Introduction
アルカリ性コメットアッセイは、単一細胞レベルでDNA鎖切断を測定します。単一細胞の懸濁液を、顕微鏡スライド上のアガロース中に埋め込まれており、細胞がDNAのスーパーコイルループを含む核様体を形成するために溶解しました。陽極に向かって移動するDNAの解放された鎖と、鎖の切断を含むDNAループ内の超らせんの損失のpH> 13の結果で電気泳動、蛍光顕微鏡で観察することができる彗星のような構造を作成します。断片化されたDNAは、DNAの破壊1を定量するために使用することができるフラグメントの大きさ、および全強度（頭部および尾部）に比べコメットテールの相対的な蛍光に基づく「テール」に彗星の「ヘッド」から移行します、2。アッセイは、単純な敏感な、汎用性の高い、迅速、かつ1比較的安価です。 DNA損傷物質によって引き起こされる断片化したDNAの検出は、細胞内のDNA損傷を定量化するためのアッセイを使用するか、またはから核を分離されているがindivi潜在的に遺伝毒性物質（複数可）で処置した動物のデュアル組織。 、その利点に、in vivoでのコメットアッセイは、現在の調和国際会議（ICH）3および欧州食品安全機関（EFSAにおける製品安全性評価を行うために（in vivoの小核試験と対になる）は、第2のin vivo遺伝毒性アッセイとして推奨されます）4規制ガイドライン。私たちの研究室では、食品成分、医薬品、およびナノ材料5-10により誘発される生体内のDNA損傷を評価するためのアッセイを採用しています。ラット肝臓は、このプロトコルの例として使用されるが、コメットアッセイは、実験動物の他の組織/器官限り、組織から単離することができる無傷の単一細胞で行うことができます。
DNA損傷の特定のタイプは、基本的なアルカリ性コメットアッセイを変更することなく、DNA鎖切断のように検出することが困難です。酸化的DNA損傷の場合には、ストランドBreaksは、8-オキソグアニン（8-oxoGua）で休憩し、メチルfapy -グアニン11を作成し、人間8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ1（hOGG1、などの修復酵素で消化することによりDNAに酸化的損傷で作成することができます。また、エンドヌクレアーゼIII（遠藤III）を酸化さピリミジン1で主に切断を生じる。したがって、酵素消化工程の追加アッセイをインビボ 12 に酸化的DNA損傷を測定するための特異的かつ高感度の方法を行う。これらのアッセイを利用して、我々は実証しましたラットとマウス6-8の肝臓におけるラット10の中心部にある毒物誘発性酸化的DNA損傷。
in vitroで敏感で識別される遺伝毒性物質のためのインビボアッセイにおけるフォローアップが3,13をテストとして1）、2）複数の組織における生体異物によって誘発されるDNA損傷のメカニズムを評価する：アルカリコメットアッセイは、遺伝毒性と人間のバイオモニタリングで多くのアプリケーションを持っています14、3）かどうかを調べるため発癌物質は、4）、5）は、ヒトの疾患および職業暴露16を調べ、そしてするDNA損傷の修復15を評価するために、遺伝毒性または作用の非遺伝毒性モード（MOA）7を使用して動作6）のための潜在的なハイスループットスクリーニングアッセイとして臓器特異的な遺伝毒性17。
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Protocol
倫理文：動物が関与する手順は、毒性学研究のための米国FDA /ナショナルセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
注：ここで説明する研究デザインは、インビボげっ歯類アルカリコメットアッセイ18の彼らの検証のための代替法検証のための日本語センター（JaCVAM）によって開発されたプロトコルに基づいて、さらにOECDガイドラインTG489 19の勧告に基づいて修正されます。
1.準備
- スライドの準備
- 電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中（のCa 2+、Mgを2+遊離およびフェノールレッドを含まない）（w / v）の1％アガロース定期的な溶融を溶解させます。
- 55℃の水浴中で溶融し、1％標準アガロース溶液を置き、浴で温度を平衡化。ディップガラス顕微鏡は、任意のexcesを切る、アガロース溶液にスライドアガロースだときれいなスライドの背中を拭いてください。平らな面に縦スライドを置き、スライドを室温で乾燥することができます。乾燥した場所にスライドを保存します。
- コメットアッセイ溶液の調製
- 0.5％の低融点アガロース溶液を調製します。電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中でアガロース低融点（ の Ca 2+はMg 2+、及びフェノールレッドを含まない）に溶解します。彗星スライドの準備中に37-45℃でソリューションをしてください。その後、残りのアガロース溶液を捨てます。
- 溶解緩衝液を準備します。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA二ナトリウム、ミスター372.24グラム/モル）、2.5 M塩化ナトリウム（NaClを、氏58.44グラム/モル）、および10 mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス塩基、ミスター121.14グラム/モル）の100 mM溶液を作ります精製水に、10 N水酸化ナトリウム溶液（NaOHで、氏は40g /モル）でpHを10に調整します。使用の日に、最終concentratを達成するために、溶液にトリトンX100、およびジメチルスルホキシド（DMSO、氏78.13グラム/モル）を添加それぞれ1％、10％、のイオン、そして使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。
- 使用日に新鮮な酵素緩衝液を作ります。 40mMの2- [4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸（HEPES、ミスター238.3グラム/モル）を含む溶液を調製し、100mMの塩化カリウム（KClを、氏74.55グラム/モル）、0.5 mMのEDTA二ナトリウム、および精製水で0.2％ウシ血清アルブミン（BSA、ミスター六万六千四百六十三/モル）。 10 N水酸化カリウム溶液（KOH、56.1グラム/モル）で8.0にpHを調整します。 RTで攪拌し、使用前に完全な溶解を確認します。
- 精製水に300mMのNaOHおよび1 mMのEDTA二ナトリウムを含むアルカリ性緩衝液を準備します。使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。使用前に溶液のpHを測定し、pHが> 13であることを確認してください。
- 精製水に0.4 Mトリス塩基の溶液を用意し、塩酸（HCl、氏36.46）でpHを7.5に調整します。 4-10℃でソリューションを保存します。これは、バッファが中和されています。
- Fを作ります使用日にバッファをミンチレッシュ。ハンクス液中の20mM EDTA二ナトリウムおよび10％DMSOを含有する溶液（HBSS、のCa 2+はMg 2+、およびフェノールレッドを含まない）を準備します。使用するまで氷上で保管してください。
- 染色溶液を調製するには、1でトリス - ホウ酸-EDTA（TBE緩衝液）と核酸蛍光染色原液を希釈：万（v / v）でした。アルミ箔を用いた光からソリューションを保護します。 2-8℃で保存し、24時間で使用しています。
ラット肝臓からの単一細胞懸濁液の調製
- 2013年版20：動物の安楽死のためのアメリカの獣医診療ガイドラインで推奨される方法以下のCO 2ガスのラットを安楽死させます。
- 2.75でCO 2流量を設定します。安楽死室（ 例えば 、デシケータージャー、通気蓋付きのラットケージ）にラットを入れ、タンクバルブを開くことにより、CO 2をオンにします。まで1.5〜2.5分間待ちラットは無意識になります。その最大設定にCO 2流を増加させます。呼吸が停止した後、安楽死を確実にするために、約1分間チャンバー内でラットを残します。ラットがハートビートを持っていないことを確認するために、触診、およびラットがその手足を撤回しないことを決定するためにつま先をつまんで安楽死を確認します。
- 70％エタノールで髪の皮膚を消毒します。腹腔を開き、手術用ハサミで無傷の肝臓を削除します。肝臓を除去した後、手術用ハサミで残りの肝臓から左側葉を取り除きます。まな板の上の左側葉を置き、使い捨て片刃カミソリの刃を使用して2つの隣接する3〜4ミリメートル厚の横断切片を切りました。
- （セクションのカールを防止するために）ろ紙上の1つの横断面を配置し、10％中性緩衝ホルマリン（NBF）にセクションを配置します。 ：1以上の組織に10％NBFの比が10であることを確認してください。少なくとも72時間の固定時間の後、PROC組織病理学のために肝臓をESS（以下のセクション7を参照してください）。
- 6センチメートルペトリ皿に5ミリリットルの氷冷ミンチバッファ（セクション1.2.6）に第2の横肝臓切片を置き、残留血液を除去するために3回すすいでください。
- 1ミリリットルの氷冷ミンチ緩衝液を含む新しい2 ml遠心管に肝臓切片を転送します。細胞を放出するために細かいハサミでよくすすぎ、肝臓切片をミンチ。任意の組織塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液株。
- 氷の上で単一細胞懸濁液を置き、1時間以内にスライドを作るために使用します。その濃度は約2×10 6細胞/ mlであることを確実にするために（血球計または電子細胞カウンターで、 例えば ）をカウントすることにより、細胞の濃度を確認してください。
コメットスライドの調製
- 溶融し、37℃、0.5％の低融点アガロース溶液（セクション1.2.1）の10倍量の単一細胞懸濁液の1ボリュームを混ぜます。すぐに、通常の融点アガロース（セクション1.1）でコーティングしたスライド上に100μLをピペット。すぐに細胞 - アガロース混合物の上にカバースリップを配置。各サンプルの少なくとも8のスライドを作成します。
注：スライドは盲検法で得点することができるように、全てのスライドは、記録された番号または類似のコードと自分のアイデンティティによって識別されるべきである（以下、6.2.2を参照のこと）。 - 30分間、4℃に平らな、クールなスライドを置きます。
- ゲルが固化した後、静かにカバースリップを除去し、予め冷却溶解バッファー（セクション1.2.2）にスライドを浸します。光からスライドを保護し、O / N（最大）に1時間（最小）から4℃の溶解緩衝液中でスライドを保ちます。
コメットスライドの4酵素処理
- 溶解緩衝液から各組織試料から調製された8スライドの6を削除し、それらを室温で酵素緩衝液（セクション1.2.3）で各5分間、3倍すすぎます。アルカリコメットアッセイワットのために、残りの2つのスライドを使用してくださいithout酵素処理（以下、5.1を参照してください）。すすいだ後、組織とスライドを排出し、ブロッティングにより、過剰な液体を除去します。
- 1で酵素緩衝液とhOGG1と遠藤III酵素株式を希釈：1,000（v / v）でした。使用するまで氷上に置いてください。
- 酵素単独緩衝液200μl（基準スライドとして使用する2スライド）、200μlのhOGG1溶液（2スライド）または200μlの遠藤III溶液（2スライド）：各処置群から調製されたスライドに、以下の溶液を200μlを適用します。
- 、湿らせたペーパータオルを敷いたペトリ皿の中にスライドを入れパラフィルムでスライドをカバーし、遠藤III処理およびリファレンススライドとhOGG1処理されたスライドの30分間、37℃で45分間インキュベートします。
- インキュベーション後、蒸留水でスライドを洗浄し、以下、5.2で説明したように処理を継続します。
5.巻き戻しと電気泳動
- 酵素で処理していないスライドは、溶解緩衝液からスライドを削除、スライドを排出し、残留洗剤および塩を除去するために、5分間の冷中和バッファー（セクション1.2.5）で1回すすいでください。
- すべてのスペースを避け、ステップ4.5および水平ゲル電気泳動槽内のランダムに5.1から場所スライド、。液面がちょうどスライドを覆うまで（アガロースの上に泡を回避し、タンクがレベルであることを確認してください）たててpH> 13電気泳動バッファー（セクション1.2.4）でタンクを埋めます。 DNAの巻き戻しの開始時に緩衝液のpHと温度を記録します。
- スライドはアルカリ責任損傷のDNAと表現の巻き戻しを可能にするために20分間、アルカリ性緩衝液に残ってみましょう。
- 電気泳動槽（V / cmの=ボルトが正極と負極の間にCMで距離で割った値）は0.7 V / cmで製造する巻き戻し、プログラム電力供給時。
- 巻き戻した後、電源装置上の実行ボタンを押してください。必要な場合は、バッファレベルを上げるか、下げることによって300ミリアンペアの電流を調整。目を保ちますただ、スライドの表面の上の電子バッファレベル。 4℃で20分間電気泳動を行います。電気泳動の開始時と終了時にスライドの配置、バッファーの温度と電流（アンペア）を記録します。
注：あまりにも多くのバッファは、DNAの移動を妨害する可能性がより低い電圧になります。 - 電気泳動後、静かにタンクからスライドを持ち上げ、5分間中和バッファー（セクション1.2.5）に浸漬することにより過剰のアルカリを中和します。スライドを排出し、さらに2回繰り返します。
- 5分間の冷100％エタノールに浸漬することによりスライドを修正しました。保存のための乾燥した場所で空気乾燥し、場所にスライドを許可します。
6. DNA染色、彗星の可視化と分析
- DNA染色
- 段ボールや金属トレイにスライドを置き、各スライドに核酸蛍光染色作業溶液（セクション1.2.7）の200μlを添加し、ガラスカバースリップでカバーしています。からスライドを保護します光は、スライドをスコアリング前に少なくとも30分間染色溶液と接触したままであることを可能にします。一度に20のバッチでスライドを染色します。
- 各スライドを読む前に、静かにカバーガラスを乱さないように注意しながら、余分な染色液を離れブロット。
- 彗星の可視化とスコアリング
- コンピュータのモニタ上の彗星スライドのライブ映像を表示するために蛍光顕微鏡に取り付けたビデオカメラを使用してください。
- ランダムに細胞を含有する顕微鏡のフィールドを選択します。マウスを使用して、セルを選択します。マウスの左クリックで「コメットヘッド」の中心をクリックします。
注：コンピュータソフトウェアは、セルのすべての測定パラメータを計算し、データファイルにデータを追加します。 - 現在のフィールド内のすべてのセルをスコア（ステップ6.2.4を参照）、その後、細胞の別のセットを見つけるために、顕微鏡のステージを制御し、画面に表示される映像を使用しています。 6.2.2で説明したように、これらの細胞をスコア。
- スライドFスコアロム右は左とまでダウンします。ランダムに約10のフィールドを選択してください。このプロセスの間、視野に表示される任意の適切な彗星の細胞は、バイアスなしで採点されるべきです。
注：以下のいずれかに該当する場合彗星を獲得しないでください：1）には、スライドのエッジのいずれかに位置しています。 2）2以上の彗星が重複します。 3）尾部の破片があります。 4）ソフトウェアは、頭と尾を区別することはできません。または5）核および/または尾の染色は、スライド上の他の彗星とは大きく異なります。
注：尾のほぼすべてのそれらのDNAの蛍光を持つ彗星は、しばしば「ハリネズミ」彗星と呼ばれています。ヘッジホッグ彗星が得点されるべきではなく、スライドスコアリング中に検出されたハリネズミの数を記録し、合計彗星の割合として報告されるべきです。 - 合計で少なくとも150彗星細胞/サンプルを得るために、器官/組織ごとに2つのスライドを読んで、スライドあたり少なくとも75彗星を分析します。スライドからの細胞の必要な数があることした後ENは、結果は、後のデータ分析のためにスプレッドシートファイルとして保存され、得点しました。
7.組織病理学分析
- 21をトリミング組織に続いて10％NBF中に72時間固定、最小の後、日常的に処理し、パラフィンワックスベースの媒体22内のサンプルの左側肝葉を埋め込 みます。セクションのサンプルでは、約5ミクロンとガラススライド上に収集します。
- ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）を持つセクションを染色：
- 染色手順の前に2時間60℃のオーブン中でパラフィン組織切片を有するスライドを加熱します。
- 側面を脱パラフィンをキシレンを使用してください。水道水洗浄への段階的エタノール（EtOH）中でスライドを再水和。
- 2分40秒のためにヘマトキシリンの450ミリリットルでスライドを配置します。水道水すすぎを実行している5分までに、次の4秒間酸（450ミリリットルに2ミリリットルの氷酢酸脱イオン水）でスライドを洗浄します。
- スライドさを置きます2分30秒、1分、70％EtOHでリンス用水道水すすぎを実行し、続いて2分間1mlの水酸化アンモニウムを含む450 mlの70％エタノールでエス。
- 3分、4 mlの氷酢酸を含む450 mlのエオシンY溶液でスライドをインキュベートします。
- 傾斜EtOHでスライドを脱水。キシレン（3回各1分）でスライドをオフにして、カバースリップをスライド上に置かれるまで、キシレンにスライドを保持します。
- 1（最小限）、2（軽度）、3（中程度）、または4のように重症度のための光学顕微鏡、レコード所見、および悪性度非腫瘍性病変によってスライドを調べます（印）。
注：;軽度=百分の16から35;中等度= 36から60までパーセント;特定の病変に適用される重症度グレードが病変と肝臓の相対的な割合（最小限= <百分の1から15に基づいており、マークさ= 61- 100％）。
8.データ解析
- 動物は、統計的評価のための実験的な単位と考えられています。 DNA損傷は、％DNとして表されます尾部にA。
- 基準スライド（無酵素処理）のバックグラウンドDNA鎖切断（SB）の推定値を提供する：酸化的DNA損傷は、次のように計算されます。
注：酵素処理したスライドは、鎖切断の尺度と酸化塩基（SB + OX）を提供します。 DNA損傷の関数としてのテールにおける％DNAのための線形の用量反応を仮定すると、SB + OXからSBの減算は、酸化ピリミジン/変更されたプリン23からのDNA鎖切断の推定を与えます。 - 車両制御に処置した動物における応答の対比較のためのダネット検定が続く一方向ANOVAによって、用量の関数として尾の％DNAを分析します。
注：すべての試験は片側であり、0.05未満のp値は、統計的有意性の基準として設定されています。
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Representative Results
インビボでのアルカリ性コメットアッセイは、酢酸シプロテロン（CPA）5で処理したラットの肝臓における直接および酸化的DNA損傷の両方を測定するための酵素修飾コメットアッセイに関連して行きました。 CPAは、メス24に比べて雄ラットに肝腫瘍を誘発するために必要な5倍高い用量で、性別特異的にラットの肝臓腫瘍を誘発する合成ホルモン薬です。 CPAの5倍、より高い用量は、DNA損傷の有意な増加を誘導するために必要とされている：私たちは、雌雄ラットの肝臓でCPAによって生成され、直接DNA損傷がそのhepatotumorigenicityと同じ性別固有のパターンを有していることがわかりましたメスに比べてオスの肝臓（ 図1）。
私たちは、性別固有のコメットアッセイの結果が15倍高くなっているヒドロキシ基転移酵素（複数可）（HST）の活動によるものであると仮定する成人男性に比べて成熟雌ラットインチHST代謝はDNA結合性代謝物（複数可）25 CPAの活性化における律速段階です。対照的に、CPAによって誘発される酸化的DNA損傷は、雌ラットの肝臓よりも男性において一般的に大きくし、腫瘍形成における律速段階（ 図2）であること、したがってにくいです。 CPA処置ラット由来の肝臓の組織病 理学評価は、正のコメットアッセイの結果は、細胞毒性5の二次的な効果はなかったことを示す、薬剤誘発性アポトーシスまたは壊死（ 表1、表 2）の証拠を示さなかった。1＆2および表1＆ フィギュア 2は、エルゼビア（文献5）の許可を得て転載しています。
CPA処理した雄と雌のラット私の肝臓における図1. DNA損傷in vivoでの アルカリコメットアッセイでasured。5 7週齢の雄と雌F344ラットのグループは、オリーブオイルに50、25、オリーブオイルまたは10で処理され、又は100mg / kg /日のCPAました。治療は、0、24で実施し、そして45時間は、ラットは48時間後に屠殺し、そしてDNA損傷をアルカリコメットアッセイを用い％テールDNAとして肝臓で測定しました。 CPA処置は有意な増加は、わずか50および100mg / kg /日の用量で検出されると、閾値状で雄ラットの肝臓における％テールDNAの増加を誘導しました。 CPA処理は、全てのCPA群で検出された％テールDNAの有意な増加と、ほぼリニア用量依存的に雌ラットの肝臓におけるDNA鎖切断を誘導しました。雌雄ラットの肝臓におけるCPAによって誘発されるDNA損傷のための最低観察された遺伝毒性効果レベル（LOGELs）は、それぞれ、10および50mg / kg /日と推定されました。 *車両詐欺にP≦0.05の相対的で重要なトロール;エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
酵素修飾された 生体内 のアルカリコメットアッセイ で 用いて測定CPA処理した雄と雌のラットの肝臓における図2.酸化的DNA損傷 。5 7週齢の雄と雌F344ラットのグループは、オリーブオイルまたは10で処理しましたオリーブオイルで25、50、又は100mg / kg /日のCPA。治療は、0、24で実施し、そして45時間は、動物は、48時間で屠殺し、酵素変性コメットアッセイは、DNA損傷の指標として％テールDNAを用いて行きました。すべてのCPAの用量は、CPAで処置した雄ラットの肝臓における遠藤III-敏感なDNA損傷の有意な増加をもたらしました。遠藤III-敏感DNA dをしながらamageのみ、25,50、および100mg / kg /日のCPA（A）で処置した雌ラットで検出されました。すべてのCPAの投与量は、雄ラットの肝臓におけるhOGG1に敏感な酸化的DNA損傷の大幅な増加をもたらしました。 hOGG1感受性DNA損傷の増加は50および100mg / kg /日のCPA（B）で処置した雌ラットで検出されました。 *車両制御にP≦0.05の相対で有意。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1＆2。組織病 理学の分析結果。細胞毒性は偽陽性コメットアッセイの結果を生成することができるので、アポトーシスおよび/ または壊死細胞のための組織病 理学的評価は彗星陽性の組織のために実施すべきです。現在の研究では、何のCPA誘発性肝細胞アポトーシスまたは壊死は認められませんでした偽陽性コメットアッセイ応答の可能性を除外し、両方の男性と女性のラットの肝臓インチ
| 病変 | データ | 用量CPA | ||||
| 0ミリグラム/キログラム | 10mg / kgの | 25 mgの/ kgの | 50 mgの/ kgの | 100 mgの/ kgの | ||
| 肝細胞の細胞質空胞化 | 病変数 | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| ＃調べ | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| 病変％ | 17％</ TD> | 20％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均重大度 | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝細胞の有糸分裂 | 病変数 | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| ＃調べ | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| 病変％ | 0 | 0 | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均重大度 | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
ビヒクルおよびCPA処理された雄のF344ラットの肝臓における非腫瘍性病変の表1.発生率。
| 病変 | データ | 用量CPA | ||||
| 0ミリグラム/キログラム | 10mg / kgの | 25 mgの/ kgの | 50 mgの/ kgの | 100 mgの/ kgの | ||
| 肝細胞の細胞質空胞化 | 病変数 | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| ＃調べ | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| 病変％ | 20％ | 60％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均重大度 | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝細胞の有糸分裂 | 病変数 | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| ＃調べ | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| 病変％ | 0 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | |
| 平均重大度 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| 肝細胞巨大核 | 病変数 | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| ＃調べ | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| 病変％ | <TD> 00 | 100％ | 100％ | 100％ | ||
| 平均重大度 | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
車両およびCPAで処理した雌のF344ラットの肝臓における非腫瘍性病変の表2発生率。
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Discussion
このプロトコルは、単一細胞レベルでのラットの肝臓の両方の直接および酸化的DNA損傷の同時測定を説明します。一般的なプロトコル（ すなわち 、DNA損傷がない試験薬剤によって、しかし動物組織の取り扱いおよび処理によって誘導される）は、単一の細胞または核は最小限の処理によって誘導されるDNA損傷に単離することができる任意の組織にも適用可能です。私たちの研究では、骨髄7,9、胃6、腎臓9、膀胱9、肺9、心臓10、乳腺5、子宮5、精巣5、および血液5から細胞にアルカリコメットアッセイを行いました。これらのアッセイは、多数の器官および実験動物の組織における生体異物誘発性のDNA損傷を研究するための、迅速、単純で安価な方法を提供することができます。また、この方法は、例えば、末梢血には、剥離、アッセイを行うことにより、人間のバイオモニタリング研究のために使用することができます尿管の細胞、または臨床的または職業的に暴露された個体から得られた頬や鼻の上皮。基本的なアプローチはまた、インビトロで培養された細胞におけるDNA損傷を評価するために使用することができます。
コメットアッセイは、急性または亜慢性毒性試験に組み込まれている場合には、サンプリング時間は、 すなわち 、最後の治療および組織収集の間の時間は、時々他の毒性学的データの収集と調整しなければならない重要な変数です。可能な場合は、サンプリング時間は、時間経過彗星データに基づくべきである、ピーク血漿または組織濃度（Cmaxは）時間が達成される、または定常状態は、試験品19の複数回投与、以下の達成された後。単一の治療がある場合のケースでは、運動データまたは組織濃度が利用できないた、OECD TG489は、2以上の処置を行い、最後の治療後の組織2-6時間の収集をお勧めします、または治療19後の両方で2-6と16-26時間後に組織をサンプリングし、実施しました。
安楽死から彗星のスライドの準備までの時間の長さはできるだけ短くすることが重要です。実験的な能力がアッセイされる組織から迅速に高品質な単一細胞懸濁液を得ることに習熟度を証明することによって確立されることをお勧めします。一般的に、彗星のスライドは、1時間の最大値を取って単一細胞調製物を用いて、動物の屠殺後できるだけ早く準備する必要があります。負（車両）コントロールの範囲と分布を確立するために、履歴データベースの構築は非常にアッセイが適切な制御下にあることを保証することをお勧めします。以下が発生した場合、DNA損傷の過剰レベルは、ビヒクル/陰性対照動物において観察され得る：組織の1）不適切な取り扱い、安楽死と彗星スライドの準備の間の2）が長すぎる時間。 UV-containin単一細胞懸濁液または3）露光G光。範囲および陽性対照のディストリビューション用の履歴データベースの構築も非常にアッセイが知られている遺伝毒性物質に対する適切な感度が表示されることを保証することをお勧めします。メタンスルホン酸メチル（MMS）は、現在の研究における陽性対照として使用しました。メタンスルホン酸エチル（EMS）は、in vivoでのコメットアッセイの18の陽性対照としてJaCVAMで推奨されています。
コメットアッセイプロトコールに病変特異的エンドヌクレアーゼで消化を組み込むことにより、DNA損傷-でここで紹介する例では、酸化されたDNA塩基の特定の種類の認識によってアッセイの感度と特異性を向上させます。しかし、いくつかのエンドヌクレアーゼが認識し、DNA損傷の様々なクラスに切断することが可能であり得ることを認識すべきです。遠藤IIIの場合には、これは酸化的DNA損傷に関連付けられていない病変を含みます。正遠藤III-修正されたコメットアッセイの結果は、混合MOAを示すことができます。 Byの比較は、hOGG1は酸化的DNA損傷11を伴うMOAを確立するために、より有用である可能性がhOOG1で修飾されたアッセイからの酸化的損傷およびデータのためのより特異的です。
細胞毒性（細胞のアポトーシスおよび壊死）は、DNA鎖切断および偽陽性のコメットアッセイの結果を招くことがあります。自分自身で陽性コメットアッセイの結果は、遺伝毒性と解釈することはできません。細胞毒性については、正のコメットアッセイの結果の生物学的関連性を確立するために必要とされます。彗星陽性組織の病理組織学的分析は、組織毒性19の関連指標としてOECD TG489によって推奨されています。組織毒性（細胞のアポトーシスまたは壊死）の明確な証拠と正のコメットアッセイのデータは慎重に解釈されるべきです。
インビボでのアルカリ性コメットアッセイおよび遠藤III-とhOGG1変性アルカリコメットアッセイは、遺伝毒性についての決定を行うために定量的に使用することができます生体異物のエクスポージャー。彼らはまた、複数の動物組織におけるDNA損傷および修復において基礎的な研究を行うために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
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