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Biology

मापने डीएनए किनारा टूट जाता है और ऑक्सीडेटिव डीएनए में नुकसान चूहा जिगर में विवो क्षारीय धूमकेतु परख और एंजाइम संशोधित क्षारीय धूमकेतु परख में

Published: May 4, 2016 doi: 10.3791/53833
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Introduction

क्षारीय धूमकेतु परख एकल कोशिका के स्तर पर डीएनए किनारा टूट जाता है उपाय। एकल कक्षों के निलंबन एक खुर्दबीन स्लाइड पर agarose में एम्बेडेड रहे हैं और कोशिकाओं nucleoids, जो डीएनए के supercoiled छोरों शामिल फार्म के लिए lysed। पीएच> 13 परिणाम डीएनए किनारा टूट जाता है, जिसमें डीएनए से मुक्त किस्में एनोड की ओर पलायन के साथ छोरों में सुपर कॉइलिंग के नुकसान में कम से वैद्युतकणसंचलन, धूमकेतु की तरह संरचनाओं कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जा सकता है बनाने। खंडित डीएनए "पूंछ" टुकड़ा के आकार, और कुल तीव्रता (सिर और पूंछ) की तुलना में धूमकेतु की पूंछ के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति पर आधारित में धूमकेतु की 'सर' से migrates डीएनए टूटना 1 यों इस्तेमाल किया जा सकता है 2। परख, सरल, संवेदनशील, बहुमुखी, तेजी से, और अपेक्षाकृत सस्ती 1 है। डीएनए हानिकारक एजेंटों की वजह से खंडित डीएनए का पता लगाने की कोशिकाओं में डीएनए की क्षति बढ़ाता के लिए एक परख इस्तेमाल किया है या से अलग नाभिक है indiviसंभावित genotoxic सामग्री (एस) के साथ इलाज जानवरों के दोहरे ऊतकों। अपने फायदे के कारण, इन विवो धूमकेतु परख वर्तमान इंटरनेशनल (आईसीएच) 3 यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण Harmonisation पर सम्मेलन और उत्पाद सुरक्षा के मूल्यांकन के संचालन के लिए एक दूसरे में विवो genotoxicity परख (विवो micronucleus परख के साथ जोड़ा) (EFSA के रूप में सिफारिश की है ) 4 नियामक दिशानिर्देशों। हमारी प्रयोगशाला में, हम इन विवो डीएनए खाद्य सामग्री, दवाइयों, और nanomaterials 5-10 से प्रेरित नुकसान में मूल्यांकन के लिए परख कार्यरत है। चूहा जिगर इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, लेकिन धूमकेतु परख अन्य ऊतकों / प्रायोगिक पशुओं के अंगों, के रूप में लंबे समय के रूप में बरकरार एकल कक्षों के ऊतकों से अलग किया जा सकता है के साथ किया जा सकता है।

डीएनए की क्षति के कुछ प्रकार के बुनियादी क्षारीय धूमकेतु परख में संशोधन के बिना डीएनए किनारा टूट जाता है के रूप में पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है। ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति के मामले में, कतरा खreaks ऐसे मानव 8 oxoguanine डीएनए-एन-glycosylase 1 (hOGG1, जो 8-oxoguanine (8 oxoGua) और मिथाइल-fapy-गुआनिन 11 पर टूट जाता है बनाता है के रूप मरम्मत एंजाइमों के साथ पचा द्वारा डीएनए में ऑक्सीडेटिव घावों पर बनाया जा सकता है। इसके अलावा, endonuclease तृतीय (इंडो तृतीय) ऑक्सीकरण pyrimidines 1 पर मुख्य रूप से टूट जाता है बनाता है। इस प्रकार, एक एंजाइम पाचन कदम के अलावा परख विवो 12 में oxidative डीएनए की क्षति को मापने के लिए एक विशिष्ट और संवेदनशील विधि बनाता है। इन assays का उपयोग, हम दिखा दिया है चूहों और चूहों 6-8 से जिगर में और चूहों 10 के दिल में विषैला प्रेरित ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति।

1) के रूप में संवेदनशील इन विट्रो द्वारा की पहचान genotoxins के लिए विवो परख में एक अनुवर्ती 3,13 परीक्षण, 2) कई ऊतकों में जीनोबायोटिक प्रेरित डीएनए की क्षति के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए: क्षारीय धूमकेतु परख आनुवंशिक विष विज्ञान और मानव biomonitoring में कई आवेदन किया है 14, 3) एक है, तो जांच करने के लिएकैसरजन एक genotoxic या कार्रवाई के लिए एक गैर-genotoxic मोड (एमओए) 7 का उपयोग कर चल रही है, 4) डीएनए की क्षति की मरम्मत 15 का मूल्यांकन करने के लिए, 5) मानव रोगों और व्यावसायिक जोखिम 16 जांच करने के लिए, और 6) के लिए एक संभावित उच्च throughput स्क्रीनिंग परख के रूप में अंग विशेष genotoxicity 17।

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Protocol

आचार बयान: जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) विषाक्तता अनुसंधान के लिए अमेरिकी एफडीए / राष्ट्रीय केंद्र में द्वारा अनुमोदित किया गया है।

नोट: यहाँ वर्णित अध्ययन डिजाइन में विवो कृंतक क्षारीय धूमकेतु परख 18 के अपने सत्यापन के लिए वैकल्पिक तरीकों के सत्यापन के लिए जापानी केंद्र (JaCVAM) द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है, और आगे ओईसीडी दिशानिर्देश में सिफारिशों के आधार पर संशोधित TG489 19 ।

1. तैयारी

  1. स्लाइड तैयारी
    1. 1% पर नियमित रूप से पिघलने agarose भंग (डब्ल्यू / वी) फॉस्फेट बफर में (सीए 2, 2 मिलीग्राम + मुक्त और फिनोल लाल मुक्त) एक माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग द्वारा।
    2. एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघला हुआ 1% मानक agarose समाधान की जगह और स्नान के साथ तापमान संतुलित करना। डुबकी गिलास खुर्दबीन agarose समाधान में स्लाइड, किसी भी Exces बंद नालीagarose है और स्लाइड साफ की पीठ पोंछे। एक सपाट सतह पर ईमानदार स्लाइड रखें और स्लाइड आरटी पर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं; सूखी जगह में स्लाइड की दुकान।
  2. धूमकेतु परख समाधान की तैयारी
    1. 0.5% कम पिघलने agarose समाधान तैयार है। (सीए 2, 2 मिलीग्राम +, और फिनोल लाल मुक्त) फॉस्फेट बफर में agarose कम पिघलने भंग एक माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग द्वारा। धूमकेतु स्लाइड तैयार करने के दौरान 37-45 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें; किसी भी शेष agarose समाधान बाद में त्यागें।
    2. Lysis बफर तैयार करें। Disodium ethylenediaminetetraacetic एसिड (Disodium EDTA, श्री 372.24 जी / मोल), 2.5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl, श्री 58.44 जी / मोल), और 10 मिमी Tris hydroxymethyl aminomethane (Tris आधार, श्री 121.14 जी / मोल) की एक 100 मिमी समाधान करें शुद्ध पानी में, और 10 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (NaOH, श्री 40 ग्राम / मोल) के साथ 10 पीएच को समायोजित करें। उपयोग के दिन, अंतिम concentrat प्राप्त करने के लिए समाधान के लिए ट्राइटन X100 और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO, श्री 78.13 जी / मोल) जोड़ने1% और 10% क्रमशः के आयनों, और कम से कम 30 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले 4-10 डिग्री सेल्सियस पर हलचल।
    3. उपयोग की दिन पर ताजा एंजाइम बफर बनाओ। एक समाधान 40 मिमी 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-YL] ethanesulfonic एसिड (HEPES, श्री 238.3 जी / मोल), 100 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl, श्री 74.55 जी / मोल), 0.5 मिमी युक्त तैयार Disodium EDTA, और 0.2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए, श्री 66,463 जी / मोल) शुद्ध पानी में। 10 एन पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (KOH, 56.1 जी / मोल) के साथ 8.0 पीएच को समायोजित करें। आरटी पर हलचल और पूरा विघटन का उपयोग करने से पहले की पुष्टि करें।
    4. 300 मिमी NaOH और शुद्ध पानी में 1 मिमी Disodium EDTA युक्त एक क्षारीय बफर समाधान तैयार है। कम से कम 30 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले 4-10 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ। समाधान का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि पीएच> 13 है बनाने के लिए पहले के पीएच उपाय।
    5. शुद्ध पानी में 0.4 एम Tris आधार के एक समाधान तैयार है, और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल, श्री 36.46) के साथ 7.5 पीएच को समायोजित करें। 4-10 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर। यह बफर को निष्क्रिय है।
    6. एफ बनाओResh के उपयोग के दिन पर बफर क़ीमा। एक समाधान हांक बैलेंस्ड नमक के घोल में 20 मिमी Disodium EDTA और 10% DMSO युक्त (HbSS, सीए 2, 2 मिलीग्राम +, और फिनोल लाल मुक्त) तैयार करें। उपयोग करें जब तक बर्फ पर दुकान।
    7. धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, 1 पर Tris-borate EDTA (TBE बफर) के साथ न्यूक्लिक एसिड फ्लोरोसेंट दाग शेयर समाधान पतला: 10,000 (वी / वी)। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से समाधान को सुरक्षित रखें। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और 24 घंटा के साथ उपयोग करें।

2. चूहा जिगर से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी

  1. सीओ 2 गैस निम्न विधियों में पशु की इच्छामृत्यु के लिए पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल दिशानिर्देश में सिफारिश के साथ चूहों Euthanize: 2013 संस्करण 20।
    1. 2.75 पर सीओ 2 प्रवाह की दर निर्धारित करें। इच्छामृत्यु कक्ष में चूहे रखो (जैसे, desiccator जार, निकाल ढक्कन के साथ चूहा पिंजरे) और टैंक वाल्व खोलने के द्वारा सीओ 2 पर बारी। जब तक 1.5 से 2.5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करेंचूहे बेहोश हो जाता है। इसकी अधिकतम स्थापित करने के लिए सीओ 2 प्रवाह बढ़ाएँ। श्वसन की समाप्ति के बाद, लगभग 1 मिनट के लिए चैम्बर में चूहे छोड़ इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए। चूहे कोई दिल की धड़कन है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए छूकर, और पैर की उंगलियों बन्द रखो निर्धारित करने के लिए है कि चूहे अपने अंग वापस नहीं करता द्वारा इच्छामृत्यु की जाँच करें।
  2. 70% इथेनॉल के साथ बालों वाली त्वचा कीटाणुरहित। उदर गुहा खोलें और शल्य कैंची के साथ बरकरार जिगर को हटा दें। जिगर को हटाने के बाद, शल्य कैंची के साथ शेष जिगर से बाएं पार्श्व पालि हटा दें। एक काटने बोर्ड पर छोड़ दिया पार्श्व पालि प्लेस, और एक डिस्पोजेबल एकल धार धार का उपयोग दो आसन्न 3-4 मिमी मोटी अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती।
  3. फिल्टर पेपर पर एक अनुप्रस्थ अनुभाग (अनुभाग के कर्लिंग रोकने के लिए) की जगह है, और 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) में खंड जगह है। सुनिश्चित करें कि ऊतकों को 10% NBF का अनुपात 10: 1 या अधिक से अधिक। कम से कम 72 घंटा प्रोक का निर्धारण समय के बादऊतकविकृतिविज्ञानी (नीचे धारा 7 देखें) के लिए जिगर ईएसएस।
  4. 5 मिलीलीटर ठंडा नख़रेबाज़ बफर (धारा 1.2.6) में दूसरे अनुप्रस्थ जिगर खंड एक 6 सेमी पेट्री डिश में रखें और अवशिष्ट रक्त को दूर करने के लिए 3 बार कुल्ला।
  5. एक नया 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर ठंडा नख़रेबाज़ बफर युक्त ट्यूब जिगर खंड स्थानांतरण। कोशिकाओं को रिहा करने के लिए ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ अच्छी तरह से rinsed जिगर खंड कीमा। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन तनाव किसी भी ऊतक गांठ हटा दें।
  6. बर्फ पर एकल कक्ष निलंबन की जगह और 1 घंटा के भीतर स्लाइड बनाने के लिए इस्तेमाल करते हैं। गिनती (जैसे, एक hemocytometer या इलेक्ट्रॉनिक सेल काउंटर के साथ) सुनिश्चित करें कि अपनी एकाग्रता लगभग 2 x10 6 कोशिकाओं / एमएल है द्वारा कोशिकाओं की एकाग्रता की जाँच करें।

3. धूमकेतु स्लाइड्स की तैयारी

  1. पिघला हुआ के 10 संस्करणों, 37 डिग्री सेल्सियस, 0.5% कम पिघलने agarose समाधान (धारा 1.2.1) के साथ एकल कक्ष निलंबन की एक मात्रा मिलाई।इसके तत्काल बाद एक स्लाइड नियमित गलनांक agarose (धारा 1.1) के साथ लेपित पर 100 μl विंदुक। इसके तत्काल बाद सेल agarose मिश्रण पर एक कवर पर्ची जगह है। प्रत्येक नमूना के लिए कम से कम 8 स्लाइड बनाने।
    नोट: सभी स्लाइड और एक नंबर या इसी तरह के कोड द्वारा की पहचान की जानी चाहिए अपनी पहचान दर्ज की गई है, ताकि स्लाइड एक अंधा फैशन में रन बनाए जा सकते हैं (6.2.2 देखने के नीचे)।
  2. स्लाइड 30 मिनट के लिए फ्लैट और 4 डिग्री सेल्सियस तक शांत निर्धारित करना।
  3. बाद जेल जम गया है, धीरे कवर फिसल जाता हटाने और पूर्व ठंडा lysis बफर (धारा 1.2.2) में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया। प्रकाश से स्लाइड को सुरक्षित रखें और हे 1 घंटा (न्यूनतम) से 4 डिग्री सेल्सियस पर lysis बफर में स्लाइड्स रखने / एन (अधिकतम)।

4. धूमकेतु स्लाइड के एंजाइम उपचार

  1. lysis बफर से प्रत्येक ऊतक के नमूने से तैयार 8 स्लाइड के 6 निकालें और उन्हें आरटी पर एंजाइम बफर (धारा 1.2.3) के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x कुल्ला। क्षारीय धूमकेतु परख w के लिए शेष दो स्लाइड्स का उपयोगithout एंजाइम उपचार (नीचे 5.1 देखें)। rinsing के बाद, draining और ऊतकों के साथ स्लाइड सोख्ता द्वारा अतिरिक्त तरल हटा दें।
  2. 1 पर पतला एंजाइम बफर के साथ hOGG1 और इंडो III एंजाइम स्टॉक्स: 1000 (वी / वी)। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
  3. अकेले एंजाइम बफर (2 स्लाइड संदर्भ स्लाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है), 200 μl hOGG1 समाधान (2 स्लाइड) या 200 μl एंडो III समाधान (2 स्लाइड) के 200 μl: प्रत्येक इलाज के समूह से तैयार स्लाइड के लिए निम्न समाधान के 200 μl लागू करें।
  4. सिक्त कागज तौलिये के साथ लाइन में खड़ा पेट्री प्लेटों में स्लाइड रखो, Parafilm के साथ स्लाइड कवर, और इंडो III का इलाज और संदर्भ स्लाइड और hOGG1 इलाज स्लाइड्स के लिए 30 मिनट के लिए 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, आसुत जल के साथ स्लाइड कुल्ला और 5.2 में वर्णित है, नीचे के रूप में प्रसंस्करण के लिए जारी है।

5. Unwinding और वैद्युतकणसंचलन

  1. स्लाइड एंजाइमों के साथ इलाज नहीं लिए, lysis बफर से स्लाइड्स निकालें, स्लाइड नाली और अवशिष्ट डिटर्जेंट और लवण दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए ठंडे निराकरण बफर (धारा 1.2.5) के साथ एक बार कुल्ला।
  2. कदम 4.5 और एक क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन टैंक में बेतरतीब ढंग से 5.1 से जगह स्लाइड, किसी भी स्थान से परहेज। ताजा बना पीएच> 13 वैद्युतकणसंचलन बफर (धारा 1.2.4) साथ टैंक को भरने जब तक तरल स्तर सिर्फ स्लाइड शामिल किया गया (agarose के ऊपर बुलबुले से बचने और यकीन है कि टैंक स्तर है)। डीएनए तनाव के शुरू में बफर पीएच और तापमान रिकॉर्ड।
  3. स्लाइड क्षारीय बफर में रहने के 20 मिनट के डीएनए और क्षार उत्तरदायी नुकसान की अभिव्यक्ति के unwinding के लिए अनुमति देने के लिए करते हैं।
  4. तनाव के दौरान, इस कार्यक्रम के बिजली की आपूर्ति 0.7 वी / वैद्युतकणसंचलन टैंक (वी / सेमी = वोल्ट सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड के बीच सेमी में दूरी से विभाजित) में सेमी का उत्पादन।
  5. तनाव के बाद, बिजली की आपूर्ति पर रन बटन दबाएँ। यदि आवश्यक हो, ऊपर उठाने या बफर के स्तर को कम करके 300 मा के लिए वर्तमान समायोजित करें। वें रखेंई बफर स्तर सिर्फ स्लाइड की सतह से ऊपर। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना। शुरुआत और वैद्युतकणसंचलन के अंत में स्लाइड नियुक्ति, बफर के तापमान और वर्तमान (amps) रिकॉर्ड।
    नोट: बहुत ज्यादा बफर कम voltages जो डीएनए प्रवास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं में परिणाम होगा।
  6. वैद्युतकणसंचलन के बाद, धीरे 5 मिनट के लिए टैंक से स्लाइड उठाने और (धारा 1.2.5) निराकरण बफर में डुबो कर अतिरिक्त क्षार बेअसर। स्लाइड नाली और दो बार दोहराएँ।
  7. 5 मिनट के लिए ठंडे 100% इथेनॉल में डुबो कर स्लाइड्स को ठीक करें। भंडारण के लिए एक शुष्क क्षेत्र में शुष्क हवा और जगह पर स्लाइड की अनुमति दें।

6. डीएनए धुंधला, धूमकेतु दृश्य और विश्लेषण

  1. डीएनए धुंधला
    1. एक गत्ता या धातु ट्रे पर स्लाइड रखें और प्रत्येक स्लाइड के लिए न्यूक्लिक एसिड फ्लोरोसेंट दाग काम समाधान (धारा 1.2.7) के 200 μl जोड़ें और एक गिलास को कवर पर्ची के साथ कवर किया। से स्लाइड सुरक्षित रखेंप्रकाश स्लाइड स्कोरिंग पहले कम से कम 30 मिनट के लिए धुंधला समाधान के साथ संपर्क में रहने के लिए अनुमति देते हैं। एक समय में 20 के बैच में स्लाइड्स दाग।
    2. प्रत्येक स्लाइड पढ़ने से पहले, धीरे अतिरिक्त धुंधला समाधान दूर दाग, कांच कवर परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है।
  2. धूमकेतु दृश्य और स्कोरिंग
    1. कंप्यूटर मॉनीटर पर धूमकेतु स्लाइड का जीना छवियों को देखने के लिए एक वीडियो कैमरा एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी से जुड़ी प्रयोग करें।
    2. बेतरतीब ढंग से कोशिकाओं से युक्त एक खुर्दबीन के क्षेत्र चुनें। एक माउस का प्रयोग, एक सेल का चयन करें। "धूमकेतु सिर" माउस के साथ छोड़ दिया क्लिक के केंद्र पर क्लिक करें।
      नोट: कंप्यूटर सॉफ्टवेयर सेल के लिए सभी माप मानकों की गणना करता है और एक डाटा फाइल करने के लिए डेटा कहते हैं।
    3. वर्तमान क्षेत्र (कदम 6.2.4 देखें) में सभी कक्षों स्कोर, और फिर माइक्रोस्कोप के मंच नियंत्रण और परदे पर वीडियो का उपयोग कोशिकाओं का एक और सेट खोजने के लिए। 6.2.2 में वर्णित के रूप में इन कोशिकाओं स्कोर।
    4. स्कोर स्लाइड चROM सही छोड़ दिया और ऊपर से नीचे तक। चारों ओर 10 क्षेत्रों में बेतरतीब ढंग से चुनें। इस प्रक्रिया के दौरान किसी भी उपयुक्त धूमकेतु सेल उस दृश्य क्षेत्र में प्रकट होता है पूर्वाग्रह के बिना रन बनाए जाना चाहिए।
      नोट: एक धूमकेतु स्कोर नहीं है, तो निम्न में से किसी भी सच है: 1) यह स्लाइड के किनारों से किसी पर स्थित है; 2) दो या अधिक धूमकेतु ओवरलैप; 3) वहाँ पूंछ में मलबा है; 4) सॉफ्टवेयर सिर और पूंछ के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं; या 5) नाभिक और / या पूंछ का धुंधला स्लाइड पर अन्य धूमकेतु से बहुत अलग है।
      नोट: पूंछ में लगभग सभी उनके डीएनए प्रतिदीप्ति साथ धूमकेतु अक्सर 'हाथी' धूमकेतु के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। हाथी धूमकेतु रन बनाए नहीं होना चाहिए, लेकिन स्लाइड स्कोरिंग के दौरान पता चला hedgehogs की संख्या दर्ज की गई और कुल धूमकेतु का एक प्रतिशत के रूप में सूचित किया जाना चाहिए।
    5. स्लाइड के अनुसार कम से कम 75 धूमकेतु, कम से कम 150 धूमकेतु कोशिकाओं / कुल में नमूना प्राप्त करने के लिए प्रति अंग / ऊतक दो स्लाइड्स पढ़ने का विश्लेषण। एक स्लाइड से कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या के बाद होएन रन बनाए, परिणाम बाद में डेटा विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजा गया है।

7. हिस्तोपैथोलोजी विश्लेषण

  1. 10% NBF में 72 घंटा निर्धारण की एक न्यूनतम, ऊतक trimming 21 के द्वारा पीछा करने के बाद, नियमित प्रक्रिया है और एक पैराफिन मोम मध्यम 22 आधार में नमूने के बाएं पार्श्व जिगर पालि एम्बेड। धारा नमूने में लगभग 5 माइक्रोन और गिलास स्लाइड पर इकट्ठा।
  2. hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ वर्गों दाग:
    1. 2 घंटा धुंधला प्रक्रिया से पहले एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में पैराफिन ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड्स हीट।
    2. पक्षों deparaffinize को xylene का प्रयोग करें। वर्गीकृत इथेनॉल (EtOH) एक चल नल के पानी से कुल्ला करने के साथ स्लाइड्स rehydrate।
    3. hematoxylin के 450 मिलीलीटर में स्लाइड 2 मिनट और 40 सेकंड के लिए रखें। 4 सेकंड के लिए एसिड के साथ कुल्ला स्लाइड्स (450 मिलीलीटर de-ionized पानी के लिए 2 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड) 5 मिनट चल नल के पानी से कुल्ला करके निम्नलिखित।
    4. जगह खिसक450 मिलीलीटर 70% 2 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, 2 मिनट और 30 सेकंड और 1 मिनट के लिए 70% EtOH कुल्ला के लिए नल के पानी से कुल्ला चल रहा द्वारा पीछा किया युक्त EtOH में es।
    5. 450 मिलीलीटर Eosin Y 3 मिनट के लिए 4 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड युक्त समाधान के साथ स्लाइड्स सेते हैं।
    6. वर्गीकृत EtOH के साथ स्लाइड निर्जलीकरण। xylene साथ स्लाइड्स (तीन बार 1 मिनट प्रत्येक) को साफ़ करें, और xylene में स्लाइड्स पकड़ जब तक कवर फिसल जाता स्लाइड पर रखा जाता है।
  3. 1 (न्यूनतम), 2 (हल्के), 3 (मध्यम), या 4 के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी, रिकॉर्ड निष्कर्ष, और गंभीरता के लिए ग्रेड गैर नवोत्पादित घावों से स्लाइड की जांच करना (चिह्नित)।
    नोट:; हल्के = 16-35%, मध्यम = 36-60%; गंभीरता ग्रेड एक विशिष्ट घाव के लिए आवेदन किया रिश्तेदार (घाव के साथ जिगर के अनुपात में कम से कम = <1-15% पर आधारित है और चिह्नित = 61- 100%)।

8. डेटा विश्लेषण

  1. पशु सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए प्रयोगात्मक इकाई माना जाता है। डीएनए की क्षति% डी.एन. के रूप में व्यक्त किया जाता हैपूंछ में एक।
  2. ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति की गणना निम्न प्रकार है: संदर्भ स्लाइड (कोई एंजाइम उपचार) पृष्ठभूमि डीएनए किनारा टूट जाता है (एसबी) के एक अनुमान प्रदान करते हैं।
    नोट: एंजाइम का इलाज स्लाइड किनारा टूट का एक उपाय और ऑक्सीकरण कुर्सियां ​​(एसबी + बैल) प्रदान करते हैं। एक रेखीय खुराक डीएनए की क्षति के एक समारोह के रूप में पूंछ% डीएनए के लिए प्रतिक्रिया मान लिया जाये, एस.बी. + बैल से एस.बी. की घटाव ऑक्सीकरण pyrimidines / बदल purines 23 से डीएनए किनारा टूट जाता है के एक अनुमान देता है।
  3. एक तरह से एनोवा द्वारा खुराक के एक समारोह में, वाहन पर नियंत्रण करने के लिए इलाज जानवरों में प्रतिक्रियाओं के जोड़ो में तुलना के लिए Dunnett के परीक्षण के बाद के रूप में पूंछ में% डीएनए का विश्लेषण।
    नोट: सभी परीक्षण एक-पुच्छ कर रहे हैं और कम से कम 0.05 की एक पी मूल्य सांख्यिकीय महत्व के लिए कसौटी के रूप में सेट किया गया है।

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Representative Results

इन विवो क्षारीय धूमकेतु परख एंजाइम संशोधित धूमकेतु परख के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन किया गया था cyproterone एसीटेट (सीपीए) 5 के साथ इलाज चूहों के यकृत में दोनों प्रत्यक्ष और oxidative डीएनए की क्षति को मापने के लिए। महिलाओं के 24 की तुलना में नर चूहों में जिगर ट्यूमर के लिए प्रेरित करने की जरूरत ज्यादा खुराक लेने गुना पाँच सीपीए एक कृत्रिम हार्मोनल दवा है कि एक सेक्स-विशिष्ट ढंग से चूहे जिगर ट्यूमर लाती है, के साथ है। हमने पाया प्रत्यक्ष डीएनए नर और मादा चूहों के यकृत में सीपीए द्वारा उत्पादित क्षति अपनी hepatotumorigenicity के रूप में एक ही लिंग-विशिष्ट पैटर्न है कि: सीपीए के एक पांच गुना से अधिक खुराक में डीएनए की क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए प्रेरित करने की जरूरत है महिलाओं की तुलना में पुरुषों के यकृत (चित्रा 1)।

हम परिकल्पना है कि सेक्स-विशिष्ट धूमकेतु परख परिणाम hydroxysteroid sulfotransferase (एस) (एचएसटी) की गतिविधि है, जो अधिक है 15 गुना की वजह से हैवयस्क पुरुषों की तुलना में वयस्क मादा चूहों में। एचएसटी चयापचय डीएनए बाध्यकारी मेटाबोलाइट (एस) से 25 सीपीए के सक्रियण में एक दर सीमित कदम है। इसके विपरीत, सीपीए प्रेरित ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति आम तौर पर महिला चूहे यकृत की तुलना में पुरुष में अधिक से अधिक है, और इस प्रकार कम एक दर सीमित ट्यूमर गठन में कदम (चित्रा 2) होने की संभावना थी। सीपीए इलाज चूहों से यकृत की हिस्तोपैथोलोजी मूल्यांकन, एजेंट प्रेरित apoptosis या परिगलन (टेबल्स 1 और 2) के कोई सबूत नहीं दिखाया दर्शाता है कि सकारात्मक धूमकेतु परख परिणाम cytotoxicity 5 का एक माध्यमिक प्रभाव नहीं थे। आंकड़े 1 और 2 और टेबल्स 1 & 2 एल्सवियर बी.वी. (संदर्भ 5) की अनुमति के साथ reprinted रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. सीपीए इलाज नर और मादा चूहों मुझे के यकृत में डीएनए की क्षतिइन विवो क्षारीय धूमकेतु परख के साथ asured। पांच से सात सप्ताह पुराने नर और मादा चूहों के समूह F344 जैतून का तेल के साथ या के साथ इलाज किया गया 10, 25, 50, या 100 मिलीग्राम / किग्रा / जैतून का तेल में दिन सीपीए। उपचार 0, 24 में आयोजित की गई, और 45 घंटा, 48 घंटा चूहों पर बलिदान किया गया है, और डीएनए की क्षति क्षारीय धूमकेतु परख का उपयोग% पूंछ डीएनए के रूप में जिगर में मापा गया था। सीपीए उपचार एक सीमा की तरह ढंग से नर चूहों के यकृत में% पूंछ डीएनए में वृद्धि प्रेरित किया, काफी बढ़ जाती है केवल 50 और 100 मिलीग्राम / किग्रा / दिन खुराक के साथ पता लगाया जा रहा है। सीपीए उपचार के निकट एक रेखीय खुराक पर निर्भर ढंग से मादा चूहों के यकृत में डीएनए किनारा टूट प्रेरित, सभी सीपीए समूहों में पाया% पूंछ डीएनए में काफी बढ़ जाती है। निम्नतम मनाया genotoxicity प्रभाव के स्तर (LOGELs) महिला और पुरुष चूहों के यकृत में सीपीए प्रेरित डीएनए की क्षति के लिए 10 और / दिन 50 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः होने का अनुमान लगाया गया था। * वाहन चोर को p≤0.05 रिश्तेदार पर महत्वपूर्णtrol; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ऑक्सीडेटिव डीएनए सीपीए का इलाज पुरुष के यकृत और मादा चूहों में नुकसान एंजाइम संशोधित विवो में क्षारीय धूमकेतु परख के साथ मापा जाता है। पांच से सात सप्ताह पुराने नर और मादा चूहों के समूह F344 जैतून का तेल के साथ या 10 के साथ इलाज किया गया, जैतून के तेल में 25, 50, या 100 मिलीग्राम / किग्रा / दिन सीपीए। उपचार 0, 24 में आयोजित की गई, और 45 घंटा, 48 घंटा जानवरों पर बलिदान किया गया है, और एंजाइम संशोधित धूमकेतु परख डीएनए की क्षति के एक मीट्रिक के रूप% पूंछ डीएनए का उपयोग कर आयोजित किया गया। सभी सीपीए खुराक सीपीए इलाज नर चूहों के यकृत में इंडो III के प्रति संवेदनशील डीएनए की क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि का उत्पादन किया; जबकि इंडो III के प्रति संवेदनशील डीएनए घamage केवल 25, 50, और 100 मिलीग्राम / किग्रा / दिन सीपीए (ए) के साथ इलाज मादा चूहों में पाया गया था। सभी सीपीए खुराक नर चूहों के यकृत में hOGG1 के प्रति संवेदनशील ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि के परिणामस्वरूप; hOGG1 के प्रति संवेदनशील डीएनए की क्षति में बढ़ जाती है केवल 50 और 100 मिलीग्राम / किग्रा / दिन सीपीए (बी) के साथ इलाज मादा चूहों में पाया गया। * वाहन पर नियंत्रण करने के लिए p≤0.05 रिश्तेदार पर महत्वपूर्ण; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टेबल्स 1 और 2। ऊतकविकृतिविज्ञानी विश्लेषण का परिणाम है। चूंकि cytotoxicity झूठी सकारात्मक धूमकेतु परख परिणाम, apoptotic और / या परिगलित कोशिकाओं के लिए histopathological आकलन उत्पन्न कर सकते हैं धूमकेतु पॉजिटिव ऊतकों के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में, कोई सीपीए प्रेरित hepatocyte apoptosis या परिगलन मनाया गयादोनों नर और मादा चूहों, जो एक झूठी सकारात्मक धूमकेतु परख प्रतिक्रिया की संभावना को बाहर रखा के यकृत में।

चोट जानकारी खुराक सीपीए
0 मिलीग्राम / किग्रा 10 मिलीग्राम / किग्रा 25 मिलीग्राम / किग्रा 50 मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा
Hepatocyte cytoplasmic vacuolization घाव गणना 1 1 5 5 6
# जांच 6 5 5 5 6
घाव% 17% </ Td> 20% 100% 100% 100%
औसत गंभीरता 1.0 1.0 1.2 1.8 2.0
hepatocyte बँटवारा घाव गणना 0 0 5 5 6
# जांच 6 5 5 5 6
घाव% 0 0 100% 100% 100%
औसत गंभीरता 0 0 1.0 1.4 1.8

तालिका 1 वाहन और सीपीए का इलाज पुरुष F344 चूहों के यकृत में गैर नवोत्पादित घावों की घटना।

<टीडी> 0
चोट जानकारी खुराक सीपीए
0 मिलीग्राम / किग्रा 10 मिलीग्राम / किग्रा 25 मिलीग्राम / किग्रा 50 मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा
Hepatocyte cytoplasmic vacuolization घाव गणना 1 3 5 5 5
# जांच 5 5 5 5 5
घाव% 20% 60% 100% 100% 100%
औसत गंभीरता 1.0 1.3 1.8 1.8 2.0
hepatocyte बँटवारा घाव गणना 0 5 5 5 5
# जांच 5 5 5 5 5
घाव% 0 100% 100% 100% 100%
औसत गंभीरता 0 1.0 1.2 1.8 2.0
hepatocyte Karyomegaly घाव गणना 0 0 5 5 5
# जांच 5 5 5 5 5
घाव% 0 100% 100% 100%
औसत गंभीरता 0 1.0 1.2 1.8 2.0

तालिका 2 वाहन और सीपीए का इलाज महिला F344 चूहों के यकृत में गैर नवोत्पादित घावों की घटना।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एकल कोशिका के स्तर पर चूहा जिगर में दोनों प्रत्यक्ष और oxidative डीएनए की क्षति की समवर्ती माप का वर्णन है। सामान्य प्रोटोकॉल (यानी, डीएनए की क्षति प्रेरित नहीं परीक्षण एजेंट के द्वारा, लेकिन हैंडलिंग और जानवरों के ऊतकों के प्रसंस्करण) के द्वारा किसी भी ऊतक से एकल कक्षों या नाभिक न्यूनतम प्रोसेसिंग प्रेरित डीएनए की क्षति के साथ अलग किया जा सकता करने के लिए लागू है। हमारे शोध में, हम अस्थि मज्जा 7.9, पेट 6, गुर्दे 9, मूत्राशय 9, फेफड़ों 9, 10 दिल, स्तन ग्रंथि 5, गर्भाशय 5, वृषण 5, और रक्त 5 से कोशिकाओं पर क्षारीय धूमकेतु assays का आयोजन किया है। ये assays कई अंगों और प्रायोगिक पशुओं के ऊतकों में जीनोबायोटिक प्रेरित डीएनए की क्षति के अध्ययन के लिए एक त्वरित, सरल और सस्ता तरीका प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, इस विधि मानव biomonitoring अध्ययन के लिए आयोजित करने के संसाधनों द्वारा, इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए परिधीय रक्त पर exfoliatedमूत्र पथ की कोशिकाओं, या मुख या नाक epithelia चिकित्सकीय या व्यवसाय से उजागर व्यक्तियों से प्राप्त की। बुनियादी दृष्टिकोण भी इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं में डीएनए की क्षति के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

जब धूमकेतु परख तीव्र या subchronic विष विज्ञान के अध्ययन, नमूने समय, यानी में एकीकृत है, पिछले उपचार और ऊतक संग्रह के बीच का समय, एक महत्वपूर्ण चर है कि कभी कभी अन्य विषाक्तता डेटा के संग्रह के साथ मेल मिलाप किया जाना चाहिए। यदि संभव हो तो, नमूना समय समय बेशक धूमकेतु डेटा, जो समय पर शिखर प्लाज्मा या ऊतक एकाग्रता (Cmax) हासिल की है, या के बाद स्थिर अवस्था परीक्षण अनुच्छेद 19 के कई प्रशासनों के बाद हासिल की है पर आधारित होना चाहिए। मामलों में थे गतिज डेटा या ऊतक सांद्रता, उपलब्ध नहीं हैं ओईसीडी TG489 दो या दो से अधिक उपचार के संचालन और पिछले उपचार के बाद ऊतकों 2-6 मानव संसाधन इकट्ठा करने की सिफारिश की है, या, यदि एक ही इलाज हैआयोजित किया, उपचार, 19 के बाद दोनों 2-6 और 16-26 घंटा पर ऊतकों के नमूने।

यह महत्वपूर्ण है कि धूमकेतु स्लाइड तैयार करने के लिए इच्छामृत्यु से समय की लंबाई के रूप में संभव के रूप में कम हो रहा है। यह सलाह दी जाती है कि प्रयोगात्मक योग्यता ऊतकों कि यत्न कर रहे हैं से जल्दी से उच्च गुणवत्ता वाले एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने में प्रवीणता का प्रदर्शन द्वारा स्थापित किया। आम तौर पर, धूमकेतु स्लाइड के रूप में जल्द ही संभव के रूप में पशु बलि के बाद एकल कक्ष तैयारी एक घंटे की एक अधिकतम लेने के साथ तैयार किया जाना चाहिए। पर्वतमाला और नकारात्मक (वाहन) नियंत्रण के वितरण की स्थापना के लिए एक ऐतिहासिक डेटाबेस की स्थापना अत्यधिक सुनिश्चित करने के लिए परख उचित नियंत्रण में है कि सिफारिश की है। डीएनए की क्षति का अत्यधिक स्तर वाहन / नकारात्मक नियंत्रण पशुओं में मनाया जा सकती है जब निम्न होते हैं: 1) ऊतक के अनुचित हैंडलिंग; 2) भी लंबे समय से इच्छामृत्यु और धूमकेतु स्लाइड तैयारी के बीच एक समय; या 3) यूवी containin करने के लिए एकल कक्ष निलंबन के जोखिमजी प्रकाश। पर्वतमाला और सकारात्मक नियंत्रण के वितरण के लिए एक ऐतिहासिक डेटाबेस की स्थापना भी अत्यधिक विश्वास दिलाता हूं कि परख जाना जाता genotoxins करने के लिए उचित संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है की सिफारिश की है। मिथाइल methanesulfonate (एमएमएस) के वर्तमान अध्ययन में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था; एथिल मीथेन सल्फ़ोनेट (ईएमएस) में विवो धूमकेतु परख 18 के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में JaCVAM द्वारा सिफारिश की है।

धूमकेतु परख प्रोटोकॉल में घाव विशेष endonucleases के साथ digestions शामिल डीएनए के विशेष प्रकार की मान्यता के माध्यम से संवेदनशीलता और परख की विशिष्टता बढ़ जाती है घावों में उदाहरण यहां प्रस्तुत किया, ऑक्सीकरण डीएनए कुर्सियां। हालांकि, यह कुछ endonucleases पहचानने और डीएनए घावों के विभिन्न वर्गों में cleaving करने में सक्षम हो सकता है कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए; इंडो III के मामले में, इस ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति के साथ जुड़ा नहीं घावों भी शामिल है। एक सकारात्मक इंडो-III संशोधित धूमकेतु परख परिणाम एक मिश्रित एमओए संकेत हो सकता है। बीY तुलना, hOGG1 एक hOOG1 संशोधित परख से ऑक्सीडेटिव घावों और डेटा के लिए और अधिक विशिष्ट एक एमओए कि ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति 11 शामिल है स्थापित करने के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है।

Cytotoxicity (सेल apoptosis और परिगलन) डीएनए किनारा टूट जाता है और एक झूठी सकारात्मक धूमकेतु परख परिणाम में परिणाम हो सकता है: स्वयं द्वारा सकारात्मक धूमकेतु परख परिणाम genotoxicity के रूप में व्याख्या नहीं की जा सकती। cytotoxicity सूचना पर एक सकारात्मक धूमकेतु परख परिणाम के जैविक प्रासंगिकता को स्थापित करने के लिए आवश्यक है। धूमकेतु पॉजिटिव ऊतकों की Histopathological विश्लेषण ऊतक विषाक्तता 19 के एक उपाय के रूप में प्रासंगिक ओईसीडी TG489 द्वारा सिफारिश की है। ऊतक विषाक्तता (सेल apoptosis या परिगलन) के स्पष्ट सबूत के साथ सकारात्मक धूमकेतु परख डेटा ध्यान से व्याख्या की जानी चाहिए।

इन विवो क्षारीय धूमकेतु परख और इंडो III- और hOGG1 संशोधित क्षारीय धूमकेतु assays के genotoxicity के बारे में निर्णय लेने के लिए एक मात्रात्मक तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता हैजीनोबायोटिक जोखिम। उन्होंने यह भी कई जानवरों के ऊतकों में डीएनए की क्षति और मरम्मत में मौलिक अनुसंधान का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)  Fisher 12-544-14
Microscope Slides Fisher 12-550-123
Dimethylsulfoxide (DMSO)  Fisher 67-68-5
EDTA, Disodium Fisher BP120-1
Phosphate buffered saline Fisher ICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) HyClone SH30588.02
HEPES Fisher BP310-1
Low Melting Point Agarose (LMP) Lonza 50081 NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA)  Fisher BP1356-100
pH testing paper strips (pH 7.5-14) Fisher M95873
Potassium Cloride Fisher 7447-40-7
Potassium Hydroxide Fisher 1310-58-3
slide labels (0.94 x 0.5 in.) Fisher NC9822036
Sodium Chloride (NaCl)  Fisher 7647-14-5
Sodium Hydroxide (NaOH)  Fisher 1310-73-2
SYBR™ Gold  Invitrogen S11494
Triton X-100  Fisher 9002-93-1
Trizma Base  Fisher 77-86-1
2.0 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-402-6
Cell strainer (40 µm) Fisher 22363547
Endonuclease III (Nth)  New England Biolabs M0268S Dilution 1:1,000
hOGG1  New England Biolabs M0241S Dilution 1:1,000

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 111 जेनेटिक विष विज्ञान चूहे जिगर, endonuclease तृतीय (इंडो तृतीय) मानव 8 oxoguanine डीएनए-एन-glycosylase 1 (hOGG1) डीएनए किनारा टूट जाता है ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति
मापने डीएनए किनारा टूट जाता है और ऑक्सीडेटिव डीएनए में नुकसान चूहा जिगर में <em>विवो</em> क्षारीय धूमकेतु परख और एंजाइम संशोधित क्षारीय धूमकेतु परख <em>में</em>
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Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. J. Vis. Exp. (111), e53833, doi:10.3791/53833 (2016).

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