Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ"א נזק חמצוני דנ"א עכברוש הכבד

Published: May 4, 2016 doi: 10.3791/53833
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Introduction

את assay השביט אלקליין מודד הפסקות גדיל DNA ברמה מתא בודד. המתלים של תאים בודדים המוטבעים agarose על שקופיות מיקרוסקופ והתאים lysed כדי ליצור nucleoids, אשר מכילים לולאות supercoiled של DNA. אלקטרופורזה ב- pH> 13 תוצאות בהפסד של supercoiling בלולאות DNA המכילות הפסקות גדיל, עם הגדילים המשוחררים של DNA נודדים לעבר האנודה, יצירת מבנים דמוי שביט שיכול להיות שנצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. DNA המקוטעת נודדת "הראש" של השביט לתוך "הזנב" בהתבסס על הגודל של השבר, ואת הקרינה היחסית של זנב השביט לעומת העוצמת הכוללת (ראש וזנב) ניתן להשתמש כדי לכמת DNA שבירת 1 , 2. Assay הוא פשוט, רגיש, צדדי, מהיר, וזול יחסית 1. הגילוי של הדנ"א מקוטעת הנגרמת על ידי סוכני נזק-DNA משמש ב assay לכימות נזק לדנ"א בתאים או מבודד גרעינים indiviרקמות כפולות של חיות שטופלו בחומר genotoxic פוטנציאלי (ים). בשל יתרונותיה, assay השביט in vivo מומלץ בתור assay עקה גנטוקסית השני in vivo (לזווג עם assay הגרעינון in vivo) לביצוע הערכות בטיחות המוצר בכנס הבינלאומי הנוכחי על Harmonisation (ICH) 3 רשות המזון האירופית לבטיחות (EFSA 4) והנחיות רגולטוריות. במעבדה שלנו, יש לנו עובדים את assay להערכת נזק DNA vivo המושרה על ידי מרכיבי מזון, תרופות, ועל ננו 5-10. כבד עכברוש ישמש כדוגמא בפרוטוקול זה, אבל assay השביט יכול להתבצע עם רקמות / איברים אחרים של חיות ניסוי, כל עוד תאי בודדים שלמים יכול להיות מבודד מן הרקמה.

סוגים מסוימים של ניזק לדנ"א קשים לזהות כמו הפסקות גדיל DNA ללא שינוי assay שביט אלקליין הבסיסי. במקרה של נזק לדנ"א חמצוני, ב גדילreaks ניתן ליצור על נגעים חמצוני ב- DNA על ידי לעכל עם אנזימים לתיקון כגון 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 אדם (hOGG1, אשר יוצרת הפסקות 8-oxoguanine (8-oxoGua) ו מתיל-fapy-גואנין 11. כמו כן, Endonuclease III (Endo III) יוצרת הפסקות בעיקר פירימידין חמצון 1. לפיכך, תוספת של צעד אנזים עיכול הופך את assay שיטה ספציפית ורגישה למדידת נזק לדנ"א חמצוני in vivo 12. ניצול מבחני אלה, שהראנו toxicant הנגרמת חימצון ל- DNA נזק בכבד של חולדות ועכברים 6-8 ו בלב חולדות 10.

את assay שביט אלקליין יש יישומים רבים טוקסיקולוגיה גנטי מסוים מופעל אדם: 1) כמו מעקב assay vivo עבור genotoxins המזוהה על ידי רגיש במבחנת בדיקות 3,13, 2) להעריך מנגנונים של ניזק לדנ"א xenobiotic הנגרמת ברקמות מרובות 14, 3) לחקור אםקרצינוגן פועלת באמצעות genotoxic או מצב שאינו genotoxic הפעולה (MOA) 7, 4) כדי להעריך תיקון DNA נזק 15, 5) לחקור מחלות אנושיות וחשיפה תעסוקתית 16, ו -6) כמו assay הקרנת תפוקה גבוהה פוטנציאל איבר ספציפי עקה גנטוקסית 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: פרוצדורות הקשורות לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) במרכז הלאומי האמריקאי FDA / לחקר טוקסיקולוגי.

הערה: מערך המחקר המתואר כאן מבוסס על הפרוטוקול שפותח על ידי המרכז היפני עבור לתיקוף השיטות החלופיות (JaCVAM) למתן התוקף שלהם של assay שביט in vivo מכרסם אלקליין 18, ובהמשך שהשתנה לפי המלצות OECD מנחת TG489 19 .

1. הכנה

  1. הכנת שקופיות
    1. ממיסים agarose ההיתוך קבוע 1% (w / v) במאגר פוספט (Ca 2+, Mg 2+ בחינם פנול אדום חינם) על ידי חימום במיקרוגל.
    2. מניחים את הפתרון agarose סטנדרטי מותכת 1% באמבט מים C ° 55 ו לאזן את הטמפרטורה עם אמבטיה. מיקרוסקופ זכוכית טובלים מחליק לתוך פתרון agarose, לנקז כל excesזה agarose ולנגב את הגב של השקופיות נקיות. מניחים את השקופיות זקוף על משטח שטוח ולאפשר השקופיות להתייבש ב RT; לאחסן את השקופיות במקום יבש.
  2. הכנת פתרונות assay שביט
    1. כן 0.5% פתרון agarose התכה נמוכה. ממיסים-התכה נמוכה agarose במאגר פוספט (Ca 2+, Mg 2+, פנול אדום חינם) על ידי חימום במיקרוגל. שמור את הפתרון ב- C ° 37-45 במהלך הכנת שקופית שביט; וזורק כל פתרון agarose הנותר לאחר מכן.
    2. כן תמוגה חיץ. בצע פתרון 100 מ"מ של חומצה ethylenediaminetetraacetic Disodium (EDTA disodium, מר 372.24 g / mol), 2.5 נתרן כלורי M (NaCl, מר 58.44 g / mol), ו -10 מ"מ טריס hydroxymethyl aminomethane (טריס הבסיס, מר 121.14 g / mol) במים מטוהרים, ולהתאים pH 10 עם 10 פתרון הידרוקסיד N נתרן (NaOH, מר 40 g / mol). ביום שימוש, להוסיף טריטון X100 ו sulfoxide דימתיל (DMSO, מר 78.13 g / mol) לפתרון להשיג תרכיזים סופייםיונים של 1% ו -10%, בהתאמה, ומערבבים ב 4-10 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
    3. הפוך חיץ אנזים טרי ביום שימוש. הכן תמיסה המכילה 40 מ"מ 2 [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-י.ל] חומצה ethanesulfonic (HEPES, מר 238.3 g / mol), 100 אשלגן כלורי מ"מ (KCl, מר 74.55 g / mol), 0.5 מ"מ EDTA disodium, ו אלבומין 0.2% שור (BSA, מר 66,463 g / mol) במים מטוהרים. התאם את ה- pH 8.0 עם 10 N פתרון אשלגן הידרוקסידי (KOH, 56.1 g / mol). מערבב ב RT ולאמת מלא פירוק לפני השימוש.
    4. הכן פתרון חיץ אלקליין המכיל 300 מ"מ NaOH ו EDTA Disodium 1 מ"מ במים מטוהרים. מערבבים ב- C ° 4-10 לפחות 30 דקות לפני השימוש. מדוד את ה- pH של התמיסה לפני השימוש ולוודא pH הוא> 13.
    5. כן פתרון של 0.4 M טריס בסיס במים מטוהרים, ולהתאים pH 7.5 עם חומצה הידרוכלורית (HCl, מר 36.46). אחסן את הפתרון ב- C ° 4-10. זה מנטרל חיץ.
    6. הפוך fריש מיותר חיץ ביום שימוש. הכן תמיסה המכילה EDTA Disodium 20 מ"מ ו 10% DMSO ב תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, Ca 2 +, Mg 2+, פנול אדום חינם). אחסן על הקרח עד לשימוש.
    7. כדי להכין פתרון מכתים, לדלל פתרון מניות כתם פלורסנט חומצות גרעין עם טריס-borate-EDTA (חיץ TBE) בשעה 1: 10,000 (v / v). הגן על פתרון מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. חנות ב 2-8 מעלות צלזיוס ולהשתמש עם 24 שעות.

2. הכנת תרחיפים תא בודד הכבד עכברוש

  1. להרדים חולדות עם CO 2 גז מהשיטות הבאות מומלץ בהנחיות האמריקאית לרפואה וטרינרית על המתת חסד של בעלי חיים: 2013 מהדורה 20.
    1. הגדר את קצב זרימת 2 CO ב 2.75. מכניסים את החולדה בתא המתת חסד (למשל, צנצנת ייבוש, מלכודת עכברים עם שמכסה) ולהדליק את ה- CO 2 על ידי פתיחת שסתום המיכל. חכה 1.5 2.5- דקות עדעכברוש מאבד את הכרתו. להגביר את זרימת CO 2 להגדרה המקסימלית שלה. לאחר הפסקת הנשימה, לעזוב את החולדה בתא כ 1 דק 'על מנת להבטיח המתת חסד. ודא המתת חסד על ידי מישוש כדי לאשר את העכברוש אין דופק, וצובטי בוהן כדי לקבוע שהחולדה לא לסגת האיבר שלה.
  2. לחטא את עור שיער עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן ולהסיר את הכבד שלם עם מספריים כירורגיות. לאחר ההסרה הכבדה, להסיר את האונה לרוחב עזבה מהכבד הנותרים עם מספרי כירורגיות. מניח את האונה לרוחב שמאלה על קרש חיתוך, וחותך לשני חלקים רוחביים עבים סמוכים 3-4 מ"מ באמצעות סכין גילוח חד פיפיות פנויה.
  3. מניחים חלק אחד רוחבי על נייר סינון (כדי למנוע סלסול של הסעיף), ומניחים עליו את סעיף לתוך שנאגרו פורמלין 10% ניטרליות (NBF). ודא כי יחס של 10% NBF לרקמות הוא 10: 1 או יותר. לאחר זמן קיבעון של לפחות 72 שעות, procESS הכבד עבור histopathology (ראה סעיף 7 להלן).
  4. מניחים את החלק הכבד רוחבי השני לתוך 5 מ"ל חיץ מתייפייף קר כקרח (סעיף 1.2.6) בצלחת 6 ס"מ פטרי ולשטוף 3 פעמים כדי להסיר דם שיורית.
  5. מעביר את החלק הכבד לצינור צנטריפוגות חדש 2 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר חיץ מתייפייף קר כקרח. לרכך את הסעיף כבד היטב שטף עם זוג מספרי בסדר לשחרר את התאים. מסננים את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר להסיר גושים ברקמה.
  6. מניחים את ההשעיה תא בודד על הקרח ולהשתמש להכנת שקופיות בתוך שעה 1. בדוק את הריכוז של תאים על ידי ספירה (למשל, עם hemocytometer או נגד תא אלקטרוני) על מנת להבטיח כי ריכוזו הוא כ 2 x10 6 תאים / מיליליטר.

3. הכנת שקופיות שביט

  1. מערבבים נפח אחד של ההשעיה תא בודד עם 10 כרכים של מותך, 37 ° C, 0.5% פתרון agarose התכה נמוכה (סעיף 1.2.1).מייד פיפטה 100 μl לשקופית מצופה agarose נקודת התכה קבועה (סעיף 1.1). מיד במקום להחליק לכסות על תערובת תאים-agarose. להפוך לפחות 8 מגלשות עבור כל דגימה.
    הערה: כל השקופיות צריכות להיות מזוהית על ידי מספר או קוד דומה וזהותם מוקלטת, כך השקופיות ניתן בקיע באופן עיוור (ראה 6.2.2, להלן).
  2. הנח את השקופיות שטוחות מגניבות 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. אחרי הג'ל יש הקרושה, בעדינות להסיר את מכסה מחליק לטבול את השקופיות חיץ תמוגה מראש צונן (סעיף 1.2.2). הגנו על שקופיות אור לשמור את השקופיות למאגר תמוגה ב 4 ° C מ 1 hr (מינימום) ל O / N (מקסימום).

4. טיפול אנזים של שקופיות שביט

  1. הסר 6 של 8 שקופיות שהוכנו מראש מכל מדגם רקמות מן המאגר תמוגה ולשטוף אותם 3x עבור 5 דקות כל אחד עם חיץ אנזים (סעיף 1.2.3) ב RT. השתמש שתי שקופיות הנותרים עבור assay השביט אלקליין without-טיפול אנזים (ראה 5.1, להלן). לאחר השטיפה, להסיר עודפי נוזלים על ידי ניקוז סופג את השקופיות עם רקמות.
  2. לדלל hOGG1 ואת אנדו III מניות אנזים עם חיץ האנזים ב 1: 1,000 (v / v). מניחים על קרח עד לשימוש.
  3. החל 200 μl של הפתרונות הבאים אל שקופיות שהוכנו מראש מכל קבוצת טיפול: 200 μl של חיץ אנזים לבד (2 מגלשות משמש שקופיות הפניה), 200 פתרון μl hOGG1 (2 שקופיות) או 200 μl אנדו III פתרון (2 שקופיות).
  4. שים את השקופיות לתוך צלחות פטרי מרופדת במגבות נייר לח, לכסות את השקופיות עם Parafilm, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עבור אנדו III שטופלו ומגלשות הפניה ו -30 דקות עבור מגלשות שטופלו hOGG1.
  5. לאחר דגירה, לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים ולהמשיך עיבוד כמתואר 5.2, להלן.

סלילת אלקטרופורזה 5.

  1. עבור שקופיות שלא טופלו אנזימים, הוצא את השקופיות מן המאגר תמוגה, לנקז את השקופיות ולשטוף פעם עם חיץ נטרול קר (סעיף 1.2.5) במשך 5 דקות כדי להסיר חומר ניקוי ומלחים שיורית.
  2. מקום שקופית מן השלבים 4.5 ו -5.1 באקראים בתוך טנק ג'ל אלקטרופורזה אופקי, הימנעות רווחים. מלאו את מיכל עם טריים pH> 13 אלקטרופורזה חיץ (סעיף 1.2.4) עד רמת נוזל רק מכסה את השקופיות (למנוע בועות על agarose ולוודא הטנק הוא רמה). רשום את pH החיץ וטמפרטורה בתחילת התרת DNA.
  3. בואו השקופיות להישאר למאגר אלקליין במשך 20 דקות, כדי לאפשר ההתרה של DNA וביטוי של נזק אלקלי עלול.
  4. במהלך ההתרה, תוכנית אספקת החשמל לייצר 0.7 V / ס"מ במיכל אלקטרופורזה (V / cm = וולט מחולק המרחק בס"מ בין אלקטרודות חיוביות ושליליות).
  5. לאחר התרה, ולחץ על כפתור ההפעלה על אספקת החשמל. במידת הצורך, להתאים את הזרם ל -300 מילי-אמפר על ידי העלאת או הורדת רמת חיץ. שמור הרמת חיץ דואר רק מעל פני השטח של השקופיות. בצע אלקטרופורזה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. רשום את מיקום שקופיות, הטמפרטורה של למאגר והזרם (אמפר) על ההתחלה והסיום של אלקטרופורזה.
    הערה: יותר מדי חיץ יגרום במתח נמוך אשר יכול להפריע גירת DNA.
  6. לאחר אלקטרופורזה, לנטרל את אלקלי העודף ידי הרמת השקופיות בעדינות מעל טנק טבילה במאגר נטרול (סעיף 1.2.5) במשך 5 דקות. מסננים את השקופיות וחזור פעמיים נוספות.
  7. תקן את השקופיות ידי טבילה באתנול 100% קרים למשך 5 דק '. אפשר השקופיות לייבוש באוויר ומניחים במקום יבש לאחסון.

6. מכתים DNA, קומט ויזואליזציה וניתוח

  1. מכתים DNA
    1. מניח את השקופיות על מגש קרטון או מתכת ולהוסיף 200 μl של פתרון עבודת כתם ניאון חומצות גרעין (סעיף 1.2.7) כל שקופית ומכסה להחליק כיסוי זכוכית. הגן על השקופיותאור לאפשר את השקופיות להישאר במגע עם הפתרון המכתים למשך 30 דקות לפחות לפני הניקוד. כתם השקופיות בקבוצות של 20 בכל פעם.
    2. לפני קריאת כל שקופית, בעדינות למחוק משם פתרון מכתים עודף, נזהר שלא להפריע את מכסה הזכוכית.
  2. ויזואליזציה שביט ניקוד
    1. השתמש מצלמת וידאו מצורף מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להציג תמונות בזמן אמת של השקופית שביט על צג המחשב.
    2. אקראי לבחור תחום מיקרוסקופ המכיל תאים. שימוש בעכבר, בחר תא. לחץ במרכז "ראש שביט" עם הכפתור השמאלי של העכבר.
      הערה: תוכנת המחשב מחשב את כל הפרמטרים המדידים של התא ומוסיפה את הנתונים לקובץ נתונים.
    3. ציון כל התאים בתחום הנוכחי (ראה שלב 6.2.4), ולאחר מכן להשתמש בפקדי השלב של מיקרוסקופ ואת הווידאו על המסך כדי למצוא קבוצה נוספת של תאים. ציון תאים אלה כמתואר 6.2.2.
    4. ציון ה- F שקופיתתקין rom לשמאל מלמטה למעלה. בחר כ -10 שדות באקראי. במהלך תהליך זה, כל תא שביט מתאים שמופיע בתחום הדעה צריך להיות בקיע ללא משוא פנים.
      הערה: אין להבקיע שביט אם כל אחד מהבאים נכון: 1) הוא ממוקם על כל הקצוות של השקופית; 2) שניים או יותר שביטים חופפים; 3) יש שאריות בזנב; 4) התוכנה לא יכולה להבדיל בין הראש לזנב או 5) המכתים של הגרעין ו / או זנב שונה מאוד שביטים אחרים בשקף.
      הערה: שביטים עם כמעט כל הקרינה DNA שלהם בזנב מכונים לעתים קרובות כמו שביטים 'קיפוד'. שביטי קיפוד לא צריכים להיות בקיע, אבל מספר הקיפודים המזוהים במהלך הניקוד שקופית צריך להיות מוקלט ודיווח כאחוז השביטים הכולל.
    5. לנתח לפחות 75 שביטים לכל שקופית, קריאת שתי שקופיות לכל רקמת איבר / להשיג לפחות 150 תאי שביט / מדגם בסך הכל. לאחר המספר הדרוש של תאים של שקופית יש להיותen הבקיע, התוצאה נשמרת כקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח נתונים מאוחר יותר.

7. ניתוח Histopathology

  1. לאחר מינימום של קיבעון 72 שעות ב 10% NBF, ואחריו רקמות זמירת 21, לעבד שגרתי ולהטביע באונה הכבדה לרוחב השמאלית של הדגימות המבוססות פרפין השעווה בינוני 22. סעיף שקופיות 5 מיקרון ולאסוף על זכוכית הדגימות ב כ.
  2. הכתם בסעיפים עם hematoxylin & eosin (H & E):
    1. מחמם את השקופיות עם חלקי פרפין הרקמה בתנור C 60 מעלות במשך שעה 2 לפני ההליך המכתים.
    2. השתמש קסילן כדי deparaffinize הצדדים. רעננותם שקופיות עם אתנול מדורגים (EtOH) כדי לשטוף במי ברז זורמים.
    3. מניחים את השקופיות 450 מ"ל של hematoxylin למשך 2 דקות ו -40 שניות. מגלשות יש לשטוף עם חומצה (2 מ"ל חומצה אצטית קרחונית 450 מ"ל דה מיונן מים) במשך 4 שניות הבאים ידי לשטוף במים זורמים מהברז 5 דקות.
    4. מניחים את החליקes ב 450 מ"ל EtOH 70% המכילה 1 מ"ל אמוניום הידרוקסיד למשך 2 דקות, ואחריו רץ לשטוף במי ברז למשך 2 דקות ו -30 שניות, ו -70 שטיפה EtOH% עבור 1 דקות.
    5. דגירה השקופיות עם פתרון 450 מ"ל Eosin Y המכילים חומצה אצטית קרחונית 4 מ"ל במשך 3 דקות.
    6. מייבשים את השקופיות עם EtOH מדורגים. נקה את השקופיות עם קסילן (שלוש פעמים 1 דקות כל אחד), וחזקים שקופיות קסילן עד תלושים לכסות ממוקמים בשקופיות.
  3. בדוק את השקופיות על ידי מיקרוסקופ אור, ממצאי שיא, ונגעים שאינם נאופלסטיות כיתה לחומרה כמו 1 (מינימאלי), 2 (קל), 3 (בינוני), או 4 (מסומן).
    הערה: דרגת חומרת מועמדותן נגע ספציפי מבוססת על חלקם היחסי של הכבד עם הנגע (= מינימאלי <1-15%; קלים = 16-35%; מתונה = 36-60%; ומסומן = 61- 100%).

ניתוח 8. נתונים

  1. החיה נחשבת יחידת ניסיוני הערכות סטטיסטיות. נזק לדנ"א מבוטא% DNא 'זנב.
  2. נזק לדנ"א חמצוני מחושב כדלקמן: השקופיות הפניה (ללא טיפול אנזים) לספק אומדן של הפסקות גדיל DNA רקע (SB).
    הערה: המגלשות שטופלו האנזים לספק מידה מסוימת של הפסקות גדיל ובסיסי חמצון (SB + OX). בהנחה מנה תגובה ליניארי עבור DNA% ב הזנב כפונקציה של נזק לדנ"א, חיסור של SB מ SB + OX נותן אומדן של הפסקות גדיל דנ"א purines פירימידין / שינו חמצון 23.
  3. ניתוח ה-% ב זנב כפונקציה של מנה ידי ANOVA חד כיווני, ואחריו המבחן של Dunnett להשוואות pairwise מהתגובות בחיות שטופלו על השליטה ברכב.
    הערה: כל בדיקות זנב אחד ו p-value של פחות מ 0.05 מוגדר כקריטריון מובהק סטטיסטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תפקידו של המוסד vivo assay השביט אלקליין בוצע בשיתוף עם assay השביט-שונה האנזים למדוד גם נזק לדנ"א ישירה חמצוני בכבד של חולדות שטופלו אצטט cyproterone (רו"ח) 5. רו"ח הוא סם סינתטי הורמונלי שגורם גידולים בכבד חולדות באופן יחסי מין ספציפי, עם פי חמישה מינונים גבוהים יותר צורך להשרות גידולים בכבד חולדות זכרים לעומת נקבות 24. מצאנו כי נזק לדנ"א ישירה המיוצר על ידי רו"ח בכבד של הזכר חולדות נקבות יש אותו דפוס ספציפי-מיניים כמו hepatotumorigenicity שלה: מנה פי חמישה-גבוה של רו"ח נדרש כדי לגרום לעלייה משמעותית נזק לדנ"א כבד זכרים לעומת נקבות (איור 1).

אנו משערים כי תוצאת assay השביט ספציפי מין בשל הפעילות של hydroxysteroid sulfotransferase (הים) (HST), הנמצאים במרחק של 15 גבוה פיאצל חולדות בוגרות מאשר זכרים בוגרים. מטבוליזם HST הוא צעד שער הגבלה בהפעלת הרו"ח כדי המטבוליט קושרי דנ"א (ים) 25. לעומת זאת, הניזק לדנ"א חמצוני מושרה רו"ח היה גדול בדרך כלל זכרים מאשר כבדי נקבה, ולכן פחות סביר להיות צעד שער הגבלה במבנה גידול (איור 2). הערכה של כבדי Histopathology חולדות שטופלו רו"ח לא הראתה כל עדות של אפופטוזיס מושרה סוכן או נימק (לוחות 1 ו -2), המציין כי תוצאות assay שביט החיוביות לא היו השפעה משנית של cytotoxicity 5. איורי 1 ו -2 ובלוחות 1 & 2 הם והודפס מחדש באישור אלסביר (הפניה 5).

איור 1
איור 1. נזק לדנ"א בכבד של גברים שטופלו רו"ח חולדות נקבות ליasured עם assay השביט in vivo אלקליין. בחמישיות בן שבעה שבועות זכר F344 הנשי חולדות טופלו עם שמן זית או עם 10, 25, 50, או 100 מ"ג / ק"ג / יום רו"ח בשמן זית. טיפולי נערכו ב 0, 24, ו -45 שעות, החולדות הוקרבו על 48 שעות, ו נזק לדנ"א נמדדה בכבד כמו DNA הזנב% באמצעות assay השביט אלקליין. טיפול רו"ח שהגדילה DNA הזנב% ב כבדי של חולדות זכרים באופן סף דמוי, עם שיראו עליות משמעותיות רק עם 50 ו -100 מ"ג / ק"ג / יום במנות. טיפול רו"ח מושרה הפסקות גדיל DNA של כבדי חולדות נקבות באופן כמעט ליניארי-תלוי-מינון, עם עליות משמעותיות DNA זנב% זוהו בכל קבוצות הרו"ח. את רמות אפקט עקה גנטוקסית נצפה הנמוך (LOGELs) בגין נזקי DNA-induced רו"ח של כבדי חולדות נקבות וזכר נאמדו להיות 10 ו -50 מ"ג / ק"ג / יום, בהתאמה. * מובהק ביחס p≤0.05 אל אסיר הרכבtrol; ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. חמצוני DNA הנזקים הכבדים של זכר רו"ח שטופלו וחולדות נקבה נמדד עם-שונה האנזים in vivo assay השביט אלקליין. בחמישיות זכר שבעה שבועות בן ו F344 הנשי חולדות טופלו עם שמן זית או עם 10, 25, 50, או 100 מ"ג / ק"ג / יום רו"ח בשמן זית. טיפולי נערכו ב 0, 24, ו -45 שעות, החיות הוקרבו על 48 שעות, ואת assay השביט-שונה האנזים נערך באמצעות DNA הזנב% כמדד של נזק לדנ"א. כל מינוני רו"ח פיק עליות משמעותיות אנדו III רגיש ניזק לדנ"א של הכבדים של חולדות זכרים שטופלו רו"ח; בעוד אנדו ד DNA III רגישamage זוהה רק בחולדות נקבות שקיבלו 25, 50, ו 100 מ"ג / ק"ג / יום רו"ח (א). כל מינוני רו"ח הביא עליות משמעותיות hOGG1 רגיש נזק לדנ"א חמצוני את הכבדים של חולדות זכרים; עליות נזק לדנ"א hOGG1 רגיש אותרו רק בחולדות נקבות שקיבלו 50 ו -100 מ"ג / ק"ג / יום רו"ח (B). * מובהק ביחס p≤0.05 לשליטה ברכב; ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לוחות 1 ו -2. תוצאות ניתוח Histopathology. מאז cytotoxicity ניתן להפיק תוצאות assay שביט חיוביות שגויות, ערכות histopathological עבור תאי אפופטוטיים ו / או נימקים צריכים להתנהל עבור רקמות שביט חיוביות. במחקר הנוכחי, לא אפופטוזיס hepatocyte הנגרם רו"ח או נימק נצפהב כבדים הן חולדות הזכרים ונקבה, אשר לא כללו את האפשרות של תגובת assay שביט חיובית כוזבת.

נֶגַע נתונים רו"ח מנה
0 מ"ג / ק"ג 10 מ"ג / ק"ג 25 מ"ג / ק"ג 50 מ"ג / ק"ג 100 מ"ג / ק"ג
Vacuolization ציטופלסמית Hepatocyte רוזן נגע 1 1 5 5 6
# בדק 6 5 5 5 6
נֶגַע% 17% < / Td> 20% 100% 100% 100%
חומרת ממוצע 1.0 1.0 1.2 1.8 2.0
מיטוזה hepatocyte רוזן נגע 0 0 5 5 6
# בדק 6 5 5 5 6
נֶגַע% 0 0 100% 100% 100%
חומרת ממוצע 0 0 1.0 1.4 1.8

תחולת טבלת 1. נגעים שאינם ממאירים בכבד של חולדות F344 זכר רכב שהיו ואת הרו"ח שטופל.

ז = "0" FO: keep-together.within-page = "1"> <td> 0
נֶגַע נתונים רו"ח מנה
0 מ"ג / ק"ג 10 מ"ג / ק"ג 25 מ"ג / ק"ג 50 מ"ג / ק"ג 100 מ"ג / ק"ג
Vacuolization ציטופלסמית Hepatocyte רוזן נגע 1 3 5 5 5
# בדק 5 5 5 5 5
נֶגַע% 20% 60% 100% 100% 100%
חומרת ממוצע 1.0 1.3 1.8 1.8 2.0
מיטוזה hepatocyte רוזן נגע 0 5 5 5 5
# בדק 5 5 5 5 5
נֶגַע% 0 100% 100% 100% 100%
חומרת ממוצע 0 1.0 1.2 1.8 2.0
hepatocyte Karyomegaly רוזן נגע 0 0 5 5 5
# בדק 5 5 5 5 5
נֶגַע% 0 100% 100% 100%
חומרת ממוצע 0 1.0 1.2 1.8 2.0

תחולת טבלה 2. נגעים שאינם ממאירים בכבד של רכב-וחולדות F344 ובנקבות מטופלות רו"ח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את המדידה במקביל של שני ניזק לדנ"א ישיר חמצוני בכבד חולדה ברמת התא הבודדה. הפרוטוקול הכללי חל על כל רקמה שממנו תאים או גרעינים יחידים יכולים להיות מבודדים עם ניזק לדנ"א נגרם עיבוד מינימאלי (כלומר, ניזק לדנ"א מושרה ולא על ידי סוכן הבדיקה, אלא על ידי הטיפול והעיבוד של הרקמות מן החי). במחקר שלנו, נהלנו מבחני שביט אלקליין על תאים מפני מח עצם 7,9, קיבה 6, כליות 9, שלפוחית ​​שתן 9, ריאות 9, לב 10, חלב בלוט 5, רחם 5, testis 5, ודם 5. מבחנים אלה יכולים לספק שיטה מהירה, פשוטה וזולה לחקר ניזק לדנ"א נגרם xenobiotic באיברים מרובים ורקמות של חיות ניסוי. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש למחקרים מסוימים מופעלים אדם על ידי מבחנים בניהול, למשל, על דם היקפי, מודבקתתאים של דרך השתן, או האפיטל buccal או אף המתקבל אנשים שנחשפו קליני או תעסוקתי. הגישה הבסיסית גם יכול לשמש להערכת נזק לדנ"א בתאים בתרבית במבחנה.

כאשר assay השביט משתלב מחקרי רעלים חריפים או subchronic, בפעם הדגימה, כלומר, הזמן שבין הטיפול האחרון וגביית הרקמות, הוא משתנה קריטי שלפעמים חייב להתפייס עם איסוף נתונים טוקסיקולוגית אחרים. במידת האפשר, פעמים הדגימה צריכה להתבסס על נתונים שביט כמובן זמן, הזמן שבו ריכוז פלזמה או רקמות השיא (CMAX) מושגת, או לאחר מצב יציב מושגת בעקבות הממשלים מרובים של המאמר הבדיקה 19. במקרים היו ריכוזי נתונים או רקמות הקינטית אינם זמינים, TG489 OECD ממליץ מנהלת שני או יותר טיפולים ואיסוף רקמות 2-6 שעות לאחר הטיפול האחרון, או, אם טיפול יחיד הואשנערך, דגימת רקמות בשני hr 2-6 ו 16-26 לאחר הטיפול 19.

זה חיוני כי משך הזמן בין המתת חסד כדי הכנת שקופית שביט להיות קצר ככל האפשר. מומלץ כי כשירות הניסיון שיקבע להפגין מומחיות בקבלת השעיות תא בודד באיכות גבוהה במהירות מן הרקמות אשר assayed. באופן כללי, מגלשות שביט אמורים להיות מוכנות בהקדם האפשרי לאחר הקרבת בעלי החיים, עם הכנת תא בודדת לוקחת לכל היותר שעה אחת. הקמת מסד נתונים היסטוריים להקים טווחי הפצות של בקרות שליליות (רכב) מומלץ מאוד על מנת להבטיח כי assay נמצאת תחת בקרה נאותה. רמות עודפות של נזק לדנ"א אפשר לראות ברכב / חיות בקרה שלילית כאשר התנאי הבא להתרחש: 1) טיפול לא נכון של רקמות; 2) זמן רב מדי בין המתת חסד והכנת שקופיות שביט; חשיפה או 3) של ההשעיה תא בודד כדי UV-containinאור g. הקמת מסד נתונים היסטוריים עבור טווחי הפצות של בקרות חיוביות גם מומלץ מאוד להבטיח כי assay מציג רגישות מתאימה כדי genotoxins ידוע. methanesulfonate מתיל (MMS) שימש כביקורת חיובית במחקר הנוכחי; sulfonate מתאן אתיל (EMS) מומלץ על ידי JaCVAM כביקורת חיובית עבור assay השביט vivo ב 18.

שילוב digestions עם endonucleases ספציפי הנגע לתוך פרוטוקול assay השביט מגביר את הרגישות והסגוליות של assay באמצעות הכרה סוגים מסוימים של DNA נגעים-בדוגמה המוצגת כאן, הבסיסים בדנ"א מושחר. עם זאת, יש להכיר בכך כי endonucleases מסוים עשוי להיות מסוגל להכיר ו ביקוע ב שיעורים שונים של נגעי DNA; במקרה של אנדו III, כולל נגעים לא קשור נזק לדנ"א חמצוני. תוצאת assay שביט חיובית אנדו III-שונה עשויה להצביע על מואה מעורבת. Bהשוואה y, hOGG1 הוא יותר ספציפי עבור נגעים חמצוני ונתונים מתוך assay hOOG1-שונה עשוי להיות שימושי יותר עבור הקמת מואה המערבת נזק לדנ"א חמצוני 11.

Cytotoxicity (תא אפופטוזיס ונימק) עלול לגרום הפסקות גדיל DNA וגם תוצאת assay שביט חיובית כוזבת: תוצאות assay שביט חיוביות בעצמם לא יכולים להתפרש עקה גנטוקסית. מידע על רעילות הנדרש לשם קביעת הרלוונטיות הביולוגית של תוצאת assay שביט חיובית. ניתוח Histopathological של רקמות שביט חיובי מומלץ על ידי ה- OECD TG489 כאמצעי הרלוונטיים של רעילות רקמות 19. נתונים assay השביט חיובי עם ראיות ברורות של רעילות רקמות (אפופטוזיס תא או נמק) יש לפרש בזהירות.

את assay השביט in vivo אלקליין ואת אנדו III- ו hOGG1-modified מבחני שביט אלקליין ניתן להשתמש באופן כמותי לקבל החלטות על עקה גנטוקסית שלחשיפות xenobiotic. הם יכולים גם לשמש כדי לערוך מחקר יסודי ב נזק לדנ"א ותיקון ברקמות בעלי חיים רבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)  Fisher 12-544-14
Microscope Slides Fisher 12-550-123
Dimethylsulfoxide (DMSO)  Fisher 67-68-5
EDTA, Disodium Fisher BP120-1
Phosphate buffered saline Fisher ICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) HyClone SH30588.02
HEPES Fisher BP310-1
Low Melting Point Agarose (LMP) Lonza 50081 NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA)  Fisher BP1356-100
pH testing paper strips (pH 7.5-14) Fisher M95873
Potassium Cloride Fisher 7447-40-7
Potassium Hydroxide Fisher 1310-58-3
slide labels (0.94 x 0.5 in.) Fisher NC9822036
Sodium Chloride (NaCl)  Fisher 7647-14-5
Sodium Hydroxide (NaOH)  Fisher 1310-73-2
SYBR™ Gold  Invitrogen S11494
Triton X-100  Fisher 9002-93-1
Trizma Base  Fisher 77-86-1
2.0 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-402-6
Cell strainer (40 µm) Fisher 22363547
Endonuclease III (Nth)  New England Biolabs M0268S Dilution 1:1,000
hOGG1  New England Biolabs M0241S Dilution 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 111 טוקסיקולוגיה גנטי חולדה כבד, Endonuclease III (Endo III) אדם 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1) הפסקות גדיל DNA DNA חמצוני נזק
<em>In vivo</em> אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook,… More

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. J. Vis. Exp. (111), e53833, doi:10.3791/53833 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter