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Medicine

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.

Introduction

Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos 1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e outros publicaram perfis da expressão de genes associados com receptores diferentes (ERa vs ERP) 2,3, diferentes ligantes 3-5 e diferentes coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq é o principal método para analisar o transcriptoma, oferecendo maior precisão e eficiência em comparação com ba microarrayanálise de expressão gênica sed 8. ARN obtido a partir de linhas celulares de 2-4,7, tecidos ou amostras de tumor são sequenciados, mapeados para montagens genómico disponíveis e genes diferencialmente regulados são identificados. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é empregada para dissecar o fator de transcrição e coregulator ligação a locais de ligação reguladoras conhecidas cromatina. ChIP-Seq (CHIP seguido de alta sequenciamento rendimento) fornece detecção imparcial de sítios de ligação globais. Metabolômica é uma outra abordagem da biologia sistema cada vez mais usado, que mede quantitativamente, a resposta multiparamétrico dinâmica dos sistemas vivos a vários estímulos, incluindo produtos químicos e perturbações genéticas.

Ao realizar perfil metabólico global, uma leitura funcional pode ser obtido a partir de células, tecidos e sangue. Além disso, as informações a partir de experimentos transcriptoma nem sempre refletem mudanças reais no nível de enzimas que contribuem para vias bioquímicas. Combinadoanálise de dados de transcriptoma e metaboloma nos permite identificar e correlacionar mudanças na expressão gênica com alterações de metabolitos reais. Aproveitando a informação de todos esses conjuntos de dados de grande escala fornecer os detalhes mecanicistas para compreender o papel de fatores de transcrição que regulam sistemas biológicos complexos, especialmente os que dizem respeito ao desenvolvimento humano e doenças como câncer e diabetes.

A natureza complexa do genoma dos mamíferos torna difícil para integrar e totalmente interpretar os dados obtidos a partir do transcriptoma, cistrome e metaboloma experimentos. Identificar eventos de ligação funcionais que levariam a alterações na expressão de genes-alvo é importante porque os locais de ligação, uma vez funcionais são identificados; análise subsequente, incluindo transcrição de ligação (TF) análise motivo, pode ser realizado com maior precisão. Isto leva à identificação de cascatas TF biologicamente significativas e mecanismos. comparis também diretosem experimentos de RNA-Seq e chip-Seq nem sempre são possíveis desde que os dados de cada experimento têm diferentes escalas e ruídos e, em alguns casos, sinais significativos são obscurecidos pelo ruído população. Não temos conhecimento de qualquer estudo que integrou informações dessas três abordagens independentes, mas relacionados para entender a regulação metabólica direta por ERa no cancro da mama. Portanto, nosso objetivo geral neste trabalho é relacionar eventos de ligação produtivas para a expressão do gene e alterações de metabolitos. Para atingir este objetivo, integrada dados de RNA-Seq, Chip-seq e metabolômica experiências e identificou aqueles estrogênio induzida ERa eventos que levariam a mudanças de expressão de genes em vias metabólicas vinculativo. Pela primeira vez, nós fornecemos um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolômica perfis e executar a análise integrada dos dados para descobrir circuitos novo gene que regulam o metabolismo da mamalinhas celulares de cancro.

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Protocol

1. Preparação de amostras de RNA-Seq

  1. Cultura Celular e Tratamento
    1. Cultura das células MCF-7 em MEM melhorado (IMEM) mais meio de vermelho de fenol com calor a 10% de FBS inactivo, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em humidificada com 5% de CO2.
      Nota: A mesma linha de células e condições de cultura de células é utilizado ao longo do estudo.
    2. Semente de 100.000 células MCF7 por poço em placas de 6 poços. Tem triplicado para cada tratamento. No dia três, remover o meio e adicionar 2 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cada poço. Incubar as placas durante 24 h em 37 ° C em humidificada com 5% de CO2.
    3. Para colher as células, adicionar 1 ml de reagente de isolamento de ARN (ácido tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio) para cada poço e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, recolher o reagente ligado celular por pipetagem e depósito em tubos de 1,5 ml
  2. Isolamento RNA
    1. Adicionar 200 ul chloroform para 1 ml de reagente de lisado celular (1.1.3) e agitar com vortex durante 10 seg. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo, sem perturbar as outras fases.
    2. Adicionar 500 ul de isopropanol a 100% para um novo tubo com a fase aquosa transferida-, e misturar por inversão. Incubar a -20 ° C durante a noite. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 750 ul de ARNase isento de 70% de etanol por breve vórtice.
    3. Centrifugar as amostras a 6000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante, e centrifuga-se a amostra a 16000 x g durante 1 min a 4 ° C para recolher todo o etanol remanescente. Remover o etanol remanescente por pipetagem com uma ponta de gel de carregamento e definir os tubos up-side para baixo para secarem naturalmente durante 10 min. Dissolver o sedimento em 20-50 DEPC água tratada ul depenDing do tamanho dos peletes.
  3. Purificar o RNA usando RNA kit de limpeza seguindo o protocolo 4. Medir a concentração de ARN utilizando um kit de ensaio de fluorometria com base na sequência do protocolo 9.
    NOTA: DO a 260 nm é feita para determinar a concentração de ARN e proporção de DO a 260 nm e 280 nm são utilizadas para determinar a pureza da amostra. Recomenda-se a verificação da qualidade RNA utilizando o ensaio Bio-analisador.
  4. Tomar cerca de 0,5 a 1 ug de ARN purificados para sequenciação.
    NOTA: Centro de Biotecnologia prepara as bibliotecas de sequenciamento e executa emparelhado-end ler sequenciamento usando métodos detalhados anteriormente 2.

2. Preparação da amostra ChIP-Seq

  1. Cultura Celular e Tratamento
    1. Semente 500.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento.
      NOTA: Para cada puxar para baixo foram utilizados 16 placas. No dia 3, remover o meio e adicionar 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cadaprato. Tratar as células durante 45 min (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2).
  2. Crosslink e celular Colheita
    1. Adicionar 250 ul de formaldeído a 37% em 5 mL de meio para reticular cromatina, incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Pare de reticulação por lavar as células com 5 ml de gelo frio 1x MEM.
    2. Colher as células em 250 ul de tampão de lise celular (EDTA 10 mM, Tri HCl a 50, 1% de SDS, N, óxido de 0,5% de N-dimethyldodecan-1-amina) por placa.
  3. A fragmentação da cromatina
    1. Sonicar as células durante 30 seg x 8 pelo amplificador de 30 a atingir tamanhos de cromatina necessários. Arrefecer cada amostra em gelo após uma sonicação de 30 segundos.
    2. Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, e cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo.
    3. Tomar uma alíquota de 5 ul do sobrenadante e verificar o tamanho do DNA por electroforese através de 1,5% em gel de agarose como descrito anteriormente 10. O tamanho idealde ADN deverá estar entre 200-500 pb.
  4. imunoprecipitação da cromatina
    1. Economize 25 ul de lisado celular como entrada. Num tubo de 50 mL, misturar 4 ml de lisado celular com 20 ml de tampão IP (EDTA a 2 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl a 20, e 0,5% de Triton X), Anticorpo ERa (F10 500 ul e 500 ul HC- 20), e proteína e prota ProtG 500 ul revestimento de esferas magnéticas. Incubar a mistura por rotação a 4 ° C durante a noite para permitir a formação do complexo anticorpo chromatin-.
  5. Lavagens e Reverso-reticulação
    1. Usar um suporte magnético para recolher as esferas magnéticas no lado magnetizadas para remover o tampão de lavagem.
    2. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão de lavagem I (2 mM de EDTA, 20 mM de Tris HCl, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 150 mM). Para lavar bem as esferas magnéticas, sem perturbar os complexos DNA-proteína, adicionar 25 ml de tampão de lavagem lentamente ao tubo ao longo do lado, em seguida, inverter os tubos até que todas as esferas magnéticas são bem misturado with o tampão de lavagem sem parecer como um pellet. Como uma alternativa, usar o rotador para inverter o tubo. Não vortex das amostras. Lavam-se as esferas magnéticas, utilizando o mesmo método nos passos seguintes.
    3. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão II-lavagem (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 500 mM).
    4. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão Wash-III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate e 250 mM de LiCl).
    5. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão 1x TE (EDTA 1 mM e Tris HCl 10 mM) duas vezes.
    6. Elui-se o ADN em 500 ul de tampão de eluição (SDS a 1%, e NaHCO 3 10 mM) e depois atribuir a eluição de 500 ul de ADN em 4 tubos. Para o ADN a partir de entradas, eluir o DNA em 125 ul de tampão de eluição.
    7. Incubar os tubos a 65 ° C durante a noite num bloco de aquecimento. Cubra os tubos no bloco de aquecimento com folha de alumínio para manter o calor mesmo em todos os tubos. Coloque um peso sobre os tubos para mantê-los de abertura. </ Li>
  6. Isolamento de DNA
    1. Arrefecer os tubos à TA durante 5 min. Isolar o DNA dos puxar para baixo amostras utilizando o kit de isolamento de DNA Chip. Siga as instruções do fabricante.
      1. Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação a cada tubo. Se os precipitado, adicionar outro tampão de ligação 250 ul até que a solução é clara.
      2. Carregar a amostra na coluna e centrifugar a 16000 xg durante 30 seg. Lavar a amostra com 250 mL de tampão de lavagem. Lembre-se de adicionar etanol para o tampão de lavagem quando a primeira hora de usá-lo. Repetir a lavagem.
      3. Elui-se o ADN em 15 ul de tampão de eluição. Combine o DNA da mesma puxar para baixo a partir de 4 tubos para atingir cerca de 55 ADN ul.
    2. Isolar o DNA de entrada usando um Kit de Purificação de DNA.
      1. Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação em cada tubo e incubar durante 10 min. Carregar a amostra na coluna de 2 ml em collectino tubo.
      2. Lava-se a amostra com 750 ul de tampão de lavagem, centrifugar a 16000 xg durante 1 min. Repetir a centrifugação para remover qualquer tampão restante. Elui-se o ADN em 30 ul de EB.
    3. Medir a concentração de DNA Usando um comercial Fluorocromo Ensaio com Modificação 11.
      1. Diluir o tampão 20x em TE 1X TE como o tampão de ensaio para diluir as amostras de ADN e reagentes. Aqui 5 ul de DNA isolada e diluir com 50 ul em TE 1X.
      2. A partir de solução de estoque / ml de DNA de 2 ug fazer um padrão de ADN que vão desde branco para 1, 10, 100, 1000 ug / ml. Numa placa de 96 poços, alocar 25 ul de cada padrão, bem como diluição em duplicado de DNA. (Triplicate para o padrão é recomendado.)
      3. Prepara-se o reagente de trabalho, fazendo uma diluição de 200 vezes de reagente de dsDNA em tampão 1x TE em tubos de plástico. Cubra a solução reagente de trabalho com papel alumínio para evitar a luz. Adicionar 200 mL de reagente de trabalho em cada amostra. DentroCubate à temperatura ambiente durante 5 min. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a luz.
      4. Medir a fluorescência das amostras utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação a 480 nm, emissão 520 nm). Gerar a curva padrão de ADN de fluorescência em função da concentração de ADN. Determinar as concentrações das amostras com base na curva padrão de ADN gerada.
  7. Verificação da Experiência chip, utilizando qPCR
    1. Tome 2 ul isoladas DNA e diluído em 20 mL de água. Configurar a reação qPCR em triplicado pela mistura de 2,5 diluição ul DNA, 5 jul Green I PCR master mix, 1 ul primer, e 1,5 mL de água livre de nuclease.
    2. Executar o qPCR com o sistema rápido PCR em tempo real utilizando o seguinte programa: Passo 1: 95 ° C durante 60 seg, Passo 2: 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 60 seg, repita a etapa 2 39 vezes.
  8. Enviar amostra de DNA de 10 ng do centro Biotech para a sequenciação.
    NOTA: A Biotech centro prepara o DNA ChIP em bibliotecas de acordo com a instrução, e realiza sequenciamento single-lidos usando métodos detalhados anteriormente 2.

3. Metabolomics Ensaio Preparação de Amostras

  1. Cultura Celular e Tratamento
    1. Semente 400.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento preparar três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia três, remover o meio e adicionam-se 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 às células. Tratar as células durante 24 h (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2).
  2. Coleta de Amostras
    1. Adicionar 5 ml gelada 1x PBS para o prato, aspirar o PBS depois inclinando brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes, e remover tanto quanto possível PBS após a última lavagem.
    2. Adicionar 750 ul de acetona pré-frio a cada placa e raspar as células. Combinam-se as células em acetona a partir de duas placas empara um tubo de 2 mL em gelo.
    3. contagem de células para a normalização
      1. Para cada tratamento, usar duas placas extras para quantificação de células. Para de-anexar as células da placa, adicionar 2 ml de HE tampão (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de NaHCO3, e EDTA 1 mM) em cada placa e incubar por 5 min.
      2. Recolha e misturar bem as células por pipetagem de células no tampão de HE. Utilize total de solução de células ul 20 para contar o número de células usando um hemocitômetro.
  3. Armazenar as amostras a -80 ° C antes de a enviar para o centro de Metabolómica para identificar e quantificar os metabolitos usando análise por espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa (GC-MS).

4. Análise integrativa

  1. ARN-SEQ de Análise de Dados:
    1. Faça a verificação da qualidade dos arquivos FASTQ usando FastQC: Leia QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Selecione FastQC: Leia sob a ferramenta de NGS: QC e manipulação. Faça o upload do arquivo de dados brutos de histor atualy.
        NOTA: Recomenda-se para dar um título para o arquivo de saída para lembrá-lo que o trabalho foi para uma vez que pode haver várias saídas.
    2. Executar e o arquivo de saída aparecerá sob a História. Repita o mesmo procedimento para cada arquivo sequência. adaptadores guarnição usando clip sob NGS: FASTX Toolkit.
    3. Alinhar lê para hg19 usando Tophat2 com anotação da referência RefSeq genoma 12 (valores padrão).
      1. Selecione Tophat2 sob ferramenta de NGS: análise de RNA. Indique a biblioteca emparelhado tipo (single-end vs emparelhado-end).
      2. Faça o upload do arquivo de entrada FASTQ da história atual. Selecione o genoma de referência. Escolha configurações padrão. Ou utilize a lista de parâmetros completa para modificar.
      3. Executar e ele vai produzir dois arquivos de saída: uma é UCSC trilha leito de entroncamentos; outro é uma lista de alinhamentos de leitura em formato BAM.
    4. Fazer upload de arquivos BAM ao seqüenciamento ferramenta de análise de dados. Calcular os valores de expressão utilizando QuantFerramenta ification.
    5. Identificar genes diferencialmente up-regulamentados usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança> 2 e valor de p <0,05. Da mesma forma, identificar os genes diferencialmente regulada para baixo usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança <0,5 e valor de p <0,05.
  2. ChIP-Seq Análise de Dados:
    1. Alinhar FASTQ Lê até o hg19 usando Bowtie2 13 (valores padrão) no Galaxy.
      1. Selecione Bowtie2 sob a ferramenta de NSC: Mapping. Verifique se a biblioteca é emparelhado-mate (single-end vs emparelhado-end). O upload do arquivo FASTQ da história atual.
      2. Selecione o genoma de referência. Use os parâmetros predefinidos. Executar e que irá produzir arquivo de saída com a sequência mapeada lê como arquivo BAM. Repita o procedimento para cada arquivo sequência.
    2. Identificar picos usando MACS 14 um p-valor de corte de 6.0E-7 e FDR de 0,01, conforme descrito anteriormente 2.
    3. Metabolómica Análise de Dados:
      1. Converter nomes químicos dos metabolitos para KEGG_IDs.
      2. Identificar metabolitos regulados diferencialmente comparando os níveis detectados em Veículo vs. E2 amostras tratadas (um de 2 vezes de corte foi utilizada neste estudo).
    4. Análise integrativa:
      1. Identificar genes que têm sítios de ligação ERa utilizando a ferramenta de análise de dados de sequenciamento. Traduzir Regiões a função de genes utilizando 20 kb como a distância de corte.
      2. Identificar genes diferencialmente cima e para baixo-regulado de análise de dados RNA-Seq usando mudança vezes> 2 e dobre mudança <0,5, respectivamente, com o valor de p <0,05 como cortadas. Compare com a lista de ERa local de ligação contendo genes utilizando comparação diagrama de Venn.
      3. Use esta lista para identificar E2 vias metabólicas modulados usando Metscape 15 módulo de Cytoscape.
        1. Ao selecionar módulo Metscape a partir de aplicativos, escolha Construir rede e depois via-basopção ed.
        2. Selecione o organismo (humano). Selecione o arquivo de dados de E2 lista composto regulamentada (KEGG ID), bem E2 lista gene-regulada.
        3. Escolha Composto -Reaction -Enzyme-Gene como o tipo de rede. Escolha compostos / genes como a consulta.
        4. Construir uma rede. Repita usando o E2 composto e genes regulados negativamente.

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Representative Results

transcriptomics
Para analisar genes diferencialmente expressos por tratamento E2, optamos por realizar um experimento RNA-Seq. Para além de fornecer informação sobre os níveis de mRNA, os dados de RNA-Seq também pode ser utilizado para monitorizar alterações na (RNAs longos não-codificantes, microRNAs) RNA não codificante e eventos de splicing alternativo. Nós não fornecem informações sobre a análise de genes não-codificantes ou RNAs transcritos alternativamente, desde âmbito do nosso estudo é a identificação de genes codificadores de proteínas que são importantes para a regulação metabólica. No entanto, o RNA-Seq é uma excelente maneira de obter informações sobre eventos de expressão diferencial de genes.

A fim de obter alta qualidade lê, é importante para obter alta RNA pureza. Após o isolamento de ARN que o ARN purificado utilizando um kit de ARN limpar. Infelizmente, cerca de 50% do ARN é perdida durante este processo e a quantidade de ARN de partida deve ser tomado em Consideration para se obter a quantidade necessária (100-500 ng) no final da etapa de purificação.

Foram quantificados os rendimentos de ARN utilizando ARN HS fluorómetro ensaio, o que é muito preciso e constitui o método preferido para a quantificação de ARN de baixa abundância. Em seguida, a integridade e a qualidade global das amostras de ARN foram examinadas utilizando bioanlayzer, que é uma alternativa viável para a electroforese em gel, utilizando uma quantidade mínima de ARN. A análise mostra todas as amostras têm bandas afiadas e limpas de 18S e 28S rRNAs indicando a integridade ea pureza das amostras (Figura 2B). ARN Integridade Número (NIR) foi utilizado como um padrão para controlo de qualidade de ARN. RIN 10 indica ARN intacto, RIN 6 parcialmente degradadas e RIN3 fortemente degradado 16.

Recomenda-se que o NIR para ser pelo menos 7 por experiência de sequenciação. Todas as nossas amostras de RNA recebeu valor RIN entre 9,6-9,9 <forte> (Figura 2A). Bibliotecas de sequenciação foram construídos a partir de 500 ng de ARN de alta qualidade a partir de cada amostra utilizando o sistema de sequenciação de ultra-high-throughput tais como Ilumina 2500. Em média 18000000 sequenciação de alta qualidade leituras foram obtidas para cada amostra (Tabela 1), que estava pronto para jusante análise. Para verificar a qualidade geral dos dados brutos sequência de alto rendimento, FastQC foi executado por de cada amostra lê. Um relatório FastQC representante para os dados de um veículo RNA-Seq foi mostrado (Figura 3). O comprimento da sequência da maioria lê foi de cerca de 100 pb (Figura 3A). Para cada leitura, o índice de qualidade foi 32-34 para a primeira 5 pb e 36-38 de 6-100bp (Figura 3B). Entre 17.990.863 lê gerado a partir desta amostra, a maioria deles teve pontuação maior qualidade do que 34 (Figura 3C). O conteúdo GC por leitura na sequência também seguiram a distribuição normal com uma média de 48% GC. No geral, a qualidadepontuação das leituras era muito alta.

análise Cistromic de sítios de ligação ERa
Para atingir o sequenciamento eficiente de profundidade, obtendo-se fragmentos de ADN com o tamanho desejável é um dos factores importantes. Abordagens de sequenciamento atuais podem ter diferentes requisitos sobre os fragmentos de DNA, por exemplo 300-600 pb para o sistema de sequenciamento de ultra-alto rendimento, 100-200 pb para AB / SOLiD 17. Nesta experiência, a maioria dos fragmentos de ADN estão entre 300 pb e 600 pb como mostrado em gel (Figura 4). Como alternativa, os leitores podem escolheu para preparar a sua cromatina utilizando MNase digestão, no entanto, sentir o nosso protocolo estabelecido fornece as amostras necessárias com alta qualidade e fornece resultados reprodutíveis. Dez ng de DNA de cada tratamento e a sua amostra de entrada correspondente foi preparado em tampão de EB. O DNA chip foi leitura única sequenciado utilizando o sistema de sequenciação de ultra-alto rendimento. Amostras de DNA ChIP rendeu cerca de20000000 lê enquanto o ADN de entrada produziu mais de 35.000,000 lê-se (Tabela 1).

Metabolomics
Para quantificar os metabolitos em células de mamíferos usando GCMS, pelo menos 10? G de massa celular são necessárias. Começamos com 400.000 células MCF7 com os experimentos. No momento da colheita, havia cerca de 500000 células em cada placa. A visão geral dos metabólitos representados por picos foram comparadas entre o controle e a amostra tratada Estradiol (Figura 5). Cerca de 100 metabolitos foram identificados, os quais contam para 60% do total conhecido em mamíferos. Aqui apresentamos uma lista dos 10 melhores metabólitos, que mostram alterações significativas no tratamento E2 (Tabela 2). Em geral, E2 upregulated vias incluindo a frutose e manose metabolismo, metabolismo histidina, metabolismo da purina, a biossíntese do colesterol e o metabolismo da vitamina B3. As vias foram regulados negativamente butanoato metabolism, biossíntese de ácido gordo de novo, via das pentoses fosfato, do ciclo da ureia e do metabolismo de arginina (Tabela 3).

A análise dos dados e integração
Os dados de RNA-Seq, Chip-Seq e GC-MS foram processados ​​e analisados ​​por meio de uma série de etapas (Figura 6). Após a comparação entre genes identificados no RNA-Seq e chip-Seq, um conjunto de up-regulada e um conjunto de genes regulados por baixo de Estradiol foram extraídos. A partir dos dados metabólicas, obteve-se dois conjuntos de compostos para cima e para baixo regulamentados pelo tratamento Estradiol. Em seguida usamos Metscape, um aplicativo para Cytoscape, para visualizar e interpretar a expressão do gene e dados metabólicos no contexto do metabolismo humano 15. Primeiro nós escolhemos a incluir elementos de composto, reação, enzima, e gene na rede. Nós selecionamos os compostos / genes como consulta e duas redes da E2-regulação (Figura 7a) e baixo-regulação (Figura 7B) foram mostrados. O Metscape também fornece uma opção para construir redes em vias seletivas. Por exemplo, utilizando o mesmo conjunto de dados como a construção da rede global regulada para baixo, uma sub-rede de biossíntese e metabolismo via androgénio-estrogénio foi gerado por interrupção da consulta a partir do composto / gene a via específica. Os genes ou compostos com mudanças significativas foram destaque na cor mais brilhante. Além de selecionar uma via específica da janela drop-down como descrito, pode-se também criar uma sub-rede, aplicando a função "criar sub-rede" para a área escolhida. Como mostrado na Figura 6A e B, ERa de activação e de ligação directa para as regiões reguladoras de genes impactado muitas vias metabólicas em células de cancro da mama. A análise indicou que integrativa, ERa liga-se directamente para e regula a expressão do gene FASN, o que é importante para de novo a biossíntese de ácidos gordos via (Figura 7C). Além disso tratamento E2 subregulado vias de biossíntese de andrógenos-estrogénio reprimindo expressão de CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 e GSTM2 nestas vias.

figura 1
Figura 1: Fluxo de trabalho da preparação de amostras de RNA, DNA e lisados ​​celulares para o RNA-Seq, Chip-Seq, e análise metabolômica.

Figura 2
Figura 2:. Um representante electroferograma dos ARN analisados ​​com Agilent Bioanalyzer 2100 Número de Integridade de ARN (NIR), indicador da qualidade do ARN, foi determinado pela análise de 9,9. (A) Em um retrato gel virtual do RNA provar ambas as bandas de 26S e 18S são nítidas. (B) Os sinais fluorescentes de rastreio indivíduo em tele RNA mostra que a intensidade do 28S pico é maior do que 18S de pico e nenhuma contaminação é visto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Um representante verificação de qualidade sobre os dados brutos de RNA-Seq Um dos dados de sequência da amostra foi analisada utilizando veículo FastQC. (A) A distribuição do comprimento de sequência da biblioteca que é 100 pb. (B) O escore de qualidade ao longo da posição na leitura. (C) O escore de qualidade por sequência mostrou o universal de alta qualidade de todas as sequências. (D) O conteúdo GC per leitura combinava com a distribuição teórica. Por favor clique aqui para ver a laversão rger desta figura.

Figura 4
Figura 4: A electroforese em gel dos fragmentos de cromatina sonicadas 5 ul de lisado de células de cada amostra foi corrida num gel de agarose a 1,5% com uma pb 1000 acrescido de escada na primeira pista.. A maioria dos fragmentos são entre 300 e 600 pb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. A visão geral de picos que representam metabolitos da GC-MS O painel superior mostra os picos identificados nas amostras tratadas E2 enquanto o painel inferior do controle. A área delimitada foi acomodados em mostrar o metabolito exata representada por cada p eak. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Fluxograma do método de agrupamento Integrativa.

Figura 7
Figura 7: A visualização dos dados de genes-metabolito integrados em Metscape (A) A rede de caminhos-regulada por E2.. (B) A rede de caminhos sub-regulada por E2. (C) E2 estimulou o recrutamento ERa para a região vizinha de FASN, que se encontra a ser regulamentada no de novo rede biossíntese do ácido graxo gerado pela aplicação de função de sub-rede.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: Resumo do sequenciamento ultra-alta taxa de transferência de RNA-Seq e chip-Seq.

mesa 2
Tabela 2: Lista dos 10 melhores metabolitos com alterações significativas com o tratamento E2.

tabela 3
Tabela 3: Caminhos para cima e para baixo-regulado por tratamento E2.

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Discussion

Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis ​​que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulados em células de câncer de mama.

transcriptomics
É crítico para começar com ARN de elevada qualidade para uma análise do transcriptoma de sucesso. A boa prática irão eliminar a possibilidade de degradação de ARN, incluindo a criação de banco isenta de RNase, mudando luvas frequentemente, armazenar em -80 ° C e mantendo-se em gelo em utilização. A adição de incubação durante a noite a -20 ºC, melhora a recuperação de ARN. Para evitar congelamento e descongelamento RNA repetidamente, pode-se atribuir as RNAs para procedur jusanteES sobre o isolamento e purificação. Para a existência de erros de sequenciação, qRT-PCR utilizando o ADNc a partir das amostras é frequentemente realizada para verificar os genes diferencialmente expressos identificados no RNA-Seq. Portanto, RNA suficiente deve ser reservado para esta finalidade. Nós executamos emparelhado-end-seqüenciamento que nos permite analisar variantes de processamento, RNAs não-codificantes e miRNAs. Para evitar os custos de alta sequenciamento, sequenciamento single-final pode ser realizada também. Em comparação com micromatrizes, RNA-Seq é mais sensível e não está limitado às sondas previstas no chip. Obtemos informação não só sobre as sequências de codificação, mas também em genes não-codificantes e transcritos diferencialmente excisadas. No momento, estamos usando esta técnica para analisar transcriptomes de várias linhas celulares após os tratamentos ligando, bem como os tecidos obtidos a partir de experiências com ratos.

Cistromics
O método ultra-alto rendimento seqüenciamento requer DNA ChIP 5 ng mínimo para a construção da biblioteca. Em Ch padrãoProtocolo IP-18 Seq, recomenda-se ter pelo menos 10 ng. Quantificação com fluorometria é crítica. Neste protocolo, utilizado ensaio de detecção de DNA de fita dupla para determinar a concentração de DNA. Pode-se também usar ensaio fluorómetro para quantificação de DNA precisa. Para as diferenças de equipamentos e materiais, é muito importante para cada laboratório para estabelecer o seu próprio protocolo de ultra-sons, que gera tamanhos fragmentos de DNA desejáveis. Over-cortar o DNA ChIP pode causar perda de enriquecimento de DNAs alvo, enquanto DNA ChIP de tamanhos grandes criar problema para sequenciamento eficiente. Antes de submeter o DNA para sequenciamento, é sempre importante verificar o enriquecimento de algumas regiões conhecidas por qPCR. A técnica é ainda limitada pela eficiência e especificidade do anticorpo usado para a imunoprecipi tacões. Para obter informações sítio de ligação que poderia ser usado de forma confiável em análises comparativas, nós validar os nossos reagentes seguintes normas Chip-Seq ENCODE, 19 e utilização standarprotocolos dized que nos fornecem conjuntos de dados consistentes. Juntamente com o sítio de ligação análise de fator de enriquecimento pós transcrição, ChIP-Seq ainda é um dos melhores métodos para determinar a ligação direta de fatores de transcrição de cromatina. No momento, estamos usando esse protocolo para estudar cinases de recrutamento, coregulators e outros fatores de transcrição para cromatina em outras linhas celulares, bem como tecidos de camundongos respondem estrogênio.

Metabolomics
Para um perfil metabólico sucesso em células de câncer de mama humano, a preparação da amostra cuidadosa é crítica. A quantidade de células em utilização e as condições de cultura de células na presente protocolo é óptima para as células MCF-7. Outras linhas de células podem exigir mais ou menos células para a detecção de um número significativo de metabolitos. Obtemos cerca de 100 metabólitos em cada experimento. Este método é limitado para a detecção de metabolitos de vida curta ou metabolitos que estão presentes em baixas concentrações. Este método oferece a facilidade de using uma única preparação de amostras para identificar vários metabolitos. No momento, estamos usando esta técnica para identificar estrogênio metabolitos regulamentados no soro e vários tecidos de rato.

Integração de dados
Numerosos transcriptomics e estudos cistromics foram realizados para investigar a sinalização estrogênio e regulação de genes em células de câncer de mama, incluindo as células MCF7 2,5-7,20. Neste estudo, pela primeira vez, nós adicionamos dados metabolômica e tentou inferir redes metabólicas que estão diretamente regulados por ERa após a adição do ligando. Esta nova abordagem permitiu-nos fixar circuitos moleculares ponto regulado pelo estrogénios que afetam o metabolismo celular. No geral, nossos resultados suportam o papel de ERa como um regulador mestre da biologia do câncer de mama.

Em resumo, nós fornecemos um compêndio detalhado de protocolos para geração de RNA-Seq, amostras de chip-Seq e metabolômica de células de câncer de mama após estrogênio tratamentos e integroperatória análise dos dados obtidos a partir destes -ómicas abordagens. Estes protocolos permitirá que os investigadores a fazer análise semelhante para outros fatores de transcrição, ligantes de receptores nucleares e condições nutricionais.

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Disclosures

Universidade de Illinois recebeu uma subvenção de Investigator iniciada a partir de Pfizer Inc. ZME e YCZ recebeu apoio salarial a partir desta concessão.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, concessão ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Departamento de Agricultura dos EUA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

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References

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Medicina Edição 109 RNA-Seq transcriptoma Chip-Seq cistrome metabolômica o estrogênio o cancro da mama
Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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