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Medicine

एस्ट्रोजन रिसेप्टर संकेतन द्वारा मेटाबोलिक नियमन की सिस्टम्स बायोलॉजी स्तन कैंसर में

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832

Abstract

-omics के आगमन के साथ कैंसर और उपापचयी सिंड्रोम जैसे पुराने रोगों के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है दृष्टिकोण। हालांकि, बड़े पैमाने पर डेटासेट में जानकारी है कि जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन, गहरी अनुक्रमण प्रयोगों या चयापचय की रूपरेखा से प्राप्त कर रहे हैं के प्रभावी खनन उजागर करने के लिए आवश्यक है और तब प्रभावी रूप से रोगग्रस्त सेल phenotypes के महत्वपूर्ण नियामकों लक्ष्य। एस्ट्रोजन रिसेप्टर α (ERα) जीन कार्यक्रमों है कि एस्ट्रोजन उत्तरदायी स्तन कैंसर के लिए महत्वपूर्ण हैं विनियमन के मास्टर प्रतिलेखन कारकों में से एक है। आदेश ERα स्तन कैंसर के चयापचय में संकेत की भूमिका को समझने के लिए हम MCF 7 कोशिकाओं एस्ट्राडियोल के साथ इलाज से, transcriptomic cistromic और metabolomic डेटा का उपयोग किया। इस रिपोर्ट में हम शाही सेना Seq, चिप Seq और metabolomics प्रयोगों और प्राप्त आंकड़ों के एकीकृत कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए नमूनों की पीढ़ी का वर्णन किया। यह दृष्टिकोण उपन्यास तिल का वर्णन करने में उपयोगी हैcular तंत्र और जीन नियामक सर्किट है कि एक विशेष प्रतिलेखन कारक द्वारा विनियमित रहे हैं जो प्रभावों सामान्य या रोगग्रस्त कोशिकाओं के चयापचय।

Introduction

एस्ट्रोजेन दोनों महिलाओं और प्रजनन ऊतकों, चयापचय ऊतकों, मस्तिष्क और हड्डी 1 सहित पुरुषों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों हैं। इन ऊतकों में लाभकारी प्रभाव के अलावा, एस्ट्रोजेन भी कैंसर है कि स्तन और प्रजनन ऊतकों से उत्पन्न होती हैं ड्राइव। एस्ट्रोजेन मुख्य रूप से सेल प्रकार विशिष्ट प्रभाव प्रेरित करने के लिए ईआर के माध्यम से काम करते हैं। शाही सेना Seq और जीनोम चौड़ा ERα डीएनए बाध्यकारी साइटों चिप Seq का उपयोग कर विश्लेषण का उपयोग ERα द्वारा विनियमित टेप की गहरी अनुक्रमण समझने के लिए कैसे ERα विभिन्न ऊतकों और कैंसर है कि उनमें से उठता में काम करता है उपयोगी साबित हुई। हम और दूसरों जीन अभिव्यक्ति (बनाम ERβ ERα) विभिन्न रिसेप्टर्स के साथ जुड़े प्रोफाइल 2,3, विभिन्न ligands 3-5 और विभिन्न coregulators 2,4,6,7 प्रकाशित किया है।

शाही सेना Seq transcriptome जांच करने के लिए, उच्च परिशुद्धता और दक्षता की पेशकश मुख्य विधि है माइक्रोएरे बीए की तुलनाएसईडी जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 8। सेल लाइनों 2-4,7, ऊतकों या ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त आरएनए अनुक्रम कर रहे हैं, उपलब्ध जीनोमिक विधानसभाओं के लिए मैप और विभिन्न विनियमित जीन की पहचान कर रहे हैं। Chromatin immunoprecipitation (चिप) प्रतिलेखन कारक और coregulator क्रोमेटिन जाना जाता नियामक बाध्यकारी साइटों के लिए बाध्य काटना के लिए कार्यरत है। चिप Seq (चिप उच्च throughput अनुक्रमण के बाद) वैश्विक बाध्यकारी साइटों की निष्पक्ष पता लगाने प्रदान करता है। Metabolomics एक और तेजी से किया प्रणाली जीव विज्ञान दृष्टिकोण है, जो मात्रात्मक उपायों, रसायन और आनुवंशिक perturbations सहित विभिन्न उत्तेजनाओं को रहने वाले सिस्टम के गतिशील multiparametric प्रतिक्रिया है।

वैश्विक चयापचय की रूपरेखा प्रदर्शन करके, एक कार्यात्मक readout से कोशिकाओं, ऊतकों, और रक्त प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, transcriptome प्रयोगों से जानकारी हमेशा एंजाइमों कि जैव रासायनिक रास्ते में योगदान के स्तर में वास्तविक परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करते। संयुक्तtranscriptome और metabolome आंकड़ों के विश्लेषण की पहचान करने और वास्तविक मेटाबोलाइट परिवर्तन के साथ जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए हमें सक्षम बनाता है। इन बड़े पैमाने पर डेटासेट यंत्रवत विवरण प्रदान सभी जानकारी दोहन जटिल जैविक प्रणालियों, खासकर कि मानव विकास और कैंसर और मधुमेह जैसी बीमारियों से संबंधित विनियमित करने प्रतिलेखन कारकों की भूमिका को समझते हैं।

स्तनधारी जीनोम की जटिल प्रकृति यह चुनौतीपूर्ण एकीकृत और पूरी तरह से डेटा transcriptome, cistrome और metabolome प्रयोगों से प्राप्त व्याख्या करने के लिए बनाता है। कार्यात्मक बाध्यकारी घटनाओं है कि परिवर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि एक बार कार्यात्मक बाध्यकारी साइटों की पहचान कर रहे पहचान करना; विश्लेषण आगामी, प्रतिलेखन बंधन (टीएफ) के मूल भाव के विश्लेषण सहित, उच्च सटीकता के साथ किया जा सकता है। यह जैविक रूप से सार्थक टीएफ cascades और तंत्र की पहचान हो जाती है। इसके अलावा प्रत्यक्ष comparisके बाद से एक प्रयोग से डेटा तराजू और शोर भिन्न और कुछ मामलों में सार्थक संकेतों आबादी शोर से छिप कर रहे हैं शाही सेना Seq और चिप Seq प्रयोगों के पर हमेशा संभव नहीं हैं। हम किसी भी अध्ययन है कि इन तीन स्वतंत्र लेकिन संबंधित दृष्टिकोण से जानकारी स्तन कैंसर में ERα द्वारा प्रत्यक्ष चयापचय विनियमन समझने के लिए एकीकृत के बारे में पता नहीं कर रहे हैं। इसलिए, इस पत्र में हमारे समग्र लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति और मेटाबोलाइट परिवर्तन करने के लिए उत्पादक बाध्यकारी घटनाओं से संबंधित है। आदेश में इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए हमें शाही सेना Seq, चिप Seq और metabolomics प्रयोगों से डेटा एकीकृत और उन एस्ट्रोजन प्रेरित ERα बाध्यकारी घटनाओं है कि चयापचय मार्ग में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व करेंगे की पहचान की। पहली बार के लिए, हम स्तन के चयापचय को विनियमित करने उपन्यास जीन सर्किट को उजागर करने के लिए चिप Seq, शाही सेना Seq और metabolomics प्रोफाइलिंग पैदा करने और डेटा का एकीकृत विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का एक पूरा सेट प्रदान करते हैंकैंसर कोशिका लाइनों।

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Protocol

1. शाही सेना Seq नमूनों की तैयारी

  1. सेल संस्कृति और उपचार
    1. संस्कृति में सुधार सदस्य (IMEM) प्लस 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 1% पेनिसिलिन / humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ फिनोल लाल माध्यम में MCF7 कोशिकाओं।
      नोट: एक ही सेल लाइन और सेल संस्कृति हालत अध्ययन के दौरान प्रयोग किया जाता है।
    2. 6 अच्छी तरह प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति बीज 100,000 MCF7 कोशिकाओं। प्रत्येक उपचार के लिए triplicates है। 3 दिन, मध्यम हटाने और के साथ या प्रत्येक के लिए 10 -8 एम E2 के बिना अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़ें। Humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस में 24 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं।
    3. कोशिकाओं फसल के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर शाही सेना अलगाव अभिकर्मक (एसिड guanidinium thiocyanate फिनोल के क्लोरोफॉर्म) जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट (आरटी) के लिए सेते हैं। फिर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में pipetting और जमा द्वारा सेल lysate अभिकर्मक इकट्ठा
  2. आरएनए अलगाव
    1. 200 μl chlorofo जोड़े1 मिलीलीटर सेल lysate अभिकर्मक (1.1.3) और 10 सेकंड के लिए भंवर करने के लिए RM। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं। Centrifugation के बाद, अन्य चरणों के बिना परेशान एक नया ट्यूब जलीय चरण (ऊपर) हस्तांतरण।
    2. स्थानांतरित कर जलीय चरण के साथ एक नया ट्यूब 500 μl 100% isopropanol जोड़ें, और inverting द्वारा मिश्रण। -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। ट्यूब के नीचे एक गोली का निरीक्षण करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और संक्षिप्त भंवर से 750 μl RNase मुक्त 70% इथेनॉल के साथ गोली धोने।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने हैं। सतह पर तैरनेवाला निकालें, और नमूना सभी शेष इथेनॉल इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र। शेष इथेनॉल pipetting द्वारा 10 मिनट के लिए हवा शुष्क करने के लिए ऊपर की ओर एक जेल लोडिंग टिप के साथ निकालें और नीचे नलियों निर्धारित किया है। निर्भरता 20-50 μl DEPC इलाज पानी में गोली भंगडिंग छर्रों के आकार पर।
  3. शाही सेना शुद्ध प्रोटोकॉल 4 निम्न आरएनए साफ-अप किट का उपयोग। आरएनए एकाग्रता उपाय प्रोटोकॉल 9 के बाद एक fluorometry आधारित परख किट का उपयोग।
    नोट: 260 एनएम पर आयुध डिपो के 260 एनएम पर आरएनए एकाग्रता और आयुध डिपो के अनुपात का निर्धारण करने के लिए लिया जाता है और 280 एनएम नमूना की शुद्धता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह शाही सेना गुणवत्ता जैव विश्लेषक परख का उपयोग कर जाँच की सिफारिश की है।
  4. अनुक्रमण के लिए लगभग 0.5 करने के लिए 1 ग्राम शुद्ध शाही सेना ले लो।
    नोट: जैव प्रौद्योगिकी केन्द्र अनुक्रमण पुस्तकालयों तैयार करता है और करता है बनती अंत में पहले 2 विस्तृत तरीकों का उपयोग कर अनुक्रमण पढ़ें।

2. चिप Seq नमूना की तैयारी

  1. सेल संस्कृति और उपचार
    1. बीज मध्यम विकास में प्रति 10 सेमी की थाली 500,000 MCF7 कोशिकाओं।
      नोट: प्रत्येक नीचे खींचने के लिए 16 प्लेटों का इस्तेमाल किया गया था। 3 दिन, मध्यम हटाने और के साथ या प्रत्येक के लिए 10 -8 एम E2 बिना 5 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़नेथाली। 45 मिनट (humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए कोशिकाओं को समझो।
  2. Crosslink और सेल हार्वेस्ट
    1. 5 मिलीलीटर माध्यम में 250 μl 37% formaldehyde जोड़े क्रोमेटिन crosslink करने के लिए, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 5 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे 1x सदस्य के साथ कोशिकाओं को धोने से crosslinking बंद करो।
    2. 250 μl सेल बफर (10 मिमी EDTA, 50 मिमी त्रि एचसीएल, 1% एसडीएस, 0.5% एन एन dimethyldodecan-1-एमाइन ऑक्साइड) प्रति प्लेट में कोशिकाओं फसल।
  3. Chromatin की विखंडन
    1. 30 amp पर 30 सेकंड के एक्स 8 के लिए कोशिकाओं Sonicate आवश्यक क्रोमेटिन आकार तक पहुँचने के लिए। 30 सेकंड के एक sonication के बाद बर्फ पर प्रत्येक नमूना शांत।
    2. 16 पर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 000 XG, और ध्यान से नीचे गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला पिपेट।
    3. सतह पर तैरनेवाला के एक 5 μl विभाज्य ले लो, और के रूप में पहले 10 में वर्णित 1.5% agarose जेल के माध्यम से वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए आकार की जाँच करें। आदर्श आकारडीएनए के 200-500 बीपी के बीच होना चाहिए।
  4. chromatin immunoprecipitation
    1. इनपुट के रूप में सेल lysate के 25 μl बचाओ। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 20 मिलीलीटर आईपी बफर (2 मिमी EDTA, 100 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris एचसीएल, और 0.5% ट्राइटन X), ERα एंटीबॉडी (500 μl F10 और 500 μl के साथ सेल lysate के 4 मिलीलीटर मिश्रण HC- 20), और 500 μl ProtA और protg प्रोटीन चुंबकीय मोती कोटिंग। chromatin- एंटीबॉडी परिसर के गठन की अनुमति 4 डिग्री सेल्सियस रात भर बारी-बारी से मिश्रण सेते हैं।
  5. Washes और रिवर्स crosslinking
    1. धो बफर दूर करने के लिए चुम्बकीय तरफ चुंबकीय मोती को इकट्ठा करने के लिए एक चुंबकीय स्टैंड का प्रयोग करें।
    2. 25 मिलीलीटर धो बफर में चुंबकीय मोती धो रहा (2 मिमी EDTA, 20 मिमी Tris एचसीएल, 01% एसडीएस, 1% ट्राइटन X, और 150 मिमी NaCl)। अच्छी तरह से, डीएनए प्रोटीन परिसरों के बिना परेशान चुंबकीय मोती धोने जोड़ने के 25 मिलीलीटर धोने पक्ष के साथ ट्यूब के लिए धीरे-धीरे बफर तो ट्यूबों पलटना जब तक सभी चुंबकीय मोती मिश्रित अच्छी तरह से वाई रहे हैंएक गोली के रूप में प्रदर्शित होने के बिना धो बफर वें। एक विकल्प के रूप में, ट्यूब पलटना रोटेटर का उपयोग करें। नमूने भंवर मत करो। निम्न चरणों में ही विधि का उपयोग चुंबकीय मोती धो लें।
    3. 25 मिलीलीटर धो बफर द्वितीय (2 मिमी EDTA, 20 मिमी Tris एचसीएल, 01% एसडीएस, 1% ट्राइटन X, और 500 मिमी NaCl) में चुंबकीय मोती धो लें।
    4. 25 मिलीलीटर धो बफर III में चुंबकीय मोती धो (1.6 मिमी EDTA, 10 मिमी Tris एचसीएल, 1% एनपी 40, 1% Dexycholate और 250 मिमी LiCl)।
    5. 25 मिलीलीटर 1x ते बफर (1 मिमी EDTA, और 10 मिमी Tris एचसीएल) में दो बार में चुंबकीय मोती धो लें।
    6. 500 μl क्षालन बफर में डीएनए Elute (1% एसडीएस, और 10 मिमी NaHCO 3) और फिर 4 ट्यूबों में 500 μl डीएनए क्षालन का आवंटन। आदानों से डीएनए के लिए, 125 μl क्षालन बफर में डीएनए elute।
    7. एक हीटिंग ब्लॉक पर रातोंरात 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ हीटिंग ब्लॉक पर ट्यूबों कवर भी सभी ट्यूबों से अधिक गर्मी रखने के लिए। उन्हें खोलने से रखने के लिए ट्यूब पर एक वजन रखें। </ Li>
  6. डीएनए अलगाव
    1. 5 मिनट के लिए आरटी पर नलियों कूल। नमूने नीचे खींच चिप डीएनए अलगाव किट का उपयोग करने से डीएनए अलग। निर्माता से निर्देशों का पालन करें।
      1. 65 डिग्री सेल्सियस पर क्षालन बफर गर्म। प्रत्येक ट्यूब बाध्यकारी बफर 625 μl जोड़ें। अगर वेग रूपों, एक और 250 μl बाध्यकारी बफर जोड़ने जब तक समाधान स्पष्ट है।
      2. 30 सेकंड के लिए 16,000 XG पर स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज पर नमूना लोड। 250 μl धो बफर के साथ नमूना धो लें। जब पहली बार इसका इस्तेमाल करने के लिए धोने बफर के लिए इथेनॉल जोड़ने के लिए याद रखें। धोने दोहराएँ।
      3. 15 μl क्षालन बफर में डीएनए Elute। गठबंधन उसी के डीएनए 4 ट्यूब से नीचे खींच चारों ओर 55 μl डीएनए हासिल करने के लिए।
    2. इनपुट डीएनए एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग अलग।
      1. 65 डिग्री सेल्सियस पर क्षालन बफर गर्म। प्रत्येक ट्यूब में 625 μl बाध्यकारी बफर जोड़ें और 10 मिनट के लिए सेते हैं। एक 2 मिलीलीटर collecti में स्तंभ पर नमूना लोडट्यूब पर।
      2. 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर 750 μl धो बफर, सेंट्रीफ्यूज के साथ नमूना धो लें। किसी भी शेष बफर दूर करने के लिए centrifuging दोहराएँ। ईबी के 30 μl में डीएनए Elute।
    3. डीएनए एकाग्रता संशोधन 11 के साथ एक वाणिज्यिक Fluorochrome परख का उपयोग उपाय।
      1. अभिकर्मक और डीएनए के नमूने गिराए के लिए परख बफर के रूप में 1x ते में 20x ते बफर पतला। 5 μl पृथक डीएनए लो और 1x ते में 50 μl में पतला।
      2. 2 माइक्रोग्राम / एमएल डीएनए शेयर समाधान से एक डीएनए खाली से 1, 10, 100, 1000 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से लेकर मानक बनाते हैं। एक 96 अच्छी तरह से थाली में, दो प्रतियों में डीएनए कमजोर पड़ने प्रत्येक मानक के 25 μl के साथ ही आवंटित। (मानक के लिए तीन प्रतियों की सिफारिश की है।)
      3. प्लास्टिक ट्यूब में 1x ते बफर में dsDNA अभिकर्मक से 200 गुना कमजोर पड़ने बनाकर काम कर अभिकर्मक तैयार करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ काम कर अभिकर्मक समाधान कवर प्रकाश से बचने के लिए। प्रत्येक नमूने में अभिकर्मक काम कर 200 μl जोड़ें। में5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर cubate। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्लेट प्रकाश से बचने के लिए।
      4. (480 एनएम, उत्सर्जन 520 एनएम पर उत्तेजना) एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग नमूनों की पुष्पन उपाय। पुष्पन डीएनए एकाग्रता बनाम के डीएनए मानक वक्र उत्पन्न करता है। उत्पन्न डीएनए मानक वक्र के आधार पर नमूनों की सांद्रता निर्धारित करते हैं।
  7. चिप प्रयोग का सत्यापन qPCR का उपयोग
    1. डीएनए अलग-थलग और पानी में 20 μl में पतला 2 μl ले लो। 2.5 μl डीएनए कमजोर पड़ने, 5 μl Green में पीसीआर मास्टर मिश्रण, 1 μl प्राइमर, और 1.5 μl nuclease मुफ्त पानी के मिश्रण से तीन प्रतियों में qPCR प्रतिक्रिया सेट करें।
    2. तेजी से वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग कर के साथ qPCR चलाएँ: चरण 1: 95 डिग्री सेल्सियस 60 सेकंड, चरण 2: 95 डिग्री 60 सेकंड, चरण 2 दोहराएँ 39 बार के लिए 10 सेकंड के लिए सी, 60 डिग्री सेल्सियस।
  8. अनुक्रमण के लिए जैव प्रौद्योगिकी केन्द्र के लिए 10 एनजी डीएनए नमूने भेजें।
    नोट: बायोटेकज केंद्र के निर्देश के अनुसार पुस्तकालयों में चिप डीएनए तैयार करता है, और पहले 2 विस्तृत तरीकों का उपयोग कर एकल पढ़ अनुक्रमण करता है।

3. Metabolomics परख नमूना तैयार

  1. सेल संस्कृति और उपचार
    1. बीज मध्यम विकास में प्रति 10 सेमी की थाली 400,000 MCF7 कोशिकाओं। प्रत्येक उपचार के लिए तीन नमूने तैयार करते हैं। प्रत्येक नमूने में दो प्लेटों का प्रयोग पता लगाने के लिए पर्याप्त कक्षों प्राप्त करने के लिए। 3 दिन, मध्यम हटाने और के साथ या कोशिकाओं के लिए 10 -8 एम E2 बिना 5 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़ें। 24 घंटा (humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए कोशिकाओं को समझो।
  2. नमूना संग्रह
    1. पीबीएस 1x 5 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे प्लेट में जोड़े, संक्षेप में प्लेट कई बार झुकने के बाद पीबीएस aspirate। दो बार दोहराएँ, और पिछले धोने के बाद जितना संभव हो उतना पीबीएस को हटा दें।
    2. प्रत्येक थाली करने के लिए पूर्व ठंड एसीटोन के 750 μl जोड़ें और कोशिकाओं परिमार्जन। में दो प्लेटों से एसीटोन में कोशिकाओं का मिश्रणबर्फ पर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए।
    3. सामान्य बनाने के लिए कोशिकाओं की संख्या
      1. प्रत्येक उपचार के लिए, सेल मात्रा का ठहराव के लिए दो अतिरिक्त प्लेटों का उपयोग करें। करने के लिए, थाली से कोशिकाओं को डी-देते हैं की वह प्रत्येक थाली में बफर (1x HBSS, 10 मिमी HEPES, 0.075% NaHCO 3, और 1 मिमी EDTA) और 5 मिनट के लिए सेते 2 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. लीजिए और महामहिम बफर में कोशिकाओं pipetting द्वारा कोशिकाओं अच्छी तरह मिलाएँ। एक hemocytometer का उपयोग सेल नंबर गिनती करने के लिए 20 μl सेल के समाधान के कुल का प्रयोग करें।
  3. Metabolomics केंद्र को भेजने से पहचान करने और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस) विश्लेषण का उपयोग चयापचयों यों तो पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहित करें।

4. एकीकृत विश्लेषण

  1. शाही सेना Seq डेटा विश्लेषण:
    1. FastQC का उपयोग कर FASTQ फ़ाइलों की गुणवत्ता की जांच को पूरा करें: पढ़ें क्यूसी (http://galaxy.illinois.edu)
      1. FastQC चयन करें: NGS के उपकरण के तहत पढ़ें: क्यूसी और हेरफेर। वर्तमान ऐतिहास से कच्चे डेटा फ़ाइल अपलोड करेंवाई।
        नोट: यह आउटपुट फ़ाइल याद दिलाने के लिए क्या काम के लिए वहाँ के बाद से कई outputs हो सकता था एक शीर्षक देने के लिए सिफारिश की है।
    2. निष्पादित और आउटपुट फ़ाइल का इतिहास तहत दिखाई देगा। प्रत्येक दृश्य फ़ाइल के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ। ट्रिम एडेप्टर NGS के तहत क्लिप का उपयोग: FASTX टूलकिट।
    3. संरेखित RefSeq जीनोम संदर्भ एनोटेशन 12 (डिफ़ॉल्ट मान) के साथ Tophat2 का उपयोग कर hg19 को पढ़ता है।
      1. NGS के उपकरण के तहत Tophat2 का चयन करें: शाही सेना विश्लेषण। पुस्तकालय बनती प्रकार (एकल अंत बनाम बनती अंत) से संकेत मिलता है।
      2. वर्तमान इतिहास से इनपुट FASTQ फ़ाइल अपलोड करें। संदर्भ जीनोम का चयन करें। चूक सेटिंग चुनें। या संशोधित करने के लिए पूर्ण पैरामीटर सूची का उपयोग करें।
      3. निष्पादित और यह दो आउटपुट फाइल का उत्पादन होगा: एक जंक्शनों के UCSC बिस्तर ट्रैक है; एक और एक बेम प्रारूप में पढ़ने संरेखण की एक सूची है।
    4. अनुक्रमण डेटा विश्लेषण उपकरण के लिए बेम फ़ाइलें अपलोड करें। क्वांट का उपयोग कर अभिव्यक्ति मूल्यों की गणनावर्गीकरण उपकरण।
    5. मूलभूत मूल्यों का उपयोग कर अभिव्यक्ति विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर विभिन्न विनियमित जीनों की पहचान और परिवर्तन> 2 और पी मूल्य <0.05 गुना। इसी तरह, मूलभूत मूल्यों का उपयोग कर अभिव्यक्ति विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर विभिन्न नीचे विनियमित जीन की पहचान करने और परिवर्तन <0.5 और पी मूल्य <0.05 गुना।
  2. चिप Seq डेटा विश्लेषण:
    1. संरेखित FASTQ आकाशगंगा में Bowtie2 13 (डिफ़ॉल्ट मान) का उपयोग करने के लिए hg19 पढ़ता है।
      1. एनएससी के उपकरण के तहत Bowtie2 चयन करें: मानचित्रण। सत्यापित करें यदि पुस्तकालय दोस्त बनती (एकल अंत बनाम बनती अंत) है। वर्तमान इतिहास से FASTQ फ़ाइल अपलोड करें।
      2. संदर्भ जीनोम का चयन करें। डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेटिंग्स का प्रयोग करें। निष्पादित और मैप किया अनुक्रम के साथ बेम फ़ाइल के रूप में पढ़ता है यह आउटपुट फ़ाइल का उत्पादन होगा। हर अनुक्रम फ़ाइल के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
    2. , एमएसीएस 14 6.0e-7 के एक पी मूल्य कटऑफ और 0.01 की एफडीआर का उपयोग कर चोटियों को पहचानें के रूप में पहले 2 का वर्णन किया।
    3. Metabolomics डेटा विश्लेषण:
      1. KEGG_IDs को चयापचयों का रासायनिक नाम परिवर्तित।
      2. वाहन में पाया बनाम। E2 स्तरों की तुलना द्वारा विभिन्न विनियमित चयापचयों पहचानें नमूने (एक 2 गुना कट ऑफ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था) का इलाज किया।
    4. एकीकृत विश्लेषण:
      1. जीन है कि ERα बाध्यकारी अनुक्रमण डेटा विश्लेषण उपकरण का उपयोग साइटों को पहचानें। दूरी कट ऑफ के रूप में 20 केबी का उपयोग कर जीन समारोह के लिए क्षेत्र का अनुवाद करें।
      2. के रूप में काट क्रमश: पी मूल्य <0.05 गुना के साथ बदलें> 2 का उपयोग कर शाही सेना Seq डेटा विश्लेषण से विभिन्न ऊपर और नीचे विनियमित जीनों की पहचान और परिवर्तन <0.5 गुना। ERα बाध्यकारी साइट जीन वेन आरेख तुलना का उपयोग कर युक्त सूची की तुलना करें।
      3. Cytoscape की Metscape 15 मॉड्यूल का उपयोग कर E2 संग्राहक चयापचय मार्ग की पहचान करने के लिए इस सूची का उपयोग करें।
        1. क्षुधा से Metscape मॉड्यूल का चयन करके, नेटवर्क और फिर मार्ग-bas बिल्ड चुनेंएड विकल्प।
        2. जीव (मानव) का चयन करें। E2 अनियमित यौगिक सूची का चयन डेटा फ़ाइल (KEGG आईडी) के रूप में अच्छी तरह से E2 जीन सूची को विनियमित।
        3. नेटवर्क प्रकार के रूप में -Reaction -Enzyme जीन यौगिक चुनें। क्वेरी के रूप में यौगिक / जीन चुनें।
        4. नेटवर्क का निर्माण। E2 नीचे विनियमित यौगिक और जीन का उपयोग कर दोहराएँ।

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Representative Results

transcriptomics
E2 उपचार द्वारा विभिन्न व्यक्त जीनों का विश्लेषण करने के लिए, हम एक शाही सेना Seq प्रयोग करने के लिए चुना है। mRNA स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करने के अलावा, शाही सेना Seq डेटा भी गैर-कोडिंग आरएनए (लंबे समय से गैर-कोडिंग RNAs, microRNAs) और वैकल्पिक splicing की घटनाओं में बदलाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम गैर-कोडिंग RNAs या वैकल्पिक रूप से लिखित जीन का विश्लेषण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं किया है, क्योंकि हमारे अध्ययन के दायरे प्रोटीन कोडिंग जीन है कि चयापचय नियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान है। हालांकि, शाही सेना Seq अंतर जीन अभिव्यक्ति घटनाओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने का एक शानदार तरीका है।

आदेश में उच्च गुणवत्ता पढ़ता प्राप्त करने के लिए, यह उच्च शुद्धता आरएनए पाने के लिए महत्वपूर्ण है। आरएनए को अलग-थलग करने के बाद हम शाही सेना एक शाही सेना को साफ किट का उपयोग कर शुद्ध। दुर्भाग्य से शाही सेना के लगभग 50% इस प्रक्रिया के दौरान खो दिया है और आरएनए शुरू की राशि सी में रखा जाना चाहिएonsideration आवश्यक राशि (100-500 एनजी) शुद्धि कदम के अंत तक प्राप्त करने के लिए।

हम fluorometer आरएनए एचएस परख है, जो बहुत ही सटीक है और कम बहुतायत शाही सेना की मात्रा का ठहराव के लिए पसंदीदा तरीका है का उपयोग कर आरएनए पैदावार मात्रा। अगले, अखंडता और शाही सेना के नमूने के समग्र गुणवत्ता bioanlayzer, जो शाही सेना की एक न्यूनतम राशि का उपयोग कर जेल वैद्युतकणसंचलन लिए एक व्यवहार्य विकल्प है का उपयोग कर जांच की गई। विश्लेषण से पता चलता सभी नमूनों अखंडता और नमूने (चित्रा 2 बी) की पवित्रता का संकेत 18S और 28S rRNAs के तेज और साफ बैंड है। आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin) शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। RIN 10 इंगित करता बरकरार शाही सेना, Rin 6 आंशिक रूप से अपमानित और RIN3 दृढ़ता से 16 अपमानित।

यह सिफारिश की है कि RIN कम से कम 7 होने की अनुक्रमण प्रयोग के लिए। हमारे शाही सेना के नमूने के सभी 9.6-9.9 के बीच RIN मूल्य प्राप्त <strong> (2A चित्रा)। अनुक्रमण पुस्तकालयों ऐसे Illumina 2500 के रूप में औसत 18,000,000 उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण पढ़ता प्रत्येक नमूना (तालिका 1), जो बहाव के लिए तैयार किया गया था के लिए प्राप्त किया गया अल्ट्रा उच्च throughput अनुक्रमण प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने से उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना के 500ng से निर्माण किया गया विश्लेषण। उच्च throughput अनुक्रम कच्चे डेटा के समग्र गुणवत्ता की जांच करने के लिए, FastQC प्रत्येक नमूना है पढ़ता के लिए चलाया गया था। एक वाहन शाही सेना Seq डेटा के लिए एक प्रतिनिधि FastQC रिपोर्ट (चित्रा 3) दिखाया गया था। सबसे पढ़ता के अनुक्रम लंबाई के बारे में 100 बीपी (चित्रा 3 ए) था। प्रत्येक पढ़ने के लिए, गुणवत्ता स्कोर और पहले 5 बी.पी. के लिए 32-34 6-100bp (चित्रा 3 बी) से 36-38 था। के अलावा 17990863 इस नमूने से उत्पन्न पढ़ता है, उनमें से ज्यादातर की गुणवत्ता की तुलना में अधिक 34 (चित्रा 3 सी) स्कोर था। अनुक्रम में पढ़ा प्रति जीसी सामग्री भी 48% जीसी के एक औसत के साथ सामान्य वितरण का पालन किया। कुल मिलाकर गुणवत्तापढ़ता के स्कोर बहुत अधिक था।

ERα बाध्यकारी साइटों की Cistromic विश्लेषण
कुशल गहरी अनुक्रमण को प्राप्त करने के लिए, वांछनीय आकार में डीएनए टुकड़े प्राप्त करने के महत्वपूर्ण कारकों में से एक है। वर्तमान अनुक्रमण दृष्टिकोण अति उच्च throughput अनुक्रमण प्रणाली के लिए 300-600 बीपी, एबी / ठोस 17 के लिए 100-200 बीपी उदाहरण के लिए डीएनए टुकड़े पर अलग अलग आवश्यकताओं है, हो सकता है। इस प्रयोग में डीएनए टुकड़े के सबसे 300 बीपी और 600 बीपी जेल पर दिखाया के रूप में (चित्रा 4) के बीच है। एक विकल्प के रूप में, पाठकों हालांकि हमें लगता है हमारे स्थापित प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता के साथ आवश्यक नमूने प्रदान करता है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है MNase पाचन का उपयोग कर अपने क्रोमेटिन तैयार करने के लिए चुना है हो सकता है। प्रत्येक उपचार से डीएनए और अपनी इसी इनपुट नमूना के दस एनजी ईबी बफर में तैयार किया गया था। चिप डीएनए एकल-पढ़ने के लिए अति उच्च throughput अनुक्रमण प्रणाली का उपयोग कर अनुक्रम था। चिप डीएनए के नमूने के बारे में झुकेंगे20,000,000 पढ़ता है, जबकि इनपुट डीएनए झुकेंगे और अधिक से अधिक 35.000,000 पढ़ता है (तालिका 1)।

metabolomics
GCMS का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं में चयापचयों यों, सेल जन के कम से कम 10 माइक्रोग्राम आवश्यक हैं। हम प्रयोगों के साथ 400,000 MCF7 कोशिकाओं के साथ शुरू कर दिया। फसल के समय तक, वहाँ प्रत्येक थाली में लगभग 500,000 कोशिकाओं थे। चयापचयों चोटियों द्वारा प्रतिनिधित्व का अवलोकन नियंत्रण और एस्ट्राडियोल इलाज नमूना (चित्रा 5) के बीच तुलना की गई। के बारे में 100 चयापचयों की पहचान की गई है, जो कुल mammalians में जाना जाता है की 60% के लिए गिनती। यहाँ हम शीर्ष 10 चयापचयों, जो E2 उपचार (तालिका 2) में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाने की एक सूची प्रस्तुत करते हैं। कुल मिलाकर, E2 फ्रक्टोज और mannose चयापचय, हिस्टिडीन चयापचय, प्यूरीन चयापचय, कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण और विटामिन बी 3 चयापचय सहित upregulated रास्ते। downregulated रास्ते थे butanoate metabolisमी, नए सिरे से फैटी एसिड biosynthesis, pentose फॉस्फेट मार्ग, यूरिया चक्र और arginine के चयापचय (3 टेबल)।

डेटा विश्लेषण और एकीकरण
शाही सेना Seq, चिप Seq और जीसी एमएस से डेटा प्रोसेस किया गया है और विश्लेषण कदम (चित्रा 6) की एक श्रृंखला के माध्यम से। शाही सेना Seq और चिप Seq में पहचान की जीन के बीच तुलना के बाद, विनियमित का एक सेट और एस्ट्राडियोल से नीचे विनियमित जीन का एक सेट निकाले गए थे। चयापचय डेटा से, हम एस्ट्राडियोल उपचार से ऊपर और नीचे विनियमित यौगिकों के दो सेट प्राप्त की। अगले हम कल्पना और मानव चयापचय 15 के संदर्भ में जीन की अभिव्यक्ति और चयापचय डेटा की व्याख्या करने Metscape, Cytoscape के लिए एक app इस्तेमाल किया। पहले हम नेटवर्क में परिसर के तत्वों, प्रतिक्रिया, एंजाइम, और जीन शामिल करने के लिए चुना है। हम यौगिकों / क्वेरी के रूप में जीन और नीचे दो E2 अप-विनियमन (चित्रा 7A) के नेटवर्क और चयनित-regulation (चित्रा 7B) दिखाया गया। Metscape भी चयनात्मक रास्ते पर नेटवर्क का निर्माण करने के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, नीचे विनियमित समग्र नेटवर्क के निर्माण के रूप में डेटा का एक ही सेट का उपयोग कर, एण्ड्रोजन एस्ट्रोजन जैवसंश्लेषण और चयापचय मार्ग का एक सबनेटवर्क यौगिक / जीन विशिष्ट मार्ग से क्वेरी स्विचन द्वारा तैयार की गई थी। जीन या महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ यौगिकों उज्जवल रंग में डाला गया था। ड्रॉप-डाउन खिड़की के रूप में वर्णित से एक विशिष्ट मार्ग का चयन करने के अलावा, एक भी चुने हुए क्षेत्र के लिए आवेदन "सबनेटवर्क बनाने के लिए" समारोह से एक उप-नेटवर्क बना सकते हैं। जैसा कि चित्र 6A और बी, ERα सक्रियण और जीन विनियामक क्षेत्रों के लिए प्रत्यक्ष बाध्यकारी में दिखाया गया है स्तन कैंसर की कोशिकाओं में कई चयापचय मार्ग पर असर पड़ा। हमारा एकीकृत विश्लेषण से संकेत दिया कि, ERα सीधे को बांधता है और FASN जीन है, जो नए सिरे से फैटी एसिड biosynthesis मार्ग के लिए महत्वपूर्ण है की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है (एफigure 7C)। इसके अलावा E2 इलाज इन रास्ते में CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, टीपीओ, GSTA4 और GSTM2 की अभिव्यक्ति के दमन से एण्ड्रोजन एस्ट्रोजन जैवसंश्लेषण रास्ते downregulated।

आकृति 1
चित्रा 1: शाही सेना Seq, चिप Seq, और metabolomic विश्लेषण के लिए और सेल lysates आरएनए, डीएनए के नमूने की तैयारी की कार्यप्रवाह।

चित्र 2
चित्रा 2:। RNAs साथ Agilent 2100 Bioanalyzer आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin), शाही सेना की गुणवत्ता का सूचक का विश्लेषण का एक प्रतिनिधि electropherogram, 9.9 के रूप में विश्लेषण द्वारा दिया गया था। (ए) शाही सेना के एक आभासी जेल के चित्र पर नमूना 26S और 18S के दोनों बैंड तेज कर रहे हैं। (बी) टी में व्यक्ति का पता लगाने के फ्लोरोसेंट संकेतवह आरएनए से पता चलता है कि 28S चोटी की तीव्रता से अधिक 18S चोटी है और कोई प्रदूषण को देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। शाही सेना Seq कच्चे डेटा पर एक प्रतिनिधि गुणवत्ता की जांच के वाहन नमूना के अनुक्रम डेटा के एक FastQC का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। (ए) पुस्तकालय जो 100 बीपी है के अनुक्रम लंबाई वितरण। (बी) पढ़ने में स्थिति के साथ गुणवत्ता स्कोर। (सी) के अनुक्रम के अनुसार गुणवत्ता स्कोर सभी दृश्यों के सार्वभौमिक उच्च गुणवत्ता दिखाया। (डी) सैद्धांतिक वितरण से मिलान पढ़ें प्रति जीसी सामग्री। एक ला देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की rger संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4: sonicated chromatin टुकड़े की जेल वैद्युतकणसंचलन प्रत्येक नमूने से सेल lysate के 5 μl 1,000 बीपी प्लस पहली लेन पर सीढ़ी के साथ एक 1.5% agarose जेल पर चलाया गया था।। टुकड़े के बहुमत के लिए 300 और 600 बीपी के बीच। रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। जीसी एमएस से चयापचयों का प्रतिनिधित्व चोटियों का अवलोकन ऊपरी पैनल चोटियों जबकि नियंत्रण से कम पैनल E2 इलाज के नमूने में पहचान से पता चलता है। क्षेत्र संलग्न में कमरों वाला था सटीक मेटाबोलाइट प्रत्येक पी द्वारा प्रतिनिधित्व दिखाने के लिए eak। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: एकीकृत क्लस्टरिंग विधि के फ़्लोचार्ट।

चित्रा 7
चित्रा 7: Metscape में एकीकृत जीन-मेटाबोलाइट डेटा के दृश्य (ए) को विनियमित रास्ते E2 द्वारा की नेटवर्क।। (बी) के रास्ते में से नेटवर्क E2 से नीचे विनियमित। (सी) E2 FASN के पास के क्षेत्र, सबनेटवर्क समारोह को लागू करने से उत्पन्न नए सिरे से फैटी एसिड biosynthesis नेटवर्क में विनियमित किया जाना पाया जाता है जो करने के लिए ERα भर्ती को प्रेरित किया।3832fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: शाही सेना Seq और चिप Seq के अति उच्च throughput अनुक्रमण का सारांश।

सारणी 2
तालिका 2: E2 उपचार के साथ महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ शीर्ष 10 चयापचयों की सूची।

टेबल तीन
तालिका 3: रास्ते ऊपर और नीचे विनियमित E2 उपचार के द्वारा।

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Discussion

इस पत्र में, हम MCF 7 कोशिकाओं है कि E2 के साथ व्यवहार कर रहे हैं से दूसरी पीढ़ी और आरएनए Seq, चिप Seq और metabolomics डेटा के एकीकृत विश्लेषण का वर्णन किया। हम सबसे कारगर तरीकों और उपयोगकर्ता के अनुकूल नरम माल जो जैविक रूप से प्रासंगिक खोज के उत्पादन का उपयोग करने के लिए strategizing प्रोटोकॉल का एक सेट विकसित की है। हमारे ज्ञान करने के लिए, हमारा तीन अलग-अलग विश्लेषण और नए चयापचय मार्ग की पहचान की है कि ERα सीधे स्तन कैंसर की कोशिकाओं में विनियमित से -omics डेटा को एकीकृत करने के लिए पहला अध्ययन है।

transcriptomics
यह एक सफल transcriptomic विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। अच्छा अभ्यास RNase मुक्त बेंच बनाने, दस्ताने अक्सर बदल रहा है, में -80 डिग्री सेल्सियस के भंडारण और उपयोग में बर्फ पर रखने सहित आरएनए गिरावट का मौका, को समाप्त होगा। -20 डिग्री सेल्सियस पर रात ऊष्मायन के अलावा आरएनए वसूली में सुधार। बार बार ठंड और विगलन आरएनए से बचने के लिए, एक नीचे की ओर procedur के लिए RNAs आवंटित कर सकते हैंअलगाव और शुद्धि पर es। अनुक्रमण त्रुटियों के अस्तित्व के लिए, QRT- पीसीआर के नमूनों से सीडीएनए का उपयोग कर अक्सर शाही सेना Seq में पहचान की विभिन्न व्यक्त जीनों को सत्यापित करने के लिए किया जाता है। इसलिए, पर्याप्त आरएनए इस उद्देश्य के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए। हम बनती अंत अनुक्रमण ब्याह वेरिएंट, गैर-कोडिंग RNAs और miRNAs का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है कि प्रदर्शन करते हैं। उच्च अनुक्रमण लागत से बचने के लिए, एकल अंत अनुक्रमण के रूप में अच्छी तरह से किया जा सकता है। प्रोटीन की तुलना में, शाही सेना Seq अधिक संवेदनशील है और चिप पर प्रदान की जांच करने के लिए सीमित नहीं है। हम न केवल कोडिंग दृश्यों पर, लेकिन यह भी गैर-कोडिंग जीन और विभिन्न spliced ​​टेप के बारे में जानकारी प्राप्त करते हैं। वर्तमान में हम इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं ligand उपचार के साथ ही ऊतकों माउस प्रयोगों से प्राप्त करने के बाद विभिन्न सेल लाइनों की transcriptomes विश्लेषण करने के लिए।

Cistromics
अति उच्च throughput अनुक्रमण विधि पुस्तकालय निर्माण के लिए कम से कम 5 एनजी चिप डीएनए की आवश्यकता है। मानक चर्चा मेंआईपी ​​प्रोटोकॉल Seq 18, इसे कम से कम 10 एनजी की सिफारिश की है। fluorometry साथ Quantitation महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में हम डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए डबल कतरा डीएनए परख का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया। एक भी सटीक डीएनए मात्रा का ठहराव के लिए fluorometer परख का उपयोग कर सकते हैं। उपकरण और सामग्री में मतभेद के लिए, यह प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए अपने स्वयं sonication प्रोटोकॉल है, जो वांछनीय डीएनए टुकड़े आकार उत्पन्न करता है स्थापित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। ओवर-कर्तन चिप डीएनए लक्ष्य DNAs के संवर्धन की हानि का कारण बड़े आकार की चिप डीएनए कुशल अनुक्रमण के लिए समस्या पैदा हो सकती है, जबकि। अनुक्रमण के लिए डीएनए प्रस्तुत करने से पहले, यह हमेशा qPCR से कुछ ज्ञात क्षेत्रों के संवर्धन को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। तकनीक अभी भी दक्षता और immunoprecipitations के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता द्वारा सीमित है। बाध्यकारी साइट जानकारी है कि मज़बूती से तुलनात्मक विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता प्राप्त करने के लिए, हम सांकेतिक शब्दों में बदलना चिप Seq मानकों का पालन हमारे अभिकर्मकों मान्य, 19 और उपयोग standardized प्रोटोकॉल है कि हमें लगातार डेटा सेट के साथ प्रदान करते हैं। पोस्ट प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइट संवर्धन विश्लेषण के साथ युग्मित, चिप Seq अभी भी सबसे अच्छा तरीकों में से एक क्रोमेटिन को प्रतिलेखन कारक के प्रत्यक्ष बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए है। वर्तमान में हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे अन्य सेल लाइनों के रूप में अच्छी तरह से एस्ट्रोजन उत्तरदायी माउस ऊतकों में chromatin पर भर्ती kinases, coregulators और अन्य प्रतिलेखन कारकों का अध्ययन करने के लिए।

metabolomics
मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक सफल चयापचय की रूपरेखा के लिए, एक सावधान नमूना तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल करते हैं और सेल संस्कृति हालत में कोशिकाओं की राशि MCF7 कोशिकाओं के लिए इष्टतम है। अन्य सेल लाइनों चयापचयों की एक महत्वपूर्ण संख्या का पता लगाने के लिए और अधिक या कम कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है। हम प्रत्येक प्रयोग में 100 चयापचयों के आसपास प्राप्त करते हैं। इस विधि को कम रहता चयापचयों या चयापचयों कि कम मात्रा में मौजूद हैं का पता लगाने के लिए सीमित है। इस विधि को उसी की आसानी प्रदान करता हैएनजी एक भी नमूना प्रस्तुत करने के लिए कई चयापचयों की पहचान। वर्तमान में हम इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं सीरम और माउस से विभिन्न ऊतकों में एस्ट्रोजन विनियमित चयापचयों की पहचान।

डेटा एकीकरण
कई transcriptomics और cistromics पढ़ाई के स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एस्ट्रोजन संकेतन और जीन विनियमन जांच करने के लिए किया गया था, MCF7 कोशिकाओं 2,5-7,20 भी शामिल है। इस अध्ययन में, पहली बार के लिए, हम metabolomics डेटा जोड़ा गया है और चयापचय नेटवर्क है कि सीधे ligand अलावा पर ERα द्वारा विनियमित रहे हैं अनुमान करने की कोशिश की। इस उपन्यास दृष्टिकोण बिंदु आणविक एस्ट्रोजेन कि सेलुलर चयापचय को प्रभावित द्वारा विनियमित circuitries पिन करने के लिए हमें सक्षम होना चाहिए। कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्ष स्तन कैंसर जीव विज्ञान के एक मास्टर नियामक के रूप में ERα की भूमिका का समर्थन।

सारांश में, हम उपचार एस्ट्रोजन और integr के बाद शाही सेना Seq, स्तन कैंसर की कोशिकाओं से चिप Seq और metabolomics नमूनों की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल की एक विस्तृत संग्रह प्रदान कीइन -omics दृष्टिकोण से प्राप्त आंकड़ों के विश्लेषण ative। इन प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं अन्य प्रतिलेखन कारक, परमाणु रिसेप्टर ligands और पोषक तत्वों की स्थितियों के लिए समान विश्लेषण करने के लिए सक्षम हो जाएगा।

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Disclosures

इलिनोइस विश्वविद्यालय फाइजर इंक ZME से एक अन्वेषक शुरू अनुदान प्राप्त और YCZ इस अनुदान से वेतन समर्थन प्राप्त है।

Acknowledgments

इस काम के खाद्य एवं कृषि के राष्ट्रीय संस्थान, अमेरिका के कृषि विभाग, पुरस्कार Illu-698-909 (ZME) और फाइजर, इंक (ZME) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। इसकी सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी अमेरिका के कृषि विभाग के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करते।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एस्ट्रोजन रिसेप्टर संकेतन द्वारा मेटाबोलिक नियमन की सिस्टम्स बायोलॉजी स्तन कैंसर में
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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