Abstract
arterioles parenchymal תוך-מוחי (PAS), הכוללים arterioles parenchymal, arterioles חודרת arterioles מראש נימי, הם כלי דם גבוה התנגדות מסתעפת מן העורקים pial ו arterioles וצלילה לתוך המוח parenchyma. רשות פרט perfuse טריטוריה גלילית דיסקרטית של parenchyma ואת נוירונים הנכלל. arterioles אלה הם שחקן מרכזי בויסות זרימת דם במוח הוא בעולם (autoregulation כלי דם במוח) מקומי (hyperemia הפונקציונלי). מגבר ספק הוא חלק מיחידת העצבים וכלי הדם, מבנה התואם את זרימת דם אזורי פעילות מטבולית במוח וכן כולל נוירונים, interneurons, האסטרוציטים. זלוף באמצעות מגבר הספק קשור ישירות לפעילות של נוירונים באותו שטח ועליות בפרט בעופרת מטבוליזם עצבית אל הגדלה ב זלוף המקומי הנגרם על ידי התרחבות של הזנת הרשות. הסדרת עוזרות אישיות שונה מזו של-מוגדרת בצורה יותר טובהעורקי pial. לחץ הנגרמת vasoconstriction גדול בפה ולגוון מנגנוני vasodilatory. בנוסף, Pas אינו מקבל עצבוב חיצוני מעצבי perivascular - העצבוב הוא מהותי ועקיפות בטבע באמצעות מגע עם endfeet astrocytic. לפיכך, נתונים בדבר הסדרת התכווצות שנצבר על ידי מחקרים באמצעות עורקי pial אינה לתרגם ישירות להבנת תפקוד הרשות. יתר על כן, הוא נשאר נקבע כיצד מצבים פתולוגיים, כגון יתר לחץ דם וסוכרת, להשפיע על מבנה רשות תגובתיות. פער ידע זה הוא בחלקו תוצר של הקשיים הטכניים הנוגעים בידוד cannulation רשות. בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד cannulation של מגברי הספק מכרסם. יתר על כן, אנו מציגים דוגמאות של ניסויים שניתן לבצע עם arterioles אלה, כולל התכווצות אגוניסט-induced תגובתיות myogenic. למרות ההתמקדות של כתב היד הזה היא על cannulation הרשות ולחץ myography, מבודד רשותים יכול לשמש גם עבור מחקרים ביוכימיים, biophysical, מולקולרי, והדמיה.
Introduction
תפוצתו המוחין מאורגנת ייחודי לתמיכה בדרישות המטבולית של תאי עצב מרכזיים, תאים שיש להם מוגבלות מאגרי אנרגיה ובשל כך הם רגישות גבוהה לשינויים בלחץ חמצן ואספקת חומרי מזון דרושים. כפי תת-אוכלוסיות נוירונים מסוימות הופכות לפעילות כאשר משימות ספציפיות מבוצעות, כלי הדם מקדם גידול מקומי מאוד ב זלוף למנוע היפוקסיה ודלדול מקומיים של חומרי הזנה 1. זוהי צורה של hyperemia הפונקציונלי המכונה צימוד neurovascular, והוא תלוי בפעילות התקינה של היחידה העצבה וכלי הדם, מורכב של נוירונים פעילים, האסטרוציטים, ועורקי מוחות 2. Arterioles תוך-מוחי parenchymal, קבוצה של כלי דם המקיף parenchymal חודר ו arterioles מראש נימי, הם בעלי חשיבות מרכזית התגובה הזאת וזה אז קריטי ללמוד אותם בנפרד כדי לחקור צימוד 3 העצבים וכלי הדם.
<p class = "jove_content"> arterioles Parenchymal קטן (20 - 70 מיקרומטר קוטר פנימי) כלי דם גבוהה התנגדות כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורות בתוך המוח. מסעף החוצה מן העורקים pial על פני השטח, arterioles parenchymal לחדור לתוך המוח parenchyma בזווית של 90 ᵒ כמעט להאכיל בזרימת הדם מתחת לפני הקרקע (איור 1). arterioles אלה ממלאים תפקיד קריטי בשמירה לחץ זלוף המתאים כפי שהם כלי חלקה הדיסטלי ביותר המכילים שרירים הגנה על הנימים. בניגוד במחזור pial השטח, arterioles parenchymal חסר סניפים בטחונות anastomoses, וכתוצאה מכך הם "צווארי בקבוק" של מחזור מוחות 4. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של arterioles parenchymal תורם להתפתחות של מחלות כלי דם במוח כגון פגיעה קוגניטיבית וסקולרית ושבץ איסכמי קטן (המכונה גם שבץ שקט או אַגמִימִי). מחקרים indicatדואר כי תפקוד לקוי arterioles parenchymal יכול להיגרם על ידי לחץ דם חיוני 5, מתח כרוני 6, והוא אירוע מוקדם במודל עכבר גנטי מחלת כלי קטנה 7. יתר על כן, חסימה הנגרמת באופן ניסיוני של arterioles חודר היחיד בחולדות מספיקה כדי לגרום שבץ איסכמי קטן כי הם גליליים בכושר, בדומה לאלו שנצפו מבוגרי בני אדם 8.בנוסף הבחנות אנטומיים אלה, מנגנוני ויסות פונקצית התכווצות שונים בין עורקי pial ו arterioles parenchymal. Vasoconstriction myogenic גדול ב arterioles parenchymal 9, ואולי בגלל חוסר עצבוב חיצוני 10, מצבים שונים של mechanotransduction 11, והבדלי Ca התאי 2+ איתות 12,13 בתאי שריר חלק בכלי דם. הראיות עולה כי מנגנוני vasodilator תלויי האנדותל ושונה גם בין vascu אלהמגזרי Lar, עם עורקי parenchymal מפגינים הסתמכות רבה יותר על מנגנוני מעורבי Ca 2+ -activated K + ערוצים ותקשורת electrotonic בתוך הקיר וסקולרית לעומת גורמי diffusible כגון תחמוצת חנקן prostacyclins 14. לכן, הנתונים שנאספו בניסויים באמצעות עורקי pial לא בהכרח חלים על Parenchymal arterioles, השארת רווח בידע שלנו של שליטה מקומית של זלוף מוחין.
למרות חשיבותם, arterioles parenchymal הם לאין ערוך תחת-למד, בעיקר בשל האתגרים הטכניים עם בידוד גובר ללימוד vivo לשעבר. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לבודד cannulate arterioles parenchymal מוחין, אשר ניתן להשתמש בהם לטיפול בלחץ myography, או לבודד רקמה immunolabeling, אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, ואת לאנליזה ביוכימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קנייה והכנה קאמרית
- כנס נימי זכוכית בורוסיליקט נקי (קוטר חיצוני: 1.2 מ"מ; קוטר פנימי: 0.69 מ"מ; 10 מ"מ אורך) לתוך החריצים של חולץ פיפטה עם נימת פלטינה (קוטר: 100 מיקרומטר).
- באמצעות הגדרות מתאימות, מושך את הנימים ליצור צינורית עם טיפ ארוך ודק (איור 2) באמצעות חולץ micropipette. ההגדרות בשימוש הם: חום - 700, משוך - 100, מהירות - 50, זמן - 10.
- הכנס צינורית לתוך המחזיק של תא הלחץ myograph. יישר את קנולות כראוי.
- בזהירות לשבור את הקצוות קנולות באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח לקוטר הרצוי. כאן אנו מראים צינורית עם טיפ 10 מיקרומטר (איור 2).
- מלאו הן קנולות עם מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF) המכיל 1.8 מ"מ Ca 2 +; למלא את התא עם Ca 2 + ללא aCSF בתוספת בסרום שור 1%אלבומין (BSA) + 10 מיקרומטר diltiazem (כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים טרי לפני תחילת הניסוי). בהתאם לגודל של החדר, לשנות את עוצמת הקול של aCSF בין 5 עד 20 מ"ל. אחסן את התא ב 4 ᵒ C עד מוכן להתחיל cannulation.
הערה: diltiazem הוא מעכב סידן מגודר הפיך L- סוג מתח שיגרמו התרחבות של arterioles, המאפשר cannulation
בידוד 2. Parenchymal arterioles
- להרדימו מייד לפני לנתיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים במעבדה המאושרת על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של המוסד. השימוש ברביטורטים או פחמן דו-חמצן הוא העדיף, כמו הרדמה אחרת נפוצה עשויה להיות השפעות vasodilatory במחזור המוחין 15. הנהלים כל חיה המוצג כאן אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש מאוניברסיטת הספר נבדה לרפואה, ונמצאים AGreement עם ה- National Institutes of Health "ממונחי היסוד טיפול ושימוש בחיות".
- להרדימו באמצעות פחמן דו חמצני. לפני עריפת הראש, להבטיח כי בעל החיים שהפסיקו לנשום ואינו מגיב כאשר צובטים כפותיו.
- לערוף את החיה באמצעות מספריים חדים (עכבר) או הגיליוטינה (חולדה). הסר את העור מן הראש של החיה וחותכת לאורך תפר גולגולתי קו האמצע באמצעות מספרי טיפ נאים. בעזרת מלקחיים בוטים (עכבר) או plier עצם להסיר בזהירות את עצמות גולגולת ולחשוף את המוח הגדול. הסר את המוח לאט ובזהירות שלא לפגוע בעורקי pial השטח. מניחים את המוח לתוך מיכל מלא עם 20 מ"ל של aCSF Ca 2 + ללא בתוספת 1% BSA על הקרח.
- למלא צלחת לנתיחה המכיל כרית עם Ca 2 קר כקרח + -חינם aCSF בתוספת 1% BSA ולהעביר את המוח עם משטח הגחון כלפי מעלה כדי המאכל הזה (איור 2 א). מניח את הצלחת תחת dissecמיקרוסקופ טינג (איור 3 א). הצמד את המוח לרפד באמצעות מחטים 27-מד. היזהר, כדי למנוע הצבת סיכות ליד עורק המוח האמצעי (MCA).
- למקם את מעגל ויליס ואת MCA הסתעפות ממנו. בעזרת מספרי Vannas חדים ומיושרים באביב, לחתוך מלבן קטן סביב MCA. ודא מלבן כי הוא קרוב ל 5 מ"מ לרוחב דרך אורכו של MCA. החלק העליון של המלבן צריך להיות מעבר לנקודת ההסתעפות מן המעגל ויליס (הפרוקסימלי המעגל ויליס, האיור 2B, חץ).
- בעזרת המספריים באביב Vannas, לבצע שתיפול לתוך העומק של הרקמה למשך כ 2 - 3 מ"מ.
הערה: חלק זה הוא קריטי עבור בידוד טוב של arterioles parenchymal, וזה עלול לקחת כמה ניסויים כדי לעשות את זה נכון. אם החתך הוא פתק עשה עמוק מספיק, arterioles parenchymal המבודד יהיה קצר; אם החתך הוא עמוק מדי, arterioles ישבור בשלב ההסתעפות שלהם כאשר גזוררקמה יוסר. - להצמיד את הקצה הדיסטלי ביותר של פרוסת המוח לתוך הצלחת לנתח עם MCA כלפי מעלה (דיסטלי מן המעגל ויליס) באמצעות סיכות חרקים. לעשות חתך רדוד לחתוך פיא ליד הסיכה, נזהר שלא לחתוך עמוק מדי לתוך קליפת המוח הבסיסית (אחרת הפינים לא יחזיקו).
- בזהירות לתפוס בכל צד של פיא עם מלקחיים קטנים ומתחיל לקלף פיא מהקורטקס. במידת הצורך, להיאחז MCA, להבטיח כי הממברנה שמסביב pial אינו פגום.
- שמור מתקלף עד פיא המכיל את MCA הוא ללא קליפת המוח. ראוי לציין, כי ההתנגדות נגד קילוף תגדל קרובה לחוג וויליס. להיות זהיר במיוחד בשלב זה, משום arterioles parenchymal עוד תהיה באזור הזה.
- לאחר פיא היא בחינם, מניח אותו בזהירות על גבי הכרית על הצלחת לנתח עם היפך השטח כדי Parenchymal arterioles פונה כלפי מטה (איור 2 ב). <li> בעזרת מספריים באביב Vannas, לגזור את arterioles גזור חינם מן MCA, מוודא את הקצוות של כלי נחתכים בבוטות.
- arterioles Collected יכול לשמש לחץ myography, ניתוח מולקולרי, או בידוד של שריר חלק יליד או תאי האנדותל.
לחץ 3. Myography
- כן התפר מראש. חותך את חוט הניילון הירוק כהה לתוך 5 חתיכות מ"מ ומניח על הצד הדביק של סרט דו צדדי על צלחת פטרי. תחת המיקרוסקופ לנתח, להפריד כל חתיכה לתוך הסיבי שלה באמצעות מלקחיים בסדר, ו רופף להכין קשר למחצה תקלה פשוטה על ידי העברת קצה אחד הנימה לתוך השני.
- בעזרת מלקחיים, להרים קשרו את הסרט דו צדדי, כדי לוודא שלא לתפוס אותו עם יותר מדי לחץ. משוך את התפר לתוך פתרון אמבטיה, קשר שקופית על צינורית והדק אותה ממרחק מהקצה של הצינורית. חזור על תהליך זה יש 2 תפרים על כל צינורית.
- מעיל זכוכיתmicropipette עם פתרון BSA 10% ולאחר מכן לשטוף את עודפי עם Ca 2 + ללא aCSF בתוספת 1% BSA.
- משוך 50 μl של פתרון לתוך micropipette זכוכית, להרים את עורקיק parenchymal ולהעביר לתא הלחץ myography. Push בוכנה בתנועה זורם אחת כדי לוותר על parenchymal עורקיק לתוך החדר כדי למנוע הדבקות לתא הפנימי של micropipette הזכוכית.
- שימוש בשני מלקחיים סופר בסדר, לפתוח את לומן של הרשות, נזהר רק לגעת הסוף של כלי השיט.
- שימוש במלקחיים כדי להחזיק את הקצוות של parenchymal עורקיק, שלוף בזהירות את הכלי על הצינורית. משוך רחוק מספיק על הצינורית כך שכלי השיט שוהה לא ממש בסוף המחודד של הצינורית (איור 3 א).
- שחרר את 2 תפרים על הצינורית והדק אותם על כלי ההובלה (איור 3 ב). שטח התפרים מזה קצת על הכלי, ולמשוך כלפי המפעיל תוך tighעשר זה. ודא כי כל סניפים ומחוזקים לפני הסגירה בקצה השני של עורקיק parenchymal.
- הפעל קאמרית ברחבי ולסגור את הקצה השני של עורקיק parenchymal כמו-שק עיוור. כדי להשיג זאת, לפתוח את הקשרים על צינורית מול ולהעביר אותו על עורקיק. לאט לסגור את הקשר בצורה כזו כי עורקיק parenchymal יהיה קשור בצד של הצינורית. הימנע מתיחה האורך של עורקיק. (איור 3 ג).
הערה: אם המטרה של המחקר היא perfuse תרופות דרך לומן, cannulate בקצה השני במקום קשירת parenchymal עורקיק לצד של צינורית. ודא קנולות אין לי שום גבישי מלח או לבנות קופצים פנימי החוסמים את זרימת intraluminal. להסדיר קצב הזרימה כראוי על מנת לשמור על מתח גזירה בתוך רמות פיזיולוגיות. מחקר שנערך על ידי שי et al. תערוכות ספיקות בתוך חודר arterioles בחולדות 8, והוא יכול לשמש מדריך ראשוני piמחקרים הרבה. - להעביר בזהירות בתא עד הבמה של המיקרוסקופ לשמש להקלטת קוטר כלי. צרף לתא לבמת מיקרוסקופ, חיבור בדיקת טמפרטורת כניסת שקעים עבור זלוף אל הצינורות הנכונים. לחצים על עורקיק עד 40 מ"מ כספית בלחץ intraluminal עבור arterioles parenchymal העכבר או 50 מ"מ כספית עבור arterioles חולדה, באמצעות מערכת הלחץ זמין במעבדה (עמודת המים, משאבת peristaltic מצמידים מתמר הלחץ, וכו.). איור 4D מציג דוגמה של משאבת peristaltic מצמיד מתמר לחץ לחצים על עורקיק cannulated.
- הפעל את המערכה המשמשת לאיתור שינויים בקוטר (האיור 3E). התאם את ההגדרות על המיקרוסקופ, כגון תאורה וניגודיות, כדי להשיג את הגילוי הטוב ביותר האפשרי. באופן אידיאלי קירות עורקיק צריכים להיות כהים ואת שקוף לומן. לאחר זיהוי ראוי, להתחיל להקליט tהוא להתנסות.
- הפעל את מערכת superfusion. שטפו את עורקיק parenchymal cannulated, בלחץ עם חם aCSF (37 ᵒ C) המכיל 1.8 מ"מ Ca 2 + למשך 15 עד 20 דקות בקצב הזרימה בין 3 - 5 מ"ל / דקה. aCSF זה לא אמור להכיל diltiazem או BSA.
- החזר את aCSF רגיל עם 60 מ"מ KCl aCSF כדי להעריך את הכדאיות של התכשיר. בשלב זה מגברי הספק צריך להפגין 10 - 20% התכווצות עד 60 מ"מ KCl. אם עורקיק לא להצר עד כדי כך, הסר cannulate אחר עורקיק.
- לשטוף את 60 מ"מ KCl עם aCSF קבוע. חכה עד דור טון myogenic ספונטני, אשר יכול להימשך עד שעה אחת. אם עורקיק אין הטון myogenic עד אז, ולהחליף אותה באחרת עורקיק.
הערה: טון myogenic הוא ציין כמו הדרגתית, ולעתים איטי, הפחתת קוטר לומן של כלי השיט ללא גירוי על ידי אגוניסטים התכווצות או פתרון KCl גבוה. טון myogenic מחושב לפי f הבאormula: (1 - (בקוטר לומן פעיל / קוטר לומן פסיבי)) x 100 5 כמות מתאימה של טון myogenic עשויה להשתנות על פי טיפולים, זנים, מינים, transgenics, וכו.. באופן כללי, טון myogenic פיסיולוגי נע בין 15 - 30% 5.
4. ניסויי Myography לחץ דוגמא: התכווצות מושרת אגוניסט ו myogenic תגובתיות
- הכינו סדרה של דילולים של אגוניסט הבחירה aCSF באמצעות ריכוזים מתאימים. עבור הדוגמה הנוכחית U46619 אגוניסט קולטן thromboxane A 2 היה בשימוש. פתרון המניות של 1 מ"ל של U46619 בריכוז של 1 מ"מ הוכן. העברת 100 μl של פתרון 1 מ"מ לצינור חדש המכיל 900 μl של aCSF לבצע דילול של פי 10 של התרופה, וכתוצאה מכך תמיסה המכילה 100 U46619 מיקרומטר. חזור על תהליך זה עבור 6 דילולים, הנע בין 1 מ"מ ל -100 ננומטר להכין עקומת הכווץ ריכוז תגובה.
- מוסיפים אתכל נפח של תמיסה המכילה אגוניסט (1 מ"ל עבור המנה הראשונה, ואחריו 900 μl של כל המינונים הבאים) ל -100 מ"ל של superfusing aCSF. זה יוביל דילול פי 100 תוספת של אגוניסט. לפיכך, ריכוזי הסופי של אגוניסט בטווח אמבטיה מ 10 בערב עד 10 מיקרומטר. אפשר arterioles כדי לדגור על ~ 10 דקות בכל ריכוז, עד קוטר לומינל מגיע יציב.
- יש לשטוף היטב את אגוניסט ידי superfusing עוזרות אישיות עם aCSF ללא כל תרופות עד קוטר הרשות היא חזרה לשווי המקורי. דגירה עורקיק parenchymal Ca 2 + aCSF -חינם (ללא BSA) בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ"מ EGTA לגרום התרחבות מקסימלית ולהקליט בקוטר פסיבית של עורקיק.
- הסר את parenchymal עורקיק מן הצינורית ידי משייכת בקפידה את זה תוך כדי לחיצה לתוך הקץ על הקשרים. שטוף את החדר כלי עם מים ללא יונים כפולים כדי להסיר שאריות ועודפות אגוניסט. ממלאים את החדר עם Ca2+ aCSF + BSA -חינם ו cannulate עורקיק אחר. לא מומלץ לבצע יותר מניסוי אחד לכל עורקיק.
- כדי לבצע ניסוי תגובתיות myogenic, לאפשר עורקיק parenchymal לאזן ב 40 מ"מ כספית בלחץ intraluminal עד הטון myogenic ספונטנית נוצרת (כמתואר לעיל). הפחתת לחץ intraluminal עד 5 מ"מ כספי ולאפשר רשות לאזן במשך ~ 5 - 10 דקות, עד קוטר לומינל מגיע למצב יציב. הגדיל בשלבי לחץ intraluminal באמצעות המרווח של בחירה (למשל מ 5 כדי 140 מ"מ כספי ב 20 מ"מ כספי במרווחים).
- אין לחשוף את עורקיק ללחץ intraluminal מתחת ל -5 מ"מ כספי, כפי שיכול לגרום לקריסה ולהזיק האנדותל, ובכך לשנות את התוצאות של הניסוי.
- בסוף עקומת הלחץ, Superfuse עורקיק parenchymal עם Ca 2 + aCSF -חינם (ללא BSA) בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ"מ EGTA וחזור על צעדים הלחץ, החל Lowesלחץ t.
הערה: זה ייתן את בקטרים הפסיביים של הרשות, אשר נחוצים כדי לחשב% טון myogenic, מוגדרים על ידי הנוסחא:% טון = (1 - (קוטר פעיל / קוטר פסיבי)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 א מראה התכווצות נציג מגברי הספק העכבר עד 60 מ"מ KCl aCSF להעריך את היושרה של התכשיר. מגברי הספק צריך להצר בין 15 - 30% בנוכחות 60 מ"מ KCl. אם ההתכווצות היא מתחת ל -15%, לבטל את רשות cannulate עוד אחד, כפי שהוא טוען כי עורקיק נפגע במהלך תהליך בידוד cannulation.
איור 5 ממחיש התכווצות הרשות לגידול בריכוזי של thromboxane A 2 אנלוגי U-46,619 (10 בערב עד 1 מיקרומטר) לאמבטיה superfusing. ההתכווצות נצפתה כהפחתה בקוטר לומן לאחר הדגרה עם כל ריכוז. רשות הורשה לאזן בכל ריכוז במשך 10 דקות. נתונים אלו ניתן לנתח והציג כשינוי קוטר (ΔDiameter) או כמו vasoconstriction% ל KCl, אשר מנרמל את צ'אנגדואר בקוטר ידי התכווצות מקסימלית עד 60 מ"מ KCl.
איור 6 מראה עקיבה נציג בקוטר לומן של רשות בניסוי תגובתיות myogenic. עליות צעדיים בלחץ intraluminal גורמות היצרות מדורגת של מגבר ספק בנוכחות 1.8 Ca תאי מ"מ 2 + (איור 6, עקיבה נמוכה). דגירה של אותו PA עם aCSF ללא Ca 2 + ו בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ"מ EGTA מבטלת דור טון myogenic, ואת קוטר לומן של עליות הרשות הפלסטיניות על פי לחץ intraluminal (איור 5, עקיבה עליונה), המהווה את פסיבי לומן בקוטר של עורקיק.
איור 1: סכמטי של Parenchymal arterioles. מגברי הספק סניף מתוך pi השטחאל העורקים ולצלול לתוך המוח parenchyma הבסיסית. כל PA perfuses אוכלוסייה עצבית קטנה בתוך שטח העמודים שלה (מודגש אזורים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. בידוד של עכבר מוחין מגברי הספק א) תמונה של המוח עם משטח הגחון כלפי מעלה מראה את מעגל ויליס (חץ 1) ואת MCA מסתעפת ממנו (חץ 2). תמונת B) של MCA עם רקמת המוח הבסיסית. נקודות החצים כדי האזור הפרוקסימלי ביותר של MCA מן המעגל ויליס. מגבר ספק C) המסתעף של MCA (חיצים). בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3: Cannulation של מגברי הספק עכבר מבודד א) תמונה של הרשות cannulated אבל לא קשור עדיין עם התפרים.. תמונה זו ממחישה את אורכו של הרשות להיות מוכנס על הצינורית לפני שתסגור אותו עם התפרים. ב) הרשות סגורה עכשיו על הצינורית עם 2 תפרים כדי להבטיח שזה יהיה לא להחליק את הצינורית לאחר שמירת לחץ קבוע. תמונת C) של עכבר cannulated, בלחץ רשות בתצורת ניסיוני עיוור-צק. בר = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ציוד בשימוש במעבדה שלנו לניסויי רשות א) Dissection מיקרוסקופ עם.מקור אור. B) בקר טמפרטורה. C) משאבת Peristaltic לאמבטיות superfusion של aCSF. D) לחץ בקרת סרוו, Living מערכות Instrumentation. E) וידאו ממד Analyzer (מימין למטה), לפקח (למעלה מימין) ווידאו Edge Detection מערכת טעונה על מחשב נייד (משמאל). F) תא כלי שיט קטן (תא יישור ליניארי). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: התכווצות של מגברי הספק כדי KCl הנגרמת שלילת קוטביות ואת thromboxane A 2 Analogue U46619 א) התכווצות נציג של מגברי הספק העכבר עד 60 מ"מ KCl aCSF להעריך את היושרה של התכשיר.. מגברי הספק צריך להצר בין 15 - 30% בנוכחות 60 מ"מ KCl. B) U46619 מושרה התכווצות של עוזרות אישיות; כפי שנצפה לראות את קווי המתאר, U46619 גורמתריכוז תלוי התכווצות של מגבר ספק, ציין כהפחתה בקוטר לומן לאחר הדגרה עם כל ריכוז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. תגובתיות myogenic של מגבר הספק עליות צעדיים בלחץ intraluminal גורמת היצרות מדורגת של מגבר ספק בנוכחות 1.8 מ"מ תאיים Ca 2 + (עקיבה נמוכה). התכווצות לחץ נגרם זו אופיינית arterioles התנגדות. דגירה של אותו PA עם aCSF ללא 1.8 מ"מ Ca 2 + ו בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ"מ EGTA מבטל הדור הטון myogenic, ואת קוטר לומן של עליות הרשות הפלסטינית על פי הלחץ intraluminal (העקיבה העליונה), המהווה את לומן פסיבי בקוטר של הדואר עורקיק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
arterioles parenchymal מוחין הם arterioles התנגדות גבוהה עם כמה anastomoses וענפים כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורים. כלי דם מתמחים אלו הם שחקנים מרכזיים autoregulation כלי דם במוח ו צימוד neurovascular באמצעות התרחבות astrocyte בתיווך 1. החשיבות של כלי דם מיוחדים אמור מחלת כלי דם מוחית ידועה כבר כ -50 שנים, כאשר העבודה החלוצית של ד"ר מילר פישר תארה שינויים מבניים arterioles parenchymal בשטחי אוטמי אַגמִימִי במוחם של חולים עם יתר לחץ דם שלאחר מוות 16 . שינויים אלה, מצמידים את ליקוי תפקודי, יכול לגרום hypoperfusion של החומר הלבן עמוק, גורם סיכון עיקרי להתפתחות של דמנציה וסקולרית הקשורות 17. arterioles Parenchymal מבחינה תפקודי נבדל עורקים תוך גולגולתי pial גדולים וכן arterioles שטח, ד שנצבר ובכךאתא באמצעות אותם חברי עץ כלי הדם במוח לא יכול להקיש מזה בקלות בזרימת דם parenchymal. למרות החשיבות הברורה בשמירה על הומאוסטזיס מוחי תקין, מחקרי התמקדות הפיסיולוגיה ותגובות תפקודיות של arterioles אלה היו נדירות עד השנים האחרונות, בעיקר בשל קשיים טכניים הקשורים בידוד ומניפולציה.
בכתב היד הנוכחי אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור עבור בידוד cannulation של arterioles parenchymal ללימודי myography לחץ, ניתוח מולקולרי, או הכנת שריר חלק יליד או תאי האנדותל. יתר על כן, אנו מציגים נתונים על השימוש בטכניקה זו כדי לחקור תקנת myogenic, הכווץ, ומנגנונים משתהים arterioles parenchymal. אנו צופים כי הכלים האלה הם myogenically פעילים, יצירת צליל myogenic ספונטני כאשר לחץ intraluminal נשמר ברמה קבועה, כמו גם שינוי שלהמצב myogenic בפני שינויים בלחץ intraluminal, תופעה-היטיב לתאר לעורקי התנגדות המכונים תגובתיות myogenic 18. תגובתיות myogenic היא גורם מפתח בוויסות לחץ זלוף בתוך המוח, שמירה על אותה תנודות וציפוי מתמדת בלחץ העורקי מערכתית, ובכך למנוע אובדן של זלוף בלחצים נמוכים, או בצקת vasogenic בלחצים גבוהים יותר 18. בנוסף, אנו מראים כי arterioles אלה מגיבים לחומרים vasoactive, כגון אנדותלין-1, מכווץ כלי דם אנדוגני חשוב המיוצר על ידי תאי האנדותל. מגבלה עיקרית של ההכנה המתוארת כאן היא כי על ידי בידוד arterioles parenchymal מרכיבים חיוניים של היחידה העצבה וכלי הדם הם אבדו ותגובות hyperemic פונקציונליות אינן יכולות להילמד. תכשירים אחרים, כגון פרוסת המוח, לשמור על המבנה של יחידת העצבים וכלי הדם השלמה במתכונת מותאמת יותר ללמוד שליטת astrocytic בקוטר arteriolar מוחות 19. הוwever, בהכנת פרוסת המוח, arterioles parenchymal אינו בלחץ ומנהל אקסוגני של סוכני מכווץ כלי דם קולטן תלוי נדרש לחקות טון בסיסי כדי ללמוד תגובות vasodilatory. לחץ myography והכנת פרוסת המוח צריכה להיות שקול משלימה לחקר בזרימת הדם המוחיה.
הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מתוך הכנה תוארה לראשונה על ידי דייסי Duling בשנת 1982 20, ולעבור שינויים בידי קוין et al. 21. ההבדל העיקרי טמון בטכניקת cannulation בשימוש:. בעוד דייסי Duling ו קוין ואח השתמש בשני סטים שונים של טפטפות, טפטפתי חיצוני חזק פיפטה cannulation intraluminal, אנו משתמשים פיפטה intraluminal בלבד גררו את הרשות אל פיפטה . טכניקה זו נעשה שימוש לאחרונה לבצע מחקרים בפה עכברוש לאחר איסכמיה מוחית - reperfusion פציעה 22, Pas מן דברי הימיםחולדות עם יתר לחץ דם ically 5, בין היתר. בעכברים, השתמשנו בטכניקה זו כדי להעריך Ca 2 + אותות בתאי שריר חלק בלחץ הרשות בתנאים פיזיולוגיים חמצת ידי צימוד cannulation הרשות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר להעריך Ca 2 + גלי וניצוצות בתאי שריר חלק 13. גם בדקנו כמה סוכני צימוד neurovascular 3 והפגינו, תוך שימוש בכלים תרופתי בשילוב עם הקלטות פוטנציאל הממברנה, כי cerebrospecific up-regulation של תעלות אשלגן מתח מגודרת K V 1 גורם פגם כמו-channelopathy במודל גנטי מחלת כלי קטן 7. דוגמאות אלו ממחישות את הכדאיות של הכנה זו כדי לענות על שאלות מחקר שונות.
חשוב להדגיש כי הבידוד של מגברי הספק מוחין מרקמת המוח השלב הקריטי ביותר, כמו הקלות של cannulation יהיה תלוי מספר ואורך מגברי הספק Isolaטד. זה עלול לקחת כמה ניסויים כדי לייעל את הבידוד. יתר על כן, עקום למידה עבור cannulation יכול להיות ארוך ומתסכל, ושיעורי הצלחה ראשוניים עשויים להיות נמוך כמו 50%. עם זאת, ברגע משתלט עליו, השחזור והתפוקה של טכניקה זו היא גבוה, וניסויים רבים יכולים להתבצע ביום אחד.
לסיכום, כתב היד הנוכחי מתאר טכניקה בידוד cannulation של arterioles parenchymal מוחין. הכנה כזו בודדה את החומר בכלי הדם של היחידה העצבה וכלי הדם, שמירה על תגובות שלמות של arterioles בלחץ. מחקרים שעשו שימוש מגברי הספק מבודד תספק תובנה חשובה זרימת parenchymal מוחין, בשני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
