Introduction
Il test della cometa misura rotture del DNA a livello di singola cellula. Sospensioni di cellule singole sono incorporati in agarosio su un vetrino da microscopio e le cellule lisate per formare nucleoidi, che contengono loop supercoiled di DNA. Elettroforesi a pH> 13 risultati in perdita di superavvolgimento nei cicli di DNA contenenti rotture dei filamenti, con i filamenti di DNA liberati migrano verso l'anodo, la creazione di strutture cometa simili che possono essere osservati al microscopio a fluorescenza. DNA frammentato migra dalla "testa" della cometa nella "coda" in base alle dimensioni del frammento, e la relativa fluorescenza della coda della cometa rispetto all'intensità totale (testa e coda) può essere utilizzato per quantificare DNA rotture 1 , 2. Il test è semplice, sensibile, versatile, rapida e relativamente poco costoso 1. La rilevazione del DNA frammentato causate da agenti che danneggiano il DNA viene utilizzato un test per quantificare il danno al DNA nelle cellule o nuclei isolati da INDIVIdoppi tessuti degli animali trattati con materiale potenzialmente genotossico (s). Grazie ai suoi vantaggi, il test della cometa in vivo è raccomandato come una seconda vivo test in genotossicità (in coppia con il test del micronucleo in vivo) per effettuare valutazioni di sicurezza dei prodotti in corrente Conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH) 3 e dell'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA ) 4 linee guida di legge. Nel nostro laboratorio, abbiamo impiegato il test di valutazione dei danni al DNA vivo indotto da ingredienti alimentari, prodotti farmaceutici e nanomateriali 5-10. fegato di ratto sarà utilizzato come esempio in questo protocollo, ma il comet assay può essere eseguita con altri tessuti / organi di animali da esperimento, purché singole cellule intatte possono essere isolate dal tessuto.
Alcuni tipi di danni al DNA sono difficili da rilevare come rotture del DNA senza modificare il test della cometa di base. In caso di danno ossidativo al DNA, sezione Breaks possono essere creati in lesioni ossidative nel DNA da digerire con gli enzimi di riparazione, come umano 8-oxoguanine-DNA-N-glicosilasi 1 (hOGG1, che crea pause a 8-oxoguanine (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. Inoltre, endonucleasi III (Endo III) crea pause principalmente alle pirimidine ossidate 1. Così, l'aggiunta di una fase enzima digestione rende il test un metodo specifico e sensibile per misurare il danno ossidativo del DNA in vivo 12. Utilizzando questi saggi, abbiamo dimostrato danno ossidativo causata da agenti tossici nel fegato di ratti e topi 6-8 e nel cuore di ratto 10.
Il test della cometa ha molte applicazioni in tossicologia genetica e il biomonitoraggio umano: 1) come un follow-up di test in vivo per genotossine individuate dal sensibile test in vitro 3,13, 2) per valutare i meccanismi di danno al DNA xenobiotici indotto in diversi tessuti 14, 3) per verificare se unacancerogeno funziona utilizzando un una modalità non-genotossico di azione (MOA) 7 genotossico o, 4) per valutare il DNA riparazione dei danni 15, 5) per studiare le malattie umane e esposizioni professionali 16, e 6) come un potenziale test di screening high-throughput per organo-specifica genotossicità 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etica dichiarazione: Le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la FDA degli Stati Uniti / Centro Nazionale per la ricerca tossicologica.
NOTA: Il disegno dello studio qui descritto si basa sul protocollo sviluppato dal Centro giapponese per la convalida dei metodi alternativi (JACVAM) per la loro validazione del test in vivo roditore alcalina cometa 18, e ulteriormente modificata in base alle raccomandazioni in linea guida OECD TG489 19 .
1. Preparazione
- preparazione del vetrino
- Sciogliere regolare agarosio fusione a 1% (w / v) in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+ libero e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde.
- Posizionare il 1% soluzione di agarosio standard di fuso a bagnomaria C 55 ° ed equilibrare la temperatura con il bagno. microscopio in vetro tuffo scivola nella soluzione di agarosio, defluire eventuali excess agarosio e pulire la parte posteriore dei vetrini puliti. Porre i vetrini in posizione verticale su una superficie piana e consentire le diapositive ad asciugare a temperatura ambiente; memorizzare le diapositive in luogo asciutto.
- Preparazione delle soluzioni Comet assay
- Preparare 0,5% soluzione di agarosio a basso punto di fusione. Sciogliere bassofondente agarosio in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde. Mantenere la soluzione a 37-45 ° C durante la preparazione del vetrino cometa; scartare qualsiasi soluzione di agarosio rimanente dopo.
- Preparare Lysis buffer. Fare una soluzione 100 mM di disodio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA disodico, il sig 372,24 g / mol), 2,5 M di cloruro di sodio (NaCl, il sig 58.44 g / mol), e 10 mm Tris idrossimetil aminomethane (Tris Base, il sig 121.14 g / mol) in acqua purificata, e regolare a pH 10 con 10 N soluzione di idrossido di sodio (NaOH, Mr 40 g / mol). Il giorno di utilizzo, aggiungere Triton X100 e dimetil solfossido (DMSO, Mr 78.13 g / mol) alla soluzione per realizzare concentrat finaleioni di 1% e 10%, rispettivamente, e mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Fare tampone enzima fresco il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 40 mM 2- [4- (2-idrossietil) piperazin-1-il] etansolfonico acido (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM di cloruro di potassio (KCl, Mr 74.55 g / mol), 0,5 mM disodio EDTA e 0,2% di siero albumina bovina (BSA, Mr 66.463 g / mol) in acqua purificata. Regolare il pH a 8.0 con 10 soluzione N idrossido di potassio (KOH, 56,1 g / mol). Mescolare a RT e verifica completa dissoluzione prima dell'uso.
- Preparare una soluzione tampone alcalina contenente 300 mM NaOH e 1 mM EDTA bisodico in acqua purificata. Mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell'uso. Misurare il pH della soluzione prima dell'uso e assicurarsi che il pH è> 13.
- Preparare una soluzione di 0,4 M Tris base in acqua purificata, e regolare a pH 7,5 con acido cloridrico (HCl, il sig 36.46). Conservare la soluzione a 4-10 ° C. Questa è la neutralizzazione del buffer.
- Fare fResh tritare tampone il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 20 mM di disodio EDTA e il 10% di DMSO in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero). Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Per preparare soluzione colorante, diluire fluorescente acido soluzione macchia magazzino nucleico con Tris-borato-EDTA (TBE buffer) a 1: 10.000 (v / v). Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Conservare a 2-8 ° C e utilizzare con 24 hr.
2. preparazione di sospensioni singola cellula da fegato di ratto
- Euthanize ratti con gas CO 2 seguenti metodi consigliati nelle linee guida mediche americana veterinari per l'eutanasia degli animali: Edizione 20 del 2013.
- Impostare la velocità di flusso di CO 2 a 2.75. Mettere il topo nella camera di eutanasia (per esempio, vaso essiccatore, gabbia ratto con coperchio ventilato) e accendere la CO 2 aprendo la valvola del serbatoio. Attendere 1,5 a 2,5 minuti fino a quando latopo diventa incosciente. Aumentare il flusso di CO 2 sul valore massimo. Dopo la cessazione della respirazione, lasciare il topo nella camera per circa 1 min per assicurare eutanasia. Verificare l'eutanasia palpando per confermare che il topo non ha battito cardiaco, e pizzicare le dita dei piedi per determinare che il topo non ritira la sua arto.
- Disinfettare la capelli-pelle con il 70% di etanolo. Aprire la cavità addominale e rimuovere il fegato intatto con forbici chirurgiche. Dopo aver rimosso il fegato, rimuovere il lobo laterale sinistra dal fegato rimanendo con forbici chirurgiche. Posizionare il lobo laterale sinistro su un tagliere e tagliare due 3-4 mm di spessore sezioni trasversali adiacenti con una lama usa e getta singolo taglio di rasoio.
- Inserire una sezione trasversale su carta da filtro (per evitare la deformazione della sezione), e posizionare la sezione in formalina 10% neutra tamponata (NBF). Assicurarsi che il rapporto del 10% NBF al tessuto è di 10: 1 o superiore. Dopo un tempo di fissazione di almeno 72 ore, procESS fegato per istopatologia (vedi sezione 7, di seguito).
- Posizionare la seconda sezione trasversale di fegato in 5 ml ghiacciata buffer di macinazione (sezione 1.2.6) in una capsula di Petri 6 centimetri e risciacquare 3 volte per rimuovere residui di sangue.
- Trasferire la sezione di fegato di un nuovo 2 ml provetta da centrifuga contenente 1 ml di tampone macinazione ghiacciata. Macinare sezione fegato ben risciacquato, con un paio di forbici sottili per liberare le cellule. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per rimuovere eventuali grumi di tessuto.
- Posizionare la sospensione singola cella in ghiaccio e utilizzare per rendere le diapositive entro 1 ora. Controllare la concentrazione di cellule contando (ad esempio, con un emocitometro o contatore di cellule elettronico) per assicurare che la sua concentrazione di circa 2 x10 6 cellule / ml.
3. Preparazione del Comet diapositive
- Mescolare un volume della sospensione cellulare singola con 10 volumi di fuso, 37 ° C, la soluzione di agarosio bassofondente 0,5% (sezione 1.2.1).pipetta Immediatamente 100 microlitri su un vetrino rivestito con regolare agarosio punto di fusione (punto 1.1). Porre immediatamente un vetrino sopra il composto di cellule-agarosio. Fare almeno 8 scivoli per ogni campione.
NOTA: Tutte le diapositive devono essere identificati da un codice numerico o simili e la loro identità registrati, in modo che le diapositive possono essere segnati in cieco (vedi 6.2.2, di seguito). - Posare le diapositive piatta e fredda a 4 ° C per 30 min.
- Dopo che il gel si è solidificato, rimuovere delicatamente il coprioggetto e immergere i vetrini in tampone di lisi pre-raffreddata (punto 1.2.2). Proteggere le diapositive dalla luce e mantenere le diapositive nel tampone di lisi a 4 ° C da 1 ora (minimo) a O / N (massimo).
4. trattamento enzimatico di Comet diapositive
- Rimuovere 6 degli 8 vetrini preparati da ciascun campione di tessuto dal tampone di lisi e risciacquarli 3x per 5 minuti ciascuno con tampone di enzima (punto 1.2.3) a temperatura ambiente. Utilizzare i rimanenti due scivoli per il test della cometa alcalino wenza enzima-trattamento (v 5.1, qui di seguito). Dopo il risciacquo, rimuovere il liquido in eccesso drenando e tamponando le diapositive con i tessuti.
- Diluire scorte enzimi hOGG1 e Endo III con tampone enzimatica a 1: 1.000 (v / v). Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Applicare 200 ml di seguenti soluzioni ai vetrini preparati da ciascun gruppo di trattamento: 200 ml di tampone enzima da solo (2 scivoli usati come diapositive di riferimento), 200 soluzione ul hOGG1 (2 scivoli) o 200 ml soluzione Endo III (2 scivoli).
- Mettere i vetrini in piastre di Petri piene di asciugamani di carta inumidite, coprire i vetrini con Parafilm e incubare a 37 ° C per 45 minuti per Endo III-trattata e diapositive di riferimento e di 30 minuti per diapositive hOGG1-trattati.
- Dopo l'incubazione, lavare i vetrini con acqua distillata e proseguire l'elaborazione come descritto in 5.2, di seguito.
5. svolgimento e elettroforesi
- Per diapositive non trattati con enzimi, rimuovere i vetrini dal tampone di lisi, Scolate le diapositive e risciacquare una volta con tampone di neutralizzazione fredda (sezione 1.2.5) per 5 minuti per rimuovere il detersivo residuo e sali.
- Collocare i vetrini da Piazza di 4.5 e 5.1 in modo casuale in un serbatoio di elettroforesi su gel orizzontale, evitando eventuali spazi. Riempire il serbatoio con pH> 13 buffer per elettroforesi appena fatto (punto 1.2.4) fino a quando il livello del liquido copre solo gli scivoli (evitare bolle sopra l'agarosio e assicurarsi che il serbatoio è di livello). Registrare il pH tampone e temperatura all'inizio di svolgimento DNA.
- Che i vetrini rimangono nel buffer alcalina per 20 minuti per consentire lo svolgimento del DNA ed espressione di danni alcalino-responsabile.
- Durante lo svolgimento, il programma di alimentazione per produrre 0,7 V / cm nel serbatoio elettroforesi (V / cm = Volt diviso per la distanza in cm tra gli elettrodi positivi e negativi).
- Dopo lo svolgimento, premere il pulsante di esecuzione sulla rete di alimentazione. Se necessario, regolare la corrente a 300 mA alzando o abbassando il livello del buffer. mantenere °livello di buffer e appena sopra la superficie delle diapositive. Eseguire elettroforesi a 4 ° C per 20 min. Registrare il posizionamento scorrevole, la temperatura del tampone e la corrente (ampere) all'inizio e alla fine di elettroforesi.
NOTA: Troppo tampone provocherà tensioni inferiori che possono interferire con la migrazione DNA. - Dopo l'elettroforesi, neutralizzare l'alcali in eccesso sollevando delicatamente i vetrini dalla vaschetta e immergendo in tampone di neutralizzazione (sezione 1.2.5) per 5 min. Scolate le diapositive e ripetere altre due volte.
- Fissare i vetrini immergendoli in acqua fredda 100% di etanolo per 5 min. Lasciare i vetrini si asciughino all'aria e posto in un luogo asciutto per la conservazione.
6. DNA di colorazione, Comet visualizzazione e analisi
- colorazione del DNA
- Porre i vetrini su un vassoio di cartone o di metallo e aggiungere 200 ml di soluzione colorante fluorescente di lavoro degli acidi nucleici (sezione 1.2.7) per ogni diapositiva e coprire con un vetrino di vetro. Proteggere le diapositive dallaluce consentire i vetrini di rimanere in contatto con la soluzione colorante per almeno 30 minuti prima competenza. Stain i vetrini in lotti di 20 alla volta.
- Prima di leggere ogni diapositiva, delicatamente macchia lontano soluzione colorante in eccesso, facendo attenzione a non disturbare il vetro di copertura.
- Visualizzazione Comet e punteggio
- Utilizzare una videocamera collegata ad un microscopio a fluorescenza per visualizzare le immagini in diretta della diapositiva cometa sul monitor del computer.
- Casualmente scegliere un microscopio a campo contenente cellule. Utilizzando un mouse, selezionare una cella. Fare clic sul centro della "testa della cometa" con click sinistro del mouse.
NOTA: Il software calcola tutti i parametri di misura per la cella e aggiunge i dati in un file di dati. - Punteggio tutte le cellule nel campo corrente (vedere il punto 6.2.4), e quindi utilizzare i controlli di scena del microscopio e il video sullo schermo per trovare un altro gruppo di cellule. Punteggio queste cellule come descritto al punto 6.2.2.
- Nota la slitta From destra a sinistra e in basso a alto. Scegliere circa 10 campi in modo casuale. Durante questo processo, qualsiasi cella cometa adatto che compare nel campo Vista risposta deve essere senza pregiudizi.
NOTA: non segna una cometa se una delle seguenti condizioni: 1) che si trova su uno dei bordi della slitta; 2) due o più comete si sovrappongono; 3) c'è detriti nella coda; 4) il software non può distinguere tra la testa e la coda; o 5) la colorazione del nucleo e / o di coda differisce notevolmente da altre comete nella diapositiva.
NOTA: Le comete con quasi tutta la loro fluorescenza del DNA nella coda sono spesso indicati come le comete 'riccio'. comete Hedgehog non devono essere lanciati, ma il numero di ricci rilevati durante le marcature di scorrimento devono essere registrati e riportati come percentuale di comete totali. - Analizzare almeno 75 comete per vetrino, la lettura di due scivoli per organo / tessuto per ottenere almeno 150 cellule / cometa campione in totale. Dopo il numero di cellule richiesto da una diapositiva hanno essereit ha segnato, il risultato viene salvato come file di foglio di calcolo per l'analisi dei dati in seguito.
7. Analisi istopatologia
- Dopo un minimo di fissaggio 72 hr a 10% NBF, seguita da tessuto rifilatura 21, ordinariamente elaborare e incorporare il lobo epatico laterale sinistro dei campioni in paraffina basata media 22. Sezione campioni a circa 5 micron e raccogliere su vetrini.
- Macchiare le sezioni con ematossilina e eosina (H & E):
- Riscaldare i vetrini con le sezioni di tessuto di paraffina in forno a 60 ° per 2 ore prima della procedura di colorazione.
- Utilizzare xilene a Deparaffinare lati. Reidratare i vetrini con etanolo graduato (EtOH) per una esecuzione risciacquo con acqua di rubinetto.
- Porre i vetrini in 450 ml di ematossilina per 2 min e 40 sec. Sciacquare i vetrini con acido (acido acetico glaciale 2 ml a 450 ml di acqua deionizzata) per 4 sec seguito da 5 minuti eseguendo risciacquo con acqua di rubinetto.
- Posizionare il fatto scorrerees in 450 ml 70% EtOH contenente 1 ml di idrossido di ammonio per 2 minuti, seguita da risciacquo correndo acqua corrente per 2 min e 30 sec, e il 70% EtOH risciacquo per 1 min.
- Incubare i vetrini con 450 ml di soluzione eosina Y contenente acido acetico glaciale 4 ml per 3 min.
- Disidratare i vetrini con classificato EtOH. Cancellare i vetrini con xilene (tre volte 1 min ciascuna), e tenere le diapositive in xilene fino vetrini sono collocati sugli scivoli.
- Esaminare i vetrini al microscopio ottico, i risultati record, e grado lesioni non neoplastiche per la gravità come 1 (minimo), 2 (lieve), 3 (moderato) o 4 (marcato).
NOTA: Il grado di gravità applicata per una lesione specifica si basa sulla proporzione relativa del fegato con la lesione (= minimal <1-15%; lieve = 16-35%; moderato = 36-60%, e ha segnato = 61- 100%).
Analisi 8. Dati
- L'animale è considerato l'unità sperimentale per valutazioni statistiche. danno al DNA è espressa in% DNUn in coda.
- danno ossidativo al DNA è calcolato come segue: le diapositive di riferimento (senza trattamento enzimatico) forniscono una stima delle rotture dei filamenti di DNA di sfondo (SB).
NOTA: Le diapositive enzimi trattati forniscono una misura di rotture dei filamenti e basi ossidate (SB + OX). Assumendo una dose-risposta lineare per% DNA in coda in funzione del danno al DNA, sottrazione di SB da SB + OX fornisce una stima di rotture del DNA da pirimidine / purine alterati ossidati 23. - Analizzare% DNA in coda come funzione della dose da ANOVA, seguita da test di Dunnett per confronti a coppie delle risposte in animali trattati al controllo del veicolo.
NOTA: Tutte le prove sono a una coda e un valore p inferiore a 0,05 è impostato come criterio di significatività statistica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il test della cometa in vivo è stata eseguita in concomitanza con il saggio comet enzima modificato per misurare sia diretta e danno ossidativo del DNA nel fegato di ratti trattati con ciproterone acetato (CPA) 5. CPA è un farmaco ormonale sintetica che induce i tumori di fegato di ratto in maniera specifica per il sesso, con cinque volte dosi più elevate necessarie per indurre tumori al fegato nei ratti maschi rispetto alle femmine 24. Abbiamo trovato che il danno al DNA continua prodotta dal CPA nel fegato di ratti maschi e femmine ha lo stesso schema specifico sesso come hepatotumorigenicity: una dose cinque volte-alto del CPA è necessario per indurre un aumento significativo danno al DNA nel fegato di maschi rispetto alle femmine (figura 1).
Noi ipotizziamo che il risultato del test della cometa specifici per il sesso è dovuta all'attività di sulfotransferasi idrossisteroide (s) (HST), che è 15 volte superiorein ratti adulti di sesso femminile che nei maschi adulti. Metabolismo HST è un fattore limitante nella attivazione del CPA di metabolita di legame al DNA (s) 25. Al contrario, CPA-indotta danno ossidativo del DNA è stata generalmente maggiore nei maschi dai fegati di ratti di sesso femminile, e quindi meno probabile che sia un fattore limitante passo nella formazione del tumore (Figura 2). La valutazione istopatologia del fegato di ratti CPA-trattati non ha mostrato alcuna evidenza di apoptosi agente indotta o necrosi (Tabelle 1 e 2), indicando che i risultati positivi test della cometa non erano un effetto secondario di citotossicità 5. Figure 1 e 2 e le tabelle 1 & 2 sono ristampato con il permesso di Elsevier (Riferimento 5).
Figura 1. danni al DNA nel fegato dei maschi CPA-trattata e mi ratti di sesso femminileasured con il test della cometa in vivo. Gruppi di cinque a sette settimane di età ratti maschi e femmina F344 sono stati trattati con olio di oliva o con 10, 25, 50, o 100 mg / kg / giorno CPA in olio di oliva. I trattamenti sono stati condotti a 0, 24, e 45 ore, i ratti sono stati sacrificati a 48 ore, e danno al DNA è stata misurata nel fegato come DNA% coda usando il test della cometa. trattamento CPA indotto un aumento DNA% coda nel fegato di ratti maschi in maniera soglia simile, con aumenti significativi state rilevate solo con le dosi da 50 e 100 mg / kg / giorno. trattamento CPA indotto rotture del DNA nel fegato di ratti di sesso femminile in un modo quasi lineare dose-dipendente, con aumenti significativi nel DNA% coda rilevati in tutti i gruppi CPA. I livelli più bassi osservati genotossicità Effect (LOGELs) per CPA-indotto danni al DNA nel fegato dei ratti maschili e femminili sono stati stimati a 10 e 50 mg / kg / die, rispettivamente. * Significativo a p≤0.05 rispetto al veicolo concontrollo; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Il danno ossidativo del DNA nel fegato dei maschi CPA-trattati e ratti femmina misurata con il test della cometa enzima modificato in vivo. Gruppi di cinque a sette settimane di età ratti maschi e femmina F344 sono stati trattati con olio di oliva o con 10, 25, 50, o 100 mg / kg / giorno CPA in olio di oliva. I trattamenti sono stati condotti a 0, 24, e 45 ore, gli animali sono stati sacrificati a 48 ore, e il saggio comet enzima modificato è stato condotto utilizzando DNA% coda come metrica del danno al DNA. Tutte le dosi CPA hanno prodotto aumenti significativi danni Endo III-sensibile del DNA nel fegato dei ratti maschi CPA-trattati; mentre Endo III-sensibili DNA DAmage è stata rilevata in ratti femmina trattati con 25, 50 e 100 mg / kg / giorno CPA (A). Tutte le dosi CPA portato ad aumenti significativi hOGG1 sensibile danno ossidativo al DNA nel fegato dei ratti maschi; aumenti di danno al DNA hOGG1 sensibili sono stati rilevati solo in ratti femmina trattati con 50 e 100 mg / kg / giorno CPA (B). * Significativo a p≤0.05 rispetto al controllo del veicolo; le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le tabelle 1 e 2. I risultati delle analisi istopatologia. Dal momento che la citotossicità in grado di generare i risultati del test della cometa falsi positivi, le valutazioni istopatologici per apoptosi delle cellule e / o necrotiche dovrebbero essere condotti per i tessuti cometa-positivi. Nel corso di studio, è stata osservata alcuna CPA-indotta l'apoptosi o necrosi degli epatocitinel fegato di entrambi i ratti maschi e femmine, che escludeva la possibilità di una risposta test della cometa di falsi positivi.
| Lesione | dati | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Epatociti vacuolizzazione citoplasmatica | Conte lesione | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Esaminato | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesione% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg gravità | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| epatociti mitosi | Conte lesione | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Esaminato | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesione% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Avg gravità | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabella 1. L'incidenza delle lesioni non neoplastiche nel fegato dei ratti F344 maschi tra veicolo e CPA-trattati.
| Lesione | dati | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Epatociti vacuolizzazione citoplasmatica | Conte lesione | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Esaminato | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesione% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg gravità | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| epatociti mitosi | Conte lesione | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Esaminato | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesione% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Avg gravità | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| epatociti cariomegalia | Conte lesione | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Esaminato | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesione% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Avg gravità | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabella 2. L'incidenza delle lesioni non neoplastiche nel fegato dei ratti F344 femmine CPA-trattati veicolo-e.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive la misurazione simultanea di entrambi danno al DNA diretti e ossidativo nel fegato di ratto a livello di singola cellula. Il protocollo generale è applicabile a qualsiasi tessuto da cui singole cellule o nuclei possono essere isolati con il minimo danno al DNA trasformazione indotta (cioè, danno al DNA indotto non dal agente di test, ma dalla manipolazione e la lavorazione dei tessuti animali). Nella nostra ricerca, abbiamo condotto test della cometa alcaline su cellule dal midollo osseo 7,9, stomaco 6, rene 9, della vescica 9, polmone 9, cuore 10, ghiandola mammaria 5, utero 5, del testicolo 5, 5 e sangue. Questi test possono fornire un metodo rapido, semplice e poco costoso per lo studio xenobiotici indotto danni al DNA in diversi organi e tessuti di animali da esperimento. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per studi biomonitoraggio umano mediante saggi conduttori, per esempio, il sangue periferico, esfoliatacellule del tratto urinario, o gli epiteli vestibolari o nasali ottenuti da individui esposti clinicamente o professionalmente. L'approccio di base può anche essere utilizzato per valutare il danno al DNA in cellule coltivate in vitro.
Quando il test della cometa è integrato in studi tossicologici acuti o subcronici, il tempo di campionamento, cioè il tempo che intercorre tra l'ultimo trattamento e la raccolta dei tessuti, è una variabile critica che a volte deve essere conciliato con la raccolta di altri dati tossicologici. Se possibile, i tempi di campionamento dovrebbero essere basate su dati in tempo corso cometa, il momento in cui viene raggiunto il picco di concentrazione plasmatica o tessuto (Cmax), oppure dopo stato stazionario è raggiunto dopo diverse amministrazioni degli articolo di prova 19. In casi sono stati concentrazioni di dati o di tessuti cinetiche non sono disponibili, OECD TG489 raccomanda lo svolgimento di due o più trattamenti e la raccolta di tessuti 2-6 ore dopo l'ultimo trattamento, oppure, se un singolo trattamento ècondotto, il campionamento dei tessuti sia a 2-6 e 16-26 ore dopo il trattamento 19.
È fondamentale che il periodo di tempo da eutanasia preparazione del vetrino cometa essere il più breve possibile. E 'consigliabile che la competenza sperimentale essere stabilita dimostrando padronanza di ottenere sospensioni singola cella di alta qualità in modo rapido dai tessuti che vengono analizzati. Generalmente, i vetrini cometa devono essere preparati appena possibile dopo il sacrificio degli animali, con preparazione singola cellula prendendo un massimo di un hr. Creazione di un database storico per stabilire gli intervalli e le distribuzioni di controlli (veicolo) negativo è altamente raccomandato per assicurare che il saggio è sotto controllo adeguato. eccessivi livelli di danno al DNA possono essere osservati in veicoli / controlli negativi quando nei seguenti casi: 1) uso improprio del tessuto; 2) un tempo troppo lungo tra la eutanasia e preparazione del vetrino cometa; o 3) l'esposizione della sospensione singola cella per UV-contenentluce g. Creazione di un database storico per i campi e le distribuzioni di controlli positivi è anche altamente raccomandato per assicurare che il saggio mostra adeguata sensibilità al genotossine noti. Metil metansolfonato (MMS) è stato utilizzato come controllo positivo in questo studio; etil metano sulfonato (EMS) è consigliato da JACVAM come controllo positivo per il test in vivo comet 18.
Incorporando digestioni con endonucleasi specifiche lesione nel protocollo test della cometa aumenta la sensibilità e la specificità del test attraverso il riconoscimento di particolari tipi di DNA lesioni-nell'esempio qui presentato, basi del DNA ossidato. Tuttavia, va riconosciuto che alcune endonucleasi possono essere in grado di riconoscere e aderire a varie classi di lesioni del DNA; nel caso di Endo III, questo include lesioni non associate al danno ossidativo del DNA. Un Endo III modificati risultato positivo test della cometa può indicare una MOA misto. Bconfronto y, hOGG1 è più specifico per le lesioni ossidative e dati da un saggio hOOG1 modificato può essere più utile per stabilire un MOA che coinvolge danno ossidativo al DNA 11.
Citotossicità (apoptosi delle cellule e necrosi) possono causare rotture del DNA e un falso risultato positivo test della cometa: risultati Comet assay positivi da soli non possono essere interpretati come genotossicità. Informazioni sulla citotossicità è necessario per stabilire la rilevanza biologica di un risultato positivo del test della cometa. Analisi istopatologica dei tessuti cometa-positivo è raccomandato dall'OCSE TG489 come misura rilevante della tossicità dei tessuti 19. Positivi i dati Comet assay con chiara evidenza di tossicità per i tessuti (apoptosi delle cellule o necrosi) devono essere interpretati con cautela.
Il test della cometa in vivo ed i test della cometa alcalini Endo III- e hOGG1-modificati possono essere utilizzati in maniera quantitativa per decidere la genotossicità diesposizioni xenobiotici. Possono inoltre essere utilizzati per condurre una ricerca fondamentale nel danno al DNA e riparazione in molteplici tessuti animali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
