Introduction
Den alkaliske kometmetoden måler DNA trådbrudd på enkeltcellenivå. Suspensjoner av enkeltceller er innebygd i agarose på et objektglass, og cellene lyseres for å danne nucleoids, som inneholder supercoil løkker av DNA. Elektroforese ved pH> 13 resulterer i tap av supercoiling i DNA løkker som inneholder trådbrudd, med de frigjorte DNA-tråder migrerer mot anoden, skape kometlignende strukturer som kan observeres ved fluorescens mikroskopi. Fragmentert DNA migrerer fra "hode" av komet inn i "hale", basert på størrelsen av fragmentet, og den relative fluorescensen av komet halen forhold til den totale intensitet (hode og hale) kan brukes til å kvantifisere DNA-brudd 1 , 2. Analysen er enkel, følsom, allsidig, hurtig og relativt rimelig en. Påvisningen av fragmentert DNA forårsaket av DNA-skadende midler benyttes en analyse for å kvantifisere DNA-skade i celler eller isolerte kjerner fra fysisk perto vev av dyr behandlet med potensielt genotoksiske materiale (r). På grunn av sine fordeler, er det in vivo kometmetoden anbefales som en andre in vivo gentoksisitet analysen (sammen med in vivo mikrokjerne assay) for å drive produktsikkerhetsvurderinger i dagens internasjonale konferansen om harmonisering (ICH) 3 og European Food Safety Authority (EFSA ) 4 gjeldende lover og forskrifter. I vårt laboratorium har vi ansatt analysen for å vurdere in vivo DNA-skade indusert av råvarer, legemidler, og nanomaterialer 5-10. Rottelever vil bli brukt som et eksempel i denne protokollen, men komet analysen kan utføres med andre vev / organer i forsøksdyr, så lenge intakte enkeltceller kan bli isolert fra vevet.
Visse typer DNA-skader er vanskelige å oppdage som DNA trådbrudd uten å endre den grunnleggende alkalisk kometmetoden. I tilfelle av oksidativ DNA-skade, tråden bdeskift kan opprettes på oksidative skader i DNA ved oppslutning med reparasjonsenzymer som menneske 8-oxoguanine-DNA-N-glykosylase 1 (hOGG1, noe som skaper pauser på åtte-oxoguanine (8-oxoGua) og metyl-fapy-guanin 11. også Endonuklease III (Endo III) oppretter bryter hovedsakelig ved oksyderte pyrimidiner 1. Således vil tilsetning av et enzym-fordøyelse trinn gjør analysen en spesifikk og følsom metode for måling av oksidativ DNA-skade in vivo-12. ved hjelp av disse analyser har vi vist giftstoff-indusert oksidativ DNA skade i leveren hos rotter og mus 6-8 og i hjertet av rotter 10.
Den alkaliske kometmetoden har mange programmer i genetisk toksikologi og menneskelig overvåking av biologisk miljø: 1) som en oppfølging in vivo-analyse for genotoxins identifisert av sensitive in vitro tester 3,13, 2) å vurdere mekanismer for xenobiotisk-indusert DNA-skader i flere vev 14, 3) for å undersøke om enkreftfremkallende opererer med en gentoksisk eller en ikke-gentoksisk virknings (MOA) 7, 4) for å evaluere DNA-skade reparasjon 15, 5) for å undersøke menneskelige sykdommer og yrkesmessig eksponering 16, og 6) som en potensiell høy gjennomstrømming screening test for organspesifikk gentoksisitet 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) på den amerikanske FDA / National Center for toksikologi Research.
MERK: studiedesign som beskrives her er basert på protokoll utviklet av den japanske Senter for validering av alternative metoder (JaCVAM) for sin validering av in vivo gnager alkalisk kometmetoden 18, og ytterligere modifisert basert på anbefalinger i OECD retningslinje TG489 19 .
1. Forberedelse
- Slide forberedelse
- Oppløs vanlig smeltende agarose ved 1% (w / v) i fosfatbuffer (Ca2 +, Mg2 + fri og fenol rød fri) ved oppvarming i en mikrobølgeovn.
- Plasser det smeltede 1% agarose standard oppløsning i et 55 ° C vannbad og ekvilibrere temperaturen til badet. Dip glass mikroskop glir inn i agarose løsning renne av eventuelle excess agarose og tørk baksiden av lysbildene rene. Plasser lysbildene oppreist på et flatt underlag og la lysbildene til tørk ved RT; lagre lysbilder i tørt sted.
- Utarbeidelse av kometanalyseløsninger
- Fremstille 0,5% lavtsmeltende agarose-løsning. Oppløs lavtsmeltende agarose i fosfatbuffer (Ca2 +, Mg2 +, og fenol rød fri) ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Hold løsningen ved 37-45 ° C i løpet av kometen lysbilde forberedelse; forkaste eventuelle gjenværende agarose løsning etterpå.
- Forbered Lysis buffer. Lage en 100 mM oppløsning av dinatrium-etylendiamintetraeddiksyre (dinatrium EDTA, Mr 372,24 g / mol), 2,5 M natriumklorid (NaCl, Mr 58,44 g / mol), og 10 mM tris hydroksymetyl aminometan (Tris Base, Mr 121,14 g / mol) i renset vann og juster til pH 10 med 10 N natriumhydroksyd-oppløsning (NaOH, Mr 40 g / mol). På dagen for bruk, legge Triton X100 og dimetylsulfoksid (DMSO, Mr 78,13 g / mol) til løsningen for å oppnå endelig Konsentraterioner av 1% og 10%, henholdsvis, og blandingen ble omrørt ved 4-10 ° C i minst 30 minutter før bruk.
- Gjør av friskt enzym buffer på bruksdagen. Fremstille en løsning inneholdende 40 mM 2- [4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-yl] etansulfonsyre (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM kaliumklorid (KCl, Mr 74,55 g / mol), 0,5 mM dinatrium EDTA og 0,2% bovint serumalbumin (BSA, Mr 66463 g / mol) i renset vann. Juster pH-verdien til 8,0 med 10 N kalilut (KOH, 56,1 g / mol). Omrør ved RT og bekrefte fullstendig oppløsning før bruk.
- Fremstille en alkalisk bufferoppløsning inneholdende 300 mM NaOH og 1 mM dinatrium-EDTA i renset vann. Omrør ved 4-10 ° C i minst 30 minutter før bruk. Mål pH i løsningen før bruk og sørge for at pH er> 13.
- Fremstille en oppløsning av 0,4 M Tris-base i renset vann og juster til pH 7,5 med saltsyre (HCl, Mr 36,46). Oppbevar løsningen ved 4-10 ° C. Dette nøytraliserer buffer.
- Gjør fResh hakking buffer på dagen for bruk. Fremstille en oppløsning inneholdende 20 mM dinatrium-EDTA og 10% DMSO i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, og fenol rød fri). Oppbevar på is inntil bruk.
- For å fremstille fargeløsning, fortynnet nukleinsyre fluorescerende flekken stamløsningen med Tris-borat-EDTA (TBE-buffer) ved 1: 10000 (volum / volum). Beskytt løsning mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie. Oppbevares ved 2-8 ° C og bruke med 24 hr.
2. Utarbeidelse av en enkelt cellesuspensjon fra rottelever
- Avlive rotter med CO 2 gass følgende metoder anbefalt i American Veterinary Medical Retningslinjer for Avliving av dyr: 2013 Edition 20.
- Sett CO 2 strømningshastighet på 2,75. Sett rotte i eutanasi kammeret (f.eks tørkeapparat krukke, rotte bur med ventilert lokk), og slå på CO 2 ved å åpne tankventilen. Vent på 1,5 til 2,5 min inntilrotte blir bevisstløs. Øke CO 2 strømmen til maksimal innstilling. Etter opphør av åndedrett, forlate Rat i kammeret for ca 1 min for å sikre aktiv dødshjelp. Kontroller dødshjelp ved palpating å bekrefte at rotta har ingen hjerterytme, og knipe tærne for å fastslå at rotta ikke trekke tilbake sitt lem.
- Desinfiser haired-hud med 70% etanol. Åpne bukhulen og fjerne den intakte leveren med kirurgisk saks. Etter fjerning av leveren, fjerne den venstre sidelapp fra den gjenværende lever med kirurgiske sakser. Plasser venstre lateral lapp på et skjærebrett, og kutte to tilstøtende 3-4 mm tykke tverrgående seksjoner ved hjelp av en engangs enkel gjennomgang barberblad.
- Plasser en tverrsnitt på filterpapir (for å hindre curling av seksjonen), og plasser delen inn 10% nøytral bufret formalin (NBF). Sørge for at forholdet mellom 10% NBF til vev er 10: 1 eller større. Etter en fiksering på minst 72 timer, procESS leveren for histopatologi (se kapittel 7 nedenfor).
- Plasser den andre tverrgående leveren delen inn 5 ml iskald hakking buffer (avsnitt 1.2.6) i en 6 cm petriskål og skyll 3 ganger for å fjerne rester av blod.
- Overfør leveren seksjon i et nytt 2 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml iskald buffer hakking. Finhakk godt skylt leveren seksjon med et par fine saks for å frigjøre cellene. Sil cellesuspensjonen gjennom en 40 mikrometer celle sil for å fjerne eventuelle vev klumper.
- Plasser enkeltcelle-suspensjon på is og brukes for å lage slides løpet av 1 time. Bekrefte konsentrasjonen av celler ved å telle (f.eks, med et hemocytometer eller elektronisk celleteller) for å sikre at dens konsentrasjon er omtrent 2 x 10 6 celler / ml.
3. Utarbeidelse av Comet Slides
- Bland ett volum av enkeltcellesuspensjon med 10 volumer av smeltet, 37 ° C, 0,5% lavtsmeltende agarose-løsning (avsnitt 1.2.1).Umiddelbart pipette 100 mL på et lysbilde belagt med vanlig smeltepunkt agarose (§ 1.1). Umiddelbart et dekkglass over celle-agarose blanding. Gjør minst 8 lysbilder for hver prøve.
MERK: Alle lysbilder bør identifiseres med et nummer eller lignende kode og sin identitet registrert, slik at lysbildene kan scores på en blindet måte (se 6.2.2 nedenfor). - Lå lysbildene flat og avkjøles til 4 ° C i 30 min.
- Etter at gelen har stivnet, forsiktig fjerne dekkglass og fordype lysbildene i pre-kjølt lysis buffer (avsnitt 1.2.2). Beskytt lysbildene fra lys og holder skinnene i lyseringsbuffer ved 4 ° C fra 1 time (minimum) til O / N (maksimum).
4. Enzyme Behandling av Comet Slides
- Fjern 6 av de 8 objektglass preparert fra hver vevsprøve fra den lyseringsbuffer og skylles 3 ganger i 5 minutter hver med enzymbuffer (1.2.3) ved romtemperatur. Bruk de resterende to lysbilder for alkalisk kometmetoden without enzym-behandling (se 5.1, nedenfor). Etter skylling, fjerne overflødig væske ved drenering og blotting lysbildene med vev.
- Spe hOGG1 og Endo III enzym aksjer med enzymet buffer på 1: 1000 (v / v). Plasser på is inntil bruk.
- Påfør 200 mL av følgende løsninger til objektglass preparert fra hver behandlingsgruppe: 200 ul enzym buffer alene (2 lysbilder brukes som referanse lysbilder), 200 mL hOGG1 løsning (2 lysbilder) eller 200 mL Endo III løsning (2 lysbilder).
- Sett inn lysbildene i petriplater foret med fuktet tørkepapir, dekke lysbilder med Parafilm og inkuber ved 37 ° C i 45 min for Endo III-behandlet og referanse lysbilder og 30 min for hOGG1 behandlet lysbilder.
- Etter inkubasjon skylles lysbilder med destillert vann og fortsette behandlingen som er beskrevet i 5.2, nedenfor.
5. Avkobling og elektroforese
- For lysbilder ikke behandles med enzymer, fjerne lysbilder fra lysis buffer, Avløp lysbildene og skylles en gang med kald nøytralisering buffer (avsnitt 1.2.5) i 5 minutter for å fjerne rester av såpe og salter.
- Plasser lysbilder fra trinn 4,5 og 5,1 tilfeldig i en horisontal gel elektroforese tank, unngå mellomrom. Fyll tanken med ferske pH> 13 elektroforese buffer (avsnitt 1.2.4) til væskenivået bare dekker lysbilder (unngå bobler over agarose og sørge for at tanken er nivået). Record buffer pH og temperatur ved begynnelsen av DNA-avkobling.
- La skinnene forblir i den alkaliske buffer i 20 min for å muliggjøre avvikling av DNA og ekspresjon av alkali-ansvarlig skade.
- Under avspolingen, fortsetter programstrømforsyningen frembringe 0,7 V / cm i elektroforese tanken (V / cm = volt dividert med avstanden i cm mellom de positive og negative elektroder).
- Etter slappe av, trykker du på Kjør-knappen på strømforsyningen. Om nødvendig, justere strømmen 300 mA ved å heve eller senke buffernivå. Hold the buffer nivå like over overflaten av skinnene. Utføre elektroforese ved 4 ° C i 20 min. Spill sleiden plassering, temperaturen av bufferen og strømmen (ampere) ved begynnelsen og slutten av elektroforese.
MERK: For mye buffer vil resultere i lavere spenninger som kan forstyrre DNA migrasjon. - Etter elektroforese, nøytralisere det overskytende alkali ved forsiktig å løfte skinnene fra tanken og neddykking i nøytralisering buffer (avsnitt 1.2.5) i 5 minutter. Drain lysbildene og gjenta to ganger til.
- Fix lysbildene ved å dyppe i kaldt 100% etanol i 5 min. Tillat lysbildene lufttørke, og plasser i et tørt område for lagring.
6. DNA Farging, Comet visualisering og analyse
- DNA farging
- Plasser lysbilder på en papp eller metall skuffen og legge 200 mL av nukleinsyre fluorescerende flekken arbeidsløsning (avsnitt 1.2.7) til hvert lysbilde og dekk med et glass dekkglass. Beskytt lysbildene fralys tillate lysbildene å forbli i kontakt med det fargeløsning i minst 30 minutter før avslutningen. Flekk lysbildene i grupper på 20 om gangen.
- Før du leser hvert lysbilde, forsiktig blot bort overflødig fargeløsning, være forsiktig med å forstyrre dekkglass.
- Comet Visualisering og scoring
- Bruk et videokamera festet til en fluorescens mikroskop for å se levende bilder av kometen lysbildet på dataskjermen.
- Tilfeldig velge et mikroskop felt som inneholder celler. Ved hjelp av en mus, velg en celle. Klikk på midten av "komet head" med venstre museklikk.
MERK: Datamaskinen Programvaren beregner alle måleparametre for cellen og legger data til en datafil. - Resultat alle cellene i den aktuelle feltet (se trinn 6.2.4), og deretter bruke mikroskop scene kontroller og den elektroniske videoen for å finne et annet sett med celler. Resultat disse cellene som beskrevet i 6.2.2.
- Resultat raset fROM høyre til venstre og ned til opp. Velg rundt 10 felt tilfeldig. I løpet av denne prosessen, bør enhver passende kometen celle som vises i synsfeltet scores uten bias.
MERK: Ikke scorer en komet hvis noe av det følgende er sant: 1) den ligger på en av kantene på lysbildet; 2) to eller flere kometer lapper; 3) det er rusk i halen; 4) programvaren kan ikke skille mellom hodet og halen; eller 5) farging av kjernen og / eller hale skiller seg sterkt fra andre kometer på lysbildet.
MERK: Comets med nesten alle sine DNA fluorescens i halen blir ofte referert til som "pinnsvinet" kometer. Hedgehog kometer bør ikke scoret, men antall piggsvin oppdaget under lysbilde scoring skal registreres og rapporteres som en prosentandel av det totale kometer. - Analyser minst 75 kometer per lysbilde, lesing to lysbilder per organ / vev for å få minst 150 komet celler / prøven totalt. Etter at det nødvendige antall celler fra et lysbilde må væreno scoret, resultatet blir lagret som et regneark-fil for senere dataanalyse.
7. Histopatologi Analysis
- Etter minimum 72 timers fiksering i 10% NBF, etterfulgt av vev trimming 21, rutinemessig behandle og legge ned den venstre laterale leverlapp av prøvene i en parafinvoksbasert medium 22. § prøvene ved ca. 5 mikron og samle på glassplater.
- Flekk seksjoner med hematoxylin og eosin (H & E):
- Varm lysbildene med parafin vevssnittene i en 60 ° C ovn i 2 timer før den fargeprosedyre.
- Bruk xylen til deparaffinize sidene. Rehydrere lysbildene med gradert etanol (EtOH) til en rennende vann skyll.
- Plasser glir i 450 ml hematoksylin i 2 min og 40 sek. Skyll lysbilder med syre (2 ml iseddik til 450 ml de-ionisert vann) for 4 sek følgende etter 5 min rennende vann skyll.
- Plasser gledes i 450 ml 70% EtOH inneholdende 1 ml ammoniumhydroksyd i 2 minutter, etterfulgt av rennende vann fra springen skylling i 2 min og 30 sek, og 70% EtOH skylling i 1 min.
- Inkuber objektglass med 450 ml Eosin Y løsning inneholdende 4 ml iseddik i 3 min.
- Dehydrere lysbilder med gradert EtOH. Tøm lysbildene med xylen (tre ganger 1 min hver), og hold lysbilder i xylen inntil dekkglass er plassert på skinnene.
- Undersøk lysbildene ved lysmikroskopi, rekordresultater, og karakteren ikke-neoplastiske lesjoner for alvorlighetsgrad som en (minimal), 2 (mild), 3 (moderat) eller 4 (merket).
MERK: alvorlighetsgrad søkt om en bestemt lesjon er basert på den relative andelen av leveren med lesjon (minimal = <1-15%, mild = 16-35%, moderat = 36-60%, og merket = 61- 100%).
analyse 8. Data
- Dyret regnes som eksperimentell enhet for statistiske evalueringer. DNA-skade blir uttrykt som% DNEn i halen.
- Oksidativt DNA skade er beregnet som følger: referanse lysbilder (uten enzym behandling) gi et overslag over bakgrunnen DNA kjedebrudd (SB).
MERK: enzymbehandlet lysbilder gi et mål på trådbrudd og oksiderte baser (SB + OX). Forutsatt at en lineær respons dose for% DNA i halen som en funksjon av DNA-skade, subtraksjon av SB fra SB + OX gir et estimat av DNA-strengbrudd fra oksyderte pyrimidiner / endret puriner 23. - Analyser% DNA i halen som en funksjon av dose ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Dunnetts test for parvise sammenligninger av svarene i behandlede dyr til bærerkontrollen.
MERK: Alle tester er ensidige og en p-verdi på mindre enn 0,05 er satt som kriterium for statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo alkaliske komet Assayet ble utført i forbindelse med det enzym-modifiserte komet assay for å måle både direkte og oksidativ DNA-skade i leveren hos rotter behandlet med cyproteronacetat (CPA) 5. CPA er et syntetisk hormon stoff som induserer rotteleversvulster i en sex-spesifikk måte, med fem ganger høyere doser for å indusere leversvulster hos hannrotter i forhold til kvinner 24. Vi har funnet at den direkte DNA-skade produsert av CPA i leveren hos hann- og hunnrotter har samme kjønn-spesifikke mønster som dens hepatotumorigenicity: en fem-ganger-høyere dose av CPA er nødvendig for å indusere en signifikant økning i DNA-skade i leveren hos menn enn hos kvinner (figur 1).
Vi hypotese at sex-spesifikke kometmetoden resultatet skyldes aktiviteten til hydroksysteroid sulfotransferaseaktivitet (er) (HST), som er 15 ganger høyerehos voksne hunnrotter enn hos voksne menn. HST metabolisme er et hastighetsbegrensende trinn i aktiveringen av CPA til DNA-bindende metabolitt (er) 25. I motsetning til CPA-indusert oksidativ DNA skade var generelt større hos menn enn hos hunnrotte lever, og dermed mindre sannsynlighet for å være en hastighetsbegrensende trinnet i tumordannelse (figur 2). Histopatologi evaluering av lever fra CPA-behandlede rotter viste ingen tegn på middel-indusert apoptose eller nekrose (tabellene 1 og 2), som indikerer at de positive komet analyseresultatene var ikke en sekundær effekt av cytotoksisitet 5. Figurene 1 og 2 og tabell 1 & 2 er gjengitt med tillatelse fra Elsevier (Referanse 5).
Figur 1. DNA-skader i leveren hos CPA-behandlede hann- og hunnrotter megasured med in vivo alkaliske komet assay. Grupper på fem syv uker gamle hann og hunn F344-rotter ble behandlet med olivenolje eller med 10, 25, 50, eller 100 mg / kg / dag CPA i olivenolje. Behandlinger ble utført ved 0, 24, og 45 timer, ble rottene avlivet ved 48 timer, og DNA-skade ble målt i leveren som% hale-DNA ved hjelp av den alkaliske komet analysen. CPA behandling induserte en økning i% hale-DNA i leveren hos hannrotter i en terskel-lignende måte, med en signifikant økning som detekteres bare med 50 og 100 mg / kg / dag doser. CPA behandling induserte DNA-strengbrudd i leveren hos hunnrotter i en nær lineær doseavhengig måte, med en betydelig økning i% hale-DNA detektert i alle CPA grupper. De laveste observerte Genotoksisitet Effect Levels (LOGELs) for CPA-indusert DNA-skader i leveren hos kvinnelige og mannlige rotter ble anslått til å være 10 og 50 mg / kg / dag, henholdsvis. * Signifikant på p≤0.05 forhold til kjøretøyet conkontroll; feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oksidativt DNA-skader i leveren hos CPA-behandlede hann- og hunnrotter målt med enzymet-modifisert in vivo alkalisk kometmetoden. Grupper på fem sju uker gamle mannlige og kvinnelige F344 rotter ble behandlet med olivenolje eller med 10, 25, 50 eller 100 mg / kg / dag CPA i olivenolje. Behandlinger ble utført på 0, 24 og 45 timer ble dyrene avlivet ved 48 timer, og det enzym-modifiserte komet-analysen ble utført under anvendelse% hale-DNA som en beregning av DNA-skade. Alle CPA doser signifikante økninger i Endo III-sensitive DNA-skader i leveren hos CPA-behandlede hannrotter; mens Endo III-sensitive DNA dAmage ble påvist bare i hunnrotter behandlet med 25, 50 og 100 mg / kg / dag CPA (A). Alle CPA doser resultert i betydelige økninger i hOGG1 følsomme oksidativ DNA skade i leveren hos hannrotter; økninger i hOGG1 følsomme DNA-skade ble påvist bare i hunnrotter behandlet med 50 og 100 mg / kg / dag CPA (B). * Signifikant på p≤0.05 forhold til kjøretøykontroll; feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabellene 1 og 2. Histopatologiske analyseresultater. Siden cytotoksisitet kan generere falske positive kometanalyseresultatene, histopatologiske vurderinger for apoptotiske og / eller nekrotiske celler bør gjennomføres for komet positive vev. I denne studien ble det ikke observert CPA-indusert hepatocytter apoptose eller nekrosei leveren hos både hann- og hunnrotter, som utelukket muligheten for en falsk positiv kometmetoden respons.
| lesjon | Data | dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocytter cytoplasma vacuolization | antall lesjoner | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersøkte | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lesjon% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Gjennomsnittlig Severity | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocytter mitose | antall lesjoner | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Undersøkte | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lesjon% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Gjennomsnittlig Severity | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabell 1. Forekomst av ikke-neoplastiske lesjoner i leveren hos kjøretøy- og CPA-behandlede hann F344 rotter.
| lesjon | Data | dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocytter cytoplasma vacuolization | antall lesjoner | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøkte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesjon% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Gjennomsnittlig Severity | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocytter mitose | antall lesjoner | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøkte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesjon% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Gjennomsnittlig Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocytter Karyomegaly | antall lesjoner | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Undersøkte | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lesjon% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Gjennomsnittlig Severity | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabell 2. Forekomst av ikke-neoplastiske lesjoner i leveren hos kjøretøy og CPA-behandlede kvinnelige F344 rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver den samtidige måling av både direkte og oksidativ DNA-skade i rottelever på celle-nivået. Den generelle protokoll er anvendbar for en hvilken som helst vev som enkeltceller eller kjerner kan bli isolert med minimal bearbeiding-indusert DNA-skade (dvs. DNA-skade indusert ikke av testmidlet, men ved håndtering og behandling av animalsk vev). I vår forskning har vi gjennomført alkaliske komet analyser på celler fra benmargen 7,9, mage 6, nyre 9, blære 9, lunge 9, hjerte 10, melkekjertlene 5, livmor 5, testikkel 5, og blod 5. Disse analyser kan gi en rask, enkel og billig metode for å studere xenobiotisk-indusert DNA-skade i flere organer og vev i forsøksdyr. I tillegg kan denne fremgangsmåte brukes for menneske biomonitoring studier ved å gjennomføre analyser, for eksempel, på perifert blod, ekspandertcellene i urinveiene, eller kinn eller nasal epitel innhentet fra klinisk eller yrkeseksponerte personer. Den grunnleggende metode kan også brukes for å vurdere DNA-skade i dyrkede celler in vitro.
Når kometen analysen er integrert i akutte eller subkronisk toksikologiske studier samplingstiden, dvs. tiden mellom siste behandling og innsamling av vev, er en kritisk variabel som noen ganger må forenes med innsamling av andre toksikologiske data. Hvis mulig, bør prøvetakingstidspunkter være basert på tid kurskometdata, tidspunktet da maksimal plasma eller vev konsentrasjon (Cmax) oppnås, eller etter at steady state oppnås etter flere administrasjoner av testen artikkel 19. I tilfeller ble kinetiske data eller vevskonsentrasjoner ikke er tilgjengelige, OECD TG489 anbefaler å drive to eller flere behandlinger og oppsamling av vev 2-6 timer etter den siste behandling, eller, hvis en enkelt behandling ergjennomført, prøvetaking vevet på både 2-6 og 16-26 timer etter behandlingen 19.
Det er viktig at lengden av tiden fra eutanasi til komet lysbilde preparatet være så kort som mulig. Det anbefales at eksperimentell kompetanse etableres ved å demonstrere ferdigheter i å oppnå høy kvalitet enkeltcellesuspensjoner raskt fra vev som er analysert. Vanligvis bør komet lysbilder utarbeides så snart som mulig etter at dyreoffer, med enkelt celle forberedelse tar maksimalt en time. Etablering av en historisk database for å etablere områder og utdeling av negative (vehicle) kontrollene er sterkt anbefalt for å sikre at analysen er under forsvarlig kontroll. Høye nivåer av DNA-skader kan observeres i kjøretøy / negative kontrolldyrene når følgende skje: 1) feilaktig håndtering av vev; 2) for lang tid mellom aktiv dødshjelp og kometen lysbilde forberedelse; eller 3) eksponering av enkeltcellesuspensjon til UV-som ing lys. Etablering av en historisk database for områdene og utdeling av positive kontroller er også sterkt anbefalt å sikre at analysen viser riktig følsomhet for kjente genotoxins. Metylmetansulfonat (MMS) ble anvendt som positiv kontroll i denne studien; etyl metansulfonat (EMS) er anbefalt av JaCVAM som en positiv kontroll for in vivo-assay komet 18.
Innlemming digestions med lesjon spesifikke endonucleases inn kometen analyseprotokollen øker sensitivitet og spesifisitet av analysen gjennom anerkjennelse av bestemte typer DNA lesjoner i eksempelet som presenteres her, oksidert DNA-baser. Det bør imidlertid være klar over at enkelte endonukleaser kan være i stand til å gjenkjenne og spalte på ulike klasser av DNA-lesjoner; i tilfelle av Endo III, omfatter dette lesjoner som ikke er forbundet med oksidativ DNA-skade. En positiv Endo III-modifisert komet analyseresultat kan indikere en blandet MOA. By sammenligning er hOGG1 mer spesifikk for oksidative skader og data fra en hOOG1-modifisert assay kan være mer nyttig for å etablere en MOA som involverer oksidativ DNA-skade 11.
Cytotoksisitet (celle apoptose og nekrose) kan føre til DNA-trådbrudd og en falsk positiv komet analyseresultat: positive kometanalyseresultatene i seg selv kan ikke tolkes som gentoksisitet. Informasjon om cytotoksisitet er nødvendig for å etablere den biologiske relevansen av en positiv kometanalyseresultatet. Histopatologiske analyser av komet positiv vev er anbefalt av OECD TG489 som et relevant mål på vev toksisitet 19. Positive kometanalysedata med klare bevis på vev toksisitet (celle apoptose eller nekrose) bør tolkes med forsiktighet.
In vivo alkaliske kometmetoden og Endo III og hOGG1-modifiserte alkaliske komet analyser kan brukes på en kvantitativ måte å ta beslutninger om gentoksisitet avxenobiotiske eksponeringer. De kan også brukes til å utføre grunnleggende forskning innen DNA-skade og reparasjon i flere animalsk vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
