Introduction
Den alkaliske komet assay måler DNA streng brud på single-celle niveau. Suspensioner af enkelte celler er indlejret i agarose på et mikroskopobjektglas, og cellerne lyseres til dannelse nucleoids, som indeholder supercoilede sløjfer af DNA. Elektroforese ved pH> 13 resulterer i tab af supercoiling i DNA loops indeholdende strengbrud, idet de frigjorte DNA-strenge migrerer mod anoden, hvilket skaber komet-lignende strukturer, som kan observeres ved fluorescensmikroskopi. Fragmenteret DNA migrerer fra "hoved" af komet i "hale" baseret på størrelsen af fragmentet, og den relative fluorescens af komet hale sammenlignet med den samlede intensitet (hoved og hale) kan anvendes til at kvantificere DNA brud 1 , to. Assayet er enkelt, følsomme, alsidig, hurtig, og relativt billig 1. Påvisningen af fragmenteret DNA forårsaget af DNA-ødelæggende midler anvendes et assay til kvantificering DNA-skader i celler eller isolerede kerner fra enkelte kdobbelt væv fra dyr behandlet med potentielt genotoksisk materiale (r). På grund af sine fordele, er in vivo comet assay anbefales som en anden in vivo genotoksicitet assay (parret med in vivo mikronukleusanalysen) for at gennemføre produkt sikkerhedsvurderinger i nuværende International Konference om Harmonisering (ICH) 3 og Den Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet (EFSA ) 4 regulatoriske retningslinier. I vores laboratorium har vi ansat analysen for at vurdere in vivo DNA skader fremkaldt af fødevareingredienser, lægemidler og nanomaterialer 5-10. Rottelever vil blive anvendt som et eksempel i denne protokol, men comet assay kan udføres med andre væv / organer fra forsøgsdyr, når blot intakte enkeltceller kan isoleres fra vævet.
Visse typer af DNA-skader er vanskelige at detektere DNA-strengbrud uden at ændre den grundlæggende alkalisk comet assay. I tilfælde af oxidativ DNA-skade, linje Bsideskift kan laves på oxidative læsioner i DNA ved fordøjelse med reparation enzymer, såsom humant 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1, der skaber pauser i 8-oxoguanine (8-oxoGua) og methyl-fapy-guanin 11. også, endonuclease III (Endo III) skaber pauser hovedsagelig på oxiderede pyrimidiner 1. tilsætningen af et enzym-fordøjelse trin gør assayet en specifik og sensitiv metode til måling af oxidativ DNA-skade in vivo 12. ved hjælp af disse assays har vi vist giftstof-induceret oxidativ DNA-beskadigelse i leveren hos rotter og mus 6-8 og i hjertet af rotter 10.
Den alkaliske komet assay har mange anvendelser i genetisk toksikologi og human bioovervågning: 1) som en opfølgning in vivo assay for genotoxins identificeret ved følsomme in vitro tests 3,13, 2) at evaluere mekanismer af miljøfremmede-induceret DNA-skader i flere væv 14, 3) at undersøge, om enkræftfremkaldende fungerer ved hjælp af en genotoksisk eller en ikke-genotoksisk virkemåde (MOA) 7, 4) for at evaluere DNA skader reparation 15, 5) at undersøge menneskelige sygdomme og erhvervsmæssig eksponering 16, og 6) som en potentiel high-throughput screening assay for organspecifik genotoksicitet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Procedurer, der involverer dyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på den amerikanske FDA / National Center for toksikologiske Research.
BEMÆRK: Undersøgelsen design beskrives her, er baseret på protokol udviklet af den japanske Center for Validering af Alternative Metoder (JaCVAM) for deres validering af in vivo gnaver alkalisk komet assay 18, og yderligere ændret på grundlag af anbefalingerne i OECD guideline TG489 19 .
1. Fremstilling
- forberedelse Slide
- Opløs regelmæssig smeltende agarose ved 1% (vægt / volumen) i phosphatbuffer (Ca2 +, Mg2 + fri og phenolrødtfrit) ved opvarmning i en mikrobølgeovn.
- Placer smeltet 1% standard agaroseopløsning i en 55 ° C vandbad og tempereres temperaturen med badet. Dip glas mikroskop glider ind i agarose løsning, bortlede eventuelle for strams agarose og tørre bagsiden af dias rene. Placer dias oprejst på en flad overflade, og lad dias til tørre ved stuetemperatur; gemme dias i tørt sted.
- Udarbejdelse af Comet assay-løsninger
- Forbered 0,5% lavtsmeltende agarose løsning. Opløs lavtsmeltende agarose i phosphatbuffer (Ca2 +, Mg2 +, og phenolrødtfrit) ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Opløsningen opbevares ved 37-45 ° C under komet slide forberedelse; kassere eventuelle resterende agaroseopløsning bagefter.
- Forbered lysisbuffer. Foretag en 100 mM opløsning af dinatrium ethylendiamintetraeddikesyre (dinatrium EDTA, hr 372,24 g / mol), 2,5 M natriumchlorid (NaCl, hr 58,44 g / mol) og 10 mM tris hydroxymethyl aminomethan (Tris Base, hr 121,14 g / mol) i renset vand, og justeres til pH 10 med 10 N natriumhydroxidopløsning (NaOH, hr 40 g / mol). På dagen for anvendelse, tilsættes Triton X100 og dimethylsulfoxid (DMSO, hr 78,13 g / mol) til opløsningen for at opnå den endelige koncentrationer af 1% og 10%, henholdsvis, og der omrøres ved 4-10 ° C i mindst 30 min før anvendelse.
- Foretag frisk enzym buffer på dagen for brug. Der fremstilles en opløsning indeholdende 40 mM 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsyre (HEPES, hr 238.3 g / mol), 100 mM kaliumchlorid (KCl, hr 74,55 g / mol), 0,5 mM dinatrium EDTA og 0,2% bovint serumalbumin (BSA, hr 66.463 g / mol) i renset vand. PH justeres til 8,0 med 10 N kaliumhydroxidopløsning (KOH, 56,1 g / mol). Der omrøres ved stuetemperatur og verificere fuldstændig opløsning før brug.
- Der laves en alkalisk pufferopløsning indeholdende 300 mM NaOH og 1 mM dinatrium EDTA i renset vand. Der omrøres ved 4-10 ° C i mindst 30 min før anvendelse. Mål pH før brug, og sørg for at pH er> 13 løsningen.
- Der fremstilles en opløsning af 0,4 M Tris Base i renset vand, og justeres til pH 7,5 med saltsyre (HCI, hr 36.46). løsningen ved 4-10 ° C opbevares. Dette neutraliserende buffer.
- Lav fresh hakning buffer på dagen for brug. Der fremstilles en opløsning indeholdende 20 mM dinatrium-EDTA og 10% DMSO i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, og phenolrødtfrit). Opbevar på is indtil brug.
- Til fremstilling farvningsopløsning, fortyndet nukleinsyre fluorescerende plet stamopløsning med Tris-borat-EDTA (TBE-buffer) ved 1: 10.000 (v / v). Beskytte opløsningen mod lys under anvendelse aluminiumsfolie. Opbevares ved 2-8 ° C og bruge med 24 timer.
2. Udarbejdelse af enkeltcellesuspensioner fra Rat Liver
- Afliv rotter med CO 2 gas følgende metoder anbefales i amerikanske Veterinary Medical retningslinjer for eutanasi af dyr: 2013 Udgave 20.
- Sæt CO 2 strømningshastigheden på 2,75. Sæt rotte i eutanasi kammer (f.eks ekssikkator krukke, rotte bur med ventileret låg) og tænd for CO 2 ved at åbne tanken ventilen. Vent i 1,5 til 2,5 min, indtil denrotte bliver bevidstløs. Forøge CO2 flow til sin maksimale indstilling. Efter ophør af respiration, forlade rotte i kammeret i ca. 1 min for at sikre eutanasi. Kontroller eutanasi ved palpating at bekræfte, at rotten ikke har nogen hjerteslag, og klemme tæerne at fastslå, at rotten ikke sit lem.
- Desinficer den hår-hud med 70% ethanol. Åbn bughulen, og fjern den intakte lever med kirurgiske sakse. Efter fjernelse af leveren, fjerne det venstre laterale lap fra den resterende lever med kirurgiske sakse. Placer venstre laterale lap på et skærebræt, og skær to tilstødende 3-4 mm tykke tværsnit ved hjælp af en engangs enægget barberblad.
- Placer en tværgående afsnit om filtrerpapir (for at forhindre krølning af afsnittet), og placer afsnittet i 10% neutral bufferet formalin (NBF). Sikre, at forholdet mellem 10% NBF til væv er 10: 1 eller større. Efter en fiksering på mindst 72 timer, procESS leveren for histopatologi (se afsnit 7 nedenfor).
- Anbring den anden tværgående leveren sektion i 5 ml iskold hakning puffer (afsnit 1.2.6) i en 6 cm petriskål og skyl 3 gange for at fjerne resterende blod.
- Overfør afsnittet leveren til en ny 2 ml centrifugerør indeholdende 1 ml iskold hakning puffer. Hak godt skyllet liver sektion med et par fine saks til at frigive cellerne. Strain cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter at fjerne eventuelle væv klumper.
- Placer enkelt celle suspension på is og bruge til at foretage dias inden for 1 time. Kontroller koncentrationen af celler ved at tælle (fx med et hæmocytometer eller elektronisk celletæller) for at sikre, at dets koncentration er ca. 2 x10 6 celler / ml.
3. Udarbejdelse af Comet Slides
- Bland et volumen af enkelt cellesuspension med 10 volumener af smeltet, 37 ° C, 0,5% lavtsmeltende agarose-opløsning (afsnit 1.2.1).Umiddelbart pipette 100 pi på et dias belagt med regelmæssig smeltepunkt agarose (afsnit 1.1). Anbring straks et dækglas over cellen-agarose blanding. Lav mindst 8 dias for hver prøve.
BEMÆRK: Alle slides skal identificeres ved et nummer eller lignende kode og deres identitet er registreret, så slides kan der scoret i en blindet måde (se 6.2.2 nedenfor). - Lå objektglassene fladt og afkøl til 4 ° C i 30 min.
- Når gelen er størknet, forsigtigt fjerne dækglas og fordybe dias i præ-kølet lysisbuffer (afsnit 1.2.2). Beskytte objektglassene mod lys og holde objektglassene i lysis buffer ved 4 ° C fra 1 time (minimum) til O / N (maksimum).
4. Enzym Behandling af Comet Slides
- Fjern 6 af de 8 slides fremstillet fra hver vævsprøve fra lyseringspuffer og skyl dem 3 x i 5 min hver med enzym-buffer (afsnit 1.2.3) ved stuetemperatur. Brug de resterende to dias for den alkaliske komet assay wed enzym-behandling (se 5.1 nedenfor). Efter skylning, fjerne overskydende væske ved dræning og duppe dias med væv.
- Fortynd hOGG1 og Endo III enzym lagre med enzym-buffer ved 1: 1.000 (v / v). Anbring på is indtil brug.
- Påfør 200 pi af følgende løsninger på de slides fremstillet fra hver behandlingsgruppe: 200 pi enzym buffer alene (2 slides anvendt som reference dias), 200 pi hOGG1 løsning (2 dias) eller 200 pi Endo III løsning (2 dias).
- Sæt objektglassene i petriskåle foret med fugtede papirhåndklæder, dækker objektglassene med parafilm, og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter for Endo III-behandlede og referencestoffer lysbilleder og 30 min for hOGG1-behandlede objektglas.
- Efter inkubation glassene skylles med destilleret vand og fortsætte behandlingen som beskrevet i 5.2, nedenfor.
5. Unwinding og elektroforese
- For slides ikke behandlet med enzymer, fjerne dias fra lysis buffer, Dræne dias og skyl en gang med kold neutralisering buffer (afsnit 1.2.5) i 5 min for at fjerne resterende vaskemiddel og salte.
- Anbring objektglassene fra trin 4.5 og 5.1 tilfældigt i en horisontal gelelektroforese tanken, undgå eventuelle mellemrum. Fyld tanken med frisk gjort pH> 13 elektroforese buffer (afsnit 1.2.4), indtil væskeniveauet bare dækker slides (undgå bobler over agarose og sørg for, at tanken er niveau). Notér pH og temperatur ved starten af DNA afvikling.
- Lad objektglassene forblive i den alkaliske puffer i 20 min for at tillade afvikling af DNA og ekspression af alkali-ansvarlige skade.
- Under afvikling, at programmet strømforsyningen producere 0,7 V / cm i elektroforese tank (V / cm = volt divideret med afstanden i cm mellem de positive og negative elektroder).
- Efter afvikling, skal du trykke på Kør-knappen på strømforsyningen. Hvis det er nødvendigt, justere den nuværende til 300 mA ved at hæve eller sænke buffer niveau. Hold the buffer niveau lige over overfladen af objektglassene. Udføre elektroforese ved 4 ° C i 20 min. Optag slide placering, temperaturen af bufferen og strømmen (ampere) ved begyndelsen og slutningen af elektroforese.
BEMÆRK: For meget buffer vil resultere i lavere spændinger, som kan forstyrre DNA migration. - Efter elektroforese, neutralisere den overskydende alkali ved forsigtigt at løfte dias fra tanken og nedsænke i neutralisering buffer (afsnit 1.2.5) i 5 min. Hæld vandet dias og gentag to gange mere.
- Fix objektglassene ved at nedsænke i kold 100% ethanol i 5 minutter. Lad dias lufttørre og sted på et tørt område til opbevaring.
6. DNA Staining, Comet Visualisering og analyse
- DNA farvning
- Placer glider på en pap eller metal bakke og tilsæt 200 pi nukleinsyre fluorescerende plet arbejdsopløsning (afsnit 1.2.7) til hvert dias og dæk med et glas cover slip. Beskyt dias fralys tillade objektglassene at forblive i kontakt med farvningsopløsning i mindst 30 minutter før scoring. Plette objektglassene i partier af 20 ad gangen.
- Før du læser hvert dias, forsigtigt skamplet væk overskydende farvning løsning, sørg for ikke at forstyrre dækglasset.
- Comet Visualisering og Scoring
- Brug et videokamera fastgjort til et fluorescensmikroskop for at se live billeder af komet slide på computerskærmen.
- Tilfældigt vælge et mikroskop felt, der indeholder celler. Ved hjælp af en mus, skal du vælge en celle. Klik på midten af "komet hovedet" med venstre klik på musen.
BEMÆRK: Computerens software beregner alle måleparametre for cellen og tilføjer data til en datafil. - Score alle cellerne i det aktuelle felt (se trin 6.2.4), og derefter bruge mikroskop kontroller scenen og skærmen videoen for at finde et andet sæt af celler. Score disse celler som beskrevet i 6.2.2.
- Score slide from højre til venstre og ned til op. Vælg omkring 10 felter tilfældigt. Under denne proces, bør enhver egnet komet celle, der vises i visningen feltet blive scoret uden fordomme.
BEMÆRK: Du må ikke score en komet, hvis et af følgende er sandt: 1) det er placeret på en af kanterne af dias; 2) to eller flere kometer overlapper; 3) der er snavs i halen; 4) software kan ikke skelne mellem hoved og hale; eller 5) farvning af kernen og / eller hale adskiller sig meget fra andre kometer på dias.
BEMÆRK: Kometer med næsten alle deres DNA fluorescens i halen ofte benævnt »pindsvin 'kometer. Hedgehog kometer bør ikke scoret, men antallet af pindsvin fundet under dias scoring registreres og rapporteres som en procentdel af det samlede antal kometer. - Analyser mindst 75 kometer pr dias, læsning to dias per organ / væv at opnå mindst 150 komet celler / prøve i alt. Efter det ønskede antal celler fra et objektglas har væreen scorede, resultatet gemmes som en regneark fil til senere dataanalyse.
7. Histopatologi Analysis
- Efter mindst 72 timer fiksering i 10% NBF, efterfulgt af væv trimning 21, rutinemæssigt behandle og integrere den venstre laterale lever lap af prøverne i en paraffin-voks baseret medium 22. Afsnit prøverne ved ca. 5 mikrometer og indsamle på objektglas.
- Farv afsnittene med hæmatoxylin & eosin (H & E):
- Varm objektglassene med paraffin vævssnit i en 60 ° C ovn i 2 timer før farvningsproceduren.
- Brug xylen at afparaffiniser siderne. Rehydrere dias med gradueret ethanol (EtOH) til en rindende vand skyl.
- Placer dias i 450 ml hæmatoxylin i 2 min og 40 sek. Skyl objektglassene med syre (2 ml iseddikesyre til 450 ml deioniseret vand) til 4 sek efterfulgt af 5 min rindende vand skyl.
- Placer gledes i 450 ml 70% EtOH indeholdende 1 ml ammoniumhydroxid i 2 min, efterfulgt af rindende vand skylles i 2 minutter og 30 sekunder, og 70% EtOH skylning i 1 min.
- Glassene inkuberes tildækket med 450 ml Eosin Y opløsning indeholdende 4 ml iseddike i 3 min.
- Dehydrer dias med gradueret EtOH. Fjern dias med xylen (tre gange 1 min hver), og hold dias i xylen indtil dækglas er placeret på dias.
- Undersøg dias ved lysmikroskopi, rekord resultater, og lønklasse ikke-neoplastiske læsioner for alvor som en (minimal), 2 (mild), 3 (moderat), eller 4 (markeret).
BEMÆRK: sværhedsgrad ansøgte om en specifik læsion er baseret på den relative andel af leveren med læsionen (minimale = <1-15%, mild = 16-35%, moderat = 36-60%, og mærket = 61- 100%).
8. Dataanalyse
- Dyret betragtes som den eksperimentelle enhed til statistiske evalueringer. DNA-beskadigelse udtrykkes som% DNA i halen.
- Oxidativ DNA skader beregnes som følger: reference- slides (ingen enzym behandling) give et skøn over de baggrund DNA streng brud (SB).
BEMÆRK: enzymbehandlede dias giver et mål for strengbrud og oxiderede baser (SB + OX). Antages en lineær dosisreaktion for% DNA i halen som en funktion af DNA-skader, subtraktion af SB fra SB + OX giver et estimat af DNA-strengbrud fra oxiderede pyrimidiner / ændrede puriner 23. - Analyser% DNA i halen som en funktion af dosis med envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts test for parvise sammenligninger af de responser i behandlede dyr til vehikelkontrollen.
BEMÆRK: Alle tests er ensidet og en p-værdi på mindre end 0,05 er sat som kriterium for statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo alkaliske komet assay blev udført i samarbejde med enzym-modificeret komet assay til at måle både direkte og oxidativ DNA-skader i leveren hos rotter behandlet med cyproteronacetat (CPA) 5. CPA er en syntetisk hormonal lægemiddel, som inducerer rotte levertumorer i en sex-specifik måde, med fem gange højere doser er nødvendige for at inducere levertumorer hos hanrotter i forhold til kvinder 24. Vi fandt, at den direkte DNA-skader produceret af CPA i leveren hos han- og hunrotter har samme køn-specifikt mønster som sin hepatotumorigenicity: en fem-fold-højere dosis af CPA er nødvendig for at inducere en signifikant stigning i DNA-skader i lever fra hanner i forhold til hunner (Figur 1).
Vi hypotesen, at den kønsspecifik komet assay resultat skyldes aktiviteten af hydroxysteroid sulfotransferase (er) (HST), som er 15 gange højerei voksne hunrotter end hos voksne mænd. HST stofskifte er et hastighedsbegrænsende trin i aktiveringen af CPA til DNA-bindende metabolit (ter) 25. I modsætning hertil CPA-induceret oxidativ DNA-beskadigelse var generelt større i mandlige end kvindelige rottelevere, og således mindre sandsynligt, at et hastighedsbegrænsende trin i tumordannelse (figur 2). Histopatologisk evaluering af levere fra CPA-behandlede rotter viste ingen tegn på agent-induceret apoptose eller nekrose (tabel 1 og 2), hvilket indikerer, at de positive komet analyseresultater ikke var en sekundær effekt af cytotoksicitet 5. Figur 1 & 2 og tabel 1 & 2 er genoptrykt med tilladelse fra Elsevier BV (reference 5).
Figur 1. DNA-skader i lever fra CPA-behandlede han- og hunrotter migasured med in vivo alkalisk komet assay. Grupper på fem syv uger gamle mandlige og kvindelige F344 rotter blev behandlet med olivenolie eller med 10, 25, 50 eller 100 mg / kg / dag CPA i olivenolie. Behandlinger blev udført ved 0, 24 og 45 timer blev rotterne aflivet ved 48 timer, og DNA-skader blev målt i lever som% hale-DNA under anvendelse af den alkaliske comet assay. CPA behandling inducerede en stigning i% hale DNA i lever fra hanrotter i en tærskel-lignende måde, med betydelige stigninger detekteres kun med de 50 og 100 mg / kg / dag doser. CPA behandling induceret DNA streng pauser i lever fra hunrotter i en nær-lineær dosisafhængig måde, med betydelige stigninger i% hale DNA påvises i alle CPA grupper. De laveste observerede Genotoksicitet Effect Levels (LOGELs) for CPA-induceret DNA-skader i lever fra kvindelige og mandlige rotter blev anslået til at være 10 og 50 mg / kg / dag. * Signifikant ved p ≤ 0,05 i forhold til køretøjet control; fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Oxidative DNA-skader i lever fra CPA-behandlede mandlige og kvindelige rotter målt med enzymet-modificerede in vivo alkalisk komet assay. Grupper på fem syv uger gamle mandlige og kvindelige F344 rotter blev behandlet med olivenolie eller med 10, 25, 50 eller 100 mg / kg / dag CPA i olivenolie. Behandlinger blev udført ved 0, 24 og 45 timer blev dyrene aflivet ved 48 timer, og enzymet modificeret komet assay blev udført under anvendelse% hale-DNA som en parameter af DNA-skader. Alle CPA doser produceret væsentlige stigninger i Endo III-følsomme DNA-skader i lever fra CPA-behandlede hanrotter; mens Endo III-sensitive DNA dAmage blev detekteret kun i hunrotter behandlet med 25, 50 og 100 mg / kg / dag CPA (A). Alle CPA doser resulterede i betydelige stigninger i hOGG1-følsomme oxidative DNA-skader i lever fra hanrotter; stigninger i hOGG1-sensitive DNA-skader blev påvist først i hunrotter behandlet med 50 og 100 mg / kg / dag CPA (B). * Signifikant ved p ≤ 0,05 i forhold til kontrollen køretøjet; fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabellerne 1 og 2. Histopatologi analyseresultater. Da cytotoksicitet kan generere falske positive komet analyseresultater, histopatologiske vurderinger for apoptotiske og / eller nekrotiske celler bør gennemføres for komet-positive væv. I den aktuelle undersøgelse blev der ikke observeret nogen CPA-induceret hepatocyt apoptose eller nekrosei lever fra både han- og hunrotter, der udelukkede muligheden for en falsk positiv komet assay respons.
| læsion | data | Dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyt cytoplasmatisk vakuolisering | læsion Count | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersøgt | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| læsion% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Gennemsnitlig Severity | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt mitose | læsion Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersøgt | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| læsion% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Gennemsnitlig Severity | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabel 1. Forekomsten af ikke-neoplastiske læsioner i lever fra køretøj og og CPA-behandlede F344 hanrotter.
| læsion | data | Dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocyt cytoplasmatisk vakuolisering | læsion Count | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøgt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| læsion% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Gennemsnitlig Severity | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt mitose | læsion Count | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøgt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| læsion% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Gennemsnitlig Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocyt Karyomegaly | læsion Count | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøgt | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| læsion% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Gennemsnitlig Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabel 2. Forekomsten af ikke-neoplastiske læsioner i lever fra køretøjer-og CPA-behandlede kvindelige F344 rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den samtidige måling af både direkte og oxidativ DNA-skader i rottelever på enkelt celle niveau. Den generelle protokol for enhver væv, hvorfra enkelte celler eller kerner kan isoleres med minimal forarbejdning-induceret DNA-beskadigelse (dvs. DNA-beskadigelse induceret ikke af testmidlet, men ved håndtering og forarbejdning af animalske væv). I vores forskning har vi udført alkaliske comet assays af celler fra knoglemarv 7,9, mave 6, nyre 9, blære 9, lunge 9, hjerte 10, brystkirtel 5, uterus 5, testis 5, og blod 5. Disse analyser kan give en hurtig, enkel og billig metode til at studere xenobiotikum-induceret DNA-skader i flere organer og væv fra forsøgsdyr. Desuden kan denne metode bruges til human biomonitering studier ved ledende analyser, for eksempel på perifert blod, ekspanderetceller i urinvejene eller den bukkale eller nasale epitel opnået fra klinisk eller erhvervsmæssigt eksponeret individer. Den grundlæggende fremgangsmåde kan også anvendes til evaluering af DNA-skader i dyrkede celler in vitro.
Når kometen analysen er integreret i akutte eller subkroniske toksikologiske undersøgelser, prøvetagning tid, dvs. tiden mellem den sidste behandling og indsamling væv, er en kritisk variabel, der nogle gange skal forenes med indsamling af andre toksikologiske data. Hvis det er muligt, bør prøveudtagning gange være baseret på tidsforløbet komet data, det tidspunkt, hvor der opnås peak plasma eller væv koncentration (Cmax), eller efter steady state opnås efter flere administrationer af testen artiklen 19. I tilfælde var kinetiske data eller vævskoncentrationer ikke er tilgængelige, OECD TG489 anbefaler gennemføre to eller flere behandlinger og indsamling af væv 2-6 timer efter den sidste behandling, eller, hvis en enkelt behandling ergennemført, prøveudtagning væv på både 2-6 og 16-26 timer efter behandlingen 19.
Det er afgørende, at længden af tid fra eutanasi til komet præparatglaspræpareringsprotokol være så kort som muligt. Det er tilrådeligt, at eksperimentel kompetence etableres ved at demonstrere færdighed i at opnå høj kvalitet enkelt cellesuspensioner hurtigt fra væv, der analyseres. Generelt bør komet slides være forberedt så hurtigt som muligt efter dyr offer, med enkelt præparat celle tager højst en time. Etablering af en historisk database til at etablere intervaller og fordelinger af negative (køretøjer) kontrol anbefales at sikre, at analysen er under behørig kontrol. Overdreven niveauer af DNA-skader kan observeres i bil / negative kontroldyr når følgende indtræffer: 1) forkert håndtering af vævet; 2) for lang tid mellem eutanasi og komet slide forberedelse; eller 3) udsættelse af enkelt cellesuspension for UV-containing lys. Etablering af en historisk database for de områder og fordelinger af positive kontroller er også stærkt anbefales at sikre, at analysen viser passende følsomhed over for kendte genotoxins. Methylmethansulfonat (MMS) blev anvendt som positiv kontrol i den aktuelle undersøgelse; ethylmethansulfonat (EMS) anbefales af JaCVAM som en positiv kontrol for in vivo-komet assay 18.
Inkorporering fordøjelser med læsionsspecifikke endonukleaser i comet assay-protokol øger følsomheden og specificiteten af assayet gennem anerkendelse af bestemte typer af DNA-læsioner-i eksemplet præsenteret her, oxideret DNA-baser. Det bør imidlertid erkendes, at nogle endonucleaser kan være i stand til at genkende og spalte på forskellige klasser af DNA-læsioner; i tilfælde af Endo III, omfatter dette læsioner ikke forbundet med oxidativ DNA-skade. En positiv Endo III-modificerede komet analyseresultat kan indikere en blandet MOA. By sammenligning hOGG1 er mere specifik for oxidative læsioner og data fra en hOOG1-modificerede assay kan være mere nyttigt for at etablere en MOA, der involverer oxidative DNA-skader 11.
Cytotoksicitet (celle apoptose og nekrose) kan medføre DNA streng brud og et falsk positivt komet analyseresultat: positive komet analyseresultater i sig selv kan ikke fortolkes som genotoksicitet. Oplysninger om cytotoksicitet er forpligtet til at etablere den biologiske relevans af et positivt komet assay resultat. Histopatologisk analyse af komet-positive væv anbefales af OECD TG489 som et relevant mål for vævstoksicitet 19. Positive komet assay data med klare beviser af væv toksicitet (celle apoptose eller nekrose) skal fortolkes forsigtigt.
In vivo alkaliske komet assay og Endo III og hOGG1-modificerede alkaliske comet assays kan anvendes på en kvantitativ måde at træffe beslutninger om genotoksicitetmiljøfremmede engagementer. De kan også anvendes til at udføre grundforskning i DNA-skader og reparation i multiple dyrevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
