Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

В Vivo щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы

Published: May 4, 2016 doi: 10.3791/53833

Introduction

Щелочной метод ДНК-комет измеряет разрывы ДНК на уровне одной клетки. Суспензии отдельных клеток встроены в агарозном на предметное стекло микроскопа и клетки лизируют с образованием нуклеоиды, которые содержат суперспирализована петли ДНК. Электрофорез при рН> 13 приводит к потере суперспирализации в петлях ДНК, содержащих разрывы цепи, с освобожденными нитями ДНК мигрирующие к аноду, создавая кометоподобное структур, которые можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Фрагментированной ДНК мигрирует из «головы» кометы в «хвост» , на основании размера фрагмента и относительной флуоресценции кометного хвоста по сравнению с полной интенсивностью (голова и хвост) могут быть использованы для количественного определения ДНК поломки 1 , 2. Анализ прост, чувствительный, универсальный, быстрый и относительно недорогой 1. Обнаружение фрагментированной ДНК, вызванное повреждающих ДНК агентов использовали анализ для количественной оценки повреждения ДНК в клетках или изолированных ядер от IndiviДвойные ткани животных, обработанных с потенциально генотоксическому материала (ов). Благодаря своим преимуществам, анализ кометы в естественных условиях рекомендуется в качестве второго естественных условиях генотоксичности анализа в (спаренной с в естественных условиях микроядер анализа) для проведения оценки безопасности продукции в текущей Международной конференции по гармонизации (ICH) 3 и Европейский орган по безопасности пищевых продуктов (EFSA ) 4 нормативным требованиям. В нашей лаборатории, мы использовали анализ для оценки в естественных условиях повреждения ДНК , вызванного пищевых ингредиентов, фармацевтических препаратов и наноматериалов 5-10. Печени крысы, будет использоваться в качестве примера в данном протоколе, но кометы анализ может быть выполнен с другими тканей / органов экспериментальных животных, пока могут быть выделены из тканей интактных одиночных клеток.

Определенные типы повреждений ДНК трудно обнаружить, как разрывы ДНК пряди, не изменяя основной щелочной кометы анализа. В случае окислительного повреждения ДНК, прядь бreaks могут быть созданы при окислительных повреждений в ДНК перевариванием с ремонтными ферментами , такими как человека 8-оксогуанин-ДНК-N-гликозилаза 1 (hOGG1, что создает разрывы в 8-оксогуанина (8-oxoGua) и метил-fapy-гуанин 11. Кроме того , эндонуклеаза III (эндо - III) создает разрывы в основном в окисленных пиримидинов 1. Таким образом, добавление стадии ферментного расщепления делает пробирной специфический и чувствительный способ измерения окислительного повреждения ДНК в естественных условиях 12. при использовании этих анализов, мы показали , ядовито-индуцированного повреждения окислительного ДНК в печени крыс и мышей 6-8 и в сердце крыс 10.

Щелочную комет имеет множество применений в генетической токсикологии и биомониторинга человека: 1) в порядке выполнения в анализе естественных условиях для генотоксинов , определенных чувствительными в пробирке тесты 3,13, 2) для оценки механизмов ксенобиотиков-индуцированного повреждения ДНК во многих тканях 14, 3) , если исследоватьканцерогеном работает с использованием генотоксичен или не-генотоксическую способ действия (МОА) 7, 4) для оценки повреждения ДНК ремонт 15, 5) для изучения заболеваний человека и профессионального облучения 16 и 6) в качестве потенциального скринингового анализа с высокой пропускной способностью для органоспецифический генотоксичность 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этика заявление: Процедуры с участием животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в FDA / Национальный центр США по токсикологических исследований с помощью.

Примечание: Дизайн исследования , описанная здесь, на основе протокола , разработанного японским Центром по валидации альтернативных методов (JaCVAM) для их проверки достоверности анализа в естественных условиях грызуны щелочной кометы 18, и далее модифицируется на основании рекомендаций , содержащихся в инструкции ОЭСР TG489 19 ,

1. Подготовка

  1. подготовка слайдов
    1. Растворите регулярные агарозе при 1% (вес / объем) в фосфатном буфере (Са 2+, Mg 2+ и свободный фенол красный свободный) путем нагревания в микроволновой печи.
    2. Поместите расплавленный 1% стандартного раствора агарозы в C водяной бане при 55 ° и уравновешивают температуру с ванной. Dip стекло микроскопа скользит в раствор агарозы, слейте excesS агарозы и протрите заднюю часть слайдов чистой. Поместите слайды прямо на ровной поверхности и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре; хранить слайды в сухом месте.
  2. Приготовление растворов кометы анализа
    1. Готовят 0,5% раствор агарозы с низкой температурой плавления. Растворите легкоплавким агарозы в фосфатном буфере (Ca 2+, Mg 2+, и фенол красный свободный) путем нагревания в микроволновой печи. Хранить раствор при 37-45 ° С во время кометной подготовки слайдов; отбрасывать любые оставшиеся агарозном решение впоследствии.
    2. Подготовка буфера для лизиса. Сделать 100 мМ раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (динатриевой соли ЭДТА, г-н 372,24 г / моль), 2,5 М хлорида натрия (NaCl, г 58,44 г / моль), и 10 мМ трис-гидроксиметил аминометан (Трис-основание, г-н 121,14 г / моль) в очищенной воде, и доведения рН до 10 с помощью 10 н раствора гидроксида натрия (NaOH, г 40 г / моль). В день использования, добавьте Triton X100 и диметилсульфоксид (ДМСО, г-н 78,13 г / моль), к раствору, чтобы достичь окончательной КонцентратИоны 1% и 10%, соответственно, и перемешивают при 4-10 ° С в течение по меньшей мере 30 мин перед использованием.
    3. Сделать свежий буфер фермента в день использования. Готовят раствор, содержащий 40 мМ 2- [4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-ил] этансульфоновой кислоты (HEPES, г-н 238,3 г / моль), 100 мМ хлорида калия (KCl, г-н 74,55 г / моль), 0,5 мМ динатрия ЭДТА, и 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, г-н 66463 г / моль) в очищенной воде. Доводят рН до 8,0 с помощью 10 н раствора гидроксида калия (КОН, 56,1 г / моль). Перемешивают при комнатной температуре и проверить полное растворение перед использованием.
    4. Готовят щелочной раствор буфера, содержащего 300 мМ NaOH и 1 мМ динатриевой соли ЭДТА в очищенной воде. Смесь перемешивают при 4-10 ° С в течение по меньшей мере 30 мин перед использованием. Измерьте рН раствора перед использованием и убедитесь, что рН> 13.
    5. Приготовьте раствор 0,4 М Трис базы в очищенной воде и доведения рН до 7,5 с помощью соляной кислоты (HCl, г-н 36,46). Хранить раствор при 4-10 ° С. Это буфер, нейтрализующий.
    6. Сделать преш мясорубки буфер на день использования. Готовят раствор , содержащий 20 мМ динатриевой соли ЭДТА и 10% ДМСО в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS, Са 2+, Mg 2+ и фенол красный свободный). Храните на льду до использования.
    7. Для приготовления раствора для окрашивания, разбавленные флуоресцентный краситель кислоты маточного раствора нуклеиновой с трис-борат-ЭДТА (КЭ буфере) в соотношении 1: 10000 (об / об). Защищайте раствор от света с помощью алюминиевой фольги. Хранить при температуре 2-8 ° C и использовать с 24 ч.

2. Подготовка одноклеточных суспензий из печени крысы

  1. Эвтаназии крыс с СО 2 газа следующих способов , рекомендуемых в медицинских Руководства Американской Ветеринарной для эвтаназии животных: 2013 20 -го издания.
    1. Установить расход CO 2 при 2,75. Поместите крысу в эвтаназии камере (например, эксикатор сосуд, клетка крысы с вентилируемым крышкой) и включите CO 2, открыв вентиль баллона. Подождите, от 1,5 до 2,5 мин до моментакрыса теряет сознание. Увеличение потока СО 2 к его максимальному. После прекращения дыхания, оставьте крыс в камере в течение приблизительно 1 мин, чтобы обеспечить эвтаназию. Проверьте эвтаназию пальпацией, чтобы подтвердить, что крыса не имеет сердцебиение, и зажимая пальцами ног, чтобы определить, что крыса не снимает свою конечность.
  2. Лечить волосого шкуру с 70% этанола. Откройте брюшной полости и удалить интактной печени с хирургическими ножницами. После удаления печени, снимите левую боковую лопасть из оставшейся печени с хирургическими ножницами. Поместите левую боковую лопасть на разделочной доске, и вырезать два смежных 3-4 мм толщиной поперечные срезы с помощью одноразового однолезвийные лезвие бритвы.
  3. Поместите один поперечный разрез на фильтровальную бумагу (для предотвращения скручивания секции), и поместите секцию в 10% нейтральный забуференный формалин (НСБ). Убедитесь, что соотношение 10% NBF в ткани составляет 10: 1 или больше. Через некоторое время фиксации, по меньшей мере, 72 ч, ProcESS печень для гистопатологии (смотри раздел 7, ниже).
  4. Поместите второй поперечный разрез печени в 5 мл охлажденного льдом буфера мясорубки (раздел 1.2.6) в чашке Петри 6 см и прополоскать 3 раза, чтобы удалить остатки крови.
  5. Перенести раздел печени в новую 2 мл центрифужную пробирку, содержащую 1 мл охлажденного льдом буфера мясорубки. Фарш хорошо промытый секцию печени с парой тонких ножниц, чтобы освободить клетки. Процедите клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм для удаления комков ткани.
  6. Поместите одноклеточной суспензии на льду и используют для изготовления слайдов в течение 1 часа. Проверьте концентрацию клеток путем подсчета (например, с помощью гемоцитометра или электронного счетчика клеток) , чтобы гарантировать , что его концентрация составляет около 2 x10 6 клеток / мл.

3. Подготовка кометы Слайды

  1. Смешайте один объем одноклеточной суспензии с 10 объемами расплавлен, 37 ° С, 0,5% раствор агарозы с низкой плавления (раздел 1.2.1).Немедленно пипеткой 100 мкл на слайд с покрытием регулярной точкой плавления агарозы (раздел 1.1). Сразу же место покровное стекло над клеточно-агарозы смеси. Сделать по крайней мере 8 слайдов для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все слайды должны быть идентифицированы с помощью ряда или аналогичного кода и их идентичность записаны, так что слайды могут быть забит слепым методом (см 6.2.2, ниже).
  2. Положите слайды плоские и охлаждают до 4 ° С в течение 30 мин.
  3. После того, как гель затвердеет, осторожно снимите крышку слипы и погрузить слайды в предварительно охлажденном буфере для лизиса (раздел 1.2.2). Защита слайды от света и сохранить слайды в буфере для лизиса при температуре 4 ° С от 1 часа (минимум) до O / N (максимум).

4. Обработка энзимами кометы Слайды

  1. Удалить 6 из 8 слайдов, приготовленных из каждого образца ткани из буфера для лизиса и промойте их 3 раза в течение 5 мин каждый с ферментом буфера (раздел 1.2.3) при комнатной температуре. Используйте оставшиеся два слайда для щелочной кометы анализа шез фермент лечение (см 5.1, ниже). После промывки, удаления избытка жидкости путем слива и промокания слайды с тканями.
  2. Развести запасы фермента hOGG1 и Эндо III с буфером фермента в соотношении 1: 1000 (об / об). Поместите на льду до использования.
  3. Применить 200 мкл следующих растворов к слайдам, приготовленных из каждой группы обработки: 200 мкл только ферментного буфера (2 слайдов, используемых в качестве эталонных слайдов), 200 мкл раствора hOGG1 (2 слайда) или 200 мкл Эндо раствора III (2 горки).
  4. Поместите слайды в чашках Петри, покрытые увлажненной бумажные полотенца, покрывают слайдам с помощью Parafilm, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 45 мин для Эндо III обработанных и контрольных слайдов и 30 мин для hOGG1 обработанных слайдами.
  5. После инкубации промойте слайды с дистиллированной водой и продолжить обработку, как описано в 5.2, ниже.

5. разматывать и электрофорез

  1. Для горок не обрабатывают ферментами, удалите слайды из буфера для лизисаСлить слайды и прополоскать один раз холодным нейтрализующего буфера (раздел 1.2.5), в течение 5 мин для удаления остатков моющего средства и соли.
  2. Место слайды из шагов 4.5 и 5.1 случайным образом в горизонтальной гель-электрофореза бак, избегая каких-либо пробелов. Залить в бак с свежеприготовленный рН> 13 буфер для электрофореза (раздел 1.2.4), пока уровень жидкости не только покрывает слайды (избежать пузырей над агарозы и убедитесь, что бак уровень). Записывают буфера рН и температуры в начале раскручивания ДНК.
  3. Пусть слайды остаются в буфере щелочную в течение 20 мин, чтобы позволить раскручиванию ДНК и экспрессии щелочно-ответственного повреждения.
  4. Во время разматывания, программа питания для производства 0,7 В / см в электрофорез резервуаре (V / см = вольты, деленное на расстояние в см между положительными и отрицательными электродами).
  5. После того, как раскручивание, нажмите кнопку запуска на блоке питания. При необходимости, регулировать ток до 300 мА путем повышения или понижения уровня буфера. Keep-ее уровня буфера непосредственно над поверхностью слайдах. Выполните электрофорезу при 4 ° С в течение 20 мин. Запись слайд-размещение, температура буфера и ток (в амперах) в начале и в конце электрофореза.
    Примечание: Слишком много буфера приведет к снижению напряжения, которые могут препятствовать миграции ДНК.
  6. После электрофореза нейтрализации избытка щелочи, осторожно поднимая слайды из резервуара и погружения в нейтрализации буфера (раздел 1.2.5) в течение 5 мин. Слить слайды и повторить еще два раза.
  7. Закрепить слайды, погружая в холодном 100% этаноле в течение 5 мин. Разрешить слайды высохнуть на воздухе и место в сухом месте для хранения.

6. ДНК Окрашивание, Comet Визуализация и анализ

  1. окрашивание ДНК
    1. Поместите слайды на картон или металлический поднос и добавить 200 мкл нуклеиновой кислоты флуоресцентный краситель рабочего раствора (раздел 1.2.7) для каждого слайда и накройте покровным стеклом. Защитите слайды изсвет позволяют слайды оставаться в контакте с красящим раствором в течение по крайней мере 30 минут до взятия ворот. Пятно слайды в партиях от 20 одновременно.
    2. Перед чтением каждого слайда, аккуратно промокните излишки окрашивание раствора, стараясь не мешать покровного стекла.
  2. Комета Визуализация и Scoring
    1. Используйте видеокамеру, прикрепленную к флуоресцентным микроскопом для просмотра живого изображения кометы слайд на мониторе компьютера.
    2. Произвольно выбрать поле микроскопа, содержащий клетки. С помощью мыши, выберите ячейку. Нажмите на центр "головы кометы" с левой кнопки мыши.
      Примечание: Программное обеспечение компьютера вычисляет все параметры измерения для ячейки и добавляет данные в файл данных.
    3. Результат все ячейки в текущей области (см шаг 6.2.4), а затем использовать элементы управления этапе микроскопа и видео на экране, чтобы найти другой набор ячеек. Оценка этих клеток, как описано в разделе 6.2.2.
    4. Оценка слайд-пром справа налево и снизу вверх. Выберите около 10 полей в случайном порядке. Во время этого процесса, любая подходящая комета клетка, которая появляется в поле зрения должен быть забит без смещения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забить кометы, если любой из следующих условий: 1) оно расположено на любом из краев слайда; 2) два или более комет перекрываются; 3) есть мусор в хвосте; 4) программное обеспечение не может различать между головой и хвостом; или 5) Окрашивание ядер и / или хвоста значительно отличается от других комет на слайде.
      Примечание: Кометы с почти всех их ДНК флуоресценции в хвосте часто называют кометы "ежа". Ежик кометы не должны быть засчитан, но количество ежей, обнаруженных во время слайд скоринг должен быть записан и в виде процента от общего числа комет.
    5. Анализ по меньшей мере, 75 комет на слайд, чтение двух слайдов на органа / ткани, чтобы получить, по меньшей мере, 150 клеток / кометы образца в общей сложности. После необходимого количества клеток из ползуна имеют бытьан забил, результат сохраняется в виде файла электронной таблицы для последующего анализа данных.

7. Анализ гистопатология

  1. После того, как минимум 72 ч фиксации в 10% НСБ, а затем ткани обрезки 21, регулярно обрабатывать и вставлять левую боковую лопасть печени образцов в парафиновый воск на основе среды 22. Раздел образцы примерно 5 мкм и собирают на стеклах.
  2. Пятно секции с гематоксилином и эозином (H & E):
    1. Нагреть слайды с парафиновых срезах ткани в печи C 60 ° в течение 2 ч до процедуры окрашивания.
    2. С помощью ксилола deparaffinize стороны. Увлажняет слайды с градуированной этанолом (EtOH) к работающему ополаскивания водопроводной воды.
    3. Поместите слайды в 450 мл гематоксилином в течение 2 мин и 40 сек. Полоскание слайды с кислотой (2 мл ледяной уксусной кислоты в 450 мл деионизированной воды) в течение 4 сек следуя по 5 мин проточной водопроводной водой полоскании.
    4. Поместите соскользнулЕ. С. в 450 мл 70% этанола, содержащего 1 мл гидроксида аммония в течение 2 мин, а затем проточной водопроводной водой полоскание в течение 2 мин и 30 сек и 70% этанола полоскание в течение 1 мин.
    5. Инкубируйте слайды с 450 мл эозин Y раствора, содержащего 4 мл ледяной уксусной кислоты в течение 3 мин.
    6. Обезвоживают слайды с градуированной этанола. Очистить слайды с ксилолом (три раза по 1 мин каждый), и провести слайды в ксилоле, пока не покровные стекла помещены на слайдах.
  3. Осмотрите слайды с помощью световой микроскопии, записывать выводы и класса неопухолевых поражений для тяжести как 1 (минимальное), 2 (мягкий), 3 (средний уровень) или 4 (маркированные).
    Примечание: Тяжесть класс применяется для конкретного поражения основана на относительной доле печени с поражением (минимальная = <1-15%, мягкому = 16-35%, умеренная = 36-60%, а также отмечены = 61- 100%).

Анализ 8. Данные

  1. Животное считается экспериментальной единицей для статистических оценок. Повреждение ДНК выражается в% DNА на хвосте.
  2. Окислительное повреждение ДНК рассчитывается следующим образом: опорные слайды (без обработки ферментом) обеспечивают оценку разрывов фона цепи ДНК (SB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: обработанную ферментом горок обеспечивают измерение разрывов нитей и окисленные основания (SB + Ox). Предполагая линейную характеристику дозы для% ДНК в хвосте в зависимости от повреждения ДНК, вычитание SB от SB + ОХ дает оценку разрывы ДНК пряди из окисленных пиримидинов / пуринов измененными 23.
  3. Анализ% ДНК в хвосте в зависимости от дозы с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом Даннетта для попарных сравнений из ответов на обработанных животных к управления транспортным средством.
    Примечание: Все тесты один хвостами и р-значение менее 0,05 устанавливается в качестве критерия статистической значимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Щелочной метод ДНК - комет в естественных условиях проводили в сочетании с модифицированном ферментом кометы анализа для измерения прямой и окислительное повреждение ДНК в печени крыс , получавших ципротерона ацетат (CPA) 5. CPA является синтетическим гормональный препарат , который вызывает опухоли печени крысы таким образом , секс-специфический, с пятикратным более высокие дозы , необходимые для индукции опухолей печени у самцов крыс по сравнению с женщинами 24. Мы обнаружили, что прямое повреждение ДНК, вызванные СРА в печени самцов и самок крыс имеет один и тот же шаблон связанный с полом, как его hepatotumorigenicity: пятикратное-выше доза CPA необходима, чтобы вызвать значительное увеличение повреждений ДНК в печень мужчин по сравнению с женщинами (Рисунок 1).

Мы предполагаем, что секс-конкретный результат комет обусловлен активностью гидроксистероидной sulfotransferase (ов) (HST), которая в 15 раз выше,у взрослых самок крыс, чем у взрослых мужчин. HST метаболизм является лимитирующей стадией в активации КВА ДНК-связывающего метаболита (ов) 25. В противоположность этому , СРА-индуцированного окислительного повреждения ДНК в целом больше у мужчин , чем женщин печени крыс, и , таким образом , менее вероятно, будет ограничивающим скорость шаг в формировании опухоли (фигура 2). Оценка Гистопатология Печень от СРА-обработанных крыс не показал никаких признаков агента-индуцированного апоптоза или некроза (таблицы 1 и 2), что свидетельствует о том , что положительные кометы результаты анализа не были вторичным эффектом цитотоксичности 5. На рисунках 1 и 2 и в таблицах 1 & 2 перепечатаны с разрешения Elsevier BV (Reference 5).

Рисунок 1
Рисунок 1. Повреждение ДНК в печени CPA обработанных самцов и самок крыс меняasured с щелочной анализа кометы в естественных условиях. Группы из пяти семи-недельных крыс - самцов и женских F344 были обработаны с оливковым маслом или с 10, 25, 50 или 100 мг / кг / день CPA в оливковом масле. Лечение проводили при 0, 24 и 45 ч крыс забивали через 48 ч, и повреждение ДНК измеряли в печени в виде% хвостовую ДНК с помощью щелочной кометы анализа. Лечение СРА вызвало увеличение% хвостовую ДНК в печени крыс-самцов в преддверие манере, со значительным увеличением обнаружения только с мг / кг / сутки дозах 50 и 100. Лечение CPA индуцированных разрывов ДНК в печени самок крыс в почти линейной зависимости от дозы, со значительным увеличением% хвостовую ДНК, обнаруженных во всех группах CPA. Оценены Самые низкие уровни Наблюдаемые Генотоксичность эффекта (LOGELs) для CPA-индуцированного повреждения ДНК в печени самок и самцов крыс, чтобы быть 10 и 50 мг / кг / сут, соответственно. * Значителен на p≤0.05 относительно кондитер транспортного средстваТроль; Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Окислительный повреждения ДНК в печени CPA обработанных самцов и самок крыс измеряли с помощью модифицированного ферментом в естественных условиях щелочной кометного анализа. Группы из пяти семи-недельных крыс - самцов и женских F344 были обработаны с оливковым маслом или с 10, 25, 50 или 100 мг / кг / день CPA в оливковом масле. Лечение проводили при 0, 24 и 45 ч, животные были умерщвлены на 48 ч, а фермент-модифицированного кометы анализ проводили с использованием% хвостовую ДНК в качестве показателя повреждения ДНК. Все дозы CPA дает значительное увеличение Endo III-чувствительных повреждений ДНК в печени CPA-обработанных крыс мужского пола; в то время как Endo III-чувствительный ДНК dAmage был обнаружен только у самок крыс , получавших 25, 50 и 100 мг / кг / день CPA (A). Все дозы CPA привело к значительному увеличению hOGG1-чувствительных окислительных повреждений ДНК в печени крыс-самцов; увеличение hOGG1-чувствительного повреждения ДНК были обнаружены только у самок крыс , получавших 50 и 100 мг / кг / день CPA (B). * Значителен на p≤0.05 относительно управления транспортным средством; Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В таблицах 1 и 2. Результаты анализа Гистопатология. Так как цитотоксичность может генерировать ложноположительные результаты анализа кометы, гистологической оценки для апоптотических и / или некротических клеток должны проводиться для Комета-позитивных тканей. В текущем исследовании, не наблюдалось CPA-индуцированного апоптоза гепатоцитов или некрозв печени обоих самцов и самок крыс, что исключало возможность ложной положительной реакции кометы анализа.

поражение Данные доза CPA
0 мг / кг 10 мг / кг 25 мг / кг 50 мг / кг 100 мг / кг
Гепатоцитов цитоплазматическая вакуолизация Количество поражений 1 1 5 5 6
# Рассмотренные 6 5 5 5 6
% поражений 17% </ TD> 20% 100% 100% 100%
Среднее Серьезность 1,0 1,0 1.2 1.8 2,0
гепатоцитов митозы Количество поражений 0 0 5 5 6
# Рассмотренные 6 5 5 5 6
% поражений 0 0 100% 100% 100%
Среднее Серьезность 0 0 1,0 1.4 1.8

Таблица 1. Заболеваемость неопухолевых поражений в печени vehicle- и CPA-обработанных крыс F344 мужчин.

<TD> 0
поражение Данные доза CPA
0 мг / кг 10 мг / кг 25 мг / кг 50 мг / кг 100 мг / кг
Гепатоцитов цитоплазматическая вакуолизация Количество поражений 1 3 5 5 5
# Рассмотренные 5 5 5 5 5
% поражений 20% 60% 100% 100% 100%
Среднее Серьезность 1,0 1.3 1.8 1.8 2,0
гепатоцитов митозы Количество поражений 0 5 5 5 5
# Рассмотренные 5 5 5 5 5
% поражений 0 100% 100% 100% 100%
Среднее Серьезность 0 1,0 1.2 1.8 2,0
гепатоцитов Karyomegaly Количество поражений 0 0 5 5 5
# Рассмотренные 5 5 5 5 5
% поражений 0 100% 100% 100%
Среднее Серьезность 0 1,0 1.2 1.8 2,0

Таблица 2. Заболеваемость неопухолевых поражений в печени транспортных средствах и CPA обработанных самок крыс F344.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает одновременное измерение прямого и окислительного повреждения ДНК в печени крыс на уровне одной клетки. Общий протокол применим к любой ткани , из которой отдельные клетки или ядра могут быть изолированы с минимальным повреждением ДНК обработки индуцированный (т.е. повреждение ДНК индуцируется не тестируемым агентом, но при обработке и обработке тканей животных). В нашем исследовании мы провели щелочные кометы анализы на клетки из костного мозга, желудка 7,9- 6, 9 почки, мочевого пузыря, легких 9 9, сердце 10, молочной железы, матки 5, 5 семенника 5 и крови 5. Эти анализы могут обеспечить быстрый, простой и недорогой метод исследования ксенобиотиков-индуцированного повреждения ДНК в различных органах и тканях экспериментальных животных. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения биомониторинга человека путем проведения анализов, например, на периферической крови, вспученногоклетки почек и мочевыводящих путей, или буккального или назального эпителий, полученные от клинически или подвергавшихся воздействию лиц. Основной подход также может быть использован для оценки повреждений ДНК в культуре клеток в пробирке.

Когда анализ кометы интегрирован в острых или подострых токсикологических исследований, времени выборки, т.е. время между последней обработкой и сбором тканей, является критической переменной , которая иногда должна быть согласована с коллекцией других токсикологических данных. Если это возможно, время выборки должны быть основаны на время курса кометных данных, время , при котором пик плазмы или ткани концентрации (Cmax) достигается, или после стационарного состояния достигается после многократного администраций тестовой статьи 19. В случаях были кинетические концентрации данных или ткани не доступны, ОЭСР TG489 рекомендует проведение двух или более обработок и сбора тканей 2-6 ч после последней обработки, или, если одно лечениепроведены, отбор проб тканей на обоих 2-6 и 16-26 ч после обработки 19.

Крайне важно, чтобы продолжительность времени от эвтаназии с кометой подготовки слайд быть как можно короче. Желательно, чтобы экспериментальная компетентность устанавливается продемонстрировать глубокое знание получения высококачественных суспензий одноклеточ- быстро из тканей, которые тестируют. Как правило, кометы слайды должны быть подготовлены как можно скорее после того, как жертвоприношения животных, с приготовлением одной клетки принимает более одного часа. Создание исторической базы данных для установления диапазонов и распределения отрицательных (транспортных средств) контроля настоятельно рекомендуется, чтобы гарантировать, что анализ находится под надлежащим контролем. Чрезмерные уровни повреждения ДНК могут наблюдаться в транспортном средстве / отрицательных контрольных животных при следующих случаях: 1) неправильное обращение ткани; 2) слишком долгое время между эвтаназией и кометной подготовки слайдов; либо 3) воздействие на суспензии отдельных клеток к УФ-containinг свет. Создание исторической базы данных для диапазонов и распределения положительного контроля также настоятельно рекомендуется, чтобы гарантировать, что анализ показывает соответствующую чувствительность к известным генотоксинов. Метилметансульфонат (MMS) использовали в качестве положительного контроля в данном исследовании; этилметансульфоната (EMS) является JaCVAM рекомендуется в качестве положительного контроля для кометы анализа 18 в естественных условиях.

Включение варок с поражением специфических эндонуклеаз в кометной протокола анализа повышает чувствительность и специфичность анализа путем признания отдельных видов ДНК-поражений в примере, представленные здесь, окисленные основания ДНК. Тем не менее, следует признать, что некоторые эндонуклеазы могут быть способны распознавать и расщеплением на различных классов повреждений ДНК; в случае Endo III, это включает в себя повреждения, не связанных с окислительным повреждением ДНК. Положительным Эндо III-модифицированного кометы результат анализа может указывать на смешанную МОД. ВСравнение Y, hOGG1 более специфично для окислительного поражения и данных из анализа hOOG1-модифицированный , может быть более полезным для установления МОА , который включает окислительное повреждение ДНК 11.

Цитотоксичность (апоптоз и некроз) может привести к ДНК разрывов ДНК и ложного положительного результата анализа кометы: положительные результаты анализа кометы сами по себе не могут быть истолкованы как генотоксичности. Информация о цитотоксичности требуется установить биологическую значимость положительного результата анализа кометы. Гистопатологический анализ кометных-позитивных тканей ОЭСР TG489 рекомендуется в качестве соответствующей меры тканевой токсичности 19. Положительные данные анализа кометы с четкими признаками токсичности ткани (апоптоза клеток или некроза) следует интерпретировать с осторожностью.

Щелочную анализ в естественных условиях кометы и щелочные кометы анализы Эндо III- и hOGG1-модифицированные могут быть использованы в количественном выражении для принятия решений о генотоксичностиксенобиотиков экспозиции. Они также могут быть использованы для проведения фундаментальных исследований в области повреждения ДНК и ремонта во многих тканях животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)  Fisher 12-544-14
Microscope Slides Fisher 12-550-123
Dimethylsulfoxide (DMSO)  Fisher 67-68-5
EDTA, Disodium Fisher BP120-1
Phosphate buffered saline Fisher ICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) HyClone SH30588.02
HEPES Fisher BP310-1
Low Melting Point Agarose (LMP) Lonza 50081 NuSieve GTG Agarose
Normal Melting Agarose (NMA)  Fisher BP1356-100
pH testing paper strips (pH 7.5-14) Fisher M95873
Potassium Cloride Fisher 7447-40-7
Potassium Hydroxide Fisher 1310-58-3
slide labels (0.94 x 0.5 in.) Fisher NC9822036
Sodium Chloride (NaCl)  Fisher 7647-14-5
Sodium Hydroxide (NaOH)  Fisher 1310-73-2
SYBR™ Gold  Invitrogen S11494
Triton X-100  Fisher 9002-93-1
Trizma Base  Fisher 77-86-1
2.0 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-402-6
Cell strainer (40 µm) Fisher 22363547
Endonuclease III (Nth)  New England Biolabs M0268S Dilution 1:1,000
hOGG1  New England Biolabs M0241S Dilution 1:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Tags

Молекулярная биология выпуск 111 генетической токсикологии крысы печень, эндонуклеаза III (Endo III) 8 человек-оксогуанин-ДНК-N-гликозилаза 1 (hOGG1) разрывы ДНК повреждение ДНК оксидативный
<em>В Vivo</em> щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook,More

Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. J. Vis. Exp. (111), e53833, doi:10.3791/53833 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter