Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

العزلة وكيفية تركيب الكانيولا من الشلل متني الشرايين

doi: 10.3791/53835 Published: May 23, 2016

Abstract

الشرايين متني داخل المخ (PAS)، والتي تشمل الشرايين متني، الشرايين اختراق والشرايين قبل الشعيرات الدموية، والأوعية الدموية مقاومة عالية تتفرع من الشرايين والشرايين حنوني والغوص في لحمة الدماغ. الفردية السلطة الفلسطينية يروي أرض أسطواني منفصلة من لحمة والخلايا العصبية الموجودة داخل. هذه الشرايين هي لاعب رئيسي في تنظيم تدفق الدم الدماغي سواء على الصعيد العالمي (تنظيم ذاتي الدماغية) ومحليا (احتقان وظيفي). المناطق المحمية هي جزء من وحدة وعائية عصبية، هيكل الذي يطابق تدفق الدم الإقليمي في النشاط الأيضي في الدماغ وتشمل أيضا الخلايا العصبية، interneurons والخلايا النجمية. نضح من خلال المناطق المحمية يرتبط ارتباطا مباشرا على نشاط الخلايا العصبية في تلك المنطقة خاصة والزيادات في الصدارة استقلاب الخلايا العصبية إلى زيادة في التروية المحلية الناجمة عن اتساع تغذية السلطة الفلسطينية. تنظيم المحمية يختلف من تميز أفضلالشرايين حنوني. تضيق الأوعية التي يسببها ضغط أكبر في المناطق المحمية وآليات توسيع الاوعيه الدمويه تختلف. وبالإضافة إلى ذلك، لا المحمية لا تتلقى تعصيب خارجي من الأعصاب المحيطة بالأوعية - تعصيب هو جوهري وغير المباشر في الطبيعة من خلال الاتصال مع endfeet نجمي الخلايا. وهكذا، البيانات المتعلقة تنظيم مقلص التي تراكمت الدراسات التي تستخدم الشرايين حنوني لا يترجم مباشرة لفهم وظيفة السلطة الفلسطينية. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يزال غير معروف كيف الحالات المرضية، مثل ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري، وتؤثر على بنية السلطة الفلسطينية والتفاعل. هذه الفجوة المعرفية هي في جزء منه نتيجة للصعوبات التقنية المتعلقة عزل السلطة الفلسطينية وإقناء؛ إدخال القنية. في هذه المخطوطة نقدم بروتوكول لعزل وإقناء؛ إدخال القنية من المناطق المحمية القوارض. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أمثلة من التجارب التي يمكن القيام بها مع هذه الشرايين، بما في ذلك انقباض الناجم عن ناهض للتفاعل عضلي. على الرغم من أن التركيز على هذه المخطوطة على إقناء؛ إدخال القنية السلطة الفلسطينية وتخطيط العضل الضغط وعزل السلطة الفلسطينيةالصورة يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الكيمياء الحيوية، والفيزيائية الحيوية والجزيئية والتصوير.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وينظم الدورة الدموية الدماغية على نحو فريد لدعم مطالب التمثيل الغذائي للخلايا العصبية المركزية، والخلايا التي حدت من مخازن الطاقة وبالتالي فهي حساسة جدا للتغيرات في ضغط الأكسجين وتوريد المواد الغذائية الضرورية. كما معينة القطعان العصبية تصبح نشطة عندما يتم تنفيذ مهام محددة، والأوعية الدموية يعزز زيادة موضعية شديدة في نضح لمنع نقص الأكسجة المحلي واستنزاف المواد الغذائية 1. هذا هو شكل من أشكال احتقان وظيفي المعروفة باسم اقتران الوعائية العصبية، وتعتمد على حسن سير العمل في وحدة وعائية عصبية، يتكون من الخلايا العصبية نشطة، النجمية، والشرايين الدماغية 2. الشرايين متني داخل المخ، مجموعة من الأوعية الدموية التي تشمل متني، اختراق والشرايين قبل شعري، مهمة مركزيا لهذه الاستجابة، ومن ثم حاسما لدراستها بشكل فردي من أجل تحقيق اقتران الوعائية العصبية 3.

<ص الطبقة = "jove_content"> الشرايين متني صغيرة (20-70 ميكرون القطر الداخلي) الأوعية الدموية عالية المقاومة التي يروي السكان العصبية متميزة داخل الدماغ. تتفرع من الشرايين حنوني على السطح، والشرايين متني تخترق لحمة الدماغ في ما يقرب من 90 زاوية لتغذية الأوعية الدقيقة تحت سطح الأرض (الشكل 1). هذه الشرايين تلعب دورا حاسما في الحفاظ على ضغط التروية المناسبة كما هي الأوعية التي تحتوي على العضلات الملساء الأكثر القاصي حماية الشعيرات الدموية. في المقابل إلى الدورة الدموية حنوني السطح، الشرايين متني تفتقر إلى فروع جانبية ومفاغرة، وبالتالي هي "عنق الزجاجة" للالدورة الدموية الدماغية 4. ونتيجة لذلك، خلل في الشرايين متني يساهم في تطور الأمراض الدماغية مثل ضعف الأوعية الدموية المعرفي والجلطات الصغيرة (المعروف أيضا باسم السكتات الدماغية الصامتة أو الجوبي). indicat دراساته أن الخلل متني الشرايين يمكن أن يسببها ارتفاع ضغط الدم والإجهاد المزمن وحدثا في وقت مبكر من مرض سفينة صغيرة نموذج الفأر الجيني 7. انسداد وعلاوة على ذلك، التي يسببها تجريبيا من الشرايين اختراق واحدة في الفئران غير كافية لتسبب الجلطات الصغيرة التي هي اسطوانية الشكل، على غرار تلك التي لوحظت في البشر السن 8.

وبالإضافة إلى هذه الفروق التشريحية، وآليات تنظيم وظيفة مقلص تختلف بين الشرايين حنوني والشرايين متني. تضيق الأوعية عضلي أكبر في الشرايين متني ربما بسبب عدم وجود تعصيب خارجي 10، وسائط مميزة من mechanotransduction 11، والاختلاف في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يشير 12،13 في خلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن آليات عائي تعتمد على البطانة تختلف أيضا بين هذه vascuشرائح لار، مع الشرايين متني واظهار مزيد من الاعتماد على آليات تنطوي الكالسيوم 2+ -activated K + القنوات والاتصالات كهربي توتري داخل جدار الأوعية الدموية مقارنة مع العوامل إنتشاري مثل أكسيد النيتريك وprostacyclins 14. ولذلك، تجمع البيانات في التجارب باستخدام الشرايين حنوني قد لا ينطبق بالضرورة على متني الشرايين، مما يترك فجوة في معرفتنا السيطرة المحلية على التروية الدماغية.

وعلى الرغم من أهميتها، والشرايين متني هي ناقصا إلى حد بعيد درس، ويرجع ذلك أساسا إلى التحديات التقنية مع العزلة وتصاعد للدراسة خارج الحي. في هذه المخطوطة وصفنا منهجية لعزل ويقني؛ يدخل القنية الشرايين متني الدماغية، والتي يمكن استخدامها للضغط تخطيط العضل، أو لعزل الأنسجة لimmunolabeling، الكهربية، وعلم الأحياء الجزيئي، وتحليل الكيمياء الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. قنية وإعداد غرفة

  1. إدراج الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات نظيفة (القطر الخارجي: 1.2 مم؛ القطر الداخلي: 0.69 ملم و 10 ملم في الطول) في الأخاديد من مجتذب ماصة مع خيوط البلاتين (القطر: 100 ميكرون).
  2. باستخدام الإعدادات المناسبة، وسحب الشعرية لتوليد قنية مع طرف طويلة ورقيقة (الشكل 2) باستخدام مجتذب micropipette. الإعدادات المستخدمة هي: الحرارة - 700، سحب - 100، السرعة - 50، الزمان - 10.
  3. إدراج قنية في حامل من غرفة الضغط مخطاط العضل. محاذاة قنية بشكل مناسب.
  4. بعناية كسر نصائح للقنية باستخدام ملقط تحت المجهر تشريح إلى القطر المطلوب. نحن هنا تظهر قنية مع طرف 10 ميكرون (الشكل 2).
  5. ملء كل من قنية مع السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على 1.8 ملي كا 2+. ملء الغرفة مع الكالسيوم 2+ خالية ACSF تستكمل مع 1٪ المصل البقريالزلال (BSA) + 10 ميكرومتر ديلتيازيم (ينبغي إعداد جميع الحلول جديدة قبل بدء التجربة). اعتمادا على حجم الغرفة، وتختلف حجم ACSF ما بين 5 إلى 20 مل. تخزين غرفة في 4 مئوية لتصبح جاهزة لبدء إقناء؛ إدخال القنية.
    ملاحظة: ديلتيازيم هو عكسها L-نوع الجهد بوابات الكالسيوم المانع من شأنها أن تتسبب في تمدد الشرايين، مما يسهل إقناء؛ إدخال القنية

2. عزل متني الشرايين

  1. الموت ببطء الحيوان مباشرة قبل تشريح باستخدام البروتوكولات القياسية في المختبر التي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسة. ويفضل استخدام المهدئات أو غاز ثاني أكسيد الكربون، وغيرها من المسكنات شائعة الاستخدام قد يكون لها آثار توسيع الاوعيه الدمويه في الدورة الدموية الدماغية 15. وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية هو موضح هنا من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان واستخدام اللجنة من كلية الحقوق بجامعة نيفادا الطب، ويتم في آغreement مع المعاهد الوطنية للصحة "المبادئ التوجيهية في رعاية واستخدام الحيوانات".
  2. الموت ببطء الحيوان باستخدام ثاني أكسيد الكربون. قبل قطع الرأس، تأكد من أن الحيوان قد توقف التنفس ولا يستجيب عندما معسر الكفوف.
  3. قطع رأس الحيوان باستخدام مقص حاد (الماوس) أو المقصلة (الفئران). إزالة الجلد من الرأس الحيوان وقطع على طول الدرز الجمجمة خط الوسط باستخدام مقص طرف على ما يرام. باستخدام الملقط حادة (الماوس) أو ذو طيات العظام إزالة بعناية عظام الجمجمة وفضح المخ. إزالة المخ ببطء وبعناية حتى لا يضر الشرايين حنوني السطح. وضع الدماغ في وعاء مملوء 20 مل من الكالسيوم 2+ خالية ACSF تستكمل مع 1٪ BSA على الجليد.
  4. ملء طبق تشريح تحتوي على وسادة مع الجليد الباردة CA2 + خالية من ACSF تستكمل مع 1٪ BSA ونقل الدماغ مع السطح البطني تواجه صعودا لهذا الطبق (الشكل 2A). وضع طبق تحت dissecتينغ المجهر (الشكل 3A). دبوس الدماغ إلى لوحة باستخدام الإبر 27 مقياس. كن حذرا لتجنب وضع دبابيس بالقرب من الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر).
  5. توطين دائرة ويليس وMCA المتفرعة منه. باستخدام الحادة والمنحازة مقص الربيع Vannas، وقطع مستطيل صغير حول MCA. تأكد من أن المستطيل قريب إلى 5 ملم عبر خلال كامل مدة MCA. وينبغي أن يكون الجزء العلوي من المستطيل بعد نقطة المتفرعة من دائرة ويليس (الأقرب إلى دائرة ويليس، الشكل 2B، السهم).
  6. باستخدام مقص الربيع Vannas، إجراء تقوض في عمق النسيج لمدة حوالي 2-3 ملم.
    ملاحظة: هذا الجزء هو أمر حاسم لعزل جيدة من الشرايين متني، وأنه قد يستغرق بضع تجارب للحصول على ذلك الحق. إذا كان الجرح مذكرة قدمت عميقة بما فيه الكفاية، فإن الشرايين متني معزولة تكون قصيرة. إذا كان الجرح عميق جدا، وسوف الشرايين كسر في نقطة التفرع الخاصة بهم عند تشريحتتم إزالة الأنسجة.
  7. أحدد نهاية معظم البعيدة للشريحة الدماغ في طبق تشريح مع مولودية الجزائر تواجه صعودا (البعيدة عن دائرة ويليس) باستخدام دبابيس الحشرات. جعل شق الضحلة لقطع الحنون قرب دبوس، والحرص على عدم قطع عميق جدا في القشرة الدماغية الكامنة (وإلا سوف دبابيس لا يحمل).
  8. بعناية الاستيلاء على كل جانب من الحنون مع ملقط صغير وبدء تقشير الحنون من القشرة. إذا لزم الأمر، على عقد لمولودية الجزائر، وضمان أن الغشاء حنوني المحيطة غير تالف.
  9. حافظ على تقشير حتى الحنون التي تحتوي على MCA خالية من القشرة. لاحظ أن المقاومة ضد تقشير ستزيد على مقربة من الدائرة ويليس. كن حذرا عند هذه النقطة، لأن الشرايين متني أطول سيكون في هذه المنطقة.
  10. مرة واحدة الحنون هو حر، وضعه بعناية على أعلى لوحة على طبق تشريح مع عكس ذلك السطح لمتني الشرايين أسفل (الشكل 2B).
  11. <لى> استخدام Vannas مقص الربيع، وقطع الشرايين تشريح خالية من مولودية الجزائر، والتأكد من يتم قطع نهايات السفينة بصراحة.
  12. الشرايين التي تم جمعها يمكن استخدامها للتخطيط العضل الضغط، والتحليل الجزيئي، أو عزل العضلات الملساء الأم أو الخلايا البطانية.

تخطيط العضل 3. الضغط

  1. إعداد خياطة في وقت مبكر. قطع الظلام خيط النايلون الأخضر إلى 5 قطع ملم ووضع على الجانب زجة من الشريط على الوجهين على طبق بيتري. تحت المجهر تشريح، فصل كل قطعة في خيوط وذلك باستخدام ملقط غرامة، وفضفاضة إعداد نصف عثرات بسيطة عقدة عن طريق تمرير نهاية واحدة خيوط في الآخر.
  2. باستخدام ملقط، واختيار عقدة قبالة الشريط على الوجهين، والتأكد من عدم الاستيلاء عليها مع الكثير من الضغط. سحب الخيط إلى حل حمام، عقدة الشرائح على قنية وتشديد على مسافة من غيض من قنية. كرر هذه العملية لديك 2 الغرز على كل قنية.
  3. معطف الزجاجmicropipette مع حل جيش صرب البوسنة 10٪ ثم شطف الزائدة مع الكالسيوم 2+ خالية ACSF تستكمل مع 1٪ BSA.
  4. سحب 50 ميكرولتر من الحل في micropipette الزجاج، وسحب ما يصل شرين متني ونقل إلى غرفة الضغط تخطيط العضل. دفع المكبس في الحركة السائل واحدة في صرف شرين متني في غرفة لمنعها من الالتصاق إلى غرفة داخلية من micropipette الزجاج.
  5. باستخدام اثنين من ملقط السوبر غرامة، فتح التجويف للسلطة الفلسطينية، والحرص على تلمس فقط نهاية جدا من السفينة.
  6. باستخدام ملقط لعقد حواف شرين متني، وسحب بعناية السفينة على قنية. سحب بعيدا بما فيه الكفاية على قنية ذلك أن السفينة ليست في نهاية مدبب جدا للقنية (الشكل 3A).
  7. قم بفك الغرز 2 على قنية وتشديد لهم على متن السفينة (الشكل 3B). مساحة الغرز بصرف النظر قليلا على متن السفينة، وسحب نحو المشغل بينما TIGHعشر منه. تأكد من أن أي فروع ترتبط من قبل أن يغلق عند الطرف الآخر من شرين متني.
  8. تحويل الغرفة حول وإغلاق الطرف الآخر من شرين متني باعتباره كيس أعمى. لتحقيق ذلك، فتح الروابط في قنية المعاكس وتمريرها على شرين. ببطء إغلاق عقدة في مثل هذه الطريقة التي شرين متني سوف تكون مرتبطة إلى جانب قنية. تجنب امتداد طولي من شرين. (الشكل 3C).
    ملاحظة: إذا كان الهدف من هذه الدراسة هو أن يروي المخدرات من خلال التجويف، يقني؛ يدخل القنية الطرف الآخر بدلا من ربط شرين متني إلى جانب قنية. تأكد من أن قنية ليس لديهم أي بلورات الملح أو الداخلية تكديس أن منع تدفق داخل اللمعة. تنظيم معدل التدفق بشكل مناسب من أجل الحفاظ على إجهاد القص ضمن مستويات الفسيولوجية. دراسة من قبل شيه وآخرون. وتظهر معدلات تدفق داخل اختراق الشرايين في فئران ويمكن أن تكون بمثابة دليل الأولي لبيالكثير من الدراسات.
  9. نقل بعناية غرفة إلى مرحلة المجهر ليتم استخدامها لتسجيل اوعية. إرفاق الغرفة على خشبة المسرح المجهر، وربط التحقيق في درجة الحرارة ومدخل ومخرج للنضح إلى الأنابيب الصحيحة. الضغط على الشريان إلى 40 مم زئبق ضغط داخل اللمعة لالشرايين متني الماوس أو 50 مم زئبقي للالشرايين الفئران، وذلك باستخدام نظام الضغط المتاحة في المختبر (عمود الماء، مضخة تحوي بالإضافة إلى محول الضغط، الخ.). ويبين الشكل 4D مثالا ل مضخة تحوي بالإضافة إلى محول الضغط للضغط على شرين مقنى.
  10. تشغيل النظام المستخدم للكشف عن تغيرات في قطر (الشكل 3E). ضبط الإعدادات على المجهر، مثل الإضاءة والتباين، وذلك للحصول على أفضل كشف ممكن. من الناحية المثالية جدران شرين ينبغي أن تكون مظلمة وشفافة التجويف. مرة واحدة في الكشف المناسب، بدء التسجيل رانه التجربة.
  11. بدء تشغيل نظام superfusion. غسل مقنى، الضغط شرين متني مع دافئ ACSF (37 C) التي تحتوي على 1.8 ملي كا 2+ لمدة 15 إلى 20 دقيقة بمعدل تدفق بين 3-5 مل / دقيقة. يجب أن لا تحتوي هذه ACSF ديلتيازيم أو BSA.
  12. استبدال ACSF منتظم مع 60 ملي بوكل ACSF لتقييم جدوى إعداد. عند هذه النقطة يجب المحمية يحمل 10-20٪ انقباض إلى 60 ملي بوكل. إذا لم شرين انقباض إلى هذا الحد، وإزالة ويقني؛ يدخل القنية شرين آخر.
  13. تغسل 60 ملي بوكل مع ACSF منتظم. الانتظار حتى الجيل من لهجة عضلي عفوية، وهو ما قد يستغرق ما يصل إلى ساعة واحدة. إذا لم يكن لديك شرين نغمة عضلي في ذلك الحين، والاستعاضة عنها شرين آخر.
    لوحظ عضلي لهجة كما تدريجي، وبطيئة في بعض الأحيان، والحد في قطر التجويف السفينة دون التحفيز عن طريق مستقبلات مقلص أو حل ارتفاع بوكل: ملاحظة. ويحسب لهجة عضلي قبل و بعدormula: (1 - (قطر التجويف نشط / السلبي قطر التجويف)) × 100 5 مبلغ مناسب لهجة عضلي قد تختلف وفقا للعلاجات، والسلالات والأنواع والجينات، وغيرها. بشكل عام، تتراوح هجة عضلي الفسيولوجية 15-30٪ 5.

4. مثال الضغط التجارب تخطيط العضل: يسببها ناهض-انقباض عضلي والتفاعلية

  1. إعداد سلسلة من التخفيفات من ناهض الاختيار في ACSF باستخدام تركيزات المناسبة. بالنسبة للمثل الحالي تم استخدام الثرموبوكسان A 2 مستقبلات ناهض U46619. وتم إعداد حل الأوراق المالية من 1 مل من U46619 بتركيز 1 ملم. نقل 100 ميكرولتر من محلول 1 ملم إلى أنبوب جديد يحتوي على 900 ميكرولتر من ACSF لجعل التخفيف 10 أضعاف من المخدرات، مما أدى إلى محلول يحتوي على 100 U46619 ميكرومتر. كرر هذه العملية لمدة 6 التخفيفات، بدءا من 1 ملم إلى 100 نانومتر لإعداد منحنى المضيقة التركيز والاستجابة.
  2. أضف الكامل حجم محلول يحتوي ناهض (1 مل للجرعة الأولى، تليها 900 ميكرولتر من كل الجرعات اللاحقة) إلى 100 مل من superfusing ACSF. وسوف يؤدي ذلك إلى تخفيف 100 أضعاف إضافية من ناهض. وهكذا، فإن تركيزات النهائي ناهض في مجموعة حمام من 22:00 إلى 10 ميكرومتر. تسمح الشرايين لاحتضان لمدة 10 دقيقة ~ في كل تركيز، حتى يصل قطرها اللمعية إلى حالة من الثبات.
  3. تغسل ناهض بواسطة superfusing المحمية مع ACSF دون أية عقاقير حتى قطر السلطة الفلسطينية هو العودة إلى القيمة الأصلية. احتضان شرين متني في كا 2+ خالية ACSF (بدون BSA) تستكمل مع 10 ميكرومتر الديلتيازيم + 2 مم EGTA للحث على أقصى اتساع وتسجيل قطر السلبي لشرين.
  4. إزالة شرين متني من قنية عن طريق سحبها بعناية في حين عقد في نهاية العلاقات بين البلدين. غسل غرفة سفينة مع الماء منزوع الأيونات مزدوج لإزالة الأنقاض ويزيد من ناهض. تملأ الغرفة مع الكالسيوم2+ ACSF خالية + جيش صرب البوسنة ويقني؛ يدخل القنية شرين آخر. فمن غير المستحسن لإجراء تجربة أكثر من واحد في شرين.
  5. لإجراء تجربة تفاعلية عضلي، والسماح للشرين متني للتوازن في 40 مم زئبق ضغط داخل اللمعة حتى يتم إنشاء نغمة عضلي عفوية (المذكورة أعلاه). تقليل الضغط داخل اللمعة إلى 5 مم زئبق والسماح للسلطة الفلسطينية لكي تتوازن ل~ 5-10 دقيقة، حتى يصل قطرها اللمعية حالة مستقرة. زيادة متدرج الضغط داخل اللمعة باستخدام فاصل من خيار (على سبيل المثال 5-140 ملم زئبقي في 20 مم زئبق الزيادات).
  6. لا تعرض شرين للضغط داخل اللمعة أقل من 5 مم زئبق، والتي يمكن أن تسبب انهيار وتلف بطانة، وبالتالي تغيير نتائج التجربة.
  7. في نهاية منحنى الضغط، superfuse شرين متني مع الكالسيوم 2+ خالية ACSF (بدون BSA) تستكمل مع 10 ميكرومتر الديلتيازيم + 2 مم EGTA وكرر الخطوات الضغط، بدءا من ادنىر الضغط.
    ملاحظة: هذا سيعطي أقطار السلبي للسلطة الفلسطينية، والتي هي ضرورية لحساب٪ لهجة عضلي، التي تحددها الصيغة:٪ لهجة = (1 - (قطر نشط / قطر السلبي)) × 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 5A انقباض تمثيلية من المناطق المحمية الماوس إلى 60 ملي بوكل ACSF لتقييم سلامة إعداد. يجب المحمية تقليص الفترة ما بين 15 - 30٪ في ظل وجود 60 ملي بوكل. إذا كان انقباض هو أقل من 15٪، تجاهل السلطة الفلسطينية ويقني؛ يدخل القنية واحد آخر، لأنه يشير إلى أن شرين تضررت أثناء عملية العزل وإقناء؛ إدخال القنية.

ويوضح الشكل 5B السلطة الفلسطينية انقباض في زيادة تركيزات الثرموبوكسان A 2 التناظرية U-46619 (22:00 إلى 1 ميكرومتر) في حمام superfusing. وقد لوحظ انقباض كتخفيض في قطر التجويف بعد الحضانة مع كل التركيز. ويحق للسلطة لكي تتوازن في كل تركيز لمدة 10 دقيقة. ويمكن تحليل هذه البيانات وتقديمها على أنها تغير في القطر (ΔDiameter) أو كنسبة مئوية من تضيق الأوعية إلى بوكل، التي تطبع تشانغالإلكترونية في قطر من أقصى انقباض إلى 60 ملي بوكل.

يبين الشكل 6 تتبع التمثيل في قطر التجويف من السلطة الفلسطينية في تجربة تفاعلية عضلي. ارتفاع تدريجي في الضغط داخل اللمعة يؤدي إلى انقباض متدرج من المناطق المحمية في وجود 1.8 مم خارج الخلية كا 2+ (الشكل 6، أقل تتبع). حضانة لنفس السلطة الفلسطينية مع ACSF دون الكالسيوم 2+ وتستكمل مع 10 ميكرومتر الديلتيازيم + 2 مم EGTA تلغي جيل لهجة عضلي، وقطر التجويف الزيادات السلطة الفلسطينية وفقا لضغوط داخل اللمعة (الشكل 5، تتبع العلوي)، والذي هو سلبي التجويف قطر شرين.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لمتني الشرايين. فرع المحمية من بي سطحآل الشرايين والغوص في حمة الدماغ الكامنة. كل السلطة الفلسطينية perfuses السكان العصبية صغيرة داخل أراضيها عمودية (أبرز المناطق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: عزل ماوس الشلل المحمية أ) صورة من الدماغ مع السطح البطني متجهة لأعلى تظهر دائرة ويليس (السهم 1) ومولودية الجزائر تتفرع منه (السهم 2). ب) صورة من مولودية الجزائر مع أنسجة الدماغ الكامنة. يشير السهم إلى أكثر المناطق القريبة من مولودية الجزائر من دائرة ويليس. C) المناطق المحمية المتفرعة من مولودية الجزائر (السهام). بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل (3)
الشكل (3): كيفية تركيب الكانيولا من عزل ماوس المحمية أ) صورة من السلطة الفلسطينية مقنى ولكن ليست مرتبطة حتى الآن مع الغرز. توضح هذه الصورة طول السلطة الفلسطينية لإدراجها على قنية قبل إغلاقه مع الغرز. ب) يتم إغلاق السلطة الفلسطينية الآن على قنية مع 2 الغرز لضمان أنها لن تنزلق قبالة قنية بعد الضغط. C) صورة من مقنى، والماوس ضغط السلطة الفلسطينية في تكوين التجريبية أعمى الكيس. بار = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: المعدات المستخدمة في المختبر لدينا لتجارب السلطة الفلسطينية أ) تشريح المجهر مع.مصدر ضوء. ب) تحكم في درجة الحرارة. C) مضخة تحوي لsuperfusion حمام من ACSF. D) السيطرة على ضغط هيدروليك، المعيشة أنظمة التهوية. E) فيديو البعد محلل (أسفل اليمين)، ومراقبة (أعلى اليمين) والفيديو كشف حافة النظام تحميلها على جهاز كمبيوتر محمول (يسار). F) غرفة سفينة صغيرة (الخطية غرفة محاذاة). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: انقباض المحمية إلى يسببها بوكل-الاستقطاب والثرموبوكسان A 2 التناظرية U46619 أ) انقباض الممثل المناطق المحمية الماوس إلى 60 ملي بوكل ACSF لتقييم سلامة إعداد. يجب المحمية تقليص الفترة ما بين 15 - 30٪ في ظل وجود 60 ملي بوكل. ب) U46619 الناجم عن انقباض المناطق المحمية. كما لوحظ في البحث عن المفقودين، U46619 يسببالتركيز التي تعتمد على انقباض المناطق المحمية، يحتفل به بوصفه انخفاض في قطر التجويف بعد الحضانة مع كل التركيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
يسبب التفاعلية عضلي المناطق المحمية زيادات تدريجية في الضغط داخل اللمعة انقباض متدرج من المناطق المحمية في وجود 1.8 مم خارج الخلية كا 2+ (أقل التتبع): الشكل (6). هذا انقباض الناجم عن الضغط هو سمة من الشرايين مقاومة. حضانة لنفس السلطة الفلسطينية مع ACSF دون 1.8 ملي كا 2+ وتستكمل مع 10 ميكرومتر الديلتيازيم + 2 مم EGTA تلغي جيل لهجة عضلي، وقطر التجويف الزيادات السلطة الفلسطينية وفقا لضغوط داخل اللمعة (تتبع العلوي)، والذي هو التجويف السلبي قطر من الالبريد شرين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الشرايين متني الدماغية هي الشرايين مقاومة عالية مع قليل من مفاغرة والفروع التي يروي السكان العصبية واضح. هذه الأوعية الدموية المتخصصة لاعبين المركزي في تنظيم ذاتي الدماغية واقتران الوعائية العصبية من خلال بوساطة نجمية توسع الأوعية 1. وقد عرف أهمية هذه الأوعية الدموية المتخصصة في أمراض الأوعية الدموية الدماغية لحوالي 50 عاما، عندما وصف العمل الرائد الدكتور ميلر فيشر التعديلات الهيكلية في الشرايين متني داخل أراضي عوائق الجوبي في أدمغة مرضى ارتفاع ضغط الدم بعد الوفاة 16 . هذه التعديلات، بالإضافة إلى اضطراب وظيفي، يمكن أن يسبب نقص انسياب الدم من المادة البيضاء العميقة، وهو عامل خطر رئيسي لتطوير المتعلقة الأوعية الدموية الخرف 17. الشرايين متني تختلف وظيفيا من الشرايين داخل الجمجمة وحنوني الكبيرة وكذلك الشرايين السطحية، والتي تراكمت دآتا استخدام هذه الأعضاء من شجرة الدماغية قد لا يكون استقراء بسهولة إلى دوران الأوعية الدقيقة متني. وعلى الرغم من أهمية واضحة في الحفاظ على توازن الدماغ السليم، الدراسات التي تركز على علم وظائف الأعضاء وكانت الاستجابات الوظيفية لهذه الشرايين نادرة حتى السنوات الأخيرة، ويرجع ذلك أساسا إلى الصعوبات التقنية المرتبطة العزلة والتلاعب.

في هذا المخطوط وصفنا تقنية بسيطة وقابلة للتكرار لعزل وإقناء؛ إدخال القنية من الشرايين متني للدراسات الضغط تخطيط العضل، التحليل الجزيئي، أو إعداد العضلات الملساء الأم أو الخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بيانات عن استخدام هذه التقنية لتحقيق التنظيم عضلي، المضيقة، وآليات المماطلة في الشرايين متني. ونلاحظ أن هذه السفن تنشط myogenically، توليد نغمة عضلي عفوية عندما يتم الإبقاء على الضغط داخل اللمعة على مستوى ثابت، وكذلك المتغيرةوضع عضلي تواجه التغييرات في الضغط داخل اللمعة، والظواهر وصفا جيدا لالشرايين مقاومة يسمى التفاعل عضلي 18. التفاعل عضلي يشكل عاملا رئيسيا في تنظيم ضغط التروية في الدماغ، والحفاظ على التقلبات التي تواجه مستمرة في الضغط الشرياني الجهازي، وبالتالي منع فقدان التروية في ضغوط منخفضة، أو وذمة وعائية المنشأ في الضغوط أعلى 18. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن هذه الشرايين تستجيب للمواد فعال في الأوعية، مثل endothelin-1، وهو مضيق للأوعية الذاتية المهم تنتجها الخلايا البطانية. العيوب الرئيسية للإعداد الموصوفة هنا هي أنه من خلال عزل الشرايين متني المكونات الحيوية وحدة وعائية عصبية فقدت ولا يمكن أن تدرس ردود تبيغي الوظيفية. الاستعدادات الأخرى، مثل شريحة الدماغ، والحفاظ على هيكل وحدة وعائية عصبية سليمة وأكثر مناسبة لدراسة السيطرة نجمي من تصلب المخ قطرها 19. هوويفر، في إعداد شريحة الدماغ، لا يتم ضغط الشرايين متني وهناك حاجة الإدارة الخارجية وكلاء مضيق للأوعية التي تعتمد على مستقبلات لتقليد لهجة القاعدية من أجل دراسة استجابات توسيع الاوعيه الدمويه. تخطيط العضل الضغط وإعداد شريحة الدماغ ينبغي أن يكون النظر مكملة لدراسة دوران الأوعية الدقيقة في الدماغ.

وقد تم تكييف البروتوكول الموصوفة هنا من إعداد وصف لأول مرة من قبل داسي وDuling في عام 1982 20، وتعديلها من قبل كوين وآخرون. 21. والفرق الرئيسي يكمن في تقنية إقناء؛ إدخال القنية المستخدمة: بينما داسي وDuling وكوين وآخرون تستخدم مجموعتين مختلفتين من الماصات، وعقد ماصة الخارجية وماصة إقناء؛ إدخال القنية داخل اللمعة، ونحن نستخدم فقط ماصة داخل اللمعة ويدويا الشريحة السلطة الفلسطينية في ماصة . وقد استخدمت هذه التقنية في الآونة الأخيرة إلى إجراء دراسات في المحمية الفئران بعد نقص التروية الدماغية - إصابة ضخه 22، المحمية من كرونically الفئران ارتفاع ضغط الدم من بين أمور أخرى. في الفئران، ونحن تستخدم هذه التقنية لتقييم الكالسيوم 2+ إشارات في الضغط السلطة الفلسطينية خلايا العضلات الملساء في ظل الظروف الفسيولوجية والحماض بواسطة اقتران السلطة الفلسطينية القسطرة ليزر المسح المجهري متحد البؤر لتقييم الكالسيوم 2+ الأمواج والشرر في خلايا العضلات الملساء 13. اختبرنا أيضا العديد من وكلاء اقتران الوعائية العصبية وأظهر، وذلك باستخدام أدوات الدوائية بالتعاون مع غشاء التسجيلات المحتملة، التي cerebrospecific يصل تنظيم قنوات البوتاسيوم الجهد مسور K V 1 يؤدي إلى خلل مثل اعتلال القنوات في النموذج الوراثي مرض سفينة صغيرة 7. هذه الأمثلة توضح جدوى هذا إعداد للإجابة على الأسئلة البحثية المختلفة.

ومن المهم التأكيد على أن عزل المناطق المحمية الدماغية من أنسجة المخ هو الخطوة الأكثر أهمية، حيث أن سهولة إقناء؛ إدخال القنية سيعتمد على عدد وطول ايزولا المحميةتيد. قد يستغرق بضعة تجارب لتحسين العزلة. وعلاوة على ذلك، فإن منحنى التعلم لإقناء؛ إدخال القنية يمكن أن تكون طويلة ومحبطة، ويمكن أن تكون معدلات النجاح الأولية منخفضة تصل إلى 50٪. ومع ذلك، مرة واحدة يتقن، استنساخ والإنتاجية لهذه التقنية عالية، والعديد من التجارب لا يمكن أن يؤديها في يوم واحد.

وباختصار، يصف هذا المخطوط تقنية لعزل وإقناء؛ إدخال القنية من الشرايين الدماغية متني. مثل هذا التحضير عزل المكون الأوعية الدموية وحدة وعائية عصبية، والحفاظ على ردود سليمة من الشرايين الضغط. والدراسات التي تستخدم المحمية معزولة توفر معلومات قيمة حول تداول متني الدماغية، في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl Fisher Scientific S-640
KCl Fisher Scientific P217
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M-8266
NaHCO3 Fisher Scientific S233
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G2870
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope Olympus SZX7
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Wiretrol 50 μl VWR Scientific 5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter VWR Scientific 28145-477
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Dark Green Nylon Thread Living Systems Instrumentation THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Video Dimension Analyzer Living Systems Instrumentation VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software Living Systems Instrumentation DAQ-IWORX-404
Heating Unit Warner Instruments 64-0102
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
  2. Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
  3. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
  5. Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
  6. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
  7. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
  8. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
  9. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
  10. Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
  11. Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
  12. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
  13. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
  14. You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
  15. Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
  16. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
  17. Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
  18. Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
  19. Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
  20. Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  21. Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
  22. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
العزلة وكيفية تركيب الكانيولا من الشلل متني الشرايين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).More

Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter