Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Systems Biology of Metabolic Regulation av østrogenreseptor signale i Breast Cancer

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Med bruk av -omics nærmer vår forståelse av kroniske sykdommer som kreft og metabolsk syndrom har økt. Imidlertid er effektiv utvinning av informasjonen i de store datasett som er hentet fra genuttrykk mikromatriser, dype sekvense eksperimenter eller metabolsk profilering viktig å avdekke og deretter effektivt målrette de kritiske regulatorer av syke celle fenotyper. Østrogen Reseptor α (ERα) er en av de hovedtranskripsjonsfaktorer som regulerer gener programmer som er viktige for østrogen responsive brystkreft. For å forstå rollen til ERα av signalering i brystkreft metabolisme benyttet vi transcriptomic, cistromic og metabolomic data fra MCF-7-celler behandlet med østradiol. I denne rapport beskrev vi generering av prøver for RNA-Seq Chip-Seq og metabolomics eksperimenter og den integrerende matematisk analyse av de oppnådde data. Denne tilnærmingen er nyttig for å kartlegge roman muldvarprund mekanismer og gen regulatoriske kretser som er regulert av en bestemt transkripsjonsfaktor som påvirker metabolismen av normale eller syke celler.

Introduction

Østrogener er viktige regulatorer av mange fysiologiske prosesser i både kvinner og menn, inkludert reproduktive vev, metabolske vev, hjerne og bein 1. I tillegg til gunstige effekter i disse vev, østrogener også kjøre kreft som oppstår fra bryst og reproduktive vev. Østrogener hovedsakelig arbeide gjennom grunnleggende kravene for å indusere celletype spesifikke effekter. Deep sekvensering av vitnemål regulert av ERα hjelp RNA-Seq og genom-wide ERα DNA bindingssteder analyse ved hjelp av chip Seq viste seg å være nyttig for å forstå hvordan ERα fungerer i ulike vev og kreft som oppstår fra dem. Vi og andre har publisert genuttrykk profiler knyttet til ulike reseptorer (ERα vs ERβ) 2,3, forskjellige ligander 3-5 og ulike coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq er den viktigste metoden for å undersøke transkriptomet, som tilbyr høyere presisjon og effektivitet sammenlignet med microarray based genekspresjonsanalyse 8. RNA hentet fra cellelinjer 2-4,7, vev eller tumorprøver er sekvensert, kartlagt til tilgjengelige genomisk forsamlinger og ulikt regulert gener er identifisert. Chromatin Immunpresipitasjon (chip) er ansatt for å dissekere transkripsjonsfaktor og coregulator kromatin binding til kjente regulatoriske bindingssteder. ChIP-Seq (Chip etterfulgt av høy throughput sekvensering) gir deg objektive påvisning av globale bindingssteder. Metabolomics er et annet økende grad brukt system biologi tilnærming, som kvantitativt tiltak, dynamisk multiparametric respons av levende systemer på ulike stimuli, inkludert kjemikalier og genetiske forstyrrelser.

Ved å utføre global metabolsk profilering, kan en funksjonell avlesing oppnås fra celler, vev og blod. I tillegg trenger informasjon fra transkriptom eksperimenter ikke alltid gjenspeiler faktiske endringer i nivået av enzymer som bidrar til biokjemiske mekanismer. kombinertanalyse av transkriptom og metabolomet data gjør oss i stand til å identifisere og relatere endringer i genuttrykk med faktiske metabolitt endringer. Å utnytte informasjon fra alle disse store datasett gi mekanistiske detaljer for å forstå hvilken rolle transkripsjonsfaktorer som regulerer komplekse biologiske systemer, spesielt de som gjelder for menneskelig utvikling og sykdommer som kreft og diabetes.

Den komplekse natur av pattedyr genomet gjør det utfordrende å integrere og fullt tolke data innhentet fra transkriptom, cistrome og metabolomet eksperimenter. Identifisere funksjonelle bindende hendelser som ville føre til endringer i uttrykket av målgener er viktig fordi når funksjonelle bindingssteder er identifisert; påfølgende analyse, inkludert transkripsjon binding (TF) motiv analyse kan utføres med høyere nøyaktighet. Dette fører til identifisering av biologisk betydningsfulle TF kaskader og mekanismer. Også direkte comparispå RNA-sekv og chip-Seq eksperimenter er ikke alltid mulig, siden dataene fra hvert forsøk har forskjellige skalaer og støy, og i noen tilfeller meningsfylte signaler blir skjult av befolkningen støy. Vi kjenner ikke til noen studie som integrert informasjon fra disse tre uavhengige men beslektede tilnærminger for å forstå den direkte metabolsk regulering av ERα i brystkreft. Derfor vårt overordnede mål i denne artikkelen er å forholde produktive bindende hendelser til genekspresjon og metabolitt endringer. For å oppnå dette målet, integrerte vi data fra RNA-Seq, Chip-Seq og metabolomics eksperimenter og identifisert de østrogeninduserte ERα bindende hendelser som ville føre til genekspresjon endringer i metabolske veier. For første gang tilbyr vi et komplett sett med protokoller (figur 1) for å generere ChIP-Seq, RNA-Seq og metabolomics profilering og utføre integrerende analyse av data for å avdekke nye genet kretser som regulerer stoffskiftet av brystkreftcancercellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av RNA-Seq Samples

  1. Cellekultur og behandling
    1. Culture de MCF7 celler i Forbedret MEM (IMEM) pluss fenol-rød medium med 10% varme inaktivt FBS, 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære.
      Merk: Samme cellelinje og cellekultur tilstand blir brukt gjennom hele studien.
    2. Seed 100000 MCF7 celler per brønn i 6-brønners plater. Har tre paralleller for hver behandling. På dag 3, fjern mediet og tilsett 2 ml friskt medium med eller uten 10 -8 M E2 til hver brønn. Inkuber platene i 24 timer i 37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære.
    3. For å høste cellene, tilsett 1 ml RNA isolering reagens (syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform) til hver brønn og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Deretter samler cellelysatet reagens ved pipettering og innskudd til 1,5 ml rør
  2. RNA Isolation
    1. Tilsett 200 ul chloroform i 1 ml cellelysat reagens (1.1.3) og vortex i 10 sek. Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Sentrifuger prøver ved 16 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering, overfører den vandige fasen (øverst) i et nytt rør uten å forstyrre de andre fasene.
    2. Tilsett 500 pl 100% isopropanol i et nytt rør med det overførte-vandige fase, og bland ved å snu. Inkuber ved -20 ° C over natten. Sentrifuger prøvene ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en pellet i bunnen av røret. Kast supernatanten og vask det pellet med 750 ul RNase-fritt 70% etanol ved kort vortex.
    3. Sentrifuger prøvene ved 6000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten, og sentrifuger prøven ved 16 000 xg i 1 min ved 4 ° C for å samle alle de gjenværende etanol. Fjerne gjenværende etanol ved pipettering med en gel-lasting spiss og setter rørene opp-ned for å lufttørke i 10 min. Oppløs pellet i 20-50 mL DEPC behandlet vann DEPENding av størrelsen av pelletene.
  3. Rense RNA ved hjelp av RNA opprydding kit følge protokollen 4. Mål-RNA-konsentrasjonen ved hjelp av en fluorometri basert analysesett følge protokollen 9.
    MERK: OD ved 260 nm blir tatt for å bestemme den RNA-konsentrasjonen og forholdet av OD ved 260 nm og 280 nm blir brukt til å bestemme renheten av prøven. Det anbefales å sjekke RNA kvalitet ved hjelp av Bio-analysator analysen.
  4. Ta ca 0,5 til 1 mikrogram renset RNA for sekvensering.
    MERK: Biotech sentrum forbereder sekvense biblioteker og utfører parvise end lese sekvensering ved hjelp av metoder som er beskrevet tidligere to.

2. Utarbeidelse av ChIP-Seq Sample

  1. Cellekultur og behandling
    1. Seed 500.000 MCF7 celler per 10 cm plate i vekstmedium.
      MERK: For hvert trekk ned 16 plater ble brukt. På dag tre, fjerner medium og tilsett 5 ml friskt medium, med eller uten 10 -8 M E2 til hvertallerken. Behandle cellene i 45 min (37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære).
  2. Tverrbinding og Cell Harvest-
    1. Tilsett 250 ul 37% formaldehyd i 5 ml medium for å tverrbinde kromatin, inkuber ved romtemperatur i 15 min. Stopp kryssbinding ved å vaske cellene med 5 ml iskald 1x MEM.
    2. Høste cellene i 250 pl Cell Lysis-buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-amin-oksyd) per plate.
  3. Fragmentering av Kromatin
    1. Sonikere cellene i 30 sekunder x 8 ved forsterker 30 til nå nødvendige kromatin størrelser. Kule hver prøve på isen etter en sonication av 30 sek.
    2. Sentrifuger ved 16 000 x g i 10 min ved 4 ° C, og nøye pipette av supernatanten uten å forstyrre pelleten på bunnen.
    3. Ta en 5 ul delmengde av supernatanten, og kontrollerer DNA størrelse ved elektroforese gjennom 1,5% agarose-gel som beskrevet tidligere 10. Den ideelle størrelsenDNA bør være mellom 200 til 500 bp.
  4. kromatin Immunpresipitasjon
    1. Spar 25 ul av cellelysat som input. I et 50 ml rør, blander 4 ml cellelysat med 20 ml IP-buffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl og 0,5% Triton X), ERα antistoff (500 ul F10 og 500 ul HC- 20), og 500 ul PROTA og ProtG protein belegning av magnetiske kuler. Inkuber blandingen ved rotasjon ved 4 ° C over natten for å tillate dannelse av chromatin- antistoff-komplekset.
  5. Vasker og Reverse-kryssbinding
    1. Bruker et magnetisk stativ for å samle magnetiske kuler på det magnetiserte side for å fjerne vaskebufferen.
    2. Vask de magnetiske kuler i 25 ml vaskebuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 01% SDS, 1% Triton X, og 150 mM NaCl). Å vaske grundig magnetiske kuler uten å forstyrre DNA-protein komplekser, tilsett 25 ml vaskebuffer sakte til røret langs siden da snu rørene før alle magnetiske kuler er blandet godt with vaskebuffer uten å virke som en pellet. Som et alternativ kan bruke rotatoren å invertere røret. Ikke vortex prøvene. Vask de magnetiske kuler ved hjelp av samme metode som i de følgende trinn.
    3. Vask de magnetiske kuler i 25 ml vaskebuffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 01% SDS, 1% Triton X, og 500 mM NaCl).
    4. Vask de magnetiske kuler i 25 ml vaskebuffer-III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate og 250 mM LiCl).
    5. Vask de magnetiske kuler i 25 ml 1x TE-buffer (1 mM EDTA, og 10 mM Tris-HCl) to ganger.
    6. Elueres DNA i 500 ul elueringsbuffer (1% SDS, og 10 mM NaHCO3) og deretter tildele 500 pl DNA-eluering i 4 rør. For DNA fra inngangene, elueres DNA i 125 ul elueringsbuffer.
    7. Inkuber rørene ved 65 ° C over natten på en varmeblokk. Dekk til rørene på varmeblokken med aluminiumsfolie for å holde varmen selv over alle rørene. Plasser en vekt på rørene for å holde dem fra å åpne. </ Li>
  6. DNA Isolation
    1. Kjøle rørene ved RT i 5 min. Isoler DNA fra rullegardinprøver med en helt DNA kit. Følg instruksjonene fra produsenten.
      1. Varm opp Eluering buffer ved 65 ° C. Legg 625 ul bindingsbuffer til hvert rør. Hvis utfelling, legge til et 250 pl bindingsbuffer inntil løsningen er klar.
      2. Laste prøven på kolonnen og sentrifuger ved 16 000 xg i 30 sek. Vaske prøven med 250 ul vaskebuffer. Husk å legge etanol til vaskebufferen når første gang du bruker den. Gjenta vask.
      3. Eluer-DNA i 15 ul elueringsbuffer. Kombiner DNA av samme trekke ned fra 4 rør for å oppnå rundt 55 mL DNA.
    2. Isoler Input DNA ved hjelp av en DNA Purification Kit.
      1. Varm opp Eluering buffer ved 65 ° C. Legg 625 ul bindingsbuffer i hvert rør og inkuberes i 10 min. Laste prøven på kolonnen i en 2 ml collectipå tube.
      2. Vaske prøven med 750 ul vaskebuffer, sentrifuger ved 16 000 xg i 1 min. Gjenta sentrifugering for å fjerne eventuelle gjenværende buffer. Eluer DNA i 30 pl av EB.
    3. Mål DNA Konsentrasjon Ved hjelp av en kommersiell fluorokromkonjugerte analysen med Modification 11.
      1. Fortynn 20 x TE-buffer inn i 1x TE som analysebuffer for å fortynne reagens- og DNA-prøvene. Ta 5 mL isolert DNA og fortynne det inn 50 pl i 1x TE.
      2. Fra 2 ug / ml DNA-stamoppløsning lage en DNA-standard som strekker seg fra emnet til 1, 10, 100, 1000 ug / ml. I en 96-brønners plate, fordele 25 pl av hver standard, så vel som DNA-fortynning i duplikat. (Tre eksemplarer for standard anbefales.)
      3. Forbered arbeids reagens ved å lage en 200-gangers fortynning fra dsDNA reagens i 1x TE buffer i plastrør. Dekk arbeids reagensoppløsningen med aluminiumsfolie for å unngå lys. Tilsett 200 ul virke reagens til hver prøve. Icubate ved romtemperatur i 5 min. Dekk plate med aluminiumsfolie for å unngå lys.
      4. Mål florescence av prøvene ved bruk av en fluorescens plateleser (eksitasjon ved 480 nm, emisjon 520 nm). Generer DNA standardkurve for florescence versus DNA-konsentrasjon. Bestemme konsentrasjonene av prøvene basert på den genererte DNA-standardkurve.
  7. Verifisering av ChIP eksperiment ved hjelp qPCR
    1. Ta 2 pl isolert DNA og fortynnet i 20 mL i vann. Sett opp qPCR reaksjon i tre eksemplarer ved å blande 2,5 mL DNA fortynning, 5 pl Grønn Jeg PCR Master Mix, en ul primer, og 1,5 mL nukleasefritt fritt vann.
    2. Kjør qPCR med Fast Real-Time PCR-systemet med følgende program: Trinn 1: 95 ° C i 60 sek, Trinn 2: 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 60 sek, gjenta trinn 2 39 ganger.
  8. Send 10 ng DNA-prøve for å Biotech senter for sekvensering.
    MERK: Biotech sentrum forbereder chip DNA i bibliotekene i henhold til instruksjon, og utfører enkelt lese sekvensering ved hjelp av metoder som er beskrevet tidligere to.

3. Metabolomics Assay Prøvepreparering

  1. Cellekultur og behandling
    1. Seed 400.000 MCF7 celler per 10 cm plate i vekstmedium. For hver behandling tilberede tre prøvene. Bruke to plater i hver prøve for å få nok celler for påvisning. På dag 3, fjern mediet og tilsett 5 ml friskt medium med eller uten 10 -8 M E2 til cellene. Behandle cellene i 24 timer (37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære).
  2. prøvetaking
    1. Tilsett 5 ml iskald 1 x PBS til platen, suge PBS etter kort vippe platen flere ganger. Gjenta to ganger, og fjerne så mye som mulig PBS etter siste vask.
    2. Legg 750 ul pre-kald aceton til hver plate og skrape cellene. Kombiner cellene i aceton fra to plater itil en 2 ml rør på is.
    3. Legemer for normalisering
      1. For hver behandling, bruke to ekstra plater for celle kvantifisering. For å de-feste cellene fra platen, tilsett 2 ml HE-buffer (1 x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3, og 1 mM EDTA) til hver plate og inkuberes i 5 min.
      2. Samle og bland godt cellene ved å pipettere celler i HE buffer. Bruk totalt 20 mL celle løsning å telle celle nummer ved hjelp av en hemocytometer.
  3. Oppbevar prøvene ved -80 ° C før de sendes til den Metabolomics sentrum for å identifisere og kvantifisere metabolitter ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) -analyse.

4. Integrative Analysis

  1. RNA-Seq Data Analysis:
    1. Utfør Kvalitetssjekk av FASTQ filer ved hjelp FastQC: Les QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Velg FastQC: Les under verktøyet for NGS: QC og manipulasjon. Last rådata filen fra gjeldende history.
        MERK: Det anbefales å gi en tittel for utdatafilen å minne deg på hva jobben var for siden det kan være flere utganger.
    2. Utføre og utdatafilen vil vises under History. Gjenta samme prosedyre for hver sekvens fil. Trim kort ved bruk Clip henhold NGS: FASTX Toolkit.
    3. Align leser til hg19 bruker Tophat2 med RefSeq genom henvisning merknad 12 (standardverdier).
      1. Velg Tophat2 henhold verktøy for NGS: RNA-analyse. Indikerer biblioteket paret type (single-end vs parvise slutten).
      2. Last opp inngangs FASTQ fil fra gjeldende historie. Velg referanse genom. Velg Standardinnstillinger. Eller bruke hele parameterlisten til å endre.
      3. Gjennomføre og det vil produsere to output filer: en er UCSC BED styr på kryss; en annen er en liste over lese justeringer i BAM-format.
    4. Last BAM filer til sekvense data analyseverktøy. Beregn uttrykk verdier ved hjelp Quantreduser fuktighet Tool.
    5. Identifisere forskjellig oppregulert gener ved hjelp av Expression Analysis Tool med standardverdier og brett endring> 2 og p-verdi <0,05. Likeledes identifisere differensielt nedregulert gener ved hjelp av Expression Analysis Tool med standardverdier og brett endring <0,5 og p-verdi <0,05.
  2. ChIP-Seq Data Analysis:
    1. Rett FASTQ Leser til hg19 bruker Bowtie2 13 (Standardverdier) i Galaxy.
      1. Velg Bowtie2 under verktøyet av NSC: Mapping. Kontroller at biblioteket er kompis-paret (single-end vs parvise slutten). Last opp FASTQ filen fra gjeldende historie.
      2. Velg referanse genom. Bruk standard parameterinnstillingene. Gjennomføre og det vil produsere output file med kartlagt sekvens lyder som BAM-fil. Gjenta prosedyren for hver sekvens fil.
    2. Identifisere toppene ved hjelp av MACS 14 en p-verdi cutoff av 6.0e-7 og FDR på 0,01, som tidligere beskrevet 2.
    3. Metabolomics Data Analysis:
      1. Konverter kjemiske navnene metabolitter til KEGG_IDs.
      2. Identifisere forskjellig regulert metabolitter ved å sammenligne nivåene påvist i Vehicle vs. E2 behandlet prøvene (en to fold cut-off ble brukt i denne studien).
    4. Integrative Analyse:
      1. Identifisere gener som har ERα bindingssteder ved hjelp av sekvensering av data analyseverktøy. Oversett Regioner gener funksjon med 20 kb som avstand cut-off.
      2. Identifisere forskjellig opp- og ned-regulert gener fra RNA-Seq dataanalyse ved hjelp foldendring> 2 og brett endring <0.5, henholdsvis med p-verdi <0,05 som kuttet av. Sammenlign med listen over ERα bindende nettstedet inneholder gener ved hjelp av Venn-diagram sammenligning.
      3. Bruk denne listen til å identifisere E2 modul metabolske veier ved hjelp Metscape 15 modul av Cytoscape.
        1. Ved å velge Metscape modulen fra apps, velger Bygg nettverk og deretter sti-based alternativet.
        2. Velg Organisme (human). Velg dataregister E2 uregulert sammensatt liste (KEGG ID) samt E2 oppregulert genet listen.
        3. Velg Compound -reaksjon -Enzyme-Gene som nettverkstype. Velg sammensatte / gener som spørringen.
        4. Bygge nettverk. Gjenta ved hjelp av E2 nedregulert forbindelse og gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

transcriptomics
For å analysere forskjellig uttrykt gener ved E2 behandling, valgte vi å utføre en RNA-Seq eksperiment. I tillegg til å gi informasjon om mRNA nivåer, kan RNA-Seq data også brukes til å overvåke endringer i ikke-kodende RNA (lange ikke-kodende RNA, microRNAs) og alternativ spleising hendelser. Vi gjorde ikke gi informasjon om analyse av ikke-kodende RNA eller alternativt transkriberte gener, ettersom omfanget av vår studie er å identifisere proteinkodende gener som er viktige for metabolsk regulering. Imidlertid er RNA-Seq en utmerket måte å skaffe informasjon om differensial genuttrykk hendelser.

For å oppnå høy kvalitet leser, er det viktig å få høy renhet RNA. Etter å isolere RNA renset vi RNA ved hjelp av en RNA rydde opp kit. Dessverre er nesten 50% av RNA går tapt under denne prosessen, og mengden av start RNA må tas i consideration for å oppnå nødvendige mengde (100-500 ng) ved slutten av rensetrinnet.

Vi kvantifisert RNA utbyttene ved hjelp fluorometer RNA HS-analyse, noe som er meget nøyaktig, og er foretrukket metode for kvantifisering av lav-overflod RNA. Deretter ble det integritet og generelle kvaliteten på RNA prøver undersøkt ved hjelp bioanlayzer, som er et levedyktig alternativ til gel-elektroforese ved å bruke en minimal mengde av RNA. Analysen viser alle prøvene har skarpe og rene band av 18S og 28S rRNAs indikerer integriteten og renhet av prøvene (figur 2B). RNA Integritet nummer (RIN) ble anvendt som en standard for RNA kvalitetskontroll. RIN 10 indikerer intakt RNA, RIN seks delvis degradert og RIN3 sterkt degradert 16.

Det anbefales at RIN å være minst 7 for sekvensering eksperiment. Alle våre RNA prøver mottatt RIN verdi mellom 09.06 til 09.09 <strong> (figur 2A). Sekvense bibliotekene ble konstruert fra 500 ng av høy kvalitet RNA fra hver prøve ved hjelp av ultra-high-throughput sekvenseringssystem som Illumina 2500. I gjennomsnitt 18000000 Høy kvalitet sekvense leser ble oppnådd for hver prøve (tabell 1), som var klar for nedstrøms analyse. For å sjekke den generelle kvaliteten på high-throughput sekvens rådata, ble FastQC kjøre for hver prøve sin leser. En representant FastQC rapport for ett kjøretøy RNA-Seq data ble vist (figur 3). Den sekvenslengde av det mest leser var omtrent 100 bp (figur 3A). For hver lese, kvaliteten på stillingen 32-34 for første fem bp og 36-38 fra 6-100bp (figur 3B). Blant 17990863 leser generert fra dette utvalget, de fleste av dem hadde kvalitet scorer høyere enn 34 (figur 3C). GC innhold pr lese i sekvensen også fulgt normalfordeling med gjennomsnittlig 48% GC. Generelle kvalitetenpoengsummen for leser var svært høy.

Cistromic analyse av ERα bindingssteder
For å oppnå effektiv dyp sekvensering, innhenting av DNA-fragmenter ved ønsket størrelse er en av de viktige faktorer. Nåværende sekvense tilnærminger kan ha ulike krav til DNA-fragmenter, for eksempel 300-600 bp for ultra-high-throughput sekvenseringssystem, 100-200 bp for AB / fast 17. I dette eksperimentet ble de fleste av de DNA-fragmenter som er mellom 300 bp og 600 bp, som vist på gel (figur 4). Som et alternativ, kan leserne valgte å forberede sin kromatin hjelp MNase fordøyelsen, men vi føler at våre etablerte protokollen gir de nødvendige prøver med høy kvalitet og gir reproduserbare resultater. Ti ng DNA fra hver behandling og den tilsvarende inngang prøve ble fremstilt i EB-buffer. Brikken DNA ble egen lese sekvensert ved hjelp av ultra-high-throughput sekvenseringssystem. ChIP DNA-prøver ga ca.20000000 leser mens inngangs DNA gitt mer enn 35.000,000 leser (tabell 1).

metabolomics
For å kvantifisere de metabolitter i pattedyrceller ved hjelp av GCMS, er minst 10 ug av cellemasse er nødvendig. Vi begynte med 400.000 MCF7 celler med forsøkene. Ved tidspunktet for innhøsting, var det ca 500 000 celler i hver plate. Oversikten av metabolitter som representeres av toppene ble sammenlignet mellom kontrollen og østradiol behandlede prøve (figur 5). Rundt 100 metabolitter ble identifisert, som står for 60% av den totale kjent i pattedyr. Her presenterer vi en liste over de 10 beste metabolitter, som viser betydelige endringer i E2 behandling (tabell 2). Overall, E2 oppregulert trasé inkludert fruktose og mannose metabolisme, histidin metabolisme, purinmetabolismen, kolesterol biosyntese og vitamin B3 metabolisme. De downregulated trasé var butanoat metabolism, de novo biosyntesen fettsyre, pentose-fosfat vei, urea syklus og metabolisme av arginin (tabell 3).

Dataanalyse og integrering
Dataene fra RNA-Seq Chip-Seq og GC-MS ble bearbeidet og analysert gjennom en rekke trinn (figur 6). Etter sammenligningen mellom genene som er identifisert i RNA-Seq og chip-Seq, ett sett av oppregulert og ett sett med nedregulert gener ved Østradiol ble hentet. Fra de metabolske data, fikk vi to sett med opp- og ned-regulert forbindelser av Østradiol behandling. Neste vi brukte Metscape, en app for Cytoscape, for å visualisere og tolke genuttrykk og metabolske data i sammenheng med menneskets metabolisme 15. Først valgte vi å inkludere elementer av forbindelsen, reaksjon, enzym, og genet i nettverket. Vi valgte forbindelser / gener som spørring og to nettverk av E2 oppregulering (figur 7A) og ned-regulation (figur 7B) ble vist. Den Metscape gir også en mulighet til å bygge nettverk på selektive veier. For eksempel bruker samme sett av data som bygger nedregulert samlede nettverket, ble et delnettverk av androgen-østrogenbiosyntese og metabolisme sti som genereres ved å bytte spørringen fra det sammensatte / genet til spesifikk sti. Genene eller forbindelser med betydelige endringer ble fremhevet i lysere farge. Foruten å velge en bestemt vei fra rullegardinvindu som beskrevet, kan man også lage en sub-nettverk ved å bruke "skape subnettet" -funksjonen til det valgte området. Som vist i figur 6A og B, ERα aktivering og direkte binding til genet regulatoriske områder påvirket mange metabolske baner i brystkreftceller. Denne integrerende analyse indikerte at, ERα binder direkte til og regulerer ekspresjon av FASN genet, noe som er viktig for de novo fettsyre biosyntesebanen (Figur 7C). I tillegg E2 behandling downregulated androgen-østrogenbiosyntese trasé ved undertrykke uttrykk for CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 og GSTM2 i disse banene.

Figur 1
Figur 1: Prosess med fremstillingen av prøver av RNA, DNA og cellelysater for RNA-Seq Chip-Seq, og Metabolomic analyse.

Figur 2
Fig. 2: Et representativt elektroferogrammet av RNA ble analysert med Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Integrity nummer (RIN), indikator for RNA-kvalitet, ble gitt av den analyse som 9,9. (A) på et virtuelt bilde gel av RNA-prøve begge band av 26S og 18S er skarpe. (B) fluorescente signalene fra individuelle spor i than RNA viser at intensiteten av 28S toppen er større enn 18S topp og ingen forurensning er sett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. En representant kvalitetssjekk på RNA-Seq rådata En av kjøretøyet prøven er sekvensdata ble analysert ved hjelp FastQC. (A) Et sekvenslengde fordeling av biblioteket som er 100 bp. (B) Kvaliteten poengsum langs posisjon i lese. (C) Kvaliteten poengsum per sekvens viste universell høy kvalitet på alle sekvenser. (D) GC-innhold per lese matchet teoretisk fordeling. Klikk her for å se et laRger versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Gel elektroforese av de sonikerte kromatin fragmenter 5 ul av cellelysatet fra hver prøve ble kjørt på en 1,5% agarosegel med et 1000 bp pluss stige på den første kjørefelt.. Flertallet av fragmentene er mellom 300 og 600 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Oversikten over toppene som representerer metabolitter fra GC-MS Den øvre panelet viser toppene identifisert i E2 behandlede prøvene mens den nedre panelet fra kontrollen. Den vedlagte var roms i området for å vise den eksakte metabolitten representert ved hver p EAK. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Flytskjema for Integrative clustering metoden.

Figur 7
Figur 7: visualisering av den integrerte gen-metabolitt data i Metscape (A) Et nettverk av veier oppregulert ved E2.. (B) Et nettverk av veier nedregulert av E2. (C) E2 stimulert ERα rekruttering til nærliggende regionen FASN, som er funnet å være regulert i de novo biosyntesen fettsyre nettverk generert ved å anvende subnettet funksjon.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Oppsummering av ultra-high-throughput sekvensering av RNA-Seq og chip-sekv.

Tabell 2
Tabell 2: Oversikt over topp 10 metabolitter med vesentlige endringer med E2 behandling.

Tabell 3
Tabell 3: Pathways opp- og ned-regulert av E2 behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen har vi beskrevet generasjon og integrerende analyse av RNA-Seq Chip-Seq og metabolomics data fra MCF-7 celler som er behandlet med E2. Vi har utviklet et sett med protokoller strategizing å utnytte de mest effektive metoder og brukervennlige myke varer som produserer biologisk relevant funn. Så vidt vi vet, er vår den første studien å integrere -omics data fra tre ulike analyser og identifisert nye metabolske veier som ERα direkte regulert i brystkreftceller.

transcriptomics
Det er viktig å starte med høy kvalitet RNA for en vellykket transcriptomic analyse. God praksis vil eliminere muligheten for RNA degradering, inkludert oppretting RNase-fritt benk, endre hansker ofte, lagring i -80 ° C og holde på is i bruk. Tilsetting av natten inkubasjon ved -20 ºC forbedrer RNA utvinning. For å unngå frysing og tining RNA gjentatte ganger, kan man fordele RNA for nedstrøms procedures ved isolering og rensing. For eksistensen av sekvenseringsfeil, blir QRT-PCR ved anvendelse av cDNA fra prøvene ofte utført for å verifisere de differensielt uttrykte gener som er identifisert i RNA-sekv. Derfor bør nok RNA være reservert for dette formål. Vi utfører parvise end-sekvensering som gjør oss i stand til å analysere spleisevarianter, ikke-kodende RNA og miRNAs. For å unngå høy-sekvensering kostnader, kan enkelt-end sekvensering utføres også. Sammenlignet med mikromatriser, er RNA-Seq mer følsom og er ikke begrenset til probene tilgjengelig på brikken. Vi innhente informasjon ikke bare på kodende sekvenser, men også på ikke-kodende gener og differensielt spleisede transkripter. Vi er for tiden bruker denne teknikken til å analysere transcriptomes av ulike cellelinjer etter ligand behandlinger samt vev oppnådd fra mus eksperimenter.

Cistromics
Den ultra-high-throughput sekvensering metoden krever minimalt med 5 ng ChIP DNA for bibliotek konstruksjon. I standard ChIP-Seq protokoll 18, er det anbefalt å ha minst 10 ng. Kvantifisering med fluorometri er kritisk. I denne protokoll som brukes vi dobbeltkjedet DNA påvisningsmetode for å bestemme DNA-konsentrasjon. Man kan også bruke fluorometer analyse for nøyaktig DNA kvantifisering. For forskjellene i utstyr og materialer, er det svært viktig for hver lab til å etablere sin egen lydbehandling protokollen, som genererer attraktive DNA-fragmenter størrelser. Over-klipping chip DNA kan føre til tap av anriking av target DNA mens ChIP DNA i store størrelser skape problem for effektiv sekvensering. Før du sender inn DNA-sekvensering, er det alltid viktig å verifisere anriking av noen kjente regioner av qPCR. Teknikken er fortsatt begrenset av effektiviteten og spesifisiteten av antistoffet som brukes for immunoutfellinger. For å få bindingssetet informasjon som kan sikkert brukes i komparative analyser, vi validere våre reagenser følgende kode chip-Seq standarder, 19 og bruk standardized protokoller som gir oss konsekvent datasett. Sammen med innlegget transkripsjonsfaktor bindingssetet berikelse analyse, er chip Seq fortsatt en av de beste metodene for å bestemme direkte binding av transkripsjonsfaktorer til kromatin. Vi er for tiden bruker denne protokollen for å studere rekruttering kinaser, coregulators og andre transkripsjonsfaktorer til kromatin i andre cellelinjer samt østrogen responsive mus vev.

metabolomics
For en vellykket metabolsk profilering i humane brystkreftceller, er en forsiktig prøveopparbeidelse kritisk. Mengden av celler som er i bruk og cellekultur tilstand i denne protokollen er optimal for MCF7 celler. Andre cellelinjer kan kreve mer eller mindre celler for detektering av et betydelig antall av metabolitter. Vi får rundt 100 metabolitter i hvert forsøk. Denne metoden er begrenset til deteksjon av kortlivete metabolitter eller metabolitter som er til stede ved lave konsentrasjoner. Denne metoden gir enkel USIng en enkelt prøve prep for å identifisere flere metabolitter. Vi er for tiden bruker denne teknikken til å identifisere østrogen regulert metabolitter i serum og ulike vev fra mus.

data Integration
Mange transcriptomics og cistromics studier ble gjort for å undersøke østrogen signalering og genregulering i brystkreftceller, inkludert MCF7 celler 2,5-7,20. I denne studien, for første gang, la vi metabolomics data og prøvde å antyde metabolske nettverk som er direkte regulert av ERα på ligand tillegg. Denne romanen tilnærmingen gjorde oss i stand til å pin punkt molekylære kretser regulert av østrogener som påvirker cellenes stoffskifte. Samlet sett våre funn støtter rollen ERα som en mester regulator av brystkreft biologi.

I sammendraget, tilbyr vi en detaljert kompendium av protokoller for generering av RNA-Seq Chip-Seq og metabolomics prøver fra brystkreftceller etter østrogen behandlinger og integrAtive analyse av data fra disse -omics tilnærminger. Disse protokollene vil gjøre forskerne til å gjøre tilsvarende analyse for andre transkripsjonsfaktorer, atom reseptorligander og næringsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

University of Illinois fikk en etterforsker Initiert stipend fra Pfizer Inc. ZME og YCZ mottatt lønn støtte fra denne bevilgningen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, pris ILLUSTRASJON-698-909 (ZME) og Pfizer, Inc (ZME). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av US Department of Agriculture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , Available from: http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049 (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Tags

Medisin RNA-Seq transkriptomet Chip-Seq cistrome metabolomics østrogen brystkreft
Systems Biology of Metabolic Regulation av østrogenreseptor signale i Breast Cancer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter