Introduction
alkali comet tahlil tek hücre düzeyinde DNA zincirinde kırılmalara ölçer. tek hücre süspansiyonları, bir mikroskop lamı üzerine agaroz gömülür ve hücrelerin DNA süper-döngüler içeren nükleotidler oluşturmak için lize edildi. anot doğru göç DNA serbest ipliklerini, iplikli sonları içeren DNA döngüler süperburulma kaybı pH> 13 sonuçlara Elektroforez, floresan mikroskop ile görülebilir kuyruklu yıldız benzeri yapılar oluşturarak. Parçalanmış DNA, DNA kırılmasını 1 ölçmek için kullanılabilir fragmanının boyutu ve toplam yoğunluğu (ön ve arka) ile karşılaştırıldığında kuyruklu kuyruk nispi floresan göre "kuyruk" olarak kuyruklu "kafa" den göç 2. Tahlil, basit, duyarlı, çok yönlü, hızlı ve 1 nispeten ucuzdur. DNA'ya hasar veren ajanlar tarafından neden parçalanmış DNA'nın saptanması hücrelerde DNA hasarına miktarının belirlenmesi için bir tahlil veya kullanılmış gelen çekirdekler izole edilir Indivipotansiyel olarak genotoksik malzeme (ler) ile muamele edilmiş hayvanların, çift dokular. Avantajları nedeniyle, in vivo kuyrukluyıldız tahlil geçerli Uyumu Uluslararası Konferansı (ICH) 3 ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi ürün güvenliği değerlendirmeler yapılması için (in vivo mikronükleus testi ile eşleştirilmiş) ikinci in vivo genotoksisite deneyi (EFSA olarak tavsiye edilir ) 4 düzenleyici kurallar. Laboratuvarda, gıda maddeleri, ilaç, ve Nanomalzemelerin 5-10 tarafından uyarılan in vivo DNA hasarına değerlendirilmesinde tahlil istihdam var. Fare Karaciğer Bu protokolde bir örnek olarak kullanılmıştır, ancak kuyruklu deney, deney hayvanlarının diğer dokular / organ sürece dokusundan izole edilebilir bozulmamış tek hücreler ile gerçekleştirilebilir.
DNA hasarının bazı türleri temel alkali kuyrukluyıldız tahlil değiştirmeden, DNA zincir kırıkları olarak tespit etmek zordur. oksidatif DNA hasarı durumunda, iplik breaks örneğin 8-OxoGuanine (8-oxoGua) ve metil-fapy-guanin 11'de sonları oluşturur insan 8-OxoGuanine-DNA-N-glikosilaz 1 (hOGG1 gibi tamir enzimleri ile sindirme ile DNA oksidatif lezyonlar oluşturulabilir. Ayrıca, Endonükleaz III (Endo III) okside pirimidinlerin 1 ağırlıklı olarak sonları oluşturur. bu nedenle, bir enzim-sindirim adımı eklenmesi çalışma, canlılar üzerinde 12 oksidatif DNA hasarı ölçmek için özel ve hassas bir yöntem sağlar. bu deneyler kullanarak, gösterdiğimiz sıçan ve fareler 6-8 karaciğer ve sıçanların 10 kalbinde toxicant yol açtığı oksidatif DNA hasarı.
In vitro hassas tarafından tanımlanan genotoxins in vivo deneyinde takip 3,13 testleri gibi 1), 2) çok sayıda dokuda ksenobiyotik kaynaklı DNA hasarının mekanizmasını için: alkali Comet deney genetik toksikoloji ve insan Biyomonitorlama bir çok uygulama alanı vardır 14, 3) araştırmak içinkanserojen, 4), 5) İnsan hastalıkları ve mesleki maruz kalmayı 16 araştırmak ve DNA hasarı tamir 15 değerlendirmek için bir genotoksik ya da eylem olmayan bir genotoksik modu (MOA) 7 kullanarak çalışır 6) için potansiyel yüksek verimli bir tarama deneyinde olarak organ-spesifik genotoksisite 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: hayvanlarla ilgili Prosedürleri Toksikoloji Araştırmaları FDA / Ulusal Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Burada anlatılan çalışma tasarımı, in vivo kemirgen alkalin kuyruklu tahlil 18 kendi doğrulama için Alternatif Yöntemler Doğrulama Japon Merkezi (JaCVAM) tarafından geliştirilen protokole dayanmaktadır ve daha OECD Kılavuzda tavsiyelerine göre modifiye TG489 19 .
1. Hazırlık
- slayt hazırlama
- % 1 normal ısıda eriyen agaroz çözülür (a / h) fosfat tampon maddesi içinde (Ca2 +, Mg2 + serbest fenol kırmızı içermeyen) bir mikro dalga fırın içinde ısıtma ile.
- 55 ° C su banyosunda erimiş% 1 standart agaroz çözüm yerleştirin ve küvetli sıcaklık dengelenmesi. Dip cam mikroskop herhangi excès boşaltın, agaroz çözeltisi içine slaytlaragaroz s ve temiz slaytlar arkasını silin. Oda sıcaklığında kurumaya slaytlar düz bir yüzeye dik slaytlar yerleştirin ve izin ver; kuru bir yerde slaytlar saklayın.
- Comet tahlil çözeltilerin hazırlanması
- % 0.5 düşük erimeli agaroz bir çözelti hazırlayın. Fosfat tamponu içinde agaroz (Ca2 +, Mg2 +, ve fenol kırmızı içermeyen), erime noktası düşük çözülür bir mikrodalga fırınında ısıtılarak. kuyrukluyıldız slayt hazırlanması sırasında 37-45 ° C'de çözüm tutmak; Daha sonra kalan agaroz çözüm atın.
- Lizis tampon hazırlayın. disodyum etilendiamintetraasetik asit (disodyum EDTA, Bay 372,24 g / Mol) ve 2.5 M sodyum klorür (NaCI, Bay 58.44 g / mol) ve 10 mM Tris hidroksimetil aminometan (Tris baz, Bay 121.14 g / mol), 100 mM'lik çözelti yapmak saflaştırılmış su içinde, 10 N sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH, Bay 40 g / mol) ile pH 10 olacak şekilde ayarlanır. Kullanılacağı gün, son konsantreler elde etmek için çözeltiye Triton X100 ve dimetil sülfoksit (DMSO, Bay 78.13 g / mol) ekleyinsırasıyla% 1 ve% 10, iyonları, ve kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 4-10 ° C'de karıştırıldı.
- Kullanım gününde taze enzim tamponu sağlayın. 40 mM 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES, Bay 238,3 g / mol), 100 mM potasyum klorür (KCl, Bay 74,55 g / mol), 0.5 mM ihtiva eden bir çözelti hazırlayın disodyum EDTA ve saflaştırılmış su içinde% 0.2 sığır serum albümini (BSA, Bay 66.463 g / mol). 10 N potasyum hidroksit çözeltisi (KOH, 56.1 g / mol) ile 8.0 pH ayarlayın. Oda sıcaklığında karıştırın ve kullanımdan önce, tam bir çözünme edin.
- 300 mM NaOH ve arıtılmış su içinde 1 mM disodyum EDTA ihtiva eden bir alkalin tampon çözeltisi hazırlayın. kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 4-10 ° C'de karıştırılır. kullanmak ve pH> 13 olduğundan emin olmak için önce çözeltinin pH ölçün.
- saflaştırılmış su içinde 0.4 M Tris bazı ihtiva eden bir çözelti hazırlayın ve hidroklorik asit (HCI, Bay 36.46) ile pH 7.5 olacak şekilde ayarlanır. 4-10 ° C'da, çözelti saklayın. Bu tampon nötralize edilir.
- f yapmakresh Kullanım gününde tampon kıyma. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 20 mM disodyum EDTA ve% 10 DMSO ihtiva eden çözeltisi (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, ve fenol kırmızı içermeyen) hazırlayın. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin.
- boyama çözeltisinin hazırlanması için, 1 Tris-borat-EDTA (TBE tamponu) nükleik asit ile floresan lekesi hazır çözeltisi: 10,000 (h / h). alüminyum folyo kullanarak ışık çözüm koruyun. 2-8 ° C'de saklayın ve 24 saat ile kullanın.
Fare karaciğerinden Tek hücre süspansiyonları 2. Hazırlık
- Hayvanların ötanazi Amerikan Veteriner Hekimleri Rehberinde önerilen CO 2 gazı aşağıdaki yöntemlerle fareleri euthanize: 2013 Sürümü 20.
- 2,75 CO 2 akış hızını ayarlayın. Ötenazi odasında sıçan koyun (örneğin, kurutucu kavanoz, havalandırmalı kapak sıçan kafes) ve tank vanasını açarak CO 2 açın. kadar 1,5 ile 2,5 dakika bekleyinSıçan bilinçsiz hale gelir. Maksimum ayara CO 2 akışını artırmak. solunum kesilmesinden sonra, ötenazi sağlamak için yaklaşık olarak 1 dakika boyunca bölme sıçan bırakın. Sıçan hiçbir kalp atışı olduğunu onaylamak için palpe ve sıçan onun uzuv çekilme olmadığını belirlemek için ayak kısma ötenazi doğrulayın.
- % 70 etanol ile saçlı-cildi dezenfekte edin. karın boşluğu açın ve cerrahi makas ile sağlam karaciğer çıkarın. karaciğer çıkardıktan sonra, cerrahi makas ile kalan karaciğer sol yanal lob çıkarın. Bir kesme tahtası üzerinde sol yanal lob yerleştirin ve tek kullanımlık bir tek kenarlı jilet kullanarak iki komşu 3-4 mm kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir.
- (Bölümün kıvrık önlemek için) filtre kağıdı üzerinde bir çapraz bölüm yerleştirin ve% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içine bölümüne yerleştirin. 1 ya da daha fazla: bir dokuya% 10 NBF oranı 10 olduğundan emin olun. en az 72 saat, proc bir tespit süresinden sonrahistopatolojik (aşağıda, bkz: bölüm 7) için karaciğer ESS.
- 6 cm Petri kabındaki 5 ml buz gibi soğuk tampon maddesi kıyma (bölüm 1.2.6) içine ikinci enine karaciğer bölümü yerleştirin ve kalıntı kan uzaklaştırmak için 3 kez yıkayın.
- 1 ml buz gibi soğuk tampon kıyma içeren yeni bir 2 ml santrifüj tüpüne karaciğer bölümü aktarın. hücreleri çıkarmak için iyi bir makas ile iyi bir şekilde yıkandı karaciğer bölümü kıyma. herhangi bir doku topaklar kaldırmak için 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün.
- buz üzerinde tek bir hücre süspansiyonu yerleştirin ve 1 saat içinde slaytlar yapmak için kullanabilirsiniz. Konsantrasyonu yaklaşık olarak 2 x 10 6 hücre / mL olması için (hemasitometre veya elektronik hücre sayacı ile, örneğin) sayarak hücreleri konsantrasyonunu kontrol edin.
Comet Slaytlar 3. hazırlanması
- 10 eriyik hacim, 37 ° C,% 0.5 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi (bölüm 1.2.1) ile tek bir hücre süspansiyonu, bir hacim karıştırın.Hemen normal erime noktası agaroz (Bölüm 1.1) ile kaplanmış bir slayt üzerine 100 ul pipetle. Hemen hücre agaroz karışımı üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Her bir numune için en az 8 slaytlar.
NOT: Tüm slaytlar bir sayı ya da benzer bir kod tespit edilmeli ve slaytlar olarak kör atılır böylece kimlik (aşağıda, Madde 6.2.2), kaydetti. - 30 dakika boyunca 4 ° C'ye slaytlar düz ve serin yatırın.
- Jel katılaşmış sonra, yavaşça kapağını fişleri kaldırmak ve önceden soğutulmuş lizis tamponu (bölüm 1.2.2) slaytlar batırmayın. ışıktan slaytlar korumak ve O, 1 saat (en az) 4 ° C'de lisis tamponu içinde slaytlar tutmak / N (maksimum).
Comet Slaytlar 4. Enzim Tedavisi
- lizis tamponu gelen her doku örneğinden hazırlanan 8 slaytlar 6 çıkarın ve onları oda sıcaklığında enzim tamponu (bölüm 1.2.3) ile 5 dakika her biri için 3 kat durulayın. Alkali Comet yöntemi w için kalan iki slaytlar kullanınildirimde enzim tedavisi (aşağıda, 5.1 bakınız). duruladıktan sonra, boşaltma ve dokularla slaytlar blot fazla sıvıyı çıkarın.
- 1 enzim tamponu ile hOGG1 ve Endo III enzimi stokları seyreltilir: 1.000 (h / h). Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
- Tek başına enzim tamponu (referans slaytlar olarak kullanılan 2 adet kaydırak), 200 ul hOGG1 çözeltisi (2 kaydıraklı) veya 200 ul Endo III çözeltisi (2 kaydıraklı) 200 ul: Her bir tedavi grubunda hazırlanan slaytlar için aşağıdaki çözümlerden 200 ul uygulayın.
- , Nemli bir kağıt havlu ile astarlanmış bir Petri plakalara slaytlar koyun Parafilm slaytlar kapak ve Endo III ile tedavi edilen ve referans slaytlar ve hOGG1 ile muamele slaytlar 30 dakika, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra damıtılmış su ile yıkayın ve slaytlar altında 5.2 de tarif edildiği gibi işleme devam eder.
5. çözme ve Elektroforez
- slaytlar enzimlerle muamele için değil, lizis tamponu slaytları kaldırmakSlaytlar drenaj ve artık deterjan ve tuzları yok etmek için 5 dakika boyunca soğuk nötralizasyon tamponu (bölüm 1.2.5) ile bir kez yıkayın.
- boşluk kaçınarak Adımlar 4.5 ve yatay jel elektroforezi tankında rastgele 5.1'den yer slaytlar. Sıvı seviyesi sadece slaytları kapsar kadar taze yapılmış pH> 13 elektroforez tamponu (bölüm 1.2.4) ile doldurun (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek ve emin tank seviye yapmak). DNA ayırma başlangıcında tampon pH ve sıcaklık kaydedilir.
- 20 dk alkali yükümlü hasar DNA ve ifade açma için izin için slaytlar alkali tampon kalır edelim.
- Çözme sırasında, program, güç kaynağı elektroforez deposu (pozitif ve negatif elektrotlar arasındaki cm mesafe ile ayrılır V / cm = Volt) 0.7 V / cm üretmek.
- açma sonra, güç kaynağındaki çalışma düğmesine basın. Gerekirse, yükselterek ya da tampon seviyesini düşürerek 300 mA akım ayarlayın. th tutmaksadece slaytlar yüzeyi üzerinde e tampon seviyesi. 20 dakika boyunca 4 ° C'de elektroforez gerçekleştirin. başlangıç ve elektroforez sonunda kayıcı yerleştirme tampon sıcaklığı ve akımı (amper) kaydedin.
NOT: Çok fazla tampon DNA göç engelleyebilir düşük voltaj neden olacaktır. - elektroforez sonra, yavaşça 5 dakika boyunca (Bölüm 1.2.5) tanktan slaytlar kaldırma ve nötralizasyon tamponu daldırarak aşırı alkali nötralize. slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca soğuk% 100 etanol içinde daldırarak slaytlar sabitleyin. depolama için kuru bir alanda kuru hava ve yer slaytlar izin verin.
6. DNA Boyama, Comet Görselleştirme ve Analizi
- DNA boyama
- Bir karton veya metal tepsi üzerinde slaytlar yerleştirin ve her slayt nükleik asit floresan leke çalışma solüsyonu (bölüm 1.2.7) 200 ul ekleyin ve cam kapak slip ile kaplayın. slaytlar koruyunIşık slaytlar skorlama öncesi en az 30 dakika boyunca boyama solüsyonu ile temas halinde kalmasını sağlamaktadır. Bir seferde 20 gruplar halinde slaytlar Leke.
- Her slayt okumaya başlamadan önce, hafifçe kapak camı rahatsız etmemek için dikkatli olmak, aşırı boyama çözüm uzak leke.
- Comet Görselleştirme ve Puanlama
- bilgisayar monitöründe kuyruklu yıldız sürgünün canlı görüntüleri bir floresan mikroskop bağlı bir video kamera kullanın.
- Rasgele hücreleri içeren bir mikroskop alanı seçin. Fare kullanma, bir hücreyi seçin. farenin sol tıklama ile "kuyruklu kafa" merkezi tıklayın.
NOT: Bilgisayar yazılımı hücre için tüm ölçüm parametrelerini hesaplar ve bir veri dosyasına veri ekler. - Geçerli alan (adım 6.2.4 bakınız) tüm hücreleri Puan ve sonra hücrelerin başka bir dizi bulmak için mikroskop sahne kontrolleri ve ekrandaki videoyu kullanın. 6.2.2'de tarif edildiği gibi bu hücreleri puan.
- slayt f Skorurom sağa sola ve yukarı aşağı. yaklaşık 10 alanları rastgele seçin. Bu süreçte, görünüm alanında görüntülenen herhangi bir uygun kuyrukluyıldız hücre önyargısız attı edilmelidir.
NOT: Aşağıdakilerden herhangi biri doğruysa bir kuyruklu yıldız puanı etmeyin: 1) slayt kenarlarında herhangi bulunur; 2) İki veya daha fazla kuyrukluyıldızların üst üste; 3) kuyruk enkaz var; 4) Yazılım baş ve kuyruk ayırt edemez; veya 5) çekirdek ve / veya kuyruk boyama slayt diğer kuyruklu yıldız büyük ölçüde farklıdır.
Not: kuyruk hemen hemen tüm DNA floresan ile Kuyrukluyıldızlar genellikle 'dikenli' kuyruklu olarak adlandırılır. Kirpi kuyrukluyıldızların attı edilmemelidir, ancak slayt puanlama sırasında tespit kirpi sayısı kaydedilir ve toplam kuyruklu bir yüzdesi olarak rapor edilmelidir. - En az 150 kuyrukluyıldız hücre / toplam örneği almak için organ / doku başına iki slaytlar okuma slayt başına en az 75 kuyrukluyıldızlar, analiz edin. Bir slayta hücrelerinin istenen sayısından sonra olmak vartr sonuç daha sonra veri analizi için bir tablo dosyası olarak kaydedilir, attı.
7. Histopatolojisi Analizi
- Doku 21 kırparak ardından% 10 NBF 72 saat tespitin en az sonra, rutin işleme ve 22 orta bazlı parafin-balmumu örneklerinin sol lateral karaciğer lobu gömün. Bölüm numuneler, yaklaşık 5 mikron cam slaytlar üzerinde toplar.
- hematoksilen & eozin (H & E) ile bölümleri Leke:
- boyama prosedürü öncesinde 2 saat için 60 ° C fırın içinde parafın doku kesitleriyle slaytlar ısıtın.
- tarafını deparaffinize ksilen kullanın. Bir akan musluk suyu durulama için kademeli etanol (EtOH) ile slaytlar rehidrate.
- 2 dakika ve 40 saniye hematoksilen 450 ml slaytlar yerleştirin. 4 saniye asit ile durulayın slaytlar (450 mi deiyonize edilmiş su, 2 ml buzlu asetik asit) 5 dakika akan musluk suyu ile durulanır, aşağıdaki.
- kaydırdı yerleştirin2 dakika ve 30 saniye, ve 1 dakika boyunca% 70 EtOH durulama için musluk suyu durulama çalıştırarak ve ardından 2 dakika boyunca 1 ml amonyum hidroksit içeren 450 ml% 70 EtOH içinde es.
- 3 dakika boyunca 4 mL buzlu asetik asit ihtiva eden 450 mi Eosin Y çözeltisi ile slaytlar inkübe edin.
- kademeli EtOH ile slaytlar dehydrate. ksilen ile slaytlar (üç kez 1 dk) temizleyin ve kapak fişleri slaytlar yerleştirilir kadar ksilen slaytlar tutun.
- 1 (minimal), 2 (hafif), 3 (orta), ya da 4 olarak şiddeti ışık mikroskobu, kayıt bulguları ve sınıf non-neoplastik lezyonlar slaytlar inceleyin (işaretli).
NOT:; hafif = 16-35%, orta = 36-60%; belirli bir lezyon için uygulanan şiddeti dereceli lezyonu olan karaciğerin nispi oranda (en az = <% 1-15 dayanır ve işaretlenmiş = 61- % 100).
8. Veri analizi
- Hayvan istatistiki değerlendirmeler için deneysel birim olarak kabul edilir. DNA hasarı% DN olarak ifade edilirkuyruk A.
- aşağıdaki gibi oksidatif DNA hasarı hesaplanır: Referans slaytlar (enzim yok tedavisi) arka plan DNA zincir kırıkları (SB) bir tahmin sağlar.
NOT: Enzim-tedavi slaytlar bir zincir kırıkları ölçüsünü ve okside üsleri (SB + OX) sağlar. DNA hasarının bir fonksiyonu olarak kuyruk,% DNA için doğrusal bir doz cevap varsayarsak, SB + OX gelen SB çıkarma okside pirimidinler / değiştirilmiş pürin 23 DNA zincir kırıkları bir tahminini verir. - Araç kontrol ile tedavi edilen hayvanlarda tepkilerin ikili karşılaştırma için Dunnett testi tarafından takip tek yönlü ANOVA ile dozun bir fonksiyonu olarak kuyruk% DNA analiz edin.
NOT: Tüm testler tek kuyruklu ve daha az 0.05 p değeri istatistiksel anlamlılık için kriter olarak ayarlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo olarak, alkalin Comet deney siproteron asetat (CPA) 5 ile muamele edilmiş sıçanların karaciğer doğrudan ve oksidatif DNA hasarı, hem ölçmek için bir enzim ile modifiye edilmiş Comet yöntemi ile bağlantılı olarak yapılmıştır. EBM ile, cinsiyete spesifik bir şekilde sıçan karaciğer tümörleri neden olmaktadır sentetik hormon ilaçtır kadınlarda 24 ile karşılaştırıldığında erkek sıçanlarda karaciğer tümörlerinin indüklemek için gerekli olan yüksek dozlar beş kat. Bu, erkek ve dişi farelerin karaciğerinde CPA ile üretilen doğrudan DNA hasarı da hepatotumorigenicity aynı cinsiyet belirli bir desen sahip olduğunu bulduk: CPA beş kat daha yüksek bir dozda DNA hasarı önemli bir artış indüklemek için gerekli olan kadınlara oranla erkeklerin karaciğerleri (Şekil 1).
Biz cinsiyete özgü kuyruklu yıldız tahlil sonucu 15 kat daha fazladır hidroksisteroid sulfotransferase (ler) (HST) aktivitesi, bağlı olduğu varsayımındayetişkin erkeklerde daha erişkin dişi sıçanlarda. HST metabolizması DNA bağlanma metabolit (ler) 25 CPA aktivasyonunda bir hız sınırlayıcı bir adımdır. Bunun aksine, CPA-neden olduğu oksidatif DNA hasarı dişi sıçan karaciğerinden daha erkek genel olarak daha büyük ve oran-sınırlayıcı tümör oluşumu, adım (Şekil 2) olmak böylece daha az olasıdır. EBM-tedavi sıçan karaciğerinin Histopatoloji değerlendirme olumlu kuyrukluyıldız tahlil sonuçları sitotoksisite 5 ikincil etkisi olmadığını belirten ajan kaynaklı apoptoz veya nekroz (Tablo 1 ve 2) hiçbir kanıt gösterdi. 1 Şekiller ve 2 ve Tablo 1 ve 2 Elsevier BV (Referans 5) izni ile yeniden basıldı edilir.
EBM-muamele erkek ve dişi sıçanların bana karaciğerlerinde Şekil 1. DNA hasarıin vivo alkali kuyruklu tahlille asured. beş ila yedi haftalık erkek ve dişi F344 sıçan grupları, zeytin yağı ya da tedavi edilen 10, zeytin yağı içinde 25, 50 ya da 100 mg / kg / gün EBM. Tedaviler, 0, 24 ° yapılmıştır, ve 45 saat, sıçanlar 48 saat sonra kurban edilmiştir ve DNA hasarı alkalin Comet analizi kullanılarak% kuyruk DNA olarak karaciğerde ölçülmüştür. CPA tedavi anlamlı bir artış sadece 50 ve 100 mg / kg / gün dozu ile tespit edilmesiyle, bir eşik benzeri bir şekilde erkek sıçanların karaciğerlerinde% kuyruk DNA'sının bir artış uyarmıştır. CPA tedavi bütün CPA gruplarında tespit edilen% kuyruk DNA'sının önemli artışlar ile yakın bir lineer doza bağımlı bir şekilde dişi sıçanların karaciğerlerinde birlikte DNA ipliklerinde kırılmalara neden olmuştur. dişi ve erkek sıçanların karaciğerlerinde EBM-bağlı DNA hasarını için Gözlemlenen en düşük Genotoksitisi Etkisi Düzeyleri (LOGELs) sırasıyla 10 ve 50 mg / kg / gün olarak tahmin edildi. * Aracın con p≤0.05 nispetle önemlitrol; Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CPA ile muamele edilmiş erkek karaciğer ve dişi sıçanlarda Şekil 2. oksidatif DNA hasarı, enzim ile modifiye edilmiş, in vivo olarak alkali Comet yöntemi ile ölçüldü. Beş ila yedi haftalık erkek ve dişi F344 sıçan grupları, zeytin yağı ya da 10 ile tedavi edildi, zeytin yağı içinde 25, 50 ya da 100 mg / kg / gün EBM. Tedaviler 0, 24 olarak yapılmıştır ve 45 saat, hayvanlar 48 saat sonra kurban edildi ve enzim modifiye kuyruklu yıldız tahlil DNA hasarının bir ölçüt olarak% kuyruk DNA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm EBM dozları EBM-tedavi erkek sıçanların karaciğerlerinde Endo III duyarlı DNA hasarının önemli artışlar üretilen; Endo III duyarlı bir DNA D iseAmage sadece 25, 50 ve 100 mg / kg / gün EBM (A) ile tedavi edilen dişi farelerde tespit edilmiştir. Bütün CPA dozlar erkek sıçanların karaciğerlerinde hOGG1 duyarlı oksidatif DNA hasar belirgin artışlar ile sonuçlanmıştır; hOGG1 duyarlı DNA hasarının de ise sadece 50 ve 100 mg / kg / gün EBM (B) ile muamele edilmiş, dişi farelerde tespit edilmiştir. * Araç kontrolü için p≤0.05 nispetle önemli; Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1 ve 2. Sitotoksisite apoptotik ve / veya nekrotik hücreler için yalancı pozitif kuyruklu yıldız tahlil sonuçlarını, histopatolojik değerlendirmeler üretebilir beri histopatoloji analiz sonuçları. Kuyrukluyıldız pozitif dokular için yapılmalıdır. Bu çalışmada, CRA kaynaklı hepatosit apoptoz veya nekroz gözlemlenmiştirBir yanlış pozitif kuyrukluyıldız tahlil tepki olasılığını hariç hem erkek hem de dişi sıçanların, karaciğerlerinde.
| yara | Veri | doz EBM | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| HEPATOSİT sitoplazmik vakuolizasyon | lezyon Sayısı | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 |
| # İncelendiğinde | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lezyon% | % 17 </ Td> | % 20 | % 100 | % 100 | % 100 | |
| Ort Önem | 1.0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatosit mitoz | lezyon Sayısı | 0 | 0 | 5 | 5 | 6 |
| # İncelendiğinde | 6 | 5 | 5 | 5 | 6 | |
| lezyon% | 0 | 0 | % 100 | % 100 | % 100 | |
| Ort Önem | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 | 1.8 | |
Taşıt ve EBM-tedavi erkek F344 sıçanların karaciğerlerinde non-neoplastik lezyonların Tablo 1. Sıklığı.
| yara | Veri | doz EBM | ||||
| 0 mg / kg | 10 mg / kg | 25 mg / kg | 50 mg / kg | 100 mg / kg | ||
| HEPATOSİT sitoplazmik vakuolizasyon | lezyon Sayısı | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 |
| # İncelendiğinde | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lezyon% | % 20 | % 60 | % 100 | % 100 | % 100 | |
| Ort Önem | 1.0 | 1.3 | 1.8 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatosit mitoz | lezyon Sayısı | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| # İncelendiğinde | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lezyon% | 0 | % 100 | % 100 | % 100 | % 100 | |
| Ort Önem | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
| hepatosit Karyomegaly | lezyon Sayısı | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| # İncelendiğinde | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| lezyon% | <td> 00 | % 100 | % 100 | % 100 | ||
| Ort Önem | 0 | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2.0 | |
Araç-ve EBM-tedavi dişi F344 sıçanların karaciğerlerinde non-neoplastik lezyonlar Tablo 2. Sıklığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, tek hücre düzeyinde sıçan karaciğer hem doğrudan ve oksidatif DNA hasarının eşzamanlı ölçümünü açıklamaktadır. Genel protokol (örneğin, DNA hasarı olmayan deney maddesinin tarafından değil, hayvan dokularının kullanım ve işleme neden) tek hücre ya da çekirdekler minimal işleme neden olduğu DNA hasarının izole edilebilir olan herhangi bir dokuya uygulanabilir. Araştırmamızda, biz kemik iliği 7,9, mide 6, böbrek 9, mesane 9, akciğer 9, kalp 10, meme bezi 5, rahim 5, testis 5 ve kan 5 hücreleri üzerinde alkali kuyruklu yıldız deneyleri yaptık. Bu deneyler, çoklu organ ve deney hayvanları dokuları ksenobiyotik neden olduğu DNA hasarına çalışmak için, hızlı, basit ve ucuz bir yöntem olabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, periferal kandan, örneğin, iletken deneyleri insan biyolojik izleme çalışmaları için kullanılabilir dağılmış olabiliridrar yolu hücreleri veya klinik veya mesleki maruz kalan bireyler elde edilen bukkal veya burun epitelyum. Temel yaklaşım ayrıca, in vitro kültürlenmiş hücrelerde DNA hasarını değerlendirmek için kullanılabilir.
Kuyrukluyıldız deneyi, yani akut veya subkronik toksikoloji çalışmalarında, örnekleme süresi, entegre edildiğinde, son tedavi ve doku toplama arasındaki süre, bazen diğer toksikolojik veri toplama ile bağdaştırılabilir gereken kritik bir değişkendir. Eğer mümkünse, örnekleme süreleri zamana kuyruklu veriler, doruk plazma veya doku konsantrasyonu (Cmax) elde veya kararlı durum testi 19.maddesi birden idareler aşağıdaki sağlandıktan sonra edildiği zamana dayalı olmalıdır. durumlarda Kinetik veriler, ya da doku konsantrasyonları tek bir tedavi ise, OECD TG489, iki ya da daha fazla tedavi yapmak ve son tedaviden sonra dokular 2-6 saat toplama tavsiye veya mevcut değildir edildiTedavi 19 sonrasında 2-6 ve 16-26 saatte dokuları örnekleme, gerçekleştirdi.
Kuyruklu yıldız slayt hazırlama ötanazi zaman uzunluğu mümkün olduğunca kısa olması büyük önem taşımaktadır. Deneysel yetkinlik deneye tabi tutulur dokulardan hızlı bir şekilde yüksek kalitede tek hücre süspansiyonları elde yeterlilik göstererek kurulmasını tavsiye edilir. Genellikle, kuyruklu yıldız slaytlar tek hücre hazırlama bir saat maksimum alarak, en kısa sürede hayvan kurban sonra hazırlanmalıdır. aralıkları ve negatif (araç) kontrol dağılımları kurmak için tarihsel bir veri tabanının oluşturulması son derece tahlil doğru kontrol altında olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Aşağıdaki meydana geldiğinde DNA hasarının aşırı düzeyde araç / negatif kontrol hayvanlarında gözlenen edilebilir: doku 1) yanlış kullanım; ötanazi ve kuyrukluyıldız slayt hazırlama arasındaki 2) çok uzun bir süre; UV containin için tek bir hücre süspansiyonu ya da 3) maruzg hafif. aralıkları ve pozitif kontrollerin dağıtımları için tarihsel bir veri tabanının oluşturulması da son derece tahlil bilinen genotoxins uygun hassasiyet gösterir sağlamak için tavsiye edilir. Metil metansülfonat (MMS) bu çalışmada pozitif kontrol olarak kullanılmıştır; etil metan sülfonat (EMS) in vivo kuyruklu tahlilinde 18 için pozitif bir kontrol olarak JaCVAM tarafından tavsiye edilmektedir.
Comet tahlil protokolüne lezyon özgü endonükleaz ile sindirim birleştirilerek DNA belirli tiplerinin tanınması yoluyla testin duyarlılık ve özgüllüğünü arttırır lezyonlarda-örneğin, burada yükseltgenmiş DNA bazları sundu. Ancak, bazı endonükleaz tanıma ve DNA lezyonları çeşitli sınıflarının en yaran yeteneğine sahip olabileceği kabul edilmelidir; Endo III durumunda, bu oksidatif DNA hasarı ile ilişkili olmayan lezyonları içerir. Pozitif Endo III modifiye kuyrukluyıldız tahlil sonucu karışık MOA gösterebilir. By karşılaştırma, hOGG1 oksidatif DNA hasarı 11 içeren bir MOA kurulması için daha yararlı olabilecek bir hOOG1 modifiye testte oksidatif lezyonlar ve veri daha özeldir.
Sitotoksisite (hücre apoptoz ve nekroz), DNA zincir kırıkları ve yanlış pozitif kuyrukluyıldız tahlil sonucu yol açabilir: kendileri pozitif kuyrukluyıldız tahlil sonuçları genotoksisite olarak yorumlanamaz. sitotoksisite ile ilgili bilgiler olumlu kuyrukluyıldız tahlil sonucu biyolojik alaka kurmak için gereklidir. Kuyruklu yıldız pozitif dokuların histopatolojik analiz doku toksisitesi 19 ilgili bir önlem olarak, OECD TG489 tarafından tavsiye edilmektedir. doku toksisitesi (hücre apoptoz veya nekroz) açık kanıtlarla pozitif kuyrukluyıldız tahlil verileri dikkatli yorumlanması gerekmektedir.
In vivo alkali kuyruklu yıldız tahlil ve Endo III ve hOGG1 modifiye alkalin kuyruklu yıldız deneyleri ve genotoksisite ile ilgili kararlar almak için nicel bir şekilde kullanılabilirKsenobiyotik maruz kalma. Ayrıca, birden fazla hayvan dokularında, DNA hasarı ve onarım temel araştırma yapmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1,000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1,000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
- Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
