Abstract
Intracerebrala parenkymala arterioler (PA), som omfattar parenkymala arterioler, penetrerande arterioler och pre-kapillära arterioler, är höga motstånds blodkärl förgrenar sig från pial artärer och arterioler och dykning i hjärnparenkymet. Individuell PA BEGJUTA en diskret cylindrisk territorium parenkymet och nervceller som finns i. Dessa arterioler är en central aktör i regleringen av det cerebrala blodflödet både globalt (cerebrovaskulär auto) och lokalt (funktionell hyperemi). PAs är en del av den neurovaskulära enheten, en struktur som matchar det regionala blodflödet till metabolisk aktivitet i hjärnan och inkluderar också neuroner, interneuronen, och astrocyter. Perfusion genom PA är direkt kopplad till aktiviteten av neuroner i det aktuella området och ökningar av neuronal metabolism leder till en ökning i lokal perfusion på grund av utvidgning av fodret PA. Reglering av PA skiljer sig från bättre karaktäriseradepial artärer. Tryck inducerad kärlsammandragning är större i Pas och kärlvidgande mekanismer varierar. Dessutom har PA inte ta emot yttre innervation från perivaskulära nerverna - innervation är inneboende och indirekt i naturen genom kontakt med astrocytisk endfeet. Således inte uppgifter om kontraktila reglering ackumulerade av studier med pial artärer inte direkt översätta till förstå PA funktion. Vidare är det fortfarande obestämd hur patologiska tillstånd, såsom högt blodtryck och diabetes, påverkar PA struktur och reaktivitet. Denna kunskapsluckorna är delvis en följd av de tekniska svårigheterna avseende PA isolering och kanyle. I detta manuskript presenterar vi ett protokoll för isolering och kanylering av gnagare PA. Vidare visar vi exempel på experiment som kan utföras med dessa arterioler, inklusive agonistinducerad sammandragning och myogenic reaktivitet. Även om fokus i detta manuskript är på PA kanyle och tryck myography isolerade PAs kan också användas för biokemiska, biofysiska, molekylära och avbildningsstudier.
Introduction
Den cerebral cirkulation är unikt organiseras för att stödja de metaboliska kraven på centrala neuroner, celler som har begränsad energiförråd och är därför mycket känsliga för förändringar i syretryck och leverans av nödvändiga näringsämnen. Som särskilda neuronala subpopulationer blir aktiv när specifika uppgifter utförs, främjar kärl en mycket lokal ökning av perfusion för att förhindra lokal hypoxi och utarmning av näringsämnen 1. Detta är en form av funktionell hyperemi kallas neurovaskulära koppling, och är beroende av väl fungerande neurovaskulära enhet, som består av aktiva nervceller, astrocyter och hjärnans kärl 2. Intracerebrala parenkymala arterioler, en grupp av blodkärl omfattar parenkymal, genomträngande och pre-kapillära arterioler, är centralt viktiga för detta svar och det är då viktigt att studera dem individuellt för att undersöka neurovaskulära koppling 3.
<p class = "jove_content"> parenkymal arterioler är små (20-70 um innerdiameter) högresistenta blodkärl som BEGJUTA distinkta neuronala populationer i hjärnan. Förgrenar sig från pial artärer på ytan, parenkymala arterioler tränga in i hjärnparenkymet på en nästan 90 ᵒ vinkel för att mata ytan mikro (Figur 1). Dessa arterioler spelar en avgörande roll för att upprätthålla lämplig perfusionstryck eftersom de är de mest distala glatta muskelceller innehåller fartyg som skyddar kapillärerna. I motsats till ytan pial cirkulationen, parenkymala arterioler saknar kollaterala grenar och anastomoser, och följaktligen är "flaskhalsar" i den cerebrala cirkulationen 4. Som ett resultat, dysfunktion av parenkymala arterioler bidrar till utvecklingen av cerebrovaskulära sjukdomar, såsom vaskulär kognitiv svikt och små ischemisk stroke (även kallad tyst eller lakunära stroke). studier indicate att parenkymal arterioler dysfunktion kan induceras av essentiell hypertoni 5, kronisk stress 6, och är en tidig händelse i litet kärl sjukdom genetisk musmodell 7. Vidare, experimentellt inducerad ocklusion av enstaka penetrerande arterioler hos råttor är tillräcklig för att orsaka små ischemisk stroke som är cylindrisk form, liknande dem som observerats hos äldre människor 8.Utöver dessa anatomiska skillnader, mekanismer som reglerar kontraktila funktion skiljer sig mellan pial artärer och parenkymal arterioler. Myogenic vasokonstriktion är större i parenkymala arterioler 9, möjligen på grund av bristen på yttre innervation 10 olika lägen av mechanotransduction 11, och skillnader i intracellulär Ca2 + signalering 12,13 i vaskulära glatta muskelceller. Uppgifter tyder på att endotelberoende kärlvidgande mekanismer skiljer sig också mellan dessa Vascunande segment, med parenkymala artärer uppvisar större tillit till mekanismer som inbegriper Ca2 + -activated K + -kanaler och electrotonic kommunikation inom kärlväggen jämfört med diffunderbara faktorer såsom kväveoxid och prostacykliner 14. Därför samlades data i experiment med användning av pial artärer inte nödvändigtvis gälla parenkymala arterioler, lämnar en lucka i vår kunskap om lokal styrning av cerebral perfusion.
Trots sin betydelse, parenkymala arterioler är väldigt under studerade, främst på grund av de tekniska utmaningarna med isolering och montering för ex vivo-studie. I detta manuskript beskriver vi en metod för att isolera och kanylera cerebrala parenkymala arterioler, som kan användas för tryck myography, eller för att isolera vävnad för immunmärkningen, elektrofysiologi, molekylärbiologi, och biokemisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kanylen och kammaren Förberedelse
- Infoga ren borosilikatglas kapillärer (ytterdiameter: 1,2 mm; innerdiameter: 0,69 mm; 10 mm i längd) in i spåren i en pipett avdragare med en platina filamentet (diameter: 100 ^ m).
- Med hjälp av lämpliga inställningar, dra kapillär att generera en kanyl med en lång och smal spets (Figur 2) med hjälp av en mikropipett avdragare. De inställningar som används är: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, Time - 10.
- Sätt kanyl i hållaren tryck myograph kammaren. Rikta kanylerna på lämpligt sätt.
- Noggrant bryta spetsarna på kanyler med hjälp av en pincett under dissektionsmikroskop till den önskade diametern. Här visar vi en kanyl med en 10 | im spets (Figur 2).
- Fyll båda kanyler med artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) innehållande 1,8 mM Ca2 +; fylla kammaren med Ca2 + -fria aCSF kompletterat med 1% bovint serumalbumin (BSA) + 10 pM Diltiazem (alla lösningar bör beredas på nytt före starten av experimentet). Beroende på storleken av kammaren, variera volymen av aCSF mellan 5 till 20 ml. Förvara kammaren vid 4 ᵒ C tills redo att börja kanyle.
OBS: Diltiazem är en reversibel L-typ spänningsstyrda kalcium inhibitor som kommer att orsaka dilatation av arteriolerna, vilket underlättar kanyle
2. Isolering av parenkymala arterioler
- Avliva djuret omedelbart före dissektion med hjälp av standardprotokoll i laboratoriet som är godkända av institutionens djurvård kommitté. Användning av barbiturater eller koldioxid föredrages, som andra vanligen använda bedövningsmedel kan ha vasodilaterande effekter i den cerebrala cirkulationen 15. Alla djurförsök som visas här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén från University of Nevada School of Medicine, och är i agreement med National Institutes of Health "Guiding Principles i skötsel och användning av djur".
- Avliva djuret med användning av koldioxid. Före halshuggning, se till att djuret har slutat att andas och inte svarar när nypa sina tassar.
- Halshugga djuret med en vass sax (mus) eller giljotin (råtta). Ta bort skinnet från djurets huvud och skär längs mittlinjen hjärn suturen med en fin spets sax. Med hjälp av en trubbig pincett (mus) eller ett ben tång försiktigt bort skallbenen och exponera storhjärnan. Ta bort hjärnan långsamt och försiktigt för att inte skada ytan pial artärer. Placera hjärnan i en behållare fylld med 20 ml av Ca2 + -fri aCSF som kompletterats med 1% BSA på is.
- Fyll en dissektion maträtt som innehåller en dyna med iskall Ca2 + -fri aCSF kompletterad med 1% BSA och överföra hjärnan med den ventrala ytan uppåt till denna maträtt (Figur 2A). Placera skålen under dissecting mikroskop (figur 3A). Stift hjärnan till dynan med användning av 27-gauge nålar. Var noga med att undvika att placera stift nära mitten cerebral artär (MCA).
- Lokalisera Circle of Willis och MCA förgrening från det. Med vassa och inriktade Vannas våren sax, klippa en liten rektangel runt MCA. Säkerställa att rektangeln är nära 5 mm tvärs genom hela längden av MCA. Den övre delen av rektangeln ska vara förbi förgreningspunkt från Circle of Willis (proximal till Circle of Willis, figur 2B, pil).
- Med användning av de Vannas våren sax, utför en underskärning i djupet av vävnaden i ungefär 2-3 mm.
OBS: Denna del är avgörande för god isolering av parenkymala arterioler, och det kan ta några försök att få det rätt. Om snittet är anteckning djupt nog, kommer de isolerade parenkymala arterioler vara kort; Om snittet är för djupt, kommer arteriolerna bryta vid deras förgreningspunkten när dissekerasvävnad tas bort. - Pin ner den mest distala änden av hjärnan skiva i dissekera skålen med MCA uppåt (distalt från Circle of Willis) med hjälp av insekter stift. Gör ett grunt snitt att skära pia nära pinnen, är noga med att inte skära för djupt in i den underliggande hjärnbarken (annars stiften inte kommer att hålla).
- ta noggrant varje sida av pia med små pincett och börja peeling PIA från cortex. Om det behövs, hålla i MCA och se till att den omgivande pial membranet inte skadas.
- Håll peeling tills pia innehållande MCA är fri från cortex. Observera att motståndet mot peeling ökar nära cirkeln Willis. Var extra försiktig vid denna tidpunkt, eftersom ju längre parenkymala arterioler kommer att vara i den här regionen.
- När pia är gratis, placera den försiktigt på toppen av dynan på dissekera skålen med ytan motsatt parenkymala arterioler vända nedåt (Figur 2B). <li> Använda Vannas våren sax, klippa ut dissekerade arterioler fria från MCA, och se till att ändarna av fartyget skärs rakt på sak.
- Insamlade arterioler kan användas för tryck myography, molekylär analys, eller isolering av nativ glatt muskulatur eller endotelceller.
3. Tryck Myography
- Förbereda suturen i förväg. Skär mörkgröna nylontråd i 5 mm bitar och lägg på den klibbiga sidan av en dubbelsidig tejp på en petriskål. Under dissektionsmikroskop, separera varje bit i sina trådar med fin pincett och löst förbereda en enkel halvslag knut genom att ena änden tråden i den andra.
- Använd pincett, plocka en knut av dubbelhäftande tejp, se till att inte ta tag i det med för mycket tryck. Dra suturen i badlösningen, skjut knut på kanylen och dra den på avstånd från spetsen av kanylen. Upprepa denna process för att ha 2 suturer på varje kanyl.
- Coat en glasmikropipett med en 10% BSA lösning och sedan skölja bort överskottet med Ca2 + -fria aCSF kompletterad med 1% BSA.
- Dra 50 | il lösning i glas mikropipett, dra upp en parenkymal arteriole och överföra till tryck myography kammaren. Tryck kolven i en flytande rörelse för att dosera parenkymala arteriole in i kammaren för att hindra den från att fastna vid den inre kammaren av glas mikropipett.
- Med hjälp av två super fin pincett, öppna lumen PA, var noga med att endast vidröra slutet av kärlet.
- Med hjälp av pincett för att hålla kanterna av parenkymal arteriole försiktigt dra fartyget på kanylen. Dra tillräckligt långt på kanylen så att fartyget inte på mycket avsmalnande änden av kanylen (figur 3A).
- Lossa 2 suturer på kanylen och dra dem på fartyget (Figur 3B). Utrymme suturerna isär lite på fartyget, och dra mot operatören medan tightio det. Se till att alla grenar är bundna av innan du stänger den motsatta änden av parenkymal arteriole.
- Vända kammaren runt och stänga motsatta änden av parenkymal arteriol som en blind-sac. För att uppnå detta, öppna banden på motsatt kanylen och passera den på arteriole. Stäng långsamt knut på ett sådant sätt att den parenkymal arteriole kommer att knytas till den sidan av kanylen. Undvik längd sträcka av arteriole. (Figur 3C).
OBS: Om målet med studien är att BEGJUTA droger genom lumen, cannulate den motsatta änden i stället för att binda parenkymal arteriole vid sidan av kanylen. Se till att kanylerna inte har några saltkristaller eller interna uppbyggnader som blockerar intraluminal flöde. Reglera flödet lämpligt sätt för att upprätthålla skjuvspänning inom fysiologiska nivåer. En studie av Shih et al. Visar flöden i penetrerande arterioler hos råttor 8, och kan fungera som en första vägledning för piLot studier. - Försiktigt överföra kammaren till scenen i mikroskop för att användas för inspelning kärldiametern. Fäst kammaren på mikroskop scenen, som förbinder temperaturgivare och inlopp och utlopp för perfusion till rätt rör. Trycksätt arteriole till 40 mmHg intraluminal tryck för mus parenkymala arterioler eller 50 mmHg för rått arterioler, med användning av ett trycksystem som finns i laboratoriet (vattenpelare, peristaltisk pump kopplad till en tryckomvandlare, etc.). Figur 4D visar ett exempel på en peristaltisk pump kopplad till en tryckomvandlare för att trycksätta kanyler arteriole.
- Slå på systemet som används för att detektera förändringar i diameter (figur 3E). Justera inställningarna på mikroskopet, såsom belysning och kontrast, för att få den bästa detekteringen möjligt. Idealt väggarna i arteriole ska vara mörka och lumen genomskinlig. När upptäckt är lämpligt, börja spela in than experimentera.
- Starta superfusionssystemet. Tvätta den kanylerade, trycksatt parenkymal arteriole med varmt (37 ᵒ C) aCSF innehållande 1,8 mM Ca 2 + i 15 till 20 min vid en flödeshastighet mellan 3-5 ml / min. Detta aCSF bör inte innehålla DTZ eller BSA.
- Byt ut vanliga aCSF med 60 mM KCl aCSF att utvärdera lönsamheten av preparatet. Vid denna tidpunkt PA bör uppvisa 10-20% sammandragning till 60 mM KCl. Om arteriole inte ihop i den utsträckningen, ta bort och cannulate annan arteriole.
- Tvätta ur 60 mM KCl med vanlig aCSF. Vänta tills generering av spontan myogenic ton, vilket kan ta upp till en timme. Om arteriole inte har myogenic ton då, ersätta det med ett arteriole.
OBS: Myogenic tonen observeras som en gradvis, och ibland långsamt, reduktion i lumen diametern hos kärlet utan stimulering genom kontraktila agonister eller högt KCl-lösning. Myogenic ton beräknas med följande formula: (1 - (aktiv lumen diameter / passiv lumen diameter)) x 100 5 En lämplig mängd av myogenic tonen kan variera beroende på behandlingar, stammar, arter, transgener, osv.. I allmänhet varierar fysiologisk myogenic ton 15-30% 5.
4. Exempel Tryck Myography Experiment: agonistinducerad sammandragning och Myogenic reaktivitet
- Bered en serie av utspädningar av en agonist val i aCSF med hjälp av lämpliga koncentrationer. För det aktuella exemplet tromboxan-A2-receptor-agonist U46619 användes. En stamlösning av 1 ml av U46619 vid en koncentration av 1 mM framställdes. Överför 100 | il av 1 mM lösning till ett nytt rör innehållande 900 | il aCSF för att göra en 10-faldig spädning av läkemedlet, vilket resulterar i en lösning innehållande 100 | iM U46619. Upprepa denna process för 6 utspädningar från 1 mM till 100 nM för att förbereda en koncentration-respons constrictor kurva.
- Lägg tillhela volymen av lösningen innehållande agonist (1 ml för den första dosen, följt av 900 ul av alla efterföljande doser) till 100 ml superfusing aCSF. Detta kommer att leda till en extra 100-faldig utspädning av agonisten. Sålunda är de slutliga koncentrationerna av agonist i badet området från 10 pM till 10 pM. Låt arterioler inkubera för ~ 10 min i varje koncentration, tills luminala diameter når ett steady-state.
- Tvätta ut agonisten genom superfusing PA med aCSF utan droger tills PA diameter är tillbaka till det ursprungliga värdet. Inkubera parenkymal arteriole i Ca2 + -fri aCSF (utan BSA) kompletterat med 10 | iM Diltiazem + 2 mM EGTA för att inducera maximal dilatation och spela in passiv diametern hos arteriolen.
- Ta bort parenkymal arteriole från kanylen genom att försiktigt dra ut samtidigt som du håller i slutet av banden. Tvätta kärlet kammaren med dubbla avjoniserat vatten för att avlägsna skräp och överskott av agonist. Fylla kammaren med Ca2+ -fri aCSF + BSA och cannulate annan arteriole. Det rekommenderas inte att utföra mer än ett experiment per arteriole.
- För att utföra en myogenic reaktivitet experiment låta parenkymal arteriole till jämvikt vid 40 mmHg intraluminal tryck tills spontan myogenic tonen genereras (beskriven ovan). Minska intraluminala trycket till 5 mmHg och låta PA till jämvikt under ~ 5-10 minuter, tills luminala diameter når steady state. Öka det intraluminala trycket stegvis med användning av intervallet av val (till exempel från 5 till 140 mmHg i steg 20 mmHg).
- Utsätt inte arteriole till intraluminala tryck under 5 mmHg, eftersom det kan orsaka kollaps och skada endotelet på så sätt ändra resultaten av försöket.
- Vid slutet av tryckkurvan, superfuse parenkymal arteriole med Ca2 + -fria aCSF (utan BSA) kompletterat med 10 | iM Diltiazem + 2 mM EGTA och upprepa de trycksteg, med början på lowest tryck.
OBS: Detta kommer att ge de passiva diametrar PA, som är nödvändiga för att beräkna% myogenic ton, definieras av formeln:% ton = (1 - (aktiv diameter / passiv diameter)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A visar en representativ sammandragning av mus PAs till 60 mM KCl aCSF att utvärdera integriteten hos preparatet. PA bör tygla mellan 15-30% i närvaro av 60 mM KCl. Om förträngningen är under 15%, kassera PA och cannulate en annan, eftersom det tyder på att arteriole skadades under isoleringen och kanyleprocessen.
Figur 5B illustrerar PA sammandragning till ökande koncentrationer av tromboxan 2 analog U-46619 (22:00 till 1 ^ M) i superfusing badet. Förträngningen iakttogs som en minskning i lumen diameter efter inkubation med varje koncentration. PA fick anta jämvikt vid varje koncentration under 10 minuter. Dessa data kan analyseras och presenteras som en förändring i diameter (ΔDiameter) eller som en% kärlsammandragning till KCI, som normaliserar change diameter av det maximala sammandragning till 60 mM KCl.
Figur 6 visar ett representativt spårning av lumen diametern av en PA i en myogenic reaktivitet experiment. Steg ökningar i intraluminal tryck orsakar en graderad sammandragning av PA i närvaro av 1,8 mM extracellulärt Ca2 + (figur 6, lägre spårning). Inkubation av samma PA med aCSF utan Ca2 + och kompletterades med 10 | iM Diltiazem + 2 mM EGTA avskaffar myogenic tonalstring, och lumendiameter av PA ökar enligt intraluminal tryck (Figur 5, övre tracing), vilket är den passiva lumendiameter i arteriolen.
Figur 1: Schematisk bild av parenkymala arterioler. PA gren av ytan pial artärer och dyka in i den underliggande hjärnparenkymet. Varje PA perfuses en liten neuronal population inom dess kolonn territorium (markerade regioner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Isolering av mus Cerebral PA A) Bild av hjärnan med den ventrala ytan uppåt visar Circle of Willis (pil 1) och MCA förgreningar från det (pil 2). B) Bild av MCA med den underliggande hjärnvävnad. Pilen pekar på den mest proximala regionen av MCA från Circle of Willis. C) PA förgrening av MCA (pilar). Bar = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3: kanylering av isolerade mus PA A) bild av en PA kanyl men ännu inte bundna med suturer.. Den här bilden visar längden på PA att införas på kanylen innan du stänger den med suturer. B) PA är nu stängt på kanylen med 2 suturer för att garantera att det inte kommer att glida av kanylen efter trycksättning. C) Bild på en kanyl, tryck mus PA i en blind-sac experimentella konfigurationen. Bar = 50 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utrustning som används i vårt laboratorium för PA Experiment A) Dissektion mikroskop med.ljuskälla. B) Temperaturregulator. C) Peristaltisk pump för bad superfusion av aCSF. D) Tryck Servo Control, Living Systems instrumentering. E) Video Dimension Analyzer (nere till höger), övervaka (uppe till höger) och Video Edge Detection systemet lastas på en bärbar dator (vänster). F) Liten kärlkammare (linjär anpassning kammaren). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Sammandragning av PAs till KCl-inducerade depolarisation och Tromboxan A2 Analog U46619 A) Representativa sammandragning av mus PAs till 60 mM KCl aCSF att utvärdera integriteten hos preparatet.. PA bör tygla mellan 15-30% i närvaro av 60 mM KCl. B) U46619 inducerad sammandragning av PA; som observerats i spårning, U46619 orsakar enkoncentrationsberoende sammandragning av PA, observeras som en minskning i lumen diameter efter inkubation med varje koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Myogenic Reaktivitet hos PAs Stegvis ökning av intraluminal trycket orsakar en graderad sammandragning av PAs i närvaro av 1,8 mM extracellulär Ca 2+ (lägre spårning). Detta tryck-inducerad sammandragning är kännetecknande för motstånds arterioler. Inkubation av samma PA med aCSF utan 1,8 mM Ca2 + och kompletterades med 10 | iM Diltiazem + 2 mM EGTA avskaffar myogenic tonalstring, och lumendiameter av PA ökar enligt intraluminal tryck (övre spårning), som är de passiva lumen diameter av the arteriole. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebrala parenkymala arterioler är hög motstånds arterioler med få anastomoser och grenar som BEGJUTA distinkta neuronala populationer. Dessa specialiserade blodkärl är centrala aktörer i cerebrovaskulär auto och neurovaskulära koppling genom astrocyternas-medierad vasodilatation 1. Betydelsen av dessa specialiserade blodkärl i cerebral kärlsjukdom har varit känt i ca 50 år, då pionjärarbete av Dr Miller Fisher beskrev strukturella förändringar i parenkymala arterioler inom territorier lakunära infarkter i hjärnan hos patienter med högt blodtryck efter slakt 16 . Dessa förändringar, tillsammans med funktionsnedsättning, kan orsaka hypoperfusion av den djupa vita substansen, en viktig riskfaktor för utveckling av vaskulär relaterade demenssjukdomar 17. Parenkymala arterioler är funktionellt skiljer sig från stora intrakraniella och pial artärer samt ytan arterioler, vilket ackumulerade data använda dessa medlemmar av cerebrovaskulär träd kan inte vara lätt extrapoleras till parenkymala mikro. Trots deras tydliga betydelse för att upprätthålla korrekt hjärnans homeostas studier med fokus på fysiologi och funktionella Effekterna av dessa arterioler har varit knappa fram till de senaste åren, främst på grund av tekniska svårigheter som är förknippade med isolering och manipulation.
I föreliggande manuskriptet beskriver vi en enkel och reproducerbar teknik för isolering och kanylering av parenkymala arterioler för tryck myography studier molekylär analys eller framställning av infödda glatt muskulatur eller endotelceller. Dessutom presenterar vi uppgifter om användningen av denna teknik för att undersöka myogenic reglering, constrictor, och förhalnings mekanismer i parenkymala arterioler. Vi observerar att dessa fartyg är myogenically aktiv, genererar spontan myogenic ton när intraluminal trycket hålls på en konstant nivå, samt ändra dessmyogenic status inför förändringar i intraluminal tryck, ett fenomen som väl beskrivna för motstånds artärer kallas myogenic reaktivitet 18. Myogenic reaktivitet är en nyckelfaktor för att reglera perfusionstryck i hjärnan, hålla den konstant fasad fluktuationer i systemiskt arteriellt tryck, vilket förhindrar förlust av perfusion vid låga tryck, eller vasogent ödem vid högre tryck 18. Dessutom visar vi att dessa arterioler svara på vasoaktiva ämnen, såsom endotelin-1, en viktig endogen vasokonstriktor som produceras av endotelceller. En viktig begränsning av beredningen som beskrivs här är att genom att isolera de parenkymala arterioler vitala komponenter i neurovaskulära enheten går förlorade och funktionella hyperemisk svar kan inte läsas. Andra beredningar, såsom hjärna skiva, bibehålla strukturen hos den intakta neurovaskulära enheten och är mer lämpligt att studera astrocytisk kontroll av cerebral arteriell diameter 19. hoWever, i hjärnan skiva beredning, parenkymala arterioler är inte trycksatt och det behövs exogen administrering av receptorberoende kärlsammandragande medel för att efterlikna basal tonen för att studera vasodilaterande svar. Tryck myography och hjärnan skiva beredning bör överväga komplementär för studier av den cerebrala mikrocirkulationen.
Protokollet som beskrivs här anpassades från ett preparat som först beskrevs av Dacey och Duling 1982 20, och förändras genom Coyne et al. 21. Den stora skillnaden ligger i kanyle teknik som används. Medan Dacey och Duling och Coyne et al används två olika uppsättningar av pipetter, en anläggning extern pipett och en intraluminal kanyle pipett använder vi bara det intraluminala pipett och manuellt skjuta PA i pipetten . Denna teknik har nyligen använts för att utföra studier på råtta PA efter cerebral ischemi - reperfusionsskada 22, PA från Chrontiskt hypertensiva råttor 5, bland andra. Hos möss, utnyttjade vi denna teknik för att bedöma Ca 2 + -signaler i tryck PA glatta muskelceller under fysiologiska förhållanden och acidos genom koppling PA kanyle till laserskanning konfokalmikroskopi att bedöma Ca2 + vågor och gnistor i glatta muskelceller 13. Vi testade också flera neurovaskulära kopplingsmedel 3 och visade med hjälp av farmakologiska verktyg i samband med membran potentiella inspelningar att cerebrospecific uppreglering av spänningskänsliga kaliumkanaler K V 1 orsakar en channelopathy liknande defekt i små kärl sjukdom genetisk modell 7. Dessa exempel illustrerar livskraft denna beredning att svara på olika frågeställningar.
Det är viktigt att betona att isolering av cerebrala PA från hjärnvävnaden är det mest kritiska steget, som lättheten att kanyle beror på antalet och längden på PA isolated. Det kan ta några försök att optimera isolering. Vidare kan inlärningskurvan för kanyle vara lång och frustrerande, och initiala träffsäkerhet kan vara så låg som 50%. Men när behärskar, är reproducerbarheten och genomströmning av denna teknik hög, och många experiment kan utföras på en dag.
Sammanfattningsvis beskriver föreliggande manuskriptet en teknik för isolering och kanylering av cerebrala parenkymala arterioler. Sådant preparat isolerade vaskulära komponenten av neurovaskulära enhet, upprätthålla intakta svar tryck arterioler. Studier som använder isolerade PA kommer att ge värdefull insikt i den cerebrala parenkymal omsättning i både fysiologiska och patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
