Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Systems Biology of Metabolic förordning av östrogenreceptorsignalering i bröstcancer

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832

Abstract

Med tillkomsten av omik närmar vår förståelse av de kroniska sjukdomar som cancer och metabolt syndrom har förbättrats. Det är dock viktigt att upptäcka en effektiv utvinning av informationen i de storskaliga datamängder som erhålls från genuttryck mikroarrayer, djupa sekvense experiment eller metabolisk profilering och sedan effektivt nå de kritiska regulatorer av sjuka celler fenotyper. Östrogenreceptor α (ERa) är en av de huvudtranskriptionsfaktorer som reglerar genen program som är viktiga för östrogenkänsliga bröstcancer. För att förstå att roll ERa signalering i bröstcancer metabolism utnyttjade vi transcriptomic, cistromic och metabolomic data från MCF-7-celler som behandlats med östradiol. I denna rapport har vi beskrivit generation av prover för RNA-Seq, ChIP-Seq och metabolomik experiment och integrerande beräknings analys av erhållna data. Detta tillvägagångssätt är användbar i avgränsar nya mullvadCular mekanismer och gen reglerande kretsar som regleras av en viss transkriptionsfaktor som påverkar metabolismen av normala eller sjuka celler.

Introduction

Östrogener är viktiga regulatorer för många fysiologiska processer i både honor och hanar, inklusive reproduktiva vävnader, metaboliska vävnader, hjärna och ben 1. Förutom positiva effekter på dessa vävnader, östrogener driver också cancer som uppkommer från bröst och reproduktiva vävnader. Östrogener arbetar främst genom ER att inducera celltyp specifika effekter. Djup sekvensering av transkript regleras av ERa hjälp av RNA-Seq och genomet hela ERa DNA-bindningsställen analys med hjälp av chip-Seq visat sig vara användbara för att förstå hur ERa fungerar i olika vävnader och cancer som uppstår från dem. Vi och andra har publicerat genuttrycksprofilerna samband med olika receptorer (ERa vs ERP) 2,3, olika ligander 3-5 och olika coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq är den huvudsakliga metoden att undersöka transkriptom, erbjuder högre precision och effektivitet jämfört med microarray baSED genexpressionsanalys 8. RNA som erhållits från cellinjer 2-4,7, vävnader eller tumörprover sekvens mappas till tillgängliga iska församlingar och differentiellt reglerade gener identifieras. Kromatin Immunoprecipitation (chip) används för att dissekera transkriptionsfaktor och coregulator kromatin binder till kända regulatoriska bindningsställen. Chip-Seq (chip följt av hög genomströmning sekvensering) erbjuder objektiva detektering av globala bindningsställen. Metabolomics är en annan används alltmer systembiologi strategi som kvantitativt åtgärder, dynamisk multiparameter svar av levande system på olika stimuli inklusive kemikalier och genetiska störningar.

Genom att utföra global metabolisk profilering, kan en funktionell avläsning erhållas från celler, vävnader och blod. Dessutom har information från transkriptom experiment inte alltid återspegla de faktiska förändringar i nivån av enzymer som bidrar till biokemiska vägar. Kombineradanalys av transkriptom och Metabolome uppgifter gör att vi kan identifiera och korrelera förändringar i genuttryck med faktiska metabolit förändringar. Utnyttja information från alla dessa storskaliga datamängder ge mekanistiska detaljer att förstå betydelsen av transkriptionsfaktorer som reglerar komplexa biologiska system, särskilt sådana som hänför sig till mänsklig utveckling och sjukdomar som cancer och diabetes.

Den komplicerade karaktären av däggdjursgenomet gör det svårt att integrera och fullt tolka data som erhållits från transkriptom, cistrome och Metabolome experiment. Identifiera funktionella bindande händelser som skulle leda till förändringar i uttryck av målgener är viktigt eftersom när funktionella bindningsställen identifieras; efterföljande analys, inklusive transkription bindning (TF) motiv analys kunde utföras med större noggrannhet. Detta leder till identifiering av biologiskt meningsfulla TF kaskader och mekanismer. Också direkta comparispå av RNA-Seq och Chip-Seq experiment är inte alltid möjligt eftersom data från varje experiment har olika skalor och ljud och i vissa fall menings signaler skyms av befolkningen buller. Vi är inte medvetna om någon studie som integrerad information från dessa tre oberoende men relaterade metoder för att förstå den direkta metabolisk reglering av ERa i bröstcancer. Därför är vårt övergripande mål i detta dokument att relatera produktiva bindande händelser till genuttryck och metabolit förändringar. För att uppnå detta mål, integrerade vi data från RNA-Seq, Chip-Seq och metabolomik experiment och identifierade dem östrogen inducerad ERa bindande händelser som skulle leda till genuttryck förändringar i metaboliska vägar. För första gången erbjuder vi en komplett uppsättning protokoll (Figur 1) för generering av Chip-Seq, RNA-Seq och metabolomik profilering och utföra integrativ analys av data för att avslöja ny gen kretsar reglerar metabolismen av bröstcancercellinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av RNA-Seq prov

  1. Cell Culture och behandling
    1. Odla MCF7-celler i förbättrad MEM (IMEM) plus fenolrött medium med 10% värme inaktiv FBS, 1% penicillin / streptomycin vid 37 ° C i fuktad 5% CO2 atmosfär.
      Obs: Samma cellinje och cellodling förhållanden används under hela studien.
    2. Seed 100.000 MCF7-celler per brunn i 6-brunnsplattor. Har triplikat för varje behandling. På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 2 ml färskt medium med eller utan 10 -8 M E2 till varje brunn. Inkubera plattorna under 24 h i 37 ° C i fuktad 5% CO2 atmosfär.
    3. Att skörda cellerna, tillsätt 1 ml RNA-isolering reagens (syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform) till varje brunn och inkubera under 5 min vid rumstemperatur (RT). Sedan samla cellysatet reagens genom att pipettera och insättning till 1,5 ml rör
  2. RNA-isolering
    1. Tillsätt 200 | il chloroform till 1 ml cellysat reagens (1.1.3) och skaka i 10 sekunder. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min. Centrifugera proverna vid 16.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Efter centrifugering, överför den vattenhaltiga fasen (överst) till ett nytt rör utan att störa de andra faserna.
    2. Tillsätt 500 | il 100% isopropanol till ett nytt rör med den överförda-vattenhaltiga fasen, och blanda genom att vända. Inkubera vid -20 ° C över natten. Centrifugera proverna vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Observera en pellet på botten av röret. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 750 | j, l RNas-fri 70% etanol genom kortvarig virvel.
    3. Centrifugera proverna vid 6000 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och centrifugera provet vid 16.000 xg under 1 min vid 4 ° C för att samla in all återstående etanol. Avlägsna kvarvarande etanol genom pipettering med en gel-laddning spets och ställa rören upp och ner för att lufttorka i 10 min. Lös pelleten i 20-50 pl DEPC behandlat vatten depending på storleken hos pelletsen.
  3. Rena RNA med hjälp av RNA-sanering kit efter protokoll 4. Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometri baserad analys kit efter protokoll 9.
    OBS: OD vid 260 nm tas för att bestämma den RNA-koncentrationen och förhållandet av OD vid 260 nm och 280 nm används för att bestämma renheten hos provet. Det rekommenderas att kontrollera RNA kvalitet med hjälp av Bio-analysator analys.
  4. Ta ca 0,5 till 1 mikrogram renat RNA för sekvensering.
    OBS: Biotech centrum förbereder biblioteken sekvense och utför parade slut läser sekvensering med hjälp av metoder som beskrivs tidigare två.

2. Framställning av Chip-Seq prov

  1. Cell Culture och behandling
    1. Seed 500.000 MCF7-celler per 10 cm platta i tillväxtmedium.
      OBS: För varje dra ner 16 plattor användes. På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 5 ml färskt medium med eller utan 10 -8 M E2 till varjetallrik. Behandla cellerna under 45 min (37 ° C i fuktad 5% CO2 atmosfär).
  2. Tvärbindning och Cell Harvest
    1. Lägg 250 | j, l 37% Formaldehyd i 5 ml medium för att tvärbinda kromatin, inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Sluta tvärbindning genom att tvätta cellerna med 5 ml iskall 1x MEM.
    2. Skörda cellerna i 250 | il Cell Lysis buffert (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-aminoxid) per platta.
  3. Fragmentering av kromatin
    1. Sonikera cellerna i 30 sekunder x 8 vid förstärkare 30 för att nå önskat kromatin storlekar. Kyla varje prov på is efter en ultraljudsbehandling av 30 sek.
    2. Centrifugera vid 16, 000 xg under 10 min vid 4 ° C, och försiktigt pipettera supernatanten utan att störa pelleten i botten.
    3. Ta en 5 | j, l alikvot av supernatanten, och kontrollera DNA-storlek genom elektrofores genom 1,5% agarosgel såsom beskrivits tidigare 10. Den idealiska storlekDNA bör vara mellan 200-500 bp.
  4. kromatin Immunoprecipitation
    1. Spara 25 | il cellysat som indata. I ett 50 ml rör, blanda 4 ml cellysat med 20 ml IP-buffert (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl och 0,5% Triton X), ERa antikropp (500 | il F10 och 500 ^ HC- 20), och 500 | il ProtA och protg protein beläggning magnetiska pärlor. Inkubera blandningen genom rotation vid 4 ° C över natten för att tillåta bildandet av chromatin- antikroppskomplex.
  5. Tvättar och omvänd-tvärbindning
    1. Använda ett magnetiskt stativ för att samla de magnetiska pärlorna på den magnetiserade sidan för att avlägsna tvättbufferten.
    2. Tvätta de magnetiska pärlorna i 25 ml tvättbuffert I (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 01% SDS, 1% Triton X, och 150 mM NaCl). Att tvätta de magnetiska pärlorna utan att störa DNA-proteinkomplex, tillsätt 25 ml tvättbuffert långsamt till röret längs sidan sedan invertera rören tills alla de magnetiska pärlorna blandas väl with tvättbufferten utan uppträder som en pellet. Som ett alternativ, använda rotatorn för att invertera röret. Inte virvel proverna. Tvätta de magnetiska pärlorna med hjälp av samma metod i följande steg.
    3. Tvätta de magnetiska pärlorna i 25 ml Wash-buffert II (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 01% SDS, 1% Triton X, och 500 mM NaCl).
    4. Tvätta de magnetiska pärlorna i 25 ml Wash-buffert III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate och 250 mM LiCl).
    5. Tvätta de magnetiska pärlorna i 25 ml 1 x TE-buffert (1 mM EDTA och 10 mM Tris-HCl) två gånger.
    6. Eluera DNA i 500 pl elueringsbuffert (1% SDS, och 10 mM NaHCOs 3) och sedan fördela 500 l DNA eluering i 4 rör. För DNA från ingångar, eluera DNA i 125 pl Elueringsbuffert.
    7. Inkubera rören vid 65 ° C över natten på ett värmeblock. Täck rören på värmeblocket med aluminiumfolie för att hålla värmen även över alla rören. Placera en vikt på rören för att hålla dem från att öppna. </ Li>
  6. DNA-isolering
    1. Kyla rören vid RT i 5 min. Isolera DNA från rullgardins prover med chip DNA-isoleringskit. Följ anvisningarna från tillverkaren.
      1. Värma upp Eluering buffert vid 65 ° C. Lägg 625 pl bindningsbuffert till varje rör. Om fällningen bildas, lägga till ytterligare 250 pl bindningsbuffert till dess att lösningen är klar.
      2. Ladda provet på kolonnen och centrifugera vid 16.000 xg under 30 sek. Tvätta provet med 250 | il tvättbuffert. Kom ihåg att lägga till etanol till tvättbufferten när första gången du använder den. Upprepa tvätten.
      3. Eluera DNA i 15 | il Elueringsbuffert. Kombinera DNA samma dra ner från 4 rör för att uppnå cirka 55 pl DNA.
    2. Isolera Input-DNA med hjälp av en DNA Purification Kit.
      1. Värma upp Eluering buffert vid 65 ° C. Lägg 625 pl bindningsbuffert i varje rör och inkubera i 10 min. Ladda provet på kolonnen i en 2 ml collectipå röret.
      2. Tvätta provet med 750 | il tvättbuffert, centrifugera vid 16.000 xg under 1 min. Upprepa centrifugering för att avlägsna eventuellt kvarvarande buffert. Eluera DNA i 30 pl EB.
    3. Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en kommersiell Fluorokrom analys med ändring 11.
      1. Späd 20x TE-buffert till 1x TE som analysbufferten för att späda reagens och DNA-prover. Ta 5 pl isolerade DNA och späda ut det i 50 pl i 1x TE.
      2. Från 2 | ig / ml DNA-stamlösning göra en DNA-standard som varierar från tom till en, 10, 100, 1000 | j, g / ml. I en 96-brunnsplatta, fördela 25 | il av varje standard, liksom DNA-utspädning i duplikat. (Triplicate för standard rekommenderas.)
      3. Förbered arbetsreagens genom att göra en 200-faldig utspädning från dsDNA reagens i 1x TE buffert i plaströr. Täck arbetsreagenslösningen med aluminiumfolie för att undvika ljus. Tillsätt 200 l arbetar reagens i varje prov. Icubate vid rumstemperatur under 5 min. Täck plattan med aluminiumfolie för att undvika ljus.
      4. Mäta fluorescens av proverna med användning av en fluorescensplattläsare (excitation vid 480 nm, emission 520 nm). Generera DNA standardkurva för fluorescens kontra DNA-koncentration. Bestämma koncentrationerna av proven baserat på den genererade DNA-standardkurvan.
  7. Kontroll av chip Experiment Använda qPCR
    1. Ta 2 pl isolerade DNA och efter utspädning till 20 pl i vatten. Ställ in qPCR reaktion i tre exemplar genom att blanda 2,5 l DNA utspädning, 5 pl Green I PCR Master Mix, 1 pl primer och 1,5 l nukleas fritt vatten.
    2. Kör qPCR med Fast realtids-PCR-system med hjälp av följande program: Steg 1: 95 ° C under 60 sekunder, steg 2: 95 ° C under 10 sekunder, 60 ° C under 60 sekunder, upprepa steg 2 39 gånger.
  8. Skicka 10 ng DNA-prov till Biotech centrum för sekvensering.
    OBS: Biotech centrum förbereder chip DNA i biblioteken enligt instruktion, och utför en enda läsa sekvense användning av metoder som beskrivs tidigare två.

3. Metabolomics Assay Provframställning

  1. Cell Culture och behandling
    1. Seed 400.000 MCF7-celler per 10 cm platta i tillväxtmedium. För varje behandling förbereda tre prover. Använd två plattor i varje prov för att få tillräckligt med celler för att upptäcka. På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 5 ml färskt medium med eller utan 10 -8 M E2 till cellerna. Behandla cellerna under 24 timmar (37 ° C i fuktad 5% CO2 atmosfär).
  2. Provtagning
    1. Tillsätt 5 ml iskall 1 x PBS till plattan, aspirera PBS efter en kort stund att luta plattan flera gånger. Upprepa två gånger, och ta bort så mycket PBS som möjligt efter den sista tvättningen.
    2. Lägg 750 ul av pre-kall aceton till varje platta och skrapa cellerna. Kombinera cellerna i aceton från två plattor itill ett 2 ml rör på is.
    3. Celltal för normalisering
      1. För varje behandling, använda två extra plattor för cell kvantifiering. Att de-fästa cellerna från plattan, tillsätt 2 ml HE-buffert (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCOs 3, och 1 mM EDTA) till varje platta och inkubera i 5 min.
      2. Samla in och blanda väl cellerna genom att pipettera celler i HE-buffert. Använd totalt 20 l cell lösning för att räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.
  3. Förvara proverna vid -80 ° C innan den skickas till Metabolomics centrum för att identifiera och kvantifiera de metaboliter med användning av gaskromatografi masspektrometri (GC-MS) analys.

4. integrativ Analys

  1. RNA-Seq Dataanalys:
    1. Utför kvalitetskontroll av FASTQ filer med FastQC: Läs QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Välj FastQC: Läs under verktyg för NGS: QC och manipulation. Överför rådatafilen från nuvarande history.
        OBS: Det rekommenderas att ge en titel för utdatafilen att påminna dig vad jobbet var för eftersom det kan finnas flera utgångar.
    2. Verkställa och utdatafilen visas under historia. Upprepa samma procedur för varje sekvens fil. Trim adaptrar använder Clip enligt NGS: FASTX Toolkit.
    3. Justera läser till hg19 använder Tophat2 med RefSeq genomet referens anteckning 12 (standardvärden).
      1. Välj Tophat2 enligt verktyg av NGS: RNA-analys. Ange biblioteket parade typ (single-end vs parade slut).
      2. Ladda ingångs FASTQ fil från det aktuella historia. Välja referens genomet. Välja standardinställningar. Eller använda hela parameterlistan för att ändra.
      3. Kör och det kommer att producera två utdatafiler: en är UCSC BED reda på korsningar; en annan är en lista över lästa anpassningar i BAM-format.
    4. Överför BAM-filer till sekvensedataanalys verktyg. Beräkna uttryck värden med Quantförgasning Tool.
    5. Identifiera differentiellt uppregleras gener med hjälp av Expression Analysis Tool med standardvärden och faldig förändring> 2 och p-värde <0,05. Likaså identifiera differentiellt ned-reglerade gener med hjälp av Expression Analysis Tool med standardvärden och faldig förändring <0,5 och p-värde <0,05.
  2. Chip-Seq Dataanalys:
    1. Rikta FASTQ Läser till hg19 använder Bowtie2 13 (standardvärden) i Galaxy.
      1. Välj Bowtie2 under verktyg för NSC: Mapping. Kontrollera om biblioteket är mate-parade (single-end vs parade slut). Överför FASTQ fil från nuvarande historia.
      2. Välja referens genomet. Använd standardparameterinställningar. Kör och det kommer att producera utdatafilen med mappade sekvens lydelse BAM fil. Upprepa proceduren för varje sekvens fil.
    2. Identifiera toppar med användning av MACS 14 ett p-värde cutoff av 6.0e-7 och FDR av 0,01, såsom tidigare beskrivits 2.
    3. Metabolomics Dataanalys:
      1. Konvertera kemiska namn metaboliter KEGG_IDs.
      2. Identifiera differentiellt reglerade metaboliter genom att jämföra nivåer detekterade i Fordon vs. E2-behandlade prov (en 2-faldig cut-off användes i denna studie).
    4. Integrativ Analys:
      1. Identifiera gener som har ERa- bindningsställen med hjälp av sekvenseringsdataanalys verktyg. Översätt Region gener funktionen med 20 kb som avstånd cut-off.
      2. Identifiera differentiellt upp- och nedregleras gener från RNA-Seq dataanalys med hjälp av faldig förändring> 2 och faldig förändring <0,5, respektive med p-värdet <0,05 som avskurna. Jämför med listan över ERa- bindningsställe som innehåller gener som använder Venndiagram jämförelse.
      3. Använd den här listan för att identifiera E2 module metaboliska vägar med hjälp av Metscape 15 modul av Cytoscape.
        1. Genom att välja Metscape modul från appar, välja Bygg nätverk och sedan pathway-based alternativ.
        2. Välj Organism (Human). Välj datafilen av E2 oreglerat förening lista (Kegg ID) samt E2 uppreglerat gen lista.
        3. Välj Förening -Reaction -Enzyme-Gene som nätverkstypen. Välj förening / gener som frågan.
        4. Bygga nätverk. Upprepa använda E2 nedregleras förening och gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

transkriptomik
För att analysera differentiellt uttryckta gener genom E2 behandling, valde vi att utföra en RNA-Seq experiment. Förutom att ge information om mRNA-nivåer, kan RNA-Seq uppgifter också användas för att övervaka förändringar i icke-kodande RNA (långa icke-kodande RNA, mikroRNA) och alternativa splitsningshändelser. Vi har inte lämnat information om analyser av icke-kodande RNA eller alternativt transkriberade gener, eftersom omfattningen av vår studie är att identifiera proteinkodande gener som är viktiga för metabolisk reglering. Dock är RNA-Seq ett utmärkt sätt att få information om differential genuttryck händelser.

För att erhålla hög kvalitet läser, är det viktigt att få hög renhet RNA. Efter isolering av RNA vi renade RNA med hjälp av en RNA städa upp kit. Tyvärr nästan 50% av RNA går förlorad under denna process och mängd start RNA bör tas i cn behandling för att erhålla önskad mängd (100-500 ng) vid slutet av reningssteg.

Vi kvantifierade RNA avkastning med hjälp av fluorometer RNA HS-analys, som är mycket exakt och är föredragen metod för kvantifiering av låga överflöd RNA. Därefter tillsattes integriteten och övergripande kvaliteten på de RNA-prover undersöktes med användning av bioanlayzer, som är ett livskraftigt alternativ till gelelektrofores med användning av en minimal mängd av RNA. Analysen visar alla prover har skarpa och rena band av 18S och 28S rRNA som anger integriteten och renheten av proverna (figur 2b). RNA Integrity Number (RIN) användes som en standard för RNA kvalitetskontroll. RIN 10 indikerar intakt RNA, RIN 6 delvis nedbrutna och RIN3 försämras kraftigt 16.

Det rekommenderas att RIN att vara minst 7 för sekvensering experiment. Alla våra RNA-prov fick RIN värde mellan 9,6-9,9 <strong> (Figur 2A). Sekvense bibliotek konstruerades från 500 ng av hög kvalitet RNA från varje prov med hjälp av extremt hög genomströmning sekvenseringssystem såsom Illumina 2500. I genomsnitt 18 miljoner hög kvalitet sekvensering läser erhölls för varje prov (tabell 1), som var redo för nedströms analys. För att kontrollera den övergripande kvaliteten på hög genomströmning sekvens rådata, var FastQC kördes för varje prov är läser. Ett representativt FastQC rapport för ett fordon RNA-Seq data (Figur 3). Sekvenslängden av de mest läser var ca 100 bp (figur 3A). För varje läsning, kvalitetspoängen var 32-34 för första 5 bp och 36-38 från 6-100bp (Figur 3B). Bland 17.990.863 läser genereras från detta prov, de flesta av dem hade kvalitet poäng högre än 34 (figur 3C). Innehållet GC per läsning i sekvensen följde också normalfördelningen med ett genomsnitt på 48% GC. Övergripande kvalitetenställningen av läser var mycket hög.

Cistromic analys av ERa- bindningsställen
För att uppnå den effektiva djup sekvensering, erhållande av DNA-fragment vid önskvärd storlek är en av de viktiga faktorerna. Nuvarande sekvense metoder kan ha olika krav på DNA-fragment, t ex 300-600 bp för ultrahög genomströmning sekvenseringssystem, 100-200 bp för AB / fast 17. I detta experiment de flesta av de DNA-fragment är mellan 300 bp och 600 bp som visas på gelén (Figur 4). Som ett alternativ, kan läsarna valde att förbereda sin kromatin använder MNas matsmältningen, men vi känner vår etablerade protokoll ger de nödvändiga prover med hög kvalitet och ger reproducerbara resultat. Tio ng DNA från varje behandling och dess motsvarande ingång prov framställdes i EB-buffert. Chipet DNA var singel lästa sekvenseras med användning ultrahög genomströmning sekvenseringssystem. ChIP DNA-prover gav ca20.000.000 läser medan ingångs DNA gav mer än 35.000,000 läser (tabell 1).

metabolomics
För att kvantifiera de metaboliter i däggdjursceller med hjälp av GCMS, åtminstone 10 mikrogram av cellmassa krävs. Vi började med 400.000 MCF7-celler med experimenten. Vid tiden för skörd, fanns det cirka 500.000 celler i varje platta. Översikten över de metaboliter som representeras av toppar jämfördes mellan kontrollen och Estradiol behandlade provet (Figur 5). Cirka 100 metaboliter identifierades, som räknas för 60% av den totala kända i däggdjur. Här presenterar vi en lista över de 10 metaboliter, som visar betydande förändringar i E2 behandling (tabell 2). Sammantaget E2 uppreglerade vägar inklusive fruktos och mannos metabolism, histidin metabolism, purinmetabolism, kolesterolbiosyntesen och vitamin B3 metabolism. De nedregleras vägar var butanoat metabolism, de novo fettsyra biosyntes syra, pentosfosfatvägen, ureacykeln och metabolism av arginin (Tabell 3).

Dataanalys och integration
Data från RNA-Seq, ChIP-Seq och GC-MS bearbetades och analyserades genom en serie steg (Figur 6). Efter jämförelse mellan gener som identifierades i RNA-Seq och Chip-Seq, en uppsättning av upp-regleras och en uppsättning av nedreglerade gener genom Estradiol extraherades. Från de metaboliska data vi erhöll två uppsättningar av upp- och ned-reglerade föreningar genom Estradiol behandling. Nästa vi använde Metscape, en app för Cytoscape, att visualisera och tolka genuttryck och metaboliska uppgifter i samband med människans ämnesomsättning 15. Först valde vi att inkludera delar av föreningen, reaktion, enzym, och genen i nätverket. Vi valde de föreningar / gener som fråga och två nät av E2 uppreglering (figur 7A) och nedåt-Förordning (Figur 7B) visades. Den Metscape ger också en möjlighet att bygga nätverk på selektiva vägar. Till exempel, genom att använda samma uppsättning data som bygga nedregleras övergripande nätverk, var en subnät av androgen-östrogensyntesen och metabolism väg genereras genom att byta frågan från föreningen / genen till specifik väg. Generna eller föreningar med betydande förändringar belystes i ljusare färg. Förutom att välja en specifik väg från rullgardinsfönster som beskrivs, kan man också skapa en sub-nätverk genom att tillämpa "skapa subnät" -funktion för att det valda området. Såsom visas i fig 6A och B, ERa aktivering och direkt bindning till genreglerande regioner påverkade många metaboliska vägar i bröstcancerceller. Vår integrativ analys visade att direkt binder ERa till och reglerar uttrycket av FASN genen, vilket är viktigt för de novo fettsyra biosyntesen syravägen (Figure 7C). Dessutom E2 behandling nedregleras androgen östrogenbiosyntes vägar genom att undertrycka uttryck av CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 och GSTM2 i dessa vägar.

Figur 1
Figur 1: Workflow för beredning av prover av RNA, DNA och cellysat för RNA-Seq, ChIP-Seq, och metabolomic analys.

figur 2
Figur 2:. Ett representativt elektroferogram av RNA analyseras med Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Integrity Number (RIN), indikator för RNA kvalitet, gavs av analysen som 9,9. (A) på en virtuell gel bild av RNA-provet båda banden av 26S och 18S är vassa. (B) Fluorescerande signaler från enskilda spår i than RNA visar att intensiteten av 28S topp är större än 18S topp och ingen kontaminering ses. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. En representativ granskning på de RNA-Seq rådata Ett av fordonets provets sekvensdata analyserades med användning FastQC. (A) Sekvenslängden fördelning av biblioteket som är 100 bp. (B) Den kvalitetsresultat längs positionen i läsning. (C) Kvaliteten poäng per sekvens visade universell hög kvalitet på alla sekvenser. (D) Innehållet GC per läsning matchas den teoretiska fördelningen. Klicka här för att se en larger version av denna figur.

figur 4
Figur 4: Gelelektrofores av de sonikerade kromatin fragment 5 ul av cellysatet från varje prov kördes på en 1,5% agarosgel med ett 1000 bp plus stege på den första banan.. Majoriteten av fragmenten är mellan 300 och 600 bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Den översikt av toppar som representerar metaboliter från GC-MS Det övre fältet visar topparna som identifieras i de E2 behandlade prover, medan den nedre panelen från kontrollen. Det område som avgränsas var roomed i att visa exakt metabolit som representeras av varje p eak. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Flödesschema för integrativ klustringsmetod.

figur 7
Figur 7: visualisering av integrerade gen-metabolit data i Metscape (A) Nätverket av vägar uppregleras av E2.. (B) Nätverket av vägar nedregleras av E2. (C) E2 stimulerade ERa rekrytering till den närliggande regionen FASN, som visar sig vara reglerad i de novo fettsyra biosyntes nätverk genereras genom applicering subnät funktion.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bord 1
Tabell 1: Sammanfattning av ultra-high-throughput sekvensering av RNA-Seq och Chip-Seq.

tabell 2
Tabell 2: Lista över topp 10 metaboliter med betydande förändringar med E2 behandling.

tabell 3
Tabell 3: Pathways upp- och nedregleras av E2-behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta dokument beskrivs vi generationen och integrativ analys av RNA-Seq, ChIP-Seq och metabolomik data från MCF-7-celler som behandlas med E2. Vi utvecklade en uppsättning protokoll strategizing att utnyttja de mest effektiva metoderna och användarvänliga mjuka varor som producerar biologiskt relevant upptäckt. Såvitt vi vet är vår första studie för att integrera omik data från tre olika analyser och identifierade nya metaboliska vägar som ERa direkt regleras i bröstcancerceller.

transkriptomik
Det är kritiskt att börja med hög kvalitet RNA för en lyckad transcriptomic analys. God praxis kommer att eliminera risken för RNA-nedbrytning, inklusive att skapa RNas-fritt bänk, ändra handskar ofta, lagring i -80 ° C och hålla på is under användning. Tillsättning av inkubation över natten vid -20 ° C förbättrar RNA återhämtning. För att undvika frysning och upptining RNA upprepade gånger kan man fördela RNA för efterföljande procedures upon isolering och rening. För existensen av sekvenseringsfel, är QRT-PCR med användning av cDNA från proverna ofta utförs för att verifiera de differentiellt uttryckta gener som identifierades i RNA-Seq. Därför bör tillräckligt RNA reserveras för detta ändamål. Vi utför parade slutet sekvense som gör det möjligt för oss att analysera splitsvarianter, icke-kodande RNA och miRNA. För att undvika hög sekvense kostnader, kan single-end sekvensering utföras också. Jämfört med mikroarrayer är RNA-Seq känsligare och är inte begränsad till de prober som tillhandahålls på chipet. Vi få information inte bara om kodande sekvenser, men även icke-kodande gener och differentiellt splitsade transkript. Vi använder för närvarande denna teknik för att analysera transcriptomes av olika cellinjer efter ligand behandlingar samt vävnaderna från mus experiment.

Cistromics
Ultra-hög genomströmning sekvenseringsmetoden kräver minimal 5 ng ChIP DNA för bibliotekskonstruktion. I standard ChIP-Seq protokoll 18, är det rekommenderas att ha åtminstone 10 ng. Kvantifiering med fluorometri är kritisk. I detta protokoll använde vi dubbelsträngad analys DNA upptäckt att bestämma DNA-koncentrationen. Man kan också använda fluorometer analys för exakt DNA kvantifiering. För skillnader i utrustning och material, är det mycket viktigt för varje labb att upprätta sin egen ultraljudsbehandling protokoll, som genererar önskvärda DNA-fragment storlekar. Över skjuvning av chip DNA kan orsaka förlust av anrikning av mål-DNA, medan Chip DNA stora storlekar skapar problem för effektiv sekvensering. Innan du skickar DNA sekvensering, är det alltid viktigt att kontrollera anrikning av vissa kända områden av qPCR. Tekniken är fortfarande begränsad av effektiviteten och specificiteten av antikroppen som används för immunoutfällningar. För att få bindningsställe information som kan användas på ett tillförlitligt sätt i jämförande analyser, vi validera våra reagenser efter Koda Chip-Seq standarder, 19 och användning standardized protokoll som ger oss konsekventa datamängder. Kopplad med posttranskriptionsfaktor bindningsställe anrikning analysen, är ChIP-Seq fortfarande en av de bästa metoderna för att bestämma direkt bindning av transkriptionsfaktorer till kromatin. Vi använder för närvarande detta protokoll för att studera rekrytering kinaser, coregulators och andra transkriptionsfaktorer till kromatin i andra cellinjer samt östrogenkänsliga mus vävnader.

metabolomics
För en framgångsrik metabolisk profilering i humana bröstcancerceller, är en noggrann provberedning kritisk. Mängden celler i användning och cellodlings tillstånd i detta protokoll är optimalt för MCF7-celler. Andra cellinjer kan kräva mer eller mindre celler för detektering av ett stort antal metaboliter. Vi får cirka 100 metaboliter i varje experiment. Denna metod är begränsad för detektering av kortlivade metaboliter eller metaboliter som är närvarande vid låga koncentrationer. Denna metod ger enkel using ett enda prov prep att identifiera flera metaboliter. Vi använder för närvarande denna teknik för att identifiera östrogen reglerade metaboliter i serum och olika vävnader från mus.

Data Integration
Talrika transkriptomik och cistromics studier gjordes för att undersöka östrogen signalering och genreglering i bröstcancerceller, inklusive MCF7-celler 2,5-7,20. I denna studie, för första gången, har vi lagt metabolomik uppgifter och försökte dra slutsatsen metaboliska nätverk som direkt regleras av ERa vid ligand tillägg. Denna nya metod det möjligt för oss att sällade molekylära krets regleras av östrogener som påverkar cellulär metabolism. Sammantaget stöder våra resultat roll ERa som en mästare regulator av bröstcancer biologi.

Sammanfattningsvis, vi gav en detaljerad sammanställning av protokoll för generering av RNA-Seq, ChIP-Seq och metabolomik prover från bröstcancerceller efter östrogenbehandlingar och integrtivt analys av de data som erhållits från dessa omik metoder. Dessa protokoll gör det möjligt för forskare att göra liknande analys för andra transkriptionsfaktorer, nukleära receptorligander och näringsförhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

University of Illinois fick en forskarinitierade bidrag från Pfizer Inc. ZME och YCZ fick lön stöd från detta bidrag.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, utmärkelse ILLU-698-909 (ZME) och Pfizer, Inc (ZME). Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter US Department of Agriculture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

Medicin RNA-Seq transkriptom Chip-Seq cistrome metabolomik östrogen bröstcancer
Systems Biology of Metabolic förordning av östrogenreceptorsignalering i bröstcancer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter