреципитации хроматина (ЧИП) используется для рассекают фактора транскрипции и coregulator хроматина связывания с известными сайтами связывания регуляторных. ЧИП-Seq (ЧИП следуют высокой пропускной последовательности) обеспечивает беспристрастную обнаружение глобальных сайтов связывания. Метаболомика является еще шире используется система биологии подход, который количественно измеряет, динамический многопараметрическая реакция живых систем на различные стимулы, включая химические вещества и генетических возмущений.

Выполнением глобального обмена веществ профилирование, функциональное считывание может быть получен из клеток, тканей и крови. Кроме того, информация из транскриптом экспериментов не всегда отражают реальные изменения в уровне ферментов, способствующих биохимических путей. комбинированныйанализ транскриптом и Метаболом данных позволяет идентифицировать и соотнести изменения в экспрессии генов с фактическими изменениями метаболита. Обуздывать информацию от всех этих крупномасштабных массивов данных обеспечивают механистические детали, чтобы понять роль транскрипционных факторов, регулирующих сложные биологические системы, особенно те, которые имеют отношение к развитию человека и таких заболеваний, как рак и диабет.

Сложный характер генома млекопитающих делает его сложно интегрировать и полностью интерпретировать данные, полученные из транскриптом, cistrome и Метаболом экспериментов. Определение функциональных связывания событий, которые приведут к изменениям в экспрессии генов-мишеней является важным, поскольку, как только функциональные сайты связывания идентифицированы; последующий анализ, в том числе транскрипции связывания (TF) анализа мотива, может быть выполнена с более высокой точностью. Это приводит к идентификации биологически значимых каскадами и механизмов TF. Также прямые comparisна РНК-Seq и ЧИП-Seq экспериментов не всегда возможно, так как данные из каждого эксперимента имеют различные масштабы и шумы, а в некоторых случаях значимые сигналы замутнено шумом населения. Мы не знаем каких-либо исследований, которые интегрированы информацию из этих трех независимых, но взаимосвязанных подходов, чтобы понять прямой регуляции метаболизма путем ERα при раке молочной железы. Таким образом, наша общая цель в этой статье, чтобы связать продуктивные связывания событий в экспрессии генов и изменения метаболита. Для достижения этой цели, мы интегрировали данные из РНК-Seq, чиповых ПОСЛ и метаболомики экспериментов и выявили те эстроген индуцированной ERα связывания событий, которые приведут к изменениям экспрессии генов в метаболических путях. Впервые, мы предоставляем полный набор протоколов (Рисунок 1) для генерации Обломок-Seq, РНК-Seq и метаболомика профилирование и проведение интегративный анализ данных для выявления новых схем генов , регулирующих метаболизм молочной железылиний раковых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение РНК-Seq Образцы

  1. Культура клеток и лечение
    1. Культуры клеток MCF7 в Improved MEM (ИМЭМ) плюс фенол-красный среде с добавлением 10% прогретой неактивной FBS, 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 атмосферы.
      Примечание: Та же линия клеток и состояние культуры клеток используется на протяжении всего исследования.
    2. Семенной 100000 MCF7 клеток на лунку в 6-луночные планшеты. Есть трехкратном повторе для каждой обработки. На 3 -й день, извлеките носитель и добавьте 2 мл свежей среды с или без 10 -8 М E2 в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 24 ч в 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 атмосферы.
    3. Для сбора клеток, добавляют 1 мл выделения РНК реагента (кислота гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ) в каждую лунку и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Затем соберите клеточного лизата реагента с помощью пипетки и месторождения в 1,5 мл пробирки
  2. Выделение РНК
    1. Добавить 200 мкл chlorofoгт в 1 мл клеточного лизата реагента (1.1.3) и вихря в течение 10 сек. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. После центрифугирования перенесите водной фазы (сверху) в новую пробирку, не нарушая других фаз.
    2. Добавить 500 мкл 100% изопропанола в новую пробирку с передаваемым-водную фазу, и взболтайте. Инкубируйте при -20 ° С в течение ночи. Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Отметим, гранулу в нижней части трубы. Удалите супернатант и промыть осадок с 750 мкл РНКазы 70% этанола путем кратковременного вихря.
    3. Центрифуга образцов при 6000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант, и центрифугирование образца при 16000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С, чтобы собрать все оставшиеся этанола. Удалите остатки этанола с помощью пипетки с гель-наливного наконечника и установки трубы вверх-вниз стороне высохнуть на воздухе в течение 10 мин. Растворить осадок в 20-50 мкл DEPC обработанной воды висимостьDing от размера гранул.
  3. Очищают РНК с использованием РНК набора очистке согласно протоколу 4. Измерение концентрации РНК с использованием набора для анализа на основе флюометрия в соответствии с протоколом 9.
    Примечание: оптическую плотность при длине волны 260 нм берется для определения концентрации РНК и отношение оптической плотности при длине волны 260 нм и 280 нм, используют для определения чистоты образца. Рекомендуется проверять качество РНК с использованием био-анализатор анализа.
  4. Возьмите примерно от 0,5 до 1 мкг очищенной РНК для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Biotech центр готовит библиотеки секвенирования и выполняет парноконцевое чтения секвенирования с использованием методов , подробно описанных ранее 2.

2. Получение чиповых-Seq образца

  1. Культура клеток и лечение
    1. Семя 500000 MCF7 клеток на 10 см пластины в среде роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого тянуть вниз были использованы 16 пластин. На 3 -й день, удалите среду и добавляют 5 мл свежей среды с добавлением или без 10 -8 М E2 в каждойпластина. Treat клетки в течение 45 минут (37 & deg ; С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2).
  2. Crosslink и Cell для уборки урожая
    1. Добавить 250 мкл 37% формальдегида в 5 мл среды сшивать хроматин, инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Прекратить сшивающий промыванием клеток с 5 мл охлажденного льдом 1х MEM.
    2. Сбора клеток в 250 мкл буфера для лизиса клеток (10 мМ ЭДТА, 50 мМ HCl, Tri 1% SDS, 0,5% N, N-оксида dimethyldodecan-1-амина) на одну пластину.
  3. Фрагментация хроматина
    1. Разрушать ультразвуком клетки в течение 30 сек х 8 на усилитель 30, чтобы достичь требуемых размеров хроматина. Охлаждают каждый образец на льду после обработки ультразвуком 30 сек.
    2. Центрифуга на 16, 000 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С, и осторожно пипеткой супернатант, не нарушая гранул в нижней части.
    3. Возьмем 5 мкл аликвоты надосадочной жидкости, и проверить размер ДНК с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле , как описано выше 10. Идеальный размерДНК должна быть в пределах 200-500 пар оснований.
  4. иммунопреципитации хроматина
    1. Сохранить 25 мкл клеточного лизата в качестве входных данных. В 50 мл пробирку, перемешивают 4 мл лизата клеток с 20 мл IP-буфера (2 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl и 0,5% Тритон Х), ERα антителом (500 мкл F10 и 500 мкл НС- 20), и 500 мкл Prota и ProtG белка покрытия магнитных шариков. Выдержите смесь путем вращения при 4 ° С в течение ночи, чтобы позволить образование chromatin- комплекса антител.
  5. Моет и обратного сшивание
    1. Используйте магнитную подставку для сбора магнитных шариков на намагниченной стороне, чтобы удалить промывочный буфер.
    2. Вымойте магнитных шариков в 25 мл промывочного буфера I (2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, 01% SDS, 1% Тритон Х и 150 мМ NaCl). Для того, чтобы тщательно промыть магнитные шарики, не нарушая ДНК-белковых комплексов, добавьте 25 мл моют медленно буфера к трубке вдоль стороны затем инвертировать трубки, пока все магнитные шарики не смешиваются хорошо Wiго промывочного буфера без появления в качестве гранул. В качестве альтернативы, использовать ротатор, чтобы инвертировать трубку. Не вихре образцы. Вымойте магнитных шариков, используя тот же метод в следующих шагах.
    3. Вымойте магнитных шариков в 25 мл промывочного буфера II (2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, 01% SDS, 1% Triton X и 500 мМ NaCl).
    4. Промыть магнитные гранулы в 25 мл промывочного буфера III (1,6 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate и 250 мМ LiCl).
    5. Промыть магнитные гранулы в 25 мл 1х ТЕ-буфере (1 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис-HCl) дважды.
    6. Элюции ДНК в 500 мкл буфера для элюции (1% SDS, и 10 мМ NaHCO 3) , а затем выделяют элюции 500 мкл ДНК в 4 пробирки. Для получения ДНК из входов, элюции ДНК в 125 мкл буфера для элюции.
    7. Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение ночи на нагревательном блоке. Накройте трубы на нагревательном блоке с алюминиевой фольгой, чтобы сохранить тепло даже в течение всех труб. Поместите вес на трубы, чтобы удержать их от открытия. </ Li>
  6. Выделение ДНК
    1. Охлаждают пробирки при комнатной температуре в течение 5 мин. Изолировать ДНК из ниспадающих образцов с использованием набора для выделения ДНК-чип. Следуйте инструкциям изготовителя.
      1. Разминка элюирующий буфер при 65 ° C. Добавить 625 мкл буфера для связывания в каждую пробирку. Если осадок формы, добавить еще 250 мкл буфера для связывания, пока раствор не станет прозрачным.
      2. Загрузить образец в колонку и центрифуге при 16000 х г в течение 30 сек. Вымойте образца с 250 мкл буфера для промывки. Не забудьте добавить этанол в промывной буфер, когда в первый раз, чтобы использовать его. Повторите мыть.
      3. Элюции ДНК в 15 мкл буфера для элюции. Объединить ДНК же тянуть вниз от 4-х труб, чтобы достичь около 55 мкл ДНК.
    2. Изолировать ДНК ввода с использованием очищающего ДНК Kit.
      1. Разминка элюирующий буфер при 65 ° C. Добавить 625 мкл буфера для связывания в каждую пробирку и инкубируют в течение 10 мин. Загрузите образец на колонку в collecti 2 млна трубке.
      2. Вымойте образца с 750 мкл промывочного буфера, центрифуге при 16000 мкг в течение 1 мин. Повторите центрифугирование для удаления остатков буфера. Элюции ДНК в 30 мкл EB.
    3. Мера концентрации ДНК с использованием коммерческого Флуорохром анализа с модификацией 11.
      1. Развести 20x TE буфера в 1x ТЕ в качестве буфера для анализа для разбавления образцов реагентов и ДНК. Возьмите 5 мкл выделенной ДНК и развести его в 50 мкл в 1x ТЕ.
      2. От 2 мкг / мл ДНК исходного раствора сделать стандартной ДНК в пределах от заготовки до 1, 10, 100, 1000 мкг / мл. В 96-луночный планшет, выделяют 25 мкл каждого стандарта, а также разбавление ДНК в двух экземплярах. (Рекомендуется Triplicate для стандарта.)
      3. Подготовить рабочий реагент, сделав 200-кратное разбавление от реагента дцДНК в буфере 1x ТЕ в пластиковой трубке. Накройте рабочего раствора реагента с алюминиевой фольгой, чтобы исключить воздействие света. Добавьте 200 мкл рабочего реагента в каждом образце. Вcubate при комнатной температуре в течение 5 мин. Закройте планшет с алюминиевой фольгой, чтобы исключить воздействие света.
      4. Измерьте цветение образцов с помощью ридера флуоресценции пластины (возбуждение при 480 нм, эмиссия 520 нм). Генерация стандартной кривой ДНК цветении в зависимости от концентрации ДНК. Определить концентрацию образцов на основании сгенерированной стандартной ДНК-кривой.
  7. Проверка чиповых эксперимент с использованием КПЦР
    1. Принимать по 2 мкл выделенной ДНК и разводили в 20 мкл в воде. Настройка реакции КПЦР в трех экземплярах путем смешивания 2,5 мкл разведения ДНК, 5 мкл Green I ПЦР основной смеси, 1 мкл праймера и 1,5 мкл нуклеазы свободной воды.
    2. Запуск КПЦР с быстрой системой ПЦР в реальном времени, используя следующую программу: Шаг 1: 95 ° C в течение 60 секунд, Шаг 2: 95 ° C в течение 10 сек, 60 ° C в течение 60 секунд, повторите шаг 2 39 раз.
  8. Отправить 10 нг образец ДНК в центре Biotech для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Biotecч Центр готовит ДНК стружку на библиотеки в соответствии с инструкцией, и выполняет ни одного чтения последовательности , используя методы , описанные ранее 2.

3. Метаболомика Анализ подготовки образцов

  1. Культура клеток и лечение
    1. Семя 400000 MCF7 клеток на 10 см пластины в среде роста. Для каждой обработки готовят три образца. С помощью двух пластин в каждом образце, чтобы получить достаточное количество клеток для обнаружения. На 3 -й день, удалите среду и добавляют 5 мл свежей среды с добавлением или без 10 -8 М E2 к клеткам. Treat клетки в течение 24 ч (37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2).
  2. Сбор образцов
    1. Добавьте 5 мл ледяной холод 1X PBS к плите, аспирация PBS после того, как на короткое время наклонить планшету несколько раз. Повторите два раза, и удалить как можно больше PBS, насколько это возможно после последней промывки.
    2. Добавить 750 мкл предварительно холодного ацетона в каждую чашку и царапать клетки. Объединяют клетки в ацетоне из двух пластин вв 2 мл пробирку на льду.
    3. Количество клеток для нормализации
      1. Для каждой обработки используют две дополнительные пластины для клеток количественной оценки. Для отмены прикрепления клеток из пластины, прибавляют 2 мл буферного (1x HBSS, 10 мМ HEPES, 0,075% NaHCO 3 и 1 мМ ЭДТА) в каждую тарелку и инкубировать в течение 5 мин.
      2. Сбор и хорошо перемешать клетки пипеткой клетки в буфере HE. Использование общей сложности 20 мкл раствора клеток для подсчета числа клеток с помощью гемоцитометра.
  3. Храните образцы при -80 ° С перед отправкой в ​​центр Metabolomics для идентификации и количественного определения метаболитов с помощью газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС) анализ.

4. интегративный анализ

  1. Секвенирование РНК Анализ данных:
    1. Выполните проверку качества FASTQ файлов с помощью FastQC: Чтение QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Выберите FastQC: Чтение под инструмент NGS: QC и манипуляцию. Загрузите файл исходных данных из текущего историу.
        Примечание: Рекомендуется, чтобы дать название для выходного файла, чтобы напомнить вам, что работа была для, так как там может быть несколько выходов.
    2. Выполнить и выходной файл появится в разделе истории. Повторите ту же процедуру для каждого файла последовательности. Обрезка адаптеры, использующие клип под NGS: FASTX Toolkit.
    3. Align читает hg19 с использованием Tophat2 с RefSeq генома эталонной аннотацию 12 (значения по умолчанию).
      1. Выберите Tophat2 под инструмент NGS: анализ РНК. Укажите библиотеку парного типа (одностороннего против парного).
      2. Загрузить файл ввода FASTQ из текущей истории. Выберите эталонный геном. Выберите настройки по умолчанию. Или использовать полный список параметров для изменения.
      3. Выполнить и он будет производить два выходных файла: один УСК BED трек перекрестков; еще один список чтения выравнивания в формате БАМ.
    4. Загрузить БАМ файлы для секвенирования инструмент анализа данных. Вычислить значения выражений с использованием Quantфикация Tool.
    5. Определение дифференцированно вверх-регулируемых генов с помощью Expression Analysis Tool , используя значения по умолчанию и сложите изменения> 2 и р-значение <0,05. Кроме того, определить дифференцированно понижающей регуляции генов с помощью Expression Analysis Tool, используя значения по умолчанию и сложите изменение <0,5 и р-значение <0,05.
  2. ЧИП-Seq Анализ данных:
    1. Совместите FASTQ Читает hg19 с использованием Bowtie2 13 (значения по умолчанию) в Галактике.
      1. Выберите Bowtie2 под инструмент НСК: Mapping. Проверьте, если библиотека мате непарных (один конец против парного). Загрузить файл FASTQ из текущей истории.
      2. Выберите эталонный геном. Используйте настройки параметров по умолчанию. Выполнить и он будет производить выходной файл с сопоставляется последовательность читает, как БАМ файла. Повторите эту процедуру для каждого файла последовательности.
    2. Определение пиков с использованием MACS 14 р-значение отсечки 6.0e-7 и FDR 0,01, как описано выше 2.
    3. Метаболомика Анализ данных:
      1. Преобразовать химические названия метаболитов KEGG_IDs.
      2. Выявление дифференциально регулируемых метаболитов путем сравнения уровней , обнаруженных в автомобиле против. E2 обработанных образцов (в 2 раза отсечка была использована в данном исследовании).
    4. Интегративный анализ:
      1. Выявление генов, которые имеют ERα сайты связывания с помощью инструмента анализа последовательности данных. Перевести Регионы к функции генов с помощью 20 кб как расстояние отсечкой.
      2. Идентифицировать дифференцированно вверх и вниз регулируемых генов из анализа данных РНК-Seq с использованием свёртки изменения> 2 и сложить изменение <0,5, соответственно , с р-значение <0,05 как отрезало. Сравнить в список ERα сайта связывания, содержащих гены с использованием Венна сравнения диаграмм.
      3. Используйте этот список , чтобы определить E2 модулированные пути метаболизма с использованием Metscape 15 модуля Cytoscape.
        1. Выбрав модуль Metscape из приложений, выберите Построить сеть, а затем путем распространения БАВОпция ред.
        2. Выберите Организм (человека). Выбрать файл данных E2 нерегулируемого списка соединения (KEGG ID), а Е2 повышающей регуляции список генов.
        3. Выберите Соединение -реакция -Enzyme-Gene в качестве типа сети. Выберите соединение / гены в качестве запроса.
        4. Построить сеть. Повторите с помощью Е2 вниз регулируемого соединения и генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

транскриптомика
Для анализа дифференциально выраженных генов путем обработки E2, мы решили выполнить РНК-Seq эксперимент. В дополнение к предоставлению информации об уровнях мРНК, РНК-Seq данные также могут быть использованы для мониторинга изменений в некодирующих РНК (длинные некодирующих РНК, микроРНК) и альтернативных событий сплайсинга. Мы не предоставили информацию об анализе некодирующих РНК или в качестве альтернативы расшифрованных генов, так как объем нашего исследования является выявление белков кодирующих генов, которые являются важными для регуляции метаболизма. Однако РНК Seq является отличным способом получения информации о дифференциальных экспрессии генов событий.

Для того чтобы получить высокое качество чтения, важно, чтобы получить высокую РНК чистоты. После выделения РНК мы очистили РНК с использованием набора очистить РНК. К сожалению, почти 50% РНК теряется в ходе этого процесса, и количество исходного РНК следует принимать во Consideration, чтобы получить необходимое количество (100-500 нг) к концу стадии очистки.

Мы количественно выходов РНК с использованием РНК Флуорометр HS анализа, который является очень точным и является предпочтительным методом для количественного определения низкой численности РНК. Далее, целостность и общее качество образцов РНК исследовали с использованием bioanlayzer, который является жизнеспособной альтернативой гель-электрофореза с использованием минимального количества РНК. Анализ показывает , все образцы имеют острые и чистые полосы 18S и 28S рРНК , указывающие на целостность и чистоту образцов (рис 2В). РНК Целостность Число (RIN) был использован в качестве стандарта для контроля качества РНК. РИН 10 указывает на неповрежденную РНК, РИН 6 частично расщепленный и RIN3 сильно деградировали 16.

Рекомендуется, чтобы RIN, чтобы быть по крайней мере 7 для секвенирования эксперимента. Все наши образцы РНК получали значение РИН между 9.6-9.9 <сильный> (рис 2A). Библиотеки секвенирования были построены из 500ng высококачественной РНК из каждого образца с использованием сверхвысокой пропускной способности системы секвенирования , таких как Illumina 2500. В среднем 18000000 высокого качества последовательности операций чтения были получены для каждого образца (таблица 1), который был готов к вниз по течению анализ. Для проверки общего качества с высокой пропускной способностью последовательности необработанных данных, FastQC был запущен для чтения каждого образца. Представитель отчет FastQC для одного транспортного средства РНК Seq данных было показано (рисунок 3). Длина последовательности наиболее считывает около 100 пар оснований (рис 3А). Для каждой операции чтения, показатель качества был 32-34 в течение первых 5 пар оснований и 36-38 из 6-100bp (рис 3B). Среди 17990863 чтений генерируется из этого образца, большинство из них имели показатель качества выше , чем 34 (рис 3C). Содержание GC на операции чтения в последовательности также следуют нормальному распределению со средним значением 48% GC. В целом качествооценка чтений была очень высокой.

Cistromic анализ сайтов связывания ERα
Для достижения эффективного глубокого секвенирования, получение ДНК-фрагментов в желаемом размере является одним из важных факторов. Современные подходы секвенирования могут иметь различные требования в отношении фрагментов ДНК, например , 300-600 п.н. для системы секвенирования ультра-высокой пропускной способностью , 100-200 б.п. для AB / SOLiD 17. В этом эксперименте , большинство фрагментов ДНК от 300 пар оснований и 600 пар оснований, как показано на геле (рис 4). В качестве альтернативы, читатели могли бы решили подготовить их хроматина с помощью MNase пищеварение, однако мы считаем, наш создан протокол обеспечивает необходимые образцы с высоким качеством и обеспечивает воспроизводимые результаты. Десять нг ДНК из каждой обработки, и соответствующий входной выборки был подготовлен в буфере EB. ДНК ЧИП был одним чтения секвенировали с использованием системы секвенирования ультра-высокой пропускной способностью. Образцы ДНК-чип дали о20000000 читает в то время как входной ДНК дали более 35.000,000 читает (таблица 1).

Метаболомика
Для количественного определения метаболитов в клетках млекопитающих с использованием МГЦ, по меньшей мере, 10 мкг клеточной массы требуются. Мы начали с 400,000 MCF7 клеток с экспериментами. Ко времени сбора урожая, было зарегистрировано около 500 000 клеток в каждой чашке. Обзор метаболитов , представленных пиков сравнивали между контрольной и эстрадиол обработанного образца (рисунок 5). Около 100 метаболитов были идентифицированы, которые рассчитывают на 60% от общего известного в млекопитающим. Здесь мы приводим список топ - 10 метаболитов, которые показывают значительные изменения в лечении E2 (таблица 2). В целом, E2 повышающей регуляции путей, включая фруктозы и маннозы метаболизма, гистидин обмена веществ, метаболизма пуринов, биосинтеза холестерина и витамина B3 метаболизма. В подавляются пути были бутановой metabolisм, биосинтез De Novo жирных кислот, пентозофосфатный путь, цикл мочевины и метаболизм аргинина (Таблица 3).

Анализ данных и интеграция
Обрабатывались Данные из РНК-Seq, Обломок-Seq и ГХ-МС и анализировали через ряд этапов (рисунок 6). После сравнения генов , идентифицированных в РНК-Seq и ЧИП-Seq, один набор до регулируемого и один набор вниз регулируемых генов эстрадиолом были извлечены. Из метаболических данных, мы получили два набора вверх и вниз регулируемых соединений обработкой эстрадиол. Далее мы использовали Metscape, приложение для Cytoscape, чтобы визуализировать и интерпретировать экспрессию генов и метаболических данных в контексте человеческого метаболизма 15. Во-первых, мы решили включать элементы соединения, реакции, фермент и ген в сети. Мы выбрали соединения / гены как запрос и две сети Е2 повышающей регуляции (7А) и вниз-regulation (7Б) были показаны. Metscape также предоставляет возможность для построения сетей на селективные путей. Например, используя один и тот же набор данных, как строительство понижающей регуляции общей пропускной способности сети, подсетью андроген-эстроген биосинтеза и метаболизма пути был сгенерирован, переключая запрос из соединения / гена к конкретному пути. Гены или соединения со значительными изменениями были выделены ярким цветом. Помимо выбора конкретного пути из выпадающего окна, как описано, можно также создать подсеть, применяя функцию "создать подсеть" в выбранной области. Как показано на фиг.6А и В, ERα активации и прямого связывания с генными регуляторных областей воздействию многих метаболических путей в клетках рака молочной железы. Наш интегративный анализ показал , что, ERα непосредственно связывается и регулирует экспрессию гена FASN, что важно для де Novo жирной кислоты биосинтеза пути (Figure 7С). Кроме того лечение E2 подавляются андроген-эстроген пути биосинтеза подавляя экспрессию CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, ТПО, GSTA4 и GSTM2 в этих путях.

Рисунок 1
Рисунок 1: Процедура подготовки образцов РНК, ДНК и клеточные лизаты для РНК-Seq, Обломок-Seq и анализа метаболомики.

фигура 2
Рис . 2: Представитель electropherogram из РНК анализировали с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer РНК Integrity Количество (РИН), показатель качества РНК, был дан анализ как 9.9. (A) На снимке виртуальной гель РНК образца обе полосы 26S и 18S острые. (B) флуоресцентных сигналов индивидуального следа в Tон РНК показывает , что интенсивность пика 28S больше , чем 18S пик и никакого загрязнения не видно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Представитель проверки качества на РНК-Seq необработанных данных Одна из данных последовательностей в образце транспортного средства была проанализирована с помощью FastQC. (А) последовательность распределения длины библиотеки , которая 100 пар оснований . (B) оценка качества по позиции для чтения. (C) показатель качества каждой последовательности показал универсальное высокое качество всех последовательностей. (D) Содержание GC на операции чтения соответствует теоретическое распределение. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра а - ляrger версия этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Гель - электрофорез обработанных ультразвуком фрагментов хроматина 5 мкл лизата клеток из каждого образца агарозном геле в 1,5% с 1000 п.о. плюс лестница на первой полосе.. Большинство фрагментов составляет от 300 до 600 пар оснований . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Обзор пиков , представляющих метаболитов из GC-MS На верхней панели показаны пики , определенные в Е2 обработанных образцах а на нижней панели из управления. Площадь, заключенная была комнатная, чтобы показать точную метаболит, представленную каждого р ЕАК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Блок - схема интегративной метода кластеризации.

Рисунок 7
Рисунок 7: Визуализация интегрированных генов-метаболит данных в Metscape (A) Сеть путей вверх-регулируемых Е2.. (В) Сеть путей подавлялась при Е2. (C) E2 стимулируется ERα вербовку в соседний регион FASN, который находится регулироваться в De Novo жирных кислот биосинтез сети генерируемой путем применения функции подсеть.3832fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1: ультравысокой пропускной последовательности РНК-Seq и ЧИП-Seq.

Таблица 2
Таблица 2: Список 10 лучших метаболитов со значительными изменениями с лечением E2.

Таблица 3
Таблица 3: Подготовка вверх и вниз регулируется путем обработки E2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы описали поколение и интегративный анализ РНК-Seq, Обломок-Seq и данных метаболомики из клеток MCF-7, которые лечат с Е2. Мы разработали набор протоколов разработки стратегии использовать наиболее эффективные методы и удобный для пользователя мягкие изделия, которые производят биологически соответствующее открытие. Насколько нам известно, наше первое исследование, чтобы интегрировать -omics данные из трех различных анализа и выявления новых метаболических путей, которые ERα непосредственно регулируются в клетках рака молочной железы.

транскриптомика
Очень важно начать с высоким качеством РНК для успешного транскриптомных анализа. Хорошая практика позволит устранить вероятность деградации РНК, включая создание РНКазы скамейки, меняя перчатки часто, хранение в -80 ° C и держать на льду в использовании. Добавление инкубации в течение ночи при -20 ° С улучшает восстановление РНК. Во избежание замораживания и оттаивания РНК повторно, можно выделить РНК ниже по течению procedurэс на выделения и очистки. Для существования ошибок последовательности, QRT-ПЦР с использованием кДНК из образцов часто выполняется для проверки дифференцированно выраженных генов, идентифицированных в РНК-Seq. Поэтому достаточно РНК должны быть зарезервированы для этой цели. Мы выполняем парноконцевое-секвенирования, которая позволяет нам анализировать варианты сплайсинга, некодирующие РНК и микроРНК. Для того, чтобы избежать затрат высокого секвенирования, одним концом последовательности может быть выполнена так же. По сравнению с микрочипов, РНК-Seq является более чувствительным и не ограничивается зондами, предусмотренных на чипе. Мы получаем информацию не только о кодирующих последовательностей, но и на некодирующих генов и дифференцированно соединенных транскриптов. Мы в настоящее время используют эту методику для анализа Транскриптом различных клеточных линий после лигандами лечения, а также тканей, полученных из экспериментов мыши.

Cistromics
Метод сверхвысокой пропускной последовательности требует минимального 5 нг ДНК для ChIP создания библиотеки. В стандартном ChIP-протокол Seq 18, рекомендуется иметь , по крайней мере , 10 нг. Количественное с флуориметрии имеет решающее значение. В этом протоколе мы использовали анализ ДНК обнаружения двойной цепи для определения концентрации ДНК. Можно также использовать Флуорометр анализ для точного количественного определения ДНК. За отличия в оборудовании и материалах, что очень важно для каждой лаборатории, чтобы создать свой собственный протокол обработки ультразвуком, который генерирует желаемые фрагменты ДНК размером. Над-стрижке ДНК ChIP может привести к потере обогащения целевых ДНК в то время как ДНК-чип больших размеров создают проблемы для эффективного секвенирования. Перед подачей ДНК секвенированию, всегда важно, чтобы проверить обогащение некоторых известных регионов КПЦР. Методика по-прежнему ограничена эффективностью и специфичность антитела, используемого для иммунопреципитации. Для получения обязательной информации сайта , которая может быть надежно использован для проведения сравнительного анализа мы сверим наши реагенты следующие закодировать Обломок-Seq стандартов, 19 и использование Standardized протоколы, которые предоставляют нам последовательные наборы данных. В сочетании с сайтом связывания анализа обогащения фактора транскрипции пост, ЧИП-Seq прежнему является одним из лучших методов для определения прямого связывания факторов транскрипции с хроматином. Мы в настоящее время используют этот протокол для изучения киназ набора персонала, coregulators и другие факторы транскрипции хроматина в других клеточных линиях, а также с эстрогеном тканей мышей.

Метаболомика
Для успешного метаболического профилирования в клетках рака молочной железы человека, тщательная подготовка проб имеет решающее значение. Количество клеток в состоянии использования и культивирования клеток в этом протоколе является оптимальным для MCF7 клеток. Другие клеточные линии могут потребовать больше или меньше клеток для обнаружения значительного количества метаболитов. Мы получаем около 100 метаболитов в каждом эксперименте. Этот метод ограничен для обнаружения короткоживущих метаболитов или метаболитов, которые присутствуют при низких концентрациях. Этот метод обеспечивает простоту USIнг одного образца приготовительный для идентификации нескольких метаболитов. Мы в настоящее время используют эту методику для выявления эстрогена регулируемых метаболитов в сыворотке крови и различных тканях у мышей.

Интеграция данных
Многочисленные транскриптомика и cistromics исследования были проведены для исследования сигналов эстрогена и регуляции генов в клетках рака молочной железы, в том числе клетки MCF7 2,5-7,20. В этом исследовании впервые, мы добавили данные Метаболомика и попытался сделать вывод сетей обмена веществ, которые непосредственно регулируются ERα на лиганд дополнительно. Этот новый подход позволил нам закрепить точечные молекулярные схемотехника регулируемые эстрогенами, которые влияют на клеточный метаболизм. В целом, наши данные подтверждают роль ERα в качестве главного регулятора биологии рака молочной железы.

Таким образом, мы представили подробный сборник протоколов для генерации РНК-Seq, Обломок-Seq и метаболомики образцов из клеток рака молочной железы после того, как эстроген лечения и Integrтельной анализ данных, полученных из этих -omics подходов. Эти протоколы позволяют исследователям сделать подобный анализ для других факторов транскрипции, лиганды ядерных рецепторов и питательных условий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Университет штата Иллинойс получил Investigator Начатое грант от компании Pfizer Inc. ZME и YCZ получил поддержку от зарплаты этого гранта.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Национального института продовольствия и сельского хозяйства, Министерства сельского хозяйства США, награду Illu-698-909 (ZME) и Pfizer, Inc (ZME). Его содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Министерства сельского хозяйства США.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

Медицина выпуск 109 РНК-Seq транскриптом ЧИП-Seq cistrome метаболомика эстроген рак молочной железы
Системная биология регулирования метаболическим путем эстрогеновых рецепторов Signaling при раке молочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter