Abstract
Intracerebral parenkymalt arterioler (BB), som omfatter parenkymalt arterioler, gennemtrængende arterioler og præ-kapillær arterioler, er høje modstand blodkar forgrener sig ud fra pial arterier og arterioler og dykning i hjerneparenkymet. Individuel PA perfundere en diskret cylindrisk område parenchym og neuroner i den. Disse arterioler er en central aktør i reguleringen af cerebral blodgennemstrømning både globalt (cerebrovaskulær autoregulering) og lokalt (funktionel hyperæmi). PA'er er en del af neurovaskulær enhed, en struktur, der matcher regional blodgennemstrømning til metabolisk aktivitet i hjernen og omfatter også neuroner, interneuroner og astrocytter. Perfusion gennem PAs er direkte forbundet med aktiviteten af neuroner i det pågældende område og stigninger i neuronal stofskifte fører til en forøgelse i lokal perfusion forårsaget af dilation af foderet PA. Regulering af PA'er afviger fra bedre karakteriseretpial arterier. Tryk vasokonstriktion er større i Pas og vasodilatoriske mekanismer variere. Hertil kommer, at PAs ikke modtage ydre innervation fra perivaskulære nerver - innervation er iboende og indirekte i naturen gennem kontakt med astrocytisk endfeet. Således ikke data vedrørende kontraktile regulering akkumuleret ved undersøgelser med anvendelse pial arterier ikke direkte oversætte til forståelsen PA funktion. Endvidere er det fortsat uafklaret, hvordan patologiske tilstande, såsom hypertension og diabetes, påvirker PA struktur og reaktivitet. Denne viden hul er til dels en konsekvens af de tekniske vanskeligheder vedrørende PA isolation og kanylering. I dette manuskript præsenterer vi en protokol til isolering og kanylering af gnavere PAs. Yderligere viser vi eksempler på eksperimenter, der kan udføres med disse arterioler, herunder agonist-induceret konstriktion og myogene reaktivitet. Selv er fokus for dette manuskript på PA kanylering og pres myography, isolerede PAs kan også anvendes til biokemiske, biofysiske, molekylære, og billeddannende undersøgelser.
Introduction
Den cerebrale cirkulation er unikt organiseret til at understøtte de metaboliske krav centrale neuroner, celler, der har begrænset energi butikker og er derfor meget følsomme over for ændringer i oxygentryk og levering af de nødvendige næringsstoffer. Som særlige neuronale delpopulationer bliver aktiv, når specifikke opgaver udføres, vaskulaturen fremmer en meget lokal stigning i perfusion at forhindre lokal hypoxi og nedbrydning af næringsstoffer 1. Dette er en form for funktionel hyperæmi kendt som neurovaskulære kobling, og er afhængig af den korrekte funktion af den neurovaskulær enhed, der består af aktive neuroner, astrocytter og cerebrale arterier 2. Intracerebral parenchymale arterioler, en gruppe af blodkar, der omfatter parenkymatisk, gennemtrængende og præ-kapillær arterioler, er centralt vigtige for denne reaktion, og det er så vigtigt at studere dem enkeltvis for at undersøge neurovaskulær kobling 3.
<p class = "jove_content"> parenchymal arterioler er små (20 - 70 um indvendig diameter) med høj modstand blodkar, perfundere særskilte neuronale populationer i hjernen. Forgrener sig ud fra pial arterier på overfladen, parenchymale arterioler trænge ind i hjernen parenkym på en næsten 90 ᵒ vinkel til foder undergrunden mikrocirkulationen (figur 1). Disse arterioler spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af passende perfusionstryk da de er de mest distale glat muskel-holdige fartøjer beskytter kapillærerne. I modsætning til overfladen pial cirkulation, parenchymale arterioler mangler sikkerhed grene og anastomoser, og følgelig er "flaskehalse" af cerebral cirkulation 4. Som et resultat, dysfunktion af parenchymale arterioler bidrager til udviklingen af cerebrovaskulære sygdomme, såsom vaskulær kognitiv svækkelse og små iskæmisk slagtilfælde (også kendt som tavse eller lakunære slagtilfælde). Undersøgelser indicate at parenchymale arterioler dysfunktion kan induceres ved essentiel hypertension 5, kronisk stress 6, og er en tidlig begivenhed i små kar sygdom genetisk musemodel 7. Endvidere eksperimentelt induceret okklusion af enkelte gennemtrængende arterioler i rotter er tilstrækkelig til at forårsage små iskæmiske slagtilfælde, som er cylindrisk i form, svarende dem observeret hos ældre mennesker 8.Ud over disse anatomiske forskelle, mekanismer, der regulerer kontraktionsfunktion forskellige mellem pial arterier og parenchymale arterioler. Myogene vasokonstriktion er større i parenkymale arterioler 9, muligvis på grund af manglen på ydre innervation 10, distinkte former for mechanotransduction 11, og forskelle i intracellulær Ca2 + signalering 12,13 i vaskulære glatte muskelceller. Noget tyder på, at endotel-afhængige vasodilaterende mekanismer også variere mellem disse vascunende segmenter, med parenkymale arterier udviser større afhængighed af mekanismer, der involverer Ca2 + -aktiverede K + kanaler og electrotonic kommunikation inden for karvæggen sammenlignet med diffunderbare faktorer såsom nitrogenoxid og prostacycliner 14. Derfor data indsamlet i forsøg med pial arterier kan ikke nødvendigvis gælde for parenkymatisk arterioler, efterlader et hul i vores viden om lokal kontrol af cerebral perfusion.
På trods af deres betydning, parenchymale arterioler er langt under-studerede, primært på grund af de tekniske udfordringer med isolering og montering for ex vivo undersøgelse. I dette manuskript beskriver vi en metode til at isolere og kanyle cerebrale parenchymale arterioler, som kan anvendes til tryk myography, eller at isolere væv til immunolabeling, elektrofysiologi, molekylærbiologi, og biokemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kanyle og Chamber Forberedelse
- Indsæt rene borsilicat glaskapillarer (ydre diameter: 1,2 mm; indvendig diameter: 0,69 mm; 10 mm i længden) ind i rillerne af en pipette aftrækker med en platin filament (diameter: 100 um).
- Ved hjælp af relevante indstillinger, trække kapillær at generere en kanyle med en lang og tynd spids (figur 2) ved hjælp af en mikropipette aftrækker. De indstillinger, der anvendes er: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, Time - 10.
- Sæt kanylen i holderen pres myograf kammer. Juster kanyler korrekt.
- bryde omhyggeligt spidserne af kanylerne ved anvendelse af en pincet under dissektionsmikroskop til den ønskede diameter. Her viser vi en kanyle med en 10 um spids (Figur 2).
- Fyld begge kanyler med kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) indeholdende 1,8 mM Ca2 +; fylde kammeret med Ca2 + -fri aCSF suppleret med 1% bovintalbumin (BSA) + 10 uM Diltiazem (alle opløsninger skal fremstilles frisk før starten af eksperimentet). Afhængig af størrelsen af kammeret, varierer rumfanget af aCSF mellem 5 og 20 ml. Opbevar kammeret ved 4 ᵒ C, indtil klar til at begynde kanylering.
BEMÆRK: Diltiazem er en reversibel L-typen spænding gated calcium inhibitor, som vil forårsage dilatation af arteriolerne, hvilket letter kanylering
2. Isolering af Parenkymalt arterioler
- Aflive dyret umiddelbart før dissektion ved hjælp af standard protokoller i laboratoriet, som er godkendt af institutionens dyr pleje udvalg. Anvendelsen af barbiturater eller carbondioxid foretrækkes, da andre almindeligt anvendte bedøvelsesmidler kan have vasodilatoriske virkninger i cerebral cirkulation 15. Alle dyreforsøg vist her er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Nevada School of Medicine, og er i agreement med National Institutes of Health "vejledende principper i Pleje og anvendelse af dyr".
- Aflive dyret under anvendelse af carbondioxid. Før halshugning, sikre, at dyret er stoppet vejrtrækning og ikke reagerer, når klemme sine poter.
- Halshugge dyret med en skarp saks (mus) eller guillotine (rotte). Fjern skindet fra dyrets hoved og klippe langs midterlinjen kranie sutur med en fin spids saks. Ved hjælp af en stump pincet (mus) eller en knogle tang forsigtigt fjerne kranieknoglerne og eksponere cerebrum. Fjern hjernen langsomt og forsigtigt for ikke at beskadige overfladen pial arterier. Placer hjernen i en beholder fyldt med 20 ml Ca2 + -fri aCSF suppleret med 1% BSA på is.
- Fyld en dissektion skål indeholdende en pude med iskold Ca2 + -fri aCSF suppleret med 1% BSA og overføre hjernen med den ventrale overflade vendende opad til denne skål (figur 2A). Placer fadet under en dissecTing mikroskop (figur 3A). Pin hjernen til puden ved hjælp 27-gauge nåle. Vær omhyggelig med at undgå at placere stifter nær midten cerebral arterie (MCA).
- Lokalisere Circle of Willis og MCA forgrening fra det. Brug skarpe og afstemt Vännäs foråret saks, klippe en lille rektangel omkring MCA. Sikre, at rektanglet er tæt på 5 mm på tværs gennem hele længden af MCA. Den øverste del af rektanglet skal være forbi forgreningspunktet fra Circle of Willis (proksimalt for Circle of Willis, figur 2B, pil).
- Brug af Vännäs foråret saks, udføre en underskæring i dybden af vævet i ca. 2 - 3 i mm.
BEMÆRK: Denne del er afgørende for god isolering af parenkymale arterioler, og det kan tage et par forsøg at få det rigtige. Hvis snittet er notat gjort dybt nok, vil de isolerede parenkymale arteriolerne være kort; hvis snittet er for dybt, vil arteriolerne pause på deres forgreningspunkt når det dissekeredevæv fjernes. - Pin ned den mest distale ende af hjernen skive ind i dissekere skål med MCA opad (distalt fra Circle of Willis) under anvendelse insekt ben. Lav en lavvandet snit til at skære pia nær stiften, og pas på ikke at skære for dybt ind i den underliggende hjernebark (ellers benene vil ikke holde).
- grab omhyggeligt hver side af pia med små pincet og begynde skrælning pia fra cortex. Hvis det er nødvendigt, at holde på MCA, der sikrer, at den omgivende pial membran ikke er beskadiget.
- Hold skrælning indtil pia indeholdende MCA er fri cortex. Bemærk, at modstanden mod afskalning vil øge tæt på Circle Willis. Vær ekstra forsigtig på dette punkt, fordi de længere parenkymalt arterioler vil være i denne region.
- Når pia er gratis, sættes omhyggeligt oven på puden på dissekere skålen med overfladen modsat parenkyme arterioler nedad (figur 2B). <li> Brug Vännäs foråret saks, klippe ud de dissekerede arterioler fri fra MCA, og sørg enderne af karret skæres ligeud.
- Samlede arterioler kan anvendes til tryk myography, molekylær analyse, eller isolering af nativt glat muskulatur eller endotelceller.
3. Pres Myography
- Forbered sutur forvejen. Skær mørkegrønne nylontråd i 5 mm stykker og placere på den klæbende side af en dobbeltsidet tape på en petriskål. Under dissektionsmikroskop, adskille hvert stykke til dets filamenter ved hjælp fine tænger, og løst forberede en simpel halv hitch knude ved at passere den ene ende af filamentet til den anden.
- Ved hjælp af pincet, vælge en knude fra dobbeltklæbende tape, og sørg for ikke at få fat i det med alt for meget pres. Træk suturen i badopløsningen, slide knude på kanylen og stram den i en afstand fra spidsen af kanylen. Gentag denne proces for at have 2 suturer på hver kanyle.
- Coat et glasmikropipette med en 10% BSA-opløsning og derefter skylle det overskydende med Ca2 + -fri aCSF suppleret med 1% BSA.
- Træk 50 ul løsning i glasset mikropipetten, trække op en parenkymalt arteriole og overføre til trykket myography kammer. Skub stemplet i en flydende bevægelse at dispensere parenkymalt arteriole ind i kammeret for at forhindre det i at klæbe til den indre kammer af glasset mikropipette.
- Brug to super fin pincet, åbne lumen PA, være omhyggelig med at kun røre allersidst i fartøjet.
- Brug af pincet til at holde kanterne af de parenkyme arteriole, forsigtigt trække fartøjet på kanylen. Træk langt nok på kanylen, så fartøjet ikke er på den meget tilspidsede ende af kanylen (figur 3A).
- Løsn de 2 suturer på kanylen og stram dem på fartøjet (figur 3B). Space suturerne hinanden lidt på skibet, og træk mod brugeren, mens Tighti det. Sørg for, at alle grene er bundet ud, før du lukker den modsatte ende af parenkymalt arteriole.
- Vend kammer rundt og lukke den modsatte ende af de parenkyme arteriole som blind vej. For at opnå dette, åbne bånd på den modsatte kanyle og videregive det på arteriole. lukker langsomt knuden på en sådan måde, at parenchymale arteriole vil være bundet til den side af kanylen. Undgå langsgående strækning af arteriole. (Figur 3C).
BEMÆRK: Hvis målet med undersøgelsen er at perfundere narkotika gennem hulrummet, kanyle den modsatte ende i stedet for at binde parenkymalt arteriole til siden af kanylen. Sørg for, at kanyler ikke har nogen saltkrystaller eller interne build-ups, der blokerer intraluminal flow. Regulere strømningshastigheden hensigtsmæssigt med henblik på at opretholde forskydningsspænding inden for fysiologiske niveauer. En undersøgelse af Shih et al. Viser strømningshastigheder inde gennemtrængende arterioler i rotter 8, og kan tjene som en indledende guide for pilot undersøgelser. - overføre omhyggeligt kammeret til det stadium af mikroskopet, der skal bruges til optagelse kardiameter. Fastgør kammeret på mikroskopet scenen, der forbinder temperatur sonde og indløb og udløb for perfusion til de korrekte rør. Tryksætte arteriole til 40 mmHg intraluminale tryk for muse parenchymale arterioler eller 50 mmHg for rotte arterioler, anvendelse af et tryk system til rådighed i laboratoriet (vandsøjlen, peristaltisk pumpe koblet til en tryktransducer, osv.). Figur 4D viser et eksempel på et peristaltisk pumpe koblet til en tryktransducer for at tryksætte den kanylerede arteriole.
- Tænd for systemet anvendes til at detektere ændringer i diameter (figur 3E). Juster indstillingerne på mikroskopet, såsom belysning og kontrast, for at opnå den bedst mulige detektion. Ideelt væggene i arteriole bør være mørk og lumen gennemskinnelige. Når registreringen er relevant, starte optagelsen than eksperimentere.
- Start superfusionssystem. Vask kanylerede, tryk parenchymale arteriole med varmt (37 ᵒ C) aCSF indeholdende 1,8 mM Ca2 + i 15 til 20 min ved en strømningshastighed mellem 3 - 5 ml / min. Denne aCSF bør ikke indeholde Diltiazem eller BSA.
- Udskift den almindelige aCSF med 60 mM KCl aCSF at vurdere levedygtigheden af præparatet. På dette tidspunkt PAs skal udvise 10 - 20% konstriktion til 60 mM KCI. Hvis arteriole ikke snøre i dette omfang, fjerne og kanyle anden arteriole.
- Skyl den 60 mM KCl med almindelig aCSF. Vent, indtil generering af spontan myogene tone, som kan tage op til en time. Hvis arteriole ikke har myogene tone inden da, erstatte det med en anden arteriole.
BEMÆRK: Myogenic tone observeres som en gradvis, og nogle gange langsomt, reduktion i lumen diameter af karret uden stimulering med kontraktile agonister eller høj KCl-opløsning. Myogene tone beregnes ved følgende formula: (1 - (aktiv lumen diameter / passiv lumen diameter)) x 100 5 En passende mængde myogene tone kan variere alt efter behandlinger, stammer, arter, transgene osv.. Generelt fysiologisk myogene tone mellem 15 - 30% 5.
4. Eksempel Pressure Myography Eksperimenter: Agonist-induceret konstriktion og Myogenic Reaktivitet
- Forbered en række fortyndinger af en agonist valg i aCSF ved hjælp af passende koncentrationer. For den nuværende eksempel thromboxan A2-receptoragonist U46619 blev anvendt. En stamopløsning af 1 ml af U46619 i en koncentration på 1 mM blev fremstillet. Transfer 100 ul af 1 mM opløsning i et nyt rør indeholdende 900 pi aCSF at lave en 10 ganges fortynding af lægemidlet, hvilket resulterer i en opløsning indeholdende 100 uM U46619. Gentag denne proces for 6 fortyndinger, der spænder fra 1 mM til 100 nM til at forberede en koncentration-respons kvælerslange kurve.
- Tilsæthele volumenet af opløsningen indeholdende agonist (1 ml for den første dosis, efterfulgt af 900 pi af alle efterfølgende doser) til 100 ml superfusing aCSF. Dette vil føre til en ekstra 100-gange fortynding af agonisten. Således er de endelige koncentrationer af agonist i badet området fra 10 pM til 10 uM. Tillad arterioler at inkubere i ~ 10 minutter i hver koncentration, indtil luminal diameter når en steady-state.
- Skyl agonisten ved superfusing PAs med aCSF uden medicin, indtil PA diameter er tilbage til den oprindelige værdi. Inkubér parenchymale arteriole i Ca2 + -fri aCSF (uden BSA) suppleret med 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA for at inducere maksimal udvidelse og registrere passiv diameter af arteriole.
- Fjern parenchymale arteriole fra kanylen ved forsigtigt at trække det ud, mens du holder ind i enden af båndene. Vask fartøjet kammer med dobbelt deioniseret vand for at fjerne snavs og overskud af agonist. Fylde kammeret med Ca2+ -fri aCSF + BSA og kanyle anden arteriole. Det anbefales ikke at udføre mere end én eksperiment pr arteriole.
- For at udføre en myogen reaktivitet eksperiment, tillader parenkymalt arteriole i ligevægt ved 40 mmHg intraluminale tryk, indtil spontan myogene tone genereres (beskrevet ovenfor). Reducer intraluminale tryk til 5 mmHg og tillade PA ækvilibrere i ~ 5 - 10 minutter, indtil luminal diameter når steady state. Øg intraluminale tryk trinvis hjælp intervallet valg (for eksempel fra 5 til 140 mmHg i 20 mmHg intervaller).
- Udsæt ikke arteriole til intraluminale tryk under 5 mmHg, som kan forårsage sammenbrud og beskadige endotel, således ændre resultaterne af forsøget.
- Ved afslutningen af trykkurven, superfuse det parenchymale arteriole med Ca2 + -fri aCSF (uden BSA) suppleret med 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA og gentag trykket trin begyndende ved lowest tryk.
BEMÆRK: Dette vil give de passive diametre af PA, som er nødvendige for at beregne% myogene tone, defineret ved formlen:% tone = (1 - (aktiv diameter / passiv diameter)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5A viser et repræsentativt konstriktion af muse PAs til 60 mM KCI aCSF at evaluere integriteten af præparatet. PA'er bør snøre mellem 15 - 30% i nærvær af 60 mM KCl. Hvis forsnævringen er under 15%, kasseres PA og kanyle en anden, da det tyder på, at arteriole blev beskadiget under isolation og kanylering proces.
Figur 5B illustrerer PA konstriktion for stigende koncentrationer af thromboxan A2 analog U-46619 (10 pM til 1 uM) i superfusing bad. Indsnævringen blev observeret en reduktion i lumen diameter efter inkubation med hver koncentration. PA lodes ækvilibrere ved hver koncentration i 10 minutter. Disse data kan analyseres og præsenteres som en ændring i diameter (ΔDiameter) eller som en% vasokonstriktion til KCI, som normaliserer Change i diameter ved den maksimale indsnævring til 60 mM KCI.
Figur 6 viser et repræsentativt sporing af lumen diameter af en PA i en myogene reaktivitet eksperiment. Trinvise stigninger i intraluminale tryk forårsager en gradueret konstriktion af PA'er i nærvær af 1,8 mM ekstracellulær Ca2 + (figur 6, lavere tracing). Inkubation af samme PA med aCSF uden Ca2 + og suppleret med 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA ophæver myogene tonegenerering, og lumen diameter BB stiger ifølge intraluminale tryk (figur 5, øvre tracing), som er den passive lumen diameter af arteriole.
Figur 1: Skematisk af Parenkymalt arterioler. PAs gren ud af overfladen pial arterier og dykke ned i den underliggende hjerneparenkym. Hver PA gennemløber vævet en lille neuronal befolkning inden for sit søjleformede område (fremhævet regioner). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Isolering af Mouse Cerebral PAs A) Billede af hjernen med den ventrale overflade vender opad viser Circle of Willis (pil 1) og MCA forgrener sig ud fra det (pil 2). B) Billede af MCA med det underliggende hjernevæv. Pilen peger på den mest proksimale region i MCA fra Circle of Willis. C) PAs forgrening af MCA (pile). Bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3: Kanylering af Isoleret Mouse PAs A) Billede af en PA kanyleret, men endnu ikke bundet med suturerne.. Dette billede illustrerer længden af PA, der skal indsættes på kanylen, før det lukkes med suturer. B) PA er nu lukket på kanylen med 2 suturer at garantere, at det ikke vil glide af kanylen efter trykforøgelse. C) Billede af en kanyle, tryk mus PA i en blind vej eksperimentel konfiguration. Bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Udstyr Brugt i vores laboratorium for PA Eksperimenter A) Dissektion mikroskop med.lyskilde. B) Temperatur controller. C) Peristaltisk pumpe til bad superfusionssystem af aCSF. D) Pressure Servo Control Living Systems Instrumentation. E) Video Dimension Analyzer (nederst til højre), overvåge (øverst til højre) og video Edge Detection-system indlæst på en bærbar computer (til venstre). F) Små fartøj kammer (lineær justering kammer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: konstriktion af PAs til KCI-induceret Depolarisering og thromboxan 2 Analog U46619 A) repræsentant konstriktion af muse PAs til 60 mM KCI aCSF at evaluere integriteten af præparatet.. PA'er bør snøre mellem 15 - 30% i nærvær af 60 mM KCl. B) U46619 inducerede konstriktion af PA; som observeret i opsporing, U46619 forårsager enkoncentrationsafhængig konstriktion af PAs, observeret som en reduktion i lumen diameter efter inkubation med hver koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Myogenic Reaktivitet af PAs Trinvis stigninger i intraluminale tryk forårsager en gradueret konstriktion af PA'er i nærvær af 1,8 mM ekstracellulær Ca2 + (lavere sporing). Dette pres-induceret indsnævring er karakteristisk for resistens arterioler. Inkubation af samme PA med aCSF uden 1,8 mM Ca2 + og suppleret med 10 pM Diltiazem + 2 mM EGTA ophæver myogene tonegenerering, og lumen diameter BB stiger ifølge intraluminale tryk (øvre sporing), som er de passive lumen diameter the arteriole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerebral parenkymalt arterioler er høje modstand arterioler med få anastomoser og grene, der perfundere forskellige neuronale populationer. Disse specialiserede blodkar er centrale aktører i cerebrovaskulær autoregulering og neurovaskulær kobling gennem astrocyt-medieret vasodilatation 1. Betydningen af disse specialiserede blodkar i cerebral vaskulær sygdom har været kendt i ca. 50 år, hvor pionerarbejde Dr. Miller Fisher beskrevet strukturelle ændringer i parenkymale arterioler inden for de områder lakunære infarkter i hjernen hos hypertensive patienter post mortem 16 . Disse ændringer, koblet til funktionsnedsættelse, kan forårsage hypoperfusion af den dybe hvide substans, en stor risikofaktor for udvikling af vaskulær-relateret demens 17. Parenchymale arterioler er funktionelt adskilt fra store intrakranielle og pial arterier samt overflade arterioler, således akkumuleret data hjælp af disse medlemmer af cerebrovaskulær træ kan ikke let ekstrapoleres til de parenkyme mikrocirkulationen. På trods af deres klare betydning at opretholde en ordentlig hjerne homeostase, undersøgelser, der fokuserer på fysiologi og funktionelle svarene fra disse arterioler har været knappe indtil de seneste år, primært på grund af tekniske vanskeligheder forbundet med isolation og manipulation.
I den foreliggende manuskript beskriver vi en enkel og reproducerbar teknik til isolering og kanylering af parenchymale arterioler for tryk myography studier, molekylær analyse, eller fremstilling af nativt glat muskulatur eller endotelceller. Desuden præsenterer vi data om anvendelsen af denne teknik til at undersøge myogene regulering, constrictor, og forhale mekanismer i parenkymale arterioler. Vi observerer, at disse fartøjer er myogenically aktiv, genererer spontan myogene tone når intraluminale tryk opretholdes på et konstant niveau, samt at ændre densmyogene status overfor ændringer i intraluminal tryk, et fænomen velbeskrevet for modstandskar kaldet myogene reaktivitet 18. Myogene reaktivitet er en nøglefaktor i reguleringen perfusion tryk i hjernen, holde det konstant modstående udsving i systemisk arterietryk, hvilket forhindrer tab af perfusion ved lave tryk, eller vasogent ødem ved højere tryk 18. Derudover viser vi, at disse arterioler svare vasoaktive stoffer, såsom endotelin-1, en vigtig endogen vasokonstriktor produceret af endothelceller. En væsentlig begrænsning af præparatet beskrevet her er, at ved at isolere parenchymale arterioler vitale elementer i neurovaskulær enhed er tabt, og funktionelle hyperæmiske responser kan ikke undersøgt. Andre præparater, såsom hjerne skive, bevare strukturen af det intakte neurovaskulær enhed og er mere hensigtsmæssigt at studere astrocytisk kontrol af cerebral arteriolær diameter 19. However, i hjernen skive forberedelse, parenchymale arterioler er ikke tryksat og exogen administration af receptor afhængige vasokonstriktor midler er nødvendig for at efterligne basal tone for at studere vasodilatoriske respons. Pres myography og forberedelse hjernen skive skal overveje et supplement til studiet af den cerebrale mikrocirkulationen.
Den her beskrevne protokol blev tilpasset fra et præparat først beskrevet af Dacey og Duling i 1982 20, og ændret af Coyne et al. 21. Den største forskel ligger i kanylering anvendte teknik:. Mens Dacey og Duling og Coyne et al anvendt to forskellige sæt af pipetter, en bedrift ekstern pipette og en intraluminal kanylering pipette, bruger vi kun det intraluminale pipette og manuelt skubbe PA ind i pipetten . Denne teknik er for nylig blevet anvendt til at udføre forsøg på rotter PAs efter cerebral iskæmi - reperfusionsskade 22, PAs fra Chrontisk hypertensive rotter 5, blandt andre. Hos mus, vi udnyttet denne teknik til at vurdere Ca2 + signaler i tryksatte PA glatte muskelceller under fysiologiske betingelser og acidose ved kobling PA kanylering til laserscanning konfokal mikroskopi for at vurdere Ca2 + bølger og gnister i glatte muskelceller 13. Vi testede også flere neurovaskulære koblingsmidler 3 og demonstreret under anvendelse farmakologiske værktøjer i forbindelse med membranpotentialet indspilninger, at cerebrospecific opregulering af spændingsstyrede kaliumkanaler K V 1 forårsager en channelopathy-lignende defekt i små kar sygdom genetisk model 7. Disse eksempler illustrerer levedygtigheden af dette præparat til at besvare forskellige forskningsspørgsmål.
Det er vigtigt at understrege, at isolering af cerebrale PAs fra hjernevævet er den mest kritiske trin, som den lette kanylering vil afhænge af antallet og længden af PA isolated. Det kan tage et par forsøg for at optimere isolation. Endvidere kan indlæringskurve for kanylering være lang og frustrerende, og indledende succesrate kan være så lav som 50%. Men når beherskes, reproducerbarhed og gennemløb af denne teknik er høj, og kan udføres mange eksperimenter på én dag.
Sammenfattende den foreliggende manuskript beskriver en teknik til isolering og kanylering af cerebrale parenchymale arterioler. Sådant præparat isoleret det vaskulære komponent i neurovaskulær enhed, opretholdelse intakte responser under tryk arterioler. Studier med isolerede PAs vil give værdifuld indsigt i den cerebrale parenkymalt omsætning, i både fysiologiske og patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
