Introduction
El ensayo cometa alcalino mide roturas de la cadena de ADN a nivel de una sola célula. Las suspensiones de células individuales están incrustadas en agarosa sobre un portaobjetos de microscopio y las células se lisaron para formar nucleoides, que contienen bucles superenrollado de ADN. Electroforesis a pH> 13 resultados en la pérdida de superenrollamiento en los bucles de ADN que contienen roturas de la cadena, con las hebras de ADN liberados que migran hacia el ánodo, creando estructuras parecidas a cometas que pueden ser observadas por microscopía de fluorescencia. La fragmentación de ADN migra de la "cabeza" del cometa en la "cola" en función del tamaño del fragmento, y la fluorescencia relativa de la cola del cometa en comparación con la intensidad total (cabeza y cola) se puede utilizar para cuantificar la rotura de ADN 1 , 2. El ensayo es simple, sensible, versátil, rápido, y relativamente barato 1. La detección de ADN fragmentado causada por agentes que dañan el ADN se utiliza un ensayo para cuantificar el daño del ADN en las células o núcleos aislados a partir de individuales tejidos de animales tratados con el material (s) potencialmente genotóxicos. Debido a sus ventajas, el ensayo cometa in vivo se recomienda como un segundo ensayo in vivo de genotoxicidad (emparejado con el ensayo de micronúcleos in vivo) para la realización de evaluaciones de seguridad de productos en la corriente de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) 3 y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (AESA 4) las directrices reguladoras. En nuestro laboratorio, hemos empleado el ensayo para evaluar el daño del ADN in vivo inducida por ingredientes de alimentos, productos farmacéuticos y los nanomateriales en 5-10. de hígado de rata se utiliza como un ejemplo en este protocolo, pero el ensayo de cometa se puede realizar con otros tejidos / órganos de animales de experimentación, siempre que las células individuales intactos pueden ser aisladas de tejido.
Ciertos tipos de daño en el ADN son difíciles de detectar como roturas de la cadena de ADN sin modificar el ensayo cometa alcalino básico. En el caso de daño oxidativo del ADN, hebra breaks se pueden crear en lesiones oxidativas en el ADN por digestión con enzimas de reparación, tales como humano 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilasa 1 (hOGG1, que crea roturas en 8-oxoguanina (8-oxoGua) y metil-Fapy-guanina 11. también, endonucleasa III (Endo III) crea rompe principalmente en pirimidinas oxidadas 1. Así, la adición de una etapa de enzima-digestión hace que el ensayo de un método específico y sensible para medir el daño oxidativo del ADN in vivo 12. Utilizando estos ensayos, hemos demostrado daño oxidativo del ADN tóxico inducido en el hígado de ratas y ratones 6-8 y en el corazón de ratas 10.
El ensayo cometa alcalino tiene muchas aplicaciones en la toxicología genética y control biológico humano: 1) como un seguimiento en el ensayo in vivo para genotoxinas sensibles identificados por los ensayos in vitro 3,13, 2) para evaluar los mecanismos de daño en el ADN-xenobióticos inducida en múltiples tejidos 14, 3) para investigar si unacarcinógeno funciona mediante un modo no genotóxico de acción (MOA) 7 genotóxico o, 4) para evaluar el ADN a reparar el daño 15, 5) para investigar enfermedades humanas y las exposiciones ocupacionales 16, y 6) como un ensayo de cribado de alto rendimiento potencial de -órgano específico genotoxicidad 17.
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Protocol
Ética declaración: Los procedimientos que implican animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en el / Centro Nacional de Investigación de la FDA para toxicológica.
NOTA: El diseño del estudio descrito aquí se basa en el protocolo desarrollado por el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (JaCVAM) para su validación de la prueba in vivo de roedores cometa alcalino 18, y aún más modifica en función de las recomendaciones de la OCDE directriz TG489 19 .
1. Preparación
- preparación de los portaobjetos
- Disolver de agarosa de fusión regular en 1% (w / v) en tampón de fosfato (Ca 2+, Mg 2+ libre y libre de rojo fenol) por calentamiento en un horno de microondas.
- Colocar la solución de agarosa estándar 1% fundido en un baño de agua C 55 ° y equilibrar la temperatura con el baño. microscopio de vidrio por inmersión se desliza dentro de la solución de agarosa, drene el exces agarosa y limpie la parte posterior de las diapositivas limpias. Colocar los portaobjetos en posición vertical sobre una superficie plana y deje que los portaobjetos para secar a temperatura ambiente; almacenar las diapositivas en lugar seco.
- Preparación de las soluciones de ensayo cometa
- Preparar la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5%. Disolver bajo punto de fusión de agarosa en tampón de fosfato (Ca 2 +, Mg2 +, y rojo de fenol libre) por calentamiento en un horno de microondas. Mantener la solución a 37-45 ° C durante la preparación de diapositivas cometa; Desechar la solución de agarosa restante después.
- Preparar tampón de lisis. Hacer una solución 100 mM de disodio del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA disódico, el Sr. 372,24 g / mol), cloruro de sodio 2,5 M (NaCl, Sr. 58,44 g / mol), y 10 mM Tris hidroximetil aminometano (Tris Base, Mr 121,14 g / mol) en agua purificada, y ajustar el pH a 10 con 10 N de solución de hidróxido de sodio (NaOH, Mr 40 g / mol). En el día de uso, añadir Triton X100 y sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sr. 78,13 g / mol) a la solución para alcanzar concentrat definitivaiones de 1% y 10%, respectivamente, y se agita a 4-10 ° C durante al menos 30 min antes de su uso.
- Hacer tampón de enzima fresco en el día de uso. Preparar una solución que contiene 40 mM de 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanosulfónico (HEPES, Sr. 238,3 g / mol), 100 mM de cloruro de potasio (KCl, Sr. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA disódico, y 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA, Mr 66.463 g / mol) en agua purificada. Ajustar el pH a 8,0 con solución de hidróxido de potasio 10 N (KOH, 56,1 g / mol). Se agita a RT y verificar la disolución completa antes de su uso.
- Preparar una solución de tampón alcalino que contiene NaOH 300 mM y 1 mM EDTA disódico en agua purificada. Se agita a 4-10 ° C durante al menos 30 min antes de su uso. Medir el pH de la solución antes de su uso y asegurarse de que el pH es> 13.
- Preparar una solución de Tris base 0,4 en agua purificada, y ajustar el pH a 7,5 con ácido clorhídrico (HCl, Sr. 36,46). Almacenar la solución a 4-10 ° C. Este es neutralizar buffer.
- hacer fResh picado búfer en el día de uso. Preparar una solución que contiene 20 mM EDTA disódico y 10% DMSO en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, y rojo de fenol libre). Almacenar en hielo hasta su uso.
- Para preparar la solución de tinción, diluir fluorescente ácido solución de tinción de la nucleico con Tris-borato-EDTA (tampón TBE) a 1: 10.000 (v / v). Proteger la solución de la luz usando papel de aluminio. Almacenar a 2-8 ° C y utilizar con seguridad 24 h.
2. Preparación de suspensiones de células individuales de hígado de rata
- La eutanasia a las ratas con CO 2 siguientes métodos de gases recomendadas en las Directrices American Veterinary Medical para la eutanasia de los animales: 2013 Edición 20.
- Ajuste la velocidad de flujo de CO2 en 2,75. Ponga la rata en la cámara de eutanasia (por ejemplo, el vaso desecador, jaula de ratas con tapa ventilada) y encienda el CO 2 mediante la apertura de la válvula del tanque. Espere a 1,5 a 2,5 min hasta que elrata queda inconsciente. Aumentar el flujo de CO 2 en la posición máxima. Después del cese de la respiración, dejar la rata en la cámara durante aproximadamente 1 min para asegurar la eutanasia. Verificar la eutanasia mediante la palpación de confirmar que la rata no tiene latido del corazón, y pellizcar los dedos de los pies para determinar que la rata no retira su extremidad.
- Desinfectar el cabello-piel con etanol al 70%. Abra la cavidad abdominal y eliminar el hígado intacto con tijeras quirúrgicas. Después de retirar el hígado, eliminar el lóbulo lateral izquierdo del hígado restante con tijeras quirúrgicas. Coloque el lóbulo lateral izquierdo en una tabla de cortar y cortar dos gruesas secciones transversales adyacentes 3-4 mm utilizando una cuchilla desechable de un solo filo de afeitar.
- Coloque una sección transversal en papel de filtro (para evitar que se encrespa de la sección), y coloque la sección en formalina al 10% tamponada neutra (NBF). Asegúrese de que la proporción de 10% NBF al tejido es 10: 1 o mayor. Después de un tiempo de fijación de por lo menos 72 horas, procESS el hígado para histopatología (véase la sección 7, a continuación).
- Coloque la segunda sección transversal de hígado en 5 ml de tampón enfriado con hielo picado (sección 1.2.6) en una placa de 6 cm Petri y enjuagar 3 veces para eliminar la sangre residual.
- La transferencia de la sección de hígado a un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml que contiene 1 ml de tampón de picar carne enfriada con hielo. Picar la sección del hígado bien enjuagado, con un par de tijeras finas para liberar las células. Colar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los grumos de tejido.
- Coloque la suspensión de células individuales en hielo y utilizar para hacer diapositivas dentro de 1 hora. Verificar la concentración de células por recuento (por ejemplo, con un hemocitómetro o un contador de células electrónico) para asegurar que su concentración es de aproximadamente 2 x 10 6 células / ml.
3. Preparación de las diapositivas Comet
- Mezclar un volumen de la suspensión de células individuales con 10 volúmenes de fundido, 37 ° C, la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% (sección 1.2.1).Inmediatamente pipeta 100 l en un portaobjetos recubierto con agarosa de punto de fusión normal (sección 1.1). Inmediatamente colocar un cubreobjetos sobre la mezcla de células de agarosa. Haga por lo menos 8 diapositivas para cada muestra.
NOTA: Todas las diapositivas deben ser identificados por un número o código similar y su identidad registran, por lo que las diapositivas se pueden calificar de forma ciega (véase 6.2.2, a continuación). - Sentar las diapositivas plana y enfriar a 4 ° C durante 30 min.
- Después de que el gel se haya solidificado, retire con cuidado la cubierta se desliza y sumergir los portaobjetos en tampón de lisis enfriado previamente (sección 1.2.2). Proteger a las diapositivas de la luz y mantener los portaobjetos en el tampón de lisis a 4 ° C de 1 hora (mínimo) a S / N (máximo).
4. El tratamiento enzimático de Comet Diapositivas
- Retire 6 de los 8 portaobjetos preparados a partir de cada muestra de tejido del tampón de lisis y enjuague 3 veces durante 5 min cada una con tampón de enzima (sección 1.2.3) a TA. Utilice las dos diapositivas restantes para el ensayo cometa alcalino without enzima-tratamiento (ver 5.1, más abajo). Después de aclarar, eliminar el exceso de líquido mediante el drenaje y secante las diapositivas con los tejidos.
- Diluir las existencias de enzimas hOGG1 y Endo III con tampón de enzima a 1: 1.000 (v / v). Colocar en hielo hasta su uso.
- Aplicar 200 l de las siguientes soluciones a los portaobjetos preparados a partir de cada grupo de tratamiento: 200 l de tampón de enzima sola (2 diapositivas utilizadas como diapositivas de referencia), 200 solución de l hOGG1 (2 diapositivas) o 200 l solución Endo III (2 diapositivas).
- Ponga los portaobjetos en placas de Petri llenas de toallas de papel humedecidas, cubrir los portaobjetos con Parafilm, y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos para Endo III-tratada y diapositivas de referencia y 30 minutos para las diapositivas tratados con hOGG1.
- Después de la incubación, enjuague los portaobjetos con agua destilada y continuar el proceso tal como se describe en el punto 5.2, a continuación.
5. El desenrollar y Electroforesis
- Para las diapositivas no tratados con enzimas, retire las diapositivas desde el tampón de lisis, La fuga de los portaobjetos y enjuagar una vez con tampón de neutralización en frío (sección 1.2.5) durante 5 minutos para eliminar los residuos de detergente y sales.
- Colocar los portaobjetos de los Pasos 4.5 y 5.1 al azar en un tanque de electroforesis en gel horizontal, evitando cualquier espacio. Llenar el depósito con pH> 13 tampón de electroforesis recién hecho (sección 1.2.4) hasta que el nivel del líquido solo cubre las diapositivas (evitar las burbujas sobre la agarosa y asegúrese de que el tanque esté nivelado). Registrar el pH del tampón y la temperatura en el inicio de la anulación de ADN.
- Deje que los portaobjetos se mantienen en el tampón alcalino durante 20 min para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión de daños alcalino-responsable.
- Durante el desenrollado, el programa de la fuente de alimentación para producir 0,7 V / cm en el tanque de electroforesis (V / cm = voltios dividido por la distancia en cm entre los electrodos positivos y negativos).
- Después de desenrollar, pulse el botón de ejecución de la fuente de alimentación. Si es necesario, ajustar la corriente de 300 mA levantando o bajando el nivel de búfer. Mantenga THnivel de tampón e justo por encima de la superficie de los portaobjetos. Realizar electroforesis a 4 ° C durante 20 min. Registrar la colocación de diapositivas, la temperatura de la memoria intermedia y la corriente (amperios) al inicio y al final de la electroforesis.
NOTA: El exceso de tampón se traducirá en tensiones más bajas que pueden interferir con la migración del ADN. - Después de la electroforesis, neutralizar el exceso de álcali levantando suavemente los portaobjetos del tanque y la inmersión en tampón de neutralización (sección 1.2.5) durante 5 min. Escurrir las diapositivas y repite dos veces más.
- Fijar los portaobjetos por inmersión en etanol frío 100% durante 5 min. Deje que los portaobjetos se sequen al aire y colocar en un lugar seco para el almacenamiento.
6. La tinción de ADN, el cometa de visualización y análisis
- tinción de ADN
- Colocar los portaobjetos en una bandeja de cartón o metal y añadir 200 l de solución de trabajo nucleico mancha fluorescente de ácido (sección 1.2.7) para cada diapositiva y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Proteger a las diapositivas deluz permiten que las diapositivas permanecen en contacto con la solución de tinción durante al menos 30 minutos antes de la puntuación. Tinción de las diapositivas en lotes de 20 a la vez.
- Antes de leer cada diapositiva, suavemente seque el exceso de solución de tinción, teniendo cuidado de no perturbar la cubierta de vidrio.
- Visualización cometa y de puntuación
- Utilizar una cámara de vídeo conectada a un microscopio de fluorescencia para ver imágenes en directo de la diapositiva cometa en el monitor de la computadora.
- Aleatoriamente elegir un campo del microscopio que contiene células. El uso de un ratón, seleccione una celda. Haga clic en el centro de la "cabeza del cometa" con el botón izquierdo del ratón.
NOTA: El software ordenador calcula todos los parámetros de medición para la célula y añade los datos a un archivo de datos. - Puntuación todas las células en el campo actual (véase el paso 6.2.4), y luego utilizar los controles de la etapa del microscopio y el video en pantalla para encontrar otro conjunto de células. Puntuación estas células como se describe en 6.2.2.
- Anotar la diapositiva from derecha a izquierda y de abajo a arriba. Elige unos 10 campos al azar. Durante este proceso, cualquier célula adecuada cometa que aparece en el campo de vista debe marcó sin sesgo.
NOTA: No marcar si un cometa cualquiera de las siguientes situaciones: 1) que se encuentra en cualquiera de los bordes de la diapositiva; 2) dos o más cometas se superponen; 3) hay restos en la cola; 4) el software no puede diferenciar entre la cabeza y la cola; o 5) la tinción del núcleo y / o la cola es muy diferente de otras cometas de la diapositiva.
NOTA: Los cometas con casi toda su fluorescencia del ADN en la cola se refieren a menudo como los cometas 'erizo'. cometas erizo no deben ser puntuados, pero el número de erizos detectados durante el marcador de diapositivas deben ser registrados y aparecen como un porcentaje del total de los cometas. - Analizar al menos 75 cometas por diapositiva, la lectura se desliza por dos órganos / tejidos para obtener al menos 150 células / muestra de cometas en total. Después de que el número requerido de células de una diapositiva tener estaren anotó, el resultado se guarda como un archivo de hoja de cálculo para el análisis de datos más adelante.
7. Análisis Histopatología
- Después de un mínimo de la fijación 72 hr en NBF al 10%, seguido por el tejido de recorte 21, de forma rutinaria procesar e incrustar el lóbulo hepático lateral izquierdo de las muestras en una parafina-cera a base medio 22. Sección de las muestras a aproximadamente 5 micras y recoger en portaobjetos de vidrio.
- Manchar las secciones con hematoxilina y eosina (H & E):
- Calentar los portaobjetos con las secciones de tejido de parafina en un horno de 60 ° C durante 2 horas antes del procedimiento de tinción.
- Use xileno para Desparafinar los lados. Rehidratar los portaobjetos con etanol clasificado (EtOH) con un enjuague con agua corriente del grifo.
- Colocar los portaobjetos en 450 ml de hematoxilina durante 2 min y 40 seg. Lavar los portaobjetos con ácido (ácido acético glacial 2 ml a 450 ml de agua desionizada) durante 4 segundos después de 5 minutos enjuagar con agua corriente del grifo.
- Coloque el deslizadoES en 450 ml 70% de EtOH que contiene 1 ml de hidróxido de amonio durante 2 min, seguido de funcionamiento del grifo enjuague de agua durante 2 min y 30 seg, y 70% de enjuague EtOH durante 1 min.
- Incubar los portaobjetos con 450 ml de solución de eosina Y que contiene ácido acético glacial 4 ml durante 3 min.
- Deshidratar las diapositivas con EtOH graduada. Limpiar los portaobjetos con xileno (tres veces 1 min cada uno), y mantenga los portaobjetos en xileno hasta cubreobjetos se colocan en las diapositivas.
- Examinar los portaobjetos de microscopio de luz, los resultados de registro, y las lesiones no neoplásicas grado de severidad que 1 (mínimo), 2 (leve), 3 (moderado) o 4 (marcado).
NOTA: El grado de severidad solicitado una lesión específica se basa en la proporción relativa del hígado con la lesión (= mínimo <1-15%; leve = 16-35%; moderado = 36-60%; y marcado = 61- 100%).
análisis 8. Datos
- El animal se considera la unidad experimental para evaluaciones estadísticas. daño en el ADN se expresa como% DNA en la cola.
- daño oxidativo del ADN se calcula de la siguiente manera: los toboganes de referencia (sin tratamiento enzimático) proporcionan una estimación de las roturas de la cadena de ADN de fondo (SB).
NOTA: Los portaobjetos tratados con enzimas proporcionan una medida de roturas de la cadena y bases oxidadas (SB + OX). Suponiendo una respuesta lineal a la dosis para el% de ADN en la cola como una función de daño en el ADN, la resta de SB de SB + OX da una estimación de roturas de la cadena de ADN de oxidados pirimidinas / purinas alterados 23. - Analizar el ADN% en la cola como una función de la dosis por ANOVA de una vía, seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones por pares de las respuestas en los animales tratados al control del vehículo.
NOTA: Todas las pruebas son de una cola y un valor de p inferior a 0,05 se establece como criterio para la significación estadística.
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Representative Results
El ensayo cometa alcalino in vivo se llevó a cabo en conjunción con el ensayo de cometa modificado por la enzima para medir tanto la lesión directa del ADN y oxidativo en el hígado de ratas tratadas con acetato de ciproterona (CPA) 5. CPA es un fármaco hormonal sintético que induce tumores de hígado de rata de una manera específica de un sexo, con cinco veces las dosis más altas necesarias para inducir tumores de hígado en ratas macho en comparación con hembras de 24. Hemos encontrado que el daño directo del ADN producido por CPA en el hígado de ratas macho y hembra tiene el mismo patrón específico del sexo como su hepatotumorigenicity: se necesita una dosis cinco veces superior de CPA para inducir un aumento significativo en el daño del ADN en el hígados de los hombres en comparación con las mujeres (Figura 1).
Nuestra hipótesis es que el resultado del ensayo cometa específico del sexo se debe a la actividad de sulfotransferasa hidroxiesteroide (s) (HST), que es 15 veces mayoren las ratas hembras adultas que en hombres adultos. Metabolismo HST es un paso limitante de la velocidad en la activación de CPA a la unión de ADN-metabolito (s) 25. Por el contrario, inducida por CPA daño oxidativo del ADN fue generalmente mayor en los hombres que en hígados de rata hembra, y por tanto menos probable que sea un paso limitante en la formación de tumor (Figura 2). Evaluación La histopatología de los hígados de ratas tratadas-CPA no mostró evidencia de apoptosis inducida por agentes o necrosis (Tablas 1 y 2), lo que indica que los resultados del ensayo de cometa positivos no eran un efecto secundario de la citotoxicidad de 5. Las figuras 1 y 2 y en las Tablas 1 y 2 se han impreso con el permiso de Elsevier (Referencia 5).
Figura 1. daño del ADN en los hígados de mí ratas machos y hembras tratados con CPAasured con el ensayo de cometa alcalino in vivo. Grupos de cinco de siete semanas de edad ratas F344 macho y hembra se trataron con aceite de oliva o con 10, 25, 50, o 100 mg / kg / día CPA en aceite de oliva. Los tratamientos se realizaron a 0, 24, y 45 horas, las ratas se sacrificaron a las 48 hr, y el daño del ADN se midió en el hígado como ADN% de la cola utilizando el ensayo de cometa alcalino. tratamiento CPA indujo un aumento en DNA% de la cola en los hígados de ratas macho de una manera umbral similar, con aumentos significativos se detectan sólo con las dosis de 50 y 100 mg / kg / día. CPA tratamiento indujo roturas de la cadena de ADN en el hígado de las ratas hembras de una manera casi lineal dependiente de la dosis, con un aumento significativo en el ADN de la cola% detectado en todos los grupos de la CPA. Se estimaron los niveles más bajos observados Genotoxicidad efecto (LOGELs) para el daño del ADN inducido por CPA en el hígado de las ratas hembra y macho a ser de 10 y 50 mg / kg / día, respectivamente. * Significativo a p = 0.05 en relación con la con vehículocontrol; barras de error representan la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. daño oxidativo del ADN en los hígados de macho tratados con CPA y ratas hembra mide con el ensayo de cometa alcalino modificado por la enzima in vivo. Grupos de cinco de siete semanas de edad ratas F344 macho y hembra se trataron con aceite de oliva o con 10, 25, 50, o 100 mg / kg / día CPA en aceite de oliva. Los tratamientos se realizaron a 0, 24, y 45 horas, los animales fueron sacrificados a las 48 hr, y el ensayo de cometa modificado por la enzima se realizó utilizando DNA% de la cola como una métrica de daño del ADN. Todas las dosis de CPA produjeron incrementos significativos en el daño del ADN Endo III-sensible en el hígado de las ratas macho tratadas con CPA; mientras Endo III-sensible DNA dAmage sólo se detectó en las ratas hembras tratadas con 25, 50, y 100 mg / / CPA día kg (A). Todas las dosis de CPA, hubo incrementos significativos en hOGG1 sensibles al daño oxidativo del ADN en el hígado de ratas macho; aumentos en el daño del ADN hOGG1 sensible se detectaron sólo en las ratas hembras tratadas con 50 y 100 mg / / CPA día kg (B). * Significativo en p = 0.05 en relación con el control del vehículo; barras de error representan la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las tablas 1 y 2. Los resultados del análisis de histopatología. Desde citotoxicidad puede generar los resultados del ensayo del cometa falsos positivos, las evaluaciones histopatológicas de las células apoptóticas y / o necróticas deben llevarse a cabo para los tejidos cometa-positivos. En el presente estudio, no se observó la apoptosis de hepatocitos inducida por CPA o necrosisen los hígados de ratas macho y hembra, lo que excluía la posibilidad de una respuesta positiva falsa ensayo cometa.
| Lesión | Datos | dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocitos vacuolización citoplasmática | recuento de lesiones | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # examinada | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesión% | 17% </ Td> | 20% | 100% | 100% | 100% | |
| Promedio de Severidad | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| la mitosis hepatocitos | recuento de lesiones | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # examinada | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| Lesión% | 0 | 0 | 100% | 100% | 100% | |
| Promedio de Severidad | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Tabla 1. Incidencia de las lesiones no neoplásicas en los hígados de ratas F344 macho tratados con vehículo y CPA.
| Lesión | Datos | dosis CPA | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| Hepatocitos vacuolización citoplasmática | recuento de lesiones | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesión% | 20% | 60% | 100% | 100% | 100% | |
| Promedio de Severidad | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| la mitosis hepatocitos | recuento de lesiones | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesión% | 0 | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| Promedio de Severidad | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatocitos cariomegalia | recuento de lesiones | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # examinada | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Lesión% | <td> 00 | 100% | 100% | 100% | ||
| Promedio de Severidad | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Tabla 2. Incidencia de las lesiones no neoplásicas en los hígados de ratas hembra tratadas F344-CPA-vehículo y.
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Discussion
Este protocolo describe la medición simultánea de tanto el daño de ADN directa y oxidativo en el hígado de rata a nivel de células individuales. El protocolo general es aplicable a cualquier tejido del que las células individuales o núcleos se pueden aislar con un mínimo de daño en el ADN de procesamiento inducida (es decir, el daño del ADN inducido no por el agente de ensayo, pero por el manejo y procesamiento de los tejidos animales). En nuestra investigación, hemos llevado a cabo el ensayo del cometa alcalinas en las células de la médula ósea 7,9, 6 de estómago, riñón 9, 9 vejiga, pulmón 9, 10 corazón, glándula mamaria 5, 5 útero, testículos 5, 5 y sangre. Estos ensayos pueden proporcionar un método rápido, simple y de bajo costo para el estudio de daño en el ADN inducido por xenobióticos en múltiples órganos y tejidos de animales experimentales. Además, este método se puede utilizar para estudios de biomonitorización humanos mediante ensayos que llevan a cabo, por ejemplo, en la sangre periférica, exfoliadacélulas del tracto urinario, o los epitelios bucales o nasales obtenidas de individuos clínicamente o con exposición ocupacional. El enfoque básico también se puede utilizar para la evaluación de daños en el ADN en células cultivadas in vitro.
Cuando el ensayo cometa se integra en los estudios de toxicología aguda o subcrónica, el tiempo de muestreo, es decir, el tiempo entre el último tratamiento y la recogida de tejidos, es una variable crítica que a veces debe conciliarse con la recogida de otros datos toxicológicos. Si es posible, los tiempos de muestreo se deben basar en el tiempo curso de datos de cometas, el momento en que se alcanza la concentración plasmática o tisular máxima (Cmáx), o después de estado estacionario se alcanza después de múltiples administraciones del artículo de prueba 19. En los casos fueron las concentraciones de datos o de tejidos cinéticos no están disponibles, la OCDE recomienda TG489 la realización de dos o más tratamientos y recogida de tejidos 2-6 horas después del último tratamiento, o, si es un tratamiento únicollevado a cabo, el muestreo de tejidos, tanto en 2-6 y 16-26 horas después del tratamiento 19.
Es crucial que la longitud de tiempo de la eutanasia a la preparación de diapositivas cometa sea lo más corto posible. Es aconsejable que la competencia experimental se establecerá mediante la demostración de competencia en la obtención de suspensiones de células individuales de alta calidad rápidamente de los tejidos que se ensayaron. En general, las diapositivas de cometas deben estar preparados tan pronto como sea posible después del sacrificio de los animales, con la preparación de células individuales teniendo un máximo de una hora. Establecimiento de una base de datos histórica para establecer rangos y las distribuciones de los controles negativos (vehículo) es muy recomendable para asegurar que el ensayo está bajo un control adecuado. Los niveles excesivos de daño en el ADN pueden ser observados en animales de control de vehículos / negativos cuando ocurre lo siguiente: 1) el manejo inadecuado de los tejidos; 2) un tiempo demasiado largo entre la eutanasia y la preparación de diapositivas cometa; o 3) la exposición de la suspensión de células individuales a los rayos UV-containing luz. Establecimiento de una base de datos histórica de los rangos y las distribuciones de los controles positivos también es muy recomendable para asegurar que el ensayo muestra la sensibilidad adecuada para genotoxinas conocidos. metanosulfonato de metilo (MMS) se utilizó como control positivo en el estudio actual; etil metano sulfonato (EMS) es recomendada por JaCVAM como control positivo para el ensayo de cometa in vivo 18.
La incorporación de las digestiones con endonucleasas de la lesión específica en el protocolo de ensayo cometa aumenta la sensibilidad y especificidad del ensayo mediante el reconocimiento de los tipos particulares de ADN lesiones en el ejemplo presentado aquí, las bases de ADN oxidados. Sin embargo, se debe reconocer que algunos endonucleasas pueden ser capaz de reconocer y escindir en diversas clases de lesiones del ADN; en el caso de Endo III, esto incluye lesiones no asociados con el daño oxidativo del ADN. Un resultado del ensayo cometa modificado Endo-III positivo puede indicar un MOA mixta. segundoy comparación, hOGG1 es más específica para las lesiones oxidativas y datos de un ensayo hOOG1 modificado puede ser más útil para establecer un MOA que implica daño oxidativo del ADN 11.
Citotoxicidad (apoptosis y necrosis celular) pueden dar lugar a roturas de la cadena de ADN y un resultado falso positivo ensayo cometa: los resultados del ensayo del cometa positivos por sí mismos no deben ser interpretados como genotoxicidad. La información sobre la citotoxicidad se requiere para establecer la relevancia biológica de un resultado positivo ensayo cometa. El análisis histopatológico de los tejidos del cometa-positivo es recomendado por la OCDE TG489 como una medida relevante de toxicidad tisular 19. los datos del ensayo del cometa positivas con una clara evidencia de toxicidad tisular (apoptosis o necrosis celular) deben interpretarse con cautela.
El ensayo cometa alcalino in vivo y los ensayos cometa alcalino Endo III- y modificados hOGG1 se pueden utilizar de una manera cuantitativa para tomar decisiones sobre la genotoxicidad deexposiciones xenobióticos. También se pueden utilizar para llevar a cabo la investigación fundamental en el daño y reparación del ADN en múltiples tejidos animales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
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