Introduction
O ensaio cometa alcalino mede rupturas dos filamentos de DNA no nível de uma única célula. As suspensões de células únicas são incorporados em agarose sobre uma lâmina de microscópio e as células lisadas para formar nucleoids, que contêm circuitos de super-enrolados ADN. Eletroforese em pH> 13 resulta na perda de supercoiling em loops de DNA contendo quebras de fita, com os fios libertados de DNA migram para o ânodo, a criação de estruturas semelhantes a cometas que podem ser observados por microscopia de fluorescência. ADN fragmentado migra a partir da "cabeça" do cometa na "cauda" com base no tamanho do fragmento, e a fluorescência relativa da cauda do cometa em comparação com a intensidade total (cabeça e cauda) pode ser utilizado para quantificar a quebra do ADN 1 , 2. O ensaio é simples, sensível, versátil, rápido, e relativamente barato 1. A detecção de ADN fragmentado causada por agentes que danificam o DNA é usado um ensaio para quantificar os danos no DNA em células ou isolado a partir de núcleos inditecidos duplos de animais tratados com o material potencialmente genotóxico (s). Devido às suas vantagens, o ensaio cometa in vivo é recomendada como um segundo ensaio in vivo genotoxicidade (emparelhado com o ensaio de micronúcleos in vivo) para a realização de avaliações de segurança de produtos no actual Conferência Internacional de Harmonização (ICH) 3 e Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA ) 4 diretrizes regulamentares. Em nosso laboratório, nós empregamos o ensaio para avaliar danos DNA vivo induzida por ingredientes alimentares, produtos farmacêuticos e nanomateriais 5-10. fígado de rato vai ser utilizado como exemplo neste protocolo, mas o ensaio de cometa pode ser realizado com outros tecidos / órgãos de animais experimentais, desde que as células individuais podem ser isoladas intactas a partir do tecido.
Certos tipos de danos no DNA são difíceis de detectar, como rupturas dos filamentos de DNA sem modificar o ensaio cometa alcalino básico. No caso de dano oxidativo ao DNA, costa breaks podem ser criados em lesões oxidativas em ADN por digestão com enzimas de reparação, tais como humano 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilase 1 (hOGG1, que cria intervalos de 8-oxoguanina (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. além disso, endonuclease III (Endo III) cria intervalos principalmente em pirimidinas oxidados 1. Assim, a adição de um passo de digestão enzimática torna o ensaio de um método específico e sensível para medir lesões oxidativas do ADN in vivo 12. Utilizando estes ensaios, que demonstraram lesões oxidativas do ADN induzida por agente tóxico no fígado de ratos e ratinhos de 6-8 e no coração de ratos 10.
O ensaio cometa alcalino tem muitas aplicações em toxicologia genética e biomonitorização humana: 1) como um follow-up ensaio in vivo para genotoxinas identificadas pela sensível in vitro testa 3,13, 2) para avaliar mecanismos de dano ao DNA induzido xenobióticos em vários tecidos 14, 3) para investigar se acancerígena funciona utilizando um modo não-genotóxica de ação (MOA) 7 genotóxicos ou, 4) para avaliar DNA reparação de danos 15, 5) para investigar doenças humanas e exposições ocupacionais 16, e 6) como um potencial ensaio de rastreio de alto rendimento para -órgão específico genotoxicidade 17.
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Protocol
Ética declaração: Procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da FDA Centro de US / Nacional para toxicológica Research.
NOTA: O desenho do estudo aqui descrito é baseado no protocolo desenvolvido pelo Centro Japonês de Validação de Métodos Alternativos (JACVAM) para a sua validação do ensaio in vivo de roedores cometa alcalino 18, e ainda mais modificada com base em recomendações da OECD TG489 19 .
1. Preparação
- preparação da lâmina
- Dissolve-se agarose de fusão normal a 1% (w / v) em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+ livre e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas.
- Coloque a solução de agarose a 1% fundida padrão em um banho de água a 55 ° C e equilibrar a temperatura com o banho. microscópio Dip lâminas de vidro para a solução de agarose, drenar qualquer excess agarose e limpe a parte de trás das lâminas limpas. Colocar as lâminas em posição vertical sobre uma superfície plana e permitem que as lâminas secar à RT; armazenar as lâminas em local seco.
- Preparação de soluções de teste do cometa
- Preparar a solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,5%. Dissolver baixo ponto de fusão de agarose em tampão de fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol), por aquecimento num forno de microondas. Mantenha a solução a 37-45 ° C durante a preparação da lâmina cometa; descartar qualquer solução de agarose restante depois.
- Preparar tampão de lise. Adicione uma solução 100 mM de dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA dissódico, Sr. 372,24 g / mol), cloreto de sódio 2,5 M (NaCl, Sr. 58,44 g / mol), e 10 mM de tris-hidroximetil-aminometano (Tris Base, Sr. 121,14 g / mol) em água purificada, e ajustar a pH 10 com 10 uma solução de hidróxido de sódio (NaOH, Mr 40 g / mol). No dia da utilização, adicionar Triton X-100 e sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sr. 78,13 g / mol) à solução para alcançar Concentrat definitivaiões de 1% e 10%, respectivamente, e agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização.
- Faça tampão enzimática fresca no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 40 mM de ácido 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanossulfónico (HEPES, Sr. 238,3 g / mol), cloreto de potássio 100 mM (KCl, Sr. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA dissódico, e 0,2% de albumina de soro bovino (BSA, Mr 66463 g / mol) em água purificada. Ajustar o pH a 8,0 com solução 10 N de hidróxido de potássio (KOH, 56,1 g / mol). Agita-se à temperatura ambiente e verificar dissolução completa antes da utilização.
- Prepara-se uma solução tampão alcalina contendo NaOH 300 mM e 1 mM de EDTA dissódico em água purificada. Agita-se a 4-10 ° C durante pelo menos 30 min antes da utilização. Medir o pH da solução antes da utilização e certificar-se de que o pH é> 13.
- Prepara-se uma solução de 0,4 M de Tris base em água purificada, e ajustar para pH 7,5 com ácido clorídrico (HCl, Sr. 36,46). Guardar a solução a 4-10 ° C. Isto é neutralizantes tampão.
- Faça fresh tampão picados no dia de uso. Prepara-se uma solução contendo 20 mM de EDTA dissódico e DMSO a 10% em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e sem vermelho de fenol). Armazenar em gelo até à sua utilização.
- Para preparar a solução de coloração, uma solução diluída de estoque mancha fluorescente ácido nucleico com Tris-borato-EDTA (tampão TBE) a 1: 10000 (v / v). Proteger a solução da luz usando papel alumínio. Armazenar de 2-8 ° C e usar com 24 hr.
2. Preparação de suspensões de células isoladas de fígado de rato
- Euthanize ratos com CO métodos seguintes 2 gás recomendadas nas Diretrizes American Medical veterinários para a eutanásia de animais: 2013 Edição 20.
- Definir a taxa de fluxo de CO 2 em 2.75. Coloque o rato na câmara de eutanásia (por exemplo, frasco secador, gaiola de ratos com tampa ventilada) e ligue o CO 2, abrindo a válvula do tanque. Espere por 1,5 a 2,5 min até orato torna-se inconsciente. Aumentar o fluxo de CO 2 para a sua configuração máxima. Após cessação de respiração, deixar o rato na câmara durante cerca de 1 min para assegurar a eutanásia. Verifique eutanásia por palpação para confirmar que o rato não tem batimentos cardíacos, e beliscando os dedos do pé para determinar que o rato não retirar a membro.
- Desinfectar o cabelo-pele com etanol 70%. Abrir a cavidade abdominal e remover o fígado intacto com tesouras cirúrgicas. Após a remoção do fígado, remover o lobo lateral esquerdo do fígado restante com tesouras cirúrgicas. Coloque o lobo lateral esquerdo em uma placa de corte, e cortar dois 3-4 mm cortes transversais de espessura adjacentes usando uma lâmina descartável só fio de navalha.
- Coloque uma secção transversal em papel de filtro (para evitar o enrolamento da secção), e colocar a secção em formalina a 10% tamponada neutra (NBF). Assegure-se que a proporção de NBF a 10% para o tecido é de 10: 1 ou superior. Depois de um tempo de fixação de pelo menos 72 h, Process o fígado para exame histopatológico (consulte a secção 7, abaixo).
- Coloque a segunda secção transversal do fígado em 5 ml de tampão gelado picagem (secção 1.2.6) numa placa de 6 centímetros de Petri e lavar 3 vezes para remover o sangue residual.
- Transferir a secção de fígado para um tubo de centrífuga de 2 ml novo contendo 1 ml de tampão de picagem gelada. Picar a secção de fígado bem enxaguada com um par de tesouras finas para libertar as células. Coe a suspensão de células através de um filtro de células 40 mm para remover todas as protuberâncias do tecido.
- Colocar a suspensão de células individuais em gelo e usar-se para fazer lâminas dentro de 1 hora. Verificar a concentração de células por contagem (por exemplo, com um hemocitómetro ou contador de células electrónico) para garantir que a sua concentração é de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml.
3. Preparação de Comet Slides
- Misturar um volume da suspensão de célula única com 10 volumes de fusão, 37 ° C, solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% (secção 1.2.1).pipeta imediatamente 100 ul numa lâmina revestida com agarose ponto de fusão normal (seção 1.1). Imediatamente coloque uma lamela sobre a mistura de células-agarose. Fazer pelo menos 8 desliza para cada amostra.
NOTA: Todas as lâminas devem ser identificados por um número ou código semelhante e sua identidade registrada, de modo que as lâminas podem ser marcados de forma cega (veja 6.2.2, abaixo). - Coloque os slides plana e fria a 4 ° C durante 30 min.
- Depois que o gel tem solidificado, remover suavemente as lamelas e mergulhe as lâminas em tampão de lise pré-refrigerados (ponto 1.2.2). Proteger as lâminas de luz e manter as lâminas em tampão de lise a 4 ° C a partir de 1 h (mínimo) de O / N (máximo).
4. Enzyme Tratamento de Comet Slides
- Remover 6 dos 8 diapositivos preparados a partir de cada amostra de tecido a partir do tampão de lise e lavá-los 3x durante 5 min cada, com tampão de enzima (secção 1.2.3) à TA. Use os restantes dois slides para o ensaio cometa alcalino without enzima-tratamento (ver 5.1, abaixo). Após a lavagem, retire o excesso de líquido por drenagem e secar as lâminas com os tecidos.
- Dilui-se stocks de enzima Endo hOGG1 e III com tampão de enzima a 1: 1000 (v / v). Colocar em gelo até à sua utilização.
- Aplicar 200 ul das soluções a seguir para os slides preparados a partir de cada grupo de tratamento: 200 ul de tampão de enzima sozinhos (2 slides utilizados como lâminas de referência), 200 solução ul hOGG1 (2 slides) ou 200 ul de Endo solução III (2 slides).
- Coloque os slides em placas de Petri forradas com papel toalha umedecido, cobrir as lâminas com Parafilm e incubar a 37 ° C durante 45 minutos para Endo III-tratada e lâminas de referência e 30 min para slides tratados hOGG1.
- Após a incubação, as lâminas enxaguar com água destilada e continuar o processamento como descrito em 5.2, abaixo.
5. desenrola e Eletroforese
- Para slides não tratado com enzimas, remova os slides do tampão de lise, Drenar as lâminas e lavar uma vez com tampão de neutralização frio (secção 1.2.5) durante 5 minutos para remover o detergente e os sais residuais.
- Colocar as lâminas de Passos 4.5 e 5.1 aleatoriamente em um tanque de eletroforese em gel horizontal, evitando quaisquer espaços. Encha o tanque com pH> 13 tampão de electroforese feita recentemente (secção 1.2.4) até que o nível do líquido cobre apenas os slides (evitar bolhas sobre a agarose e certifique-se o tanque está nivelado). Grave o pH e a temperatura no início do desenrolamento do ADN.
- Deixe as lâminas permanecem no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-susceptível.
- Durante o desenrolamento, o programa de fornecimento de energia para a produção de 0,7 V / cm no tanque de electroforese (V / cm = Volts dividida pela distância em centímetros entre os eléctrodos positivos e negativos).
- Depois de desenrolar, pressione o botão Executar da fonte de alimentação. Se necessário, ajustar a corrente de 300 mA, aumentando ou diminuindo o nível do tampão. Mantenha thnível tampão e apenas acima da superfície das lâminas. Efectuar a electroforese a 4 ° C durante 20 min. Grave a colocação slide, a temperatura do buffer e as correntes (AMPS) no início e no final de eletroforese.
NOTA: O excesso de tampão irá resultar em tensões mais baixas que podem interferir com a migração de ADN. - Após a eletroforese, neutralizar o excesso alcalino, levantando suavemente as lâminas do tanque e imersão em tampão de neutralização (ponto 1.2.5) durante 5 min. Escorra os slides e repetir mais duas vezes.
- Fixar as lâminas por imersão em etanol frio a 100% durante 5 min. Permitir que as lâminas para o ar seco e coloque em uma área seca para armazenamento.
6. DNA Coloração, Comet visualização e análise
- coloração DNA
- Colocar as lâminas em uma bandeja de papelão ou metal e adicione 200 ml de solução de mancha de trabalho nucleico fluorescente ácido (secção 1.2.7) para cada slide e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger os slidesluz para permitir que as lâminas se mantenham em contacto com a solução de coloração, durante pelo menos 30 minutos antes da contagem. Corar as lâminas em lotes de 20 de cada vez.
- Antes de ler cada slide, suavemente apagar afastado solução de coloração excesso, tomando cuidado para não perturbar a tampa de vidro.
- Visualization cometa e Scoring
- Use uma câmera de vídeo acoplada a um microscópio de fluorescência para visualizar imagens ao vivo da lâmina cometa no monitor do computador.
- Aleatoriamente escolher um campo do microscópio contendo células. Usando um mouse, selecione uma célula. Clique no centro do "cabeça do cometa" com o botão esquerdo do mouse.
NOTA: O software de computador calcula os parâmetros de medida para a célula e adiciona os dados para um ficheiro de dados. - Marcar todas as células no campo atual (veja o passo 6.2.4), e, em seguida, usar os controles do estágio do microscópio e o vídeo na tela para encontrar um outro conjunto de células. Pontuação essas células, como descrito em 6.2.2.
- Marcar o slide from direita para a esquerda e para baixo para cima. Escolha cerca de 10 campos aleatoriamente. Durante este processo, qualquer célula cometa adequado que aparece no campo de visão deve ser marcado sem viés.
NOTA: Não marcar um cometa se qualquer uma das seguintes situações: 1) ele está localizado em qualquer uma das extremidades da corrediça; 2) dois ou mais cometas se sobrepõem; 3) há detritos na cauda; 4) o software não é possível diferenciar entre a cabeça e a cauda; ou 5) a coloração do núcleo e / ou cauda difere grandemente de outras cometas sobre a corrediça.
NOTA: cometas com quase toda a sua fluorescência do ADN na cauda são muitas vezes referidos como cometas "ouriço". cometas hedgehog não deve ser marcado, mas o número de ouriços detectados durante o placar de slides devem ser registrados e relatados como percentagem de cometas totais. - Analisar pelo menos 75 cometas por slide, leitura dois slides por órgão / tecido para obter pelo menos 150 células / cometa amostra total. Depois do número requerido de células a partir de uma corrediça tem seren marcou, o resultado é salvo como um arquivo de planilha para análise de dados mais tarde.
7. Análise Histopatologia
- Depois de um mínimo de 72 horas de fixação em NBF a 10%, seguido de tecido de corte 21, rotineiramente processar e incorporar o lobo lateral esquerdo do fígado das amostras em uma parafina-cera com base em forma 22. Secção as amostras em cerca de 5 micra e recolher em lâminas de vidro.
- Corar as secções com hematoxilina e eosina (H & E):
- Aquece-se as lâminas com as secções de tecido de parafina numa estufa a 60 ° C durante 2 horas antes do procedimento de coloração.
- Use xileno para Desparafinar os lados. Reidratar as lâminas com etanol graduado (EtOH) a uma lavagem com água da torneira em execução.
- Colocar as lâminas em 450 ml de hematoxilina em 2 min e 40 seg. Lavar as lâminas com ácido (ácido acético glacial 2 ml a 450 ml de água deionizada) para 4 seg seguido de 5 min correndo lavagem com água da torneira.
- Coloque o deslizouES em EtOH 450% 70 mL contendo 1 mL de hidróxido de amónio durante 2 min, seguido por água corrente da torneira de lavagem durante 2 min e 30 seg, e 70% de EtOH de lavagem para 1 min.
- Incubar as lâminas com 450 ml de solução de eosina Y contendo ácido acético glacial, 4 ml, durante 3 minutos.
- Desidratar as lâminas com EtOH classificados. Limpar as lâminas com xileno (três vezes 1 min cada), e mantenha slides em xileno até lamínulas são colocados sobre os slides.
- Examine os slides por microscopia de luz, os resultados recordes, e as lesões de grau não neoplásicas para a gravidade como 1 (mínima), 2 (moderada), 3 (moderada), ou 4 (marcado).
NOTA: O grau de gravidade aplicada para uma lesão específica baseia-se no peso relativo do fígado, com a lesão (= mínimas <1-15%; 16-35% = ligeira, moderada = 36-60%; e marcado = 61- 100%).
8. Análise de Dados
- O animal é considerado a unidade experimental para avaliações estatísticas. dano do ADN é expressa como% DNUm na cauda.
- dano oxidativo ao DNA é calculado da seguinte forma: os slides de referência (sem tratamento enzimático) fornecer uma estimativa das rupturas dos filamentos de ADN de fundo (SB).
NOTA: Os slides tratado com enzimas fornecer uma medida de rupturas dos filamentos e bases oxidadas (SB + Ox). Assumindo que uma resposta a dose linear de DNA% em cauda como uma função de danos no ADN, a partir da subtracção do SB SB + OX dá uma estimativa de quebras da cadeia de ADN a partir de purinas / pirimidinas oxidados alterados 23. - Analise% em ADN da cauda, como uma função da dose por ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Dunnett para comparações de pares de respostas nos animais tratados com o controlo do veículo.
NOTA: Todos os testes são uma cauda e um valor de p inferior a 0,05 é definido como o critério para a significância estatística.
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Representative Results
O ensaio cometa alcalina in vivo foi realizada em conjunto com o ensaio cometa modificado por enzima para medir tanto o dano oxidativo directa de ADN e no fígado dos ratos tratados com o acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA é um fármaco hormonal sintética que induz tumores de fígado de rato de uma forma dependente do sexo, com cinco vezes doses mais elevadas necessárias para induzir tumores do fígado em ratos machos em comparação com as fêmeas 24. Nós descobrimos que os danos no DNA directa produzido pela CPA no fígado de ratos machos e fêmeas tem o mesmo padrão específico do sexo quanto sua hepatotumorigenicity: é necessária uma dose cinco vezes mais altos de CPA para induzir um aumento significativo no dano do ADN no fígados de machos em comparação com as fêmeas (Figura 1).
Nós supomos que o resultado do ensaio cometa específicos do sexo é devido à actividade de sulfotransferase hidroxiesteróides (s) (HST), o que é 15 vezes maiorem ratas adultas do que em homens adultos. Metabolismo HST é um passo limitante da taxa na activação de CPA a metabólito (s) de ligação de ADN 25. Em contraste, lesões oxidativas do ADN induzida por CPA era geralmente maior do que no sexo masculino fígados de ratos fêmeas, e, assim, menos susceptíveis de ser um passo na formação de tumores limitante da taxa (Figura 2). Histopatologia de fígados de ratos tratados com CPA não mostraram nenhuma evidência de apoptose induzida por agente ou necrose (Tabelas 1 e 2), indicando que os resultados do ensaio de cometas positivos não foram um efeito secundário de citotoxicidade 5. As Figuras 1 e 2 e nas Tabelas 1 & 2 são reproduzidas com a permissão da Elsevier BV (Referência 5).
Figura 1. danos no DNA de fígados de sexo masculino tratados com CPA e ratas measured com o ensaio cometa alcalina in vivo. Grupos de cinco ratos machos F344 e fêmea de sete semanas de idade foram tratadas com azeite ou com 10, 25, 50, ou 100 mg / kg / dia de CPA no azeite. Os tratamentos foram realizados a 0, 24, e 45 horas, os ratos foram sacrificados a 48 h, e danos no ADN foi medida no fígado como ADN% cauda utilizando o ensaio cometa alcalino. CPA tratamento induziu um aumento na% de ADN da cauda nos fígados de ratos machos de uma forma limiar semelhante, com aumentos significativos ser detectado apenas com as doses de 50 e 100 mg / kg / dia. tratamento de CPA induzidas quebras na cadeia de ADN nos fígados de ratos do sexo feminino de uma maneira quase linear dependente da dose, com aumentos significativos no ADN da cauda% detectados em todos os grupos de CPA. A menor observados níveis de genotoxicidade Effect (LOGELs) para danos no DNA induzidos por CPA nos fígados dos ratos fêmeas e machos foram estimadas em 10 e 50 mg / kg / dia, respectivamente. * Significativo a p≤0.05 em relação ao con veículocontrole; barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os danos do ADN oxidativo no fígado de macho-CPA, e tratada ratas medido com o ensaio in vivo cometa alcalina modificada com enzima. Grupos de cinco ratos machos F344 e fêmea de sete semanas de idade foram tratadas com azeite ou com 10, 25, 50, ou 100 mg CPA / kg / dia em azeite. Os tratamentos foram realizados a 0, 24, e 45 h, os animais foram sacrificados às 48 h, e o ensaio do cometa modificada por enzima foi conduzida usando DNA% cauda como uma métrica de danos no ADN. Todas as doses de CPA produziu aumentos significativos no dano Endo III-sensível do ADN nos fígados de ratos machos tratados com CPA; enquanto DNA d Endo III-sensitiveAmage foi detectado apenas em ratas tratadas com 25, 50, e 100 mg / kg / dia de CPA (A). Todas as doses de CPA resultou em aumentos significativos de danos hOGG1 sensível DNA oxidativo no fígado de ratos machos; aumentos em danos no ADN hOGG1-sensíveis foram detectados apenas em ratas tratadas com 50 e 100 mg / kg / dia de CPA (B). * Significativo a p £ 0,05 em relação ao controlo do veículo; barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As Tabelas 1 e 2. Os resultados da análise de histopatologia. Desde citotoxicidade pode gerar resultados do ensaio cometa falso-positivos, avaliações histopatológicos para células em apoptose e / ou necróticas deve ser conduzida para tecidos cometa-positivos. No presente estudo, não foi observada a apoptose de hepatócitos induzida por CPA ou necroseem fígados de ambos os ratos machos e fêmeas, que excluiu a possibilidade de uma resposta ensaio do cometa de falsos positivos.
| Lesão | Dados | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Vacuolização citoplasmática dos hepatócitos | contagem de lesões | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # Examinada | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesão% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Média de Gravidade | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| mitose hepatócito | contagem de lesões | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # Examinada | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesão% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Média de Gravidade | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabela 1. Incidência de lesões não neoplásicas em fígados de ratos F344 macho com veículo e tratados com CPA.
| Lesão | Dados | Dose CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Vacuolização citoplasmática dos hepatócitos | contagem de lesões | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # Examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesão% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Média de Gravidade | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| mitose hepatócito | contagem de lesões | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # Examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesão% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Média de Gravidade | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatócito Karyomegaly | contagem de lesões | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # Examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesão% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Média de Gravidade | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabela 2. Incidência de lesões não-neoplásicas no fígado de ratos F344 fêmeas tratadas com CPA veículo-e.
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Discussion
Este protocolo descreve a medição simultânea tanto dos danos de ADN directa e oxidativo no fígado de rato ao nível da célula individual. O protocolo geral é aplicável a qualquer tecido a partir do qual as células individuais ou núcleos podem ser isolados com o mínimo de danos de DNA induzidos por transformação (isto é, danos no ADN induzida não pelo agente de teste, mas pelo manuseamento e processamento dos tecidos animais). Em nossa pesquisa, realizamos ensaios cometa alcalino em células da medula óssea 7,9, estômago 6, rim 9, bexiga 9, pulmão 9, coração 10, glândula mamária 5, útero 5, testis 5, e sangue 5. Estes ensaios podem proporcionar um método rápido, simples e barato para estudar danos no ADN induzida por xenobióticos em vários órgãos e tecidos de animais experimentais. Além disso, este método pode ser utilizado para estudos de biomonitorização humana por ensaios de condutores, por exemplo, no sangue periférico, esfoliadacélulas do tracto urinário, ou os epitélios bucal ou nasal obtidos a partir de indivíduos clinicamente ou profissionalmente expostos. A abordagem básica também pode ser utilizado para a avaliação de danos ao DNA em células em cultura in vitro.
Quando o teste do cometa é integrado em estudos de toxicologia aguda ou subcrônica, o tempo de amostragem, ou seja, o tempo entre o último tratamento e coleta de tecido, é uma variável crítica que às vezes deve ser conciliado com a recolha de outros dados toxicológicos. Se possível, os tempos de amostragem deve basear-se em curso de tempo dos dados de cometas, o momento em que o pico de plasma ou tecido de concentração (Cmax) foi atingida, ou após estado estacionário é atingido após várias administrações do artigo de teste 19. Em casos foram concentrações de dados cinéticos ou tecidos não estão disponíveis, TG489 OCDE recomenda realização dois ou mais tratamentos e recolha de tecidos 2-6 horas após o último tratamento, ou, se é um único tratamentorealizada, a amostragem de tecidos, tanto a 2-6 e 16-26 horas após o tratamento 19.
É crucial que o período de tempo desde a eutanásia a preparação da lâmina cometa ser tão curto quanto possível. É aconselhável que a competência experimental ser estabelecido por demonstração de proficiência na obtenção de suspensões de células simples de alta qualidade com rapidez a partir de tecidos que são ensaiadas. Geralmente, as lâminas de cometas deve ser preparado o mais rapidamente possível após o sacrifício dos animais, com uma preparação de célula única tendo um máximo de uma hora. Estabelecimento de uma base de dados históricos para estabelecer as gamas e distribuições de veículo (controlos negativos) é altamente recomendável para assegurar que o ensaio está sob controlo adequado. Os níveis excessivos de danos no DNA podem ser observados em veículos / animais controle negativos quando ocorre o seguinte: 1) manipulação imprópria do tecido; 2) um tempo muito longo entre a eutanásia ea preparação da lâmina cometa; ou 3) a exposição da suspensão de células individuais para UV-contendg luz. Estabelecimento de uma base de dados históricos para os intervalos e distribuições de controlos positivos também é altamente recomendável para assegurar que o ensaio exibe sensibilidade adequada para genotoxinas conhecidos. Metil metanossulfonato (MMS) foi utilizado como controlo positivo no estudo; metanossulfonato de etilo (EMS) é recomendado por JACVAM como um controlo positivo para o ensaio in vivo cometa 18.
A incorporação de digestões com endonucleases específicas de lesão para o protocolo de ensaio do cometa aumenta a sensibilidade e a especificidade do ensaio por meio do reconhecimento de tipos particulares de ADN-lesões no exemplo apresentado aqui, as bases de ADN oxidado. No entanto, deve ser reconhecido que algumas endonucleases pode ser capaz de reconhecer e clivar a várias classes de lesões do ADN; no caso de endo III, isso inclui não lesões associadas com lesões oxidativas do ADN. Um resultado ensaio cometa Endo III-modificado positivo pode indicar um MOA mista. Bcomparação y, hOGG1 é mais específica para as lesões oxidativas e dados a partir de um ensaio modificado com hOOG1 pode ser mais útil para o estabelecimento de um MOA que envolve lesões oxidativas do ADN 11.
Citotoxicidade (apoptose celular e necrose) pode resultar em rupturas dos filamentos de DNA e resultado teste do cometa de falsos positivos: resultados do ensaio cometa positivos por si só não pode ser interpretado como genotoxicidade. Informações sobre a citotoxicidade é necessário para estabelecer a relevância biológica de um resultado de teste do cometa positivo. A análise histopatológica dos tecidos cometa positivo é recomendado pela OCDE TG489 como uma medida relevante da toxicidade dos tecidos 19. Positivos dados do ensaio cometa com uma clara evidência de toxicidade tecidual (apoptose celular ou necrose) devem ser interpretados com cuidado.
O ensaio cometa alcalina in vivo e os ensaios de cometa alcalino Endo III- e hOGG1-modificados podem ser utilizados de uma forma quantitativa de tomar decisões sobre a genotoxicidade doexposições xenobióticos. Eles também podem ser usados para realizar a pesquisa fundamental em danos e reparação do ADN em múltiplos tecidos animais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
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