Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Published: May 23, 2016 doi: 10.3791/53835

Abstract

parankimal Arteriolleri, delici arteriol ve pre-kapiller Arteriolleri içeren Intraserebral parankimal arteriol (genelge), beyin parankimi içine pial arterler ve arteriol ve dalış dallanma yüksek direnç kan damarları vardır. Bireysel PA parankim ayrı bir silindirik bölge ve içinde bulunan nöronlar serpmek. Bu arteriyollerde yerel serebral kan akımı, hem küresel (serebrovasküler otoregülasyon) ve (fonksiyonel hiperemi) düzenlenmesinde merkezi bir oyuncu vardır. PA nörovasküler biriminde, beyin içinde metabolik aktivite bölgesel kan akımı ile eşleşen bir yapının parçası olan ve aynı zamanda nöronlar, internöronlardan ve astrositler içerir. Pleomorfik adenomun ile perfüzyon doğrudan yem PA genişlemesinden kaynaklanır yerel perfüzyon bir artışlarına söz konusu bölgede nöronlar ve nöronal metabolizma kurşun artışların aktivitesi ile bağlantılıdır. Pleomorfik düzenlenmesi daha iyi karakterize farklıdırpial arterler. Basınç kaynaklı vazokonstriksiyon PA olgularında daha büyüktür ve vazodilatör mekanizmaları değişir. Buna ek olarak, PA perivasküler sinirler dışsal innervasyon almıyorsunuz - innervasyon astrositik endfeet ile temas yoluyla içsel ve doğada dolaylı olduğunu. Böylece, pial arterleri kullanarak çalışmalarla biriken kontraktil düzenlenmesi ile ilgili verileri doğrudan PA işlevini anlamak için anlamına gelmez. Hipertansiyon ve diyabet gibi patolojik durumlar, PA yapısı ve reaktivite nasıl etkilediğini Ayrıca, belirsiz kalır. Bu bilgi boşluğu kısmen PA izolasyon ve kanülasyona ilişkin teknik zorluklar bir sonucudur. Bu yazıda izolasyon ve kemirgen PA olgularının kanülasyon için bir protokol mevcut. Dahası, agonist kaynaklı daralma içi ve kas reaktivitesi de dahil olmak üzere, bu arteriyoller ile yapılabilir deneylerin örnekleri göstermektedir. Bu yazının odak noktası PA kanülasyon ve basınç myography üzerinde olmasına rağmen, PA izoles da biyokimyasal biyofiziksel moleküler ve görüntüleme çalışmaları için kullanılabilir.

Introduction

serebral dolaşım benzersiz merkezi nöronları, enerji depolar sınırlı ve oksijen basıncı ve gerekli besinlerin temini değişimlere dolayısıyla son derece duyarlıdır hücrelerin metabolik taleplerini desteklemek üzere düzenlenmiştir. Özel görevler yapılırken özellikle nöronal alt popülasyonlar aktif hale geldikçe, damarsal yerel hipoksi ve besin 1 tükenmesi önlemek için perfüzyon oldukça lokalize bir artış teşvik etmektedir. Bu aktif nöronlar, astrositler ve serebral arterlerin 2 oluşan nörovasküler kaplin olarak bilinen fonksiyonel hiperemi şeklidir ve nörovasküler ünitenin düzgün çalışması bağlıdır. İntraserebral parankimal Arterioller, kan damarları, parankimal kapsayan delici ve pre-kapiller arteriol bir grup, bu yanıt için merkezi önem taşımaktadır ve nörovasküler kaplin 3 araştırmak amacıyla bunları tek tek incelemek için kritik öneme sahiptir.

<beyin içinde farklı nöron popülasyonları serpmek - (70 mikron iç çapı 20) yüksek dirençli kan damarları p class = "jove_content"> parankim arteriol küçüktür. Yüzeyde pial arterlerden dallanma, parankimal arteriol yeraltı mikro dolaşımı (Şekil 1) beslemek için yaklaşık 90 açıyla beyin parankimi içine nüfuz eder. Bu arteriyollerde onlar kılcal koruyan en uzak düz kas içeren kaplar gibi uygun perfüzyon basıncını muhafaza kritik bir rol oynamaktadır. Yüzey pial dolaşıma aksine, parankimal arteriol teminat şubesi ve anastomoz eksikliği ve dolayısıyla serebral dolaşımın 4 "darboğazlar" dir. Sonuç olarak, parankimal arteriollerin disfonksiyonu gibi vasküler kognitif bozukluk ve küçük iskemik inme (aynı zamanda sessiz veya laküner vuruş olarak da bilinir) gibi serebrovasküler hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. çalışmalar Indicate bu parankimal arteriyollerinde disfonksiyonu esansiyel hipertansiyon 5, kronik stres 6 tarafından uyarılan ve küçük damar hastalığı, genetik fare modelinde 7 erken bir olaydır olabilir. Sıçanlarda bir nüfuz arteriyollerin Bundan başka, deneysel olarak indüklenmiş oklüzyon yaşlı insanlarda 8 gözlenenler silindirik, benzer küçük bir iskemik inme neden olmak için yeterli olduğunu.

Bu anatomik farklılıklara ek olarak, kontraktil fonksiyon düzenleyici mekanizmalar Pial arter ve parenkimal arteriyollerin arasında farklılık gösterir. Miyojenik vazokonstriksiyon nedeniyle muhtemelen damar düz kas hücrelerinde 12,13 sinyalizasyon hücre içi Ca dışsal inervasyon 10, mechanotransduction 11 farklı modları ve farklılıkların olmaması 2+ arasında parankimal arteriyollerde 9 daha fazladır. Kanıt endotele bağımlı vazodilatör mekanizmaları da bu vascu arasında farklılık göstermektedirCa 2+ içeren mekanizmalar üzerinde daha fazla güven sergileyen parankimal arterler ile lar bölümleri, nitrik oksit ve prostasiklinler 14 olarak yayılabilir faktörlerle karşılaştırıldığında damar duvarındaki K + kanalları ve elektrotonik iletişim -etkinleştirilmiş. Bu nedenle, veri serebral perfüzyon yerel kontrolü bilgimizin bir boşluk bırakarak, mutlaka Arteriolleri parenkimal için geçerli olmayabilir pial arterleri kullanarak deneylerde toplandı.

Onların önemine rağmen, parankimal arteriol öncelikle izolasyon ve ex vivo çalışma için montaj teknik zorluklar altında incelenmiş, büyük ölçüde vardır. Bu yazıda izole ve basınç myography için kullanılabilir ya da immunolabeling, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, ve biyokimyasal analiz için doku izole etmek için olan serebral parenkimal arteriyollerin kanülasyonu için bir yöntem tarif eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kanül ve Odası Hazırlık

  1. (Dış çap: 1.2 mm; iç çapı: 0.69 mm, uzunluğu 10 mm), temiz borosilikat cam kılcal takın bir platin filaman (100 um çapında), bir pipet çektirmenin oluklara.
  2. Uygun ayarları kullanarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak, uzun ve ince ucu (Şekil 2) ile bir kanül oluşturmak için kılcal çekin. kullanılan ayarlar şunlardır: Isı - 700, Pull - 100, Hız - 50, Zaman - 10.
  3. Basınç myograph odasının tutucu içine kanül yerleştirin. uygun kanüller aynı hizaya getirin.
  4. Dikkatle istenilen çapa mikroskop altında bir forseps kullanarak kanüller ipuçları bölünürler. Burada, bir 10 um ucu ile bir kanül (Şekil 2) göstermektedir.
  5. 1.8 mM Ca2 + içeren yapay serebrospinal akışkan (CSF) her iki kanüllerin doldurmak; % 1 sığır serumu ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen ACSF bölmeyi doldurmakalbümini (BSA) + 10 uM diltiazem (bütün çözeltiler, deney başlamadan önce taze hazırlanmalıdır). odasının boyutuna bağlı olarak, 5 ila 20 ml arasında aCSF hacmini gösterir. Kanülasyon başlatmak için hazır olana kadar 4 C odasına saklayın.
    NOT: Diltiazem kanül kolaylaştıran arteriollerin genişlemesine neden olur tersine çevrilebilir bir L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum inhibitörü,

Parankimal arteriollerin 2. izolasyonu

  1. Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış laboratuarda standart protokolleri kullanarak hemen önce diseksiyon hayvan Euthanize. Diğer yaygın olarak kullanılan anestezikler, serebral dolaşım 15 vazodilatör etkileri olabilir barbitüratlar veya karbon dioksit kullanılması tercih edilmektedir. Burada gösterilen tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Tıp Nevada Okulu Üniversitesi Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış, ve ag geçmiş bulunmaktadır"Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yol Gösterici İlkeler" Sağlık National Institutes ile reement.
  2. Karbondioksit kullanarak hayvan Euthanize. dekapitasyon önce, hayvan nefes durdu ve pençeleri kısma zaman tepkisiz olduğunu olduğundan emin olun.
  3. keskin bir makas (fare) ya da giyotin (sıçan) kullanarak hayvan başını kesmek. Hayvanın başının cildi çıkarın ve ince uçlu makas kullanılarak orta hat kafatası sütür boyunca kesilir. künt forseps (fare) ya da kemik Pense kullanarak dikkatli bir şekilde kafatası kemikleri kaldırmak ve beyni maruz kalmaktadır. yavaş ve dikkatli yüzey pial damarlara zarar etmeyecek şekilde beyin çıkarın. Buz üzerinde% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen aCSF 20 ml dolu bir kap içine beyin yerleştirin.
  4. % 1 BSA ile desteklenmiş buz soğukluğunda Ca2 + içermeyen ACSF bir ped ihtiva eden bir diseksiyon çanak doldurun ve çanak (Şekil 2A) için yukarı doğru bakan ventral yüzeyi ile beyin aktarın. Bir dissec altında tabak yerleştirinting mikroskobu (Şekil 3A). 27-gauge iğne kullanılarak pad beyin sabitleyin. orta serebral arter (MCA) yakınlarındaki işaretçilerine yerleştirerek önlemek için dikkatli olun.
  5. Willis ve ondan dallanma MCA Çemberi yerelleştirilmesine. Keskin ve hizalanmış Vannas yaylı makas kullanılarak, MCA etrafında küçük bir dikdörtgen kesin. Bu dikdörtgen MCA tüm uzunluğu boyunca genelinde 5 mm yakın olduğundan emin olun. Dikdörtgenin üst kısmı (Willis, Şekil 2B, ok Circle proksimal) Willis poligonu gelen dallanma noktasından öteye olmalıdır.
  6. 3 mm - Vannas yaylı makas kullanılarak, yaklaşık 2 için doku derinlemesine bir alttan gerçekleştirin.
    NOT: Bu bölüm parankimal arteriollerin iyi izolasyonu için kritik olduğunu ve doğru almak için birkaç deneme alabilir. kesim yeterince derin yapılmış notu ise, izole parankimal arteriol kısa olacaktır; kesim çok derin ise disseke zaman, arteriol kendi dallanma noktasında kıracakdoku çıkarılır.
  7. böcek pimleri kullanarak yukarı (Willis poligonu gelen distalinde) bakan MCA ile diseksiyon çanak içine beyin dilim en uzak ucunu aşağı pin. sığ bir kesi altta yatan serebral korteks (aksi pimleri tutmak olmaz) çok derin kesmek için dikkatli olmak, pin yakın pia kesmek için emin olun.
  8. Dikkatle küçük forseps ile pia her tarafında yakala ve korteksten pia soyma başlar. Gerekirse, çevredeki pial zarı hasar olmadığından emin olduktan, MCA üzerinde tutmak.
  9. MCA içeren pia korteks serbest kalıncaya kadar soyulması tutun. soyulmaya karşı direnç Çember Willis yakın artacağını unutmayın. uzun parankimal arteriyollerde bu bölgede olacak çünkü, bu noktada ekstra dikkatli olun.
  10. Pia ücretsiz sonra, (Şekil 2B) aşağı bakacak şekilde Arteriolleri parenkimal yüzey ile ters diseksiyon çanak pedin üstüne dikkatlice yerleştirin.
  11. <li> Vannas yaylı makas kullanarak, geminin uçları açık açık kesilir emin olun, MCA ücretsiz disseke Arteriolleri kesip.
  12. Toplanan arteriyoller basınç myography, moleküler analiz, ya da yerli düz kas veya endotel hücrelerinin izolasyonu için de kullanılabilir.

3. Basınç myography

  1. Vaktinden önce dikiş hazırlayın. 5 mm parçalar halinde koyu yeşil naylon iplik kesin ve Petri kabı bir çift taraflı bant yapışkan tarafına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak filamentler içine her parçayı ayrı ve gevşek bir ucunu diğer içine filaman geçirerek basit bir yarı-hitch düğüm hazırlamak.
  2. forseps kullanarak, çok fazla basınç ile kapmak için değil emin, çift taraflı bant kapalı bir düğüm seçin. kanül üzerine banyo çözüm, slayt düğüme dikiş çekin ve kanülün ucundan bir mesafede sıkın. Her kanül 2 sütür için bu işlemi tekrarlayın.
  3. Bir cam Coat% 10 BSA çözeltisi ile mikropipet ve daha sonra% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen ACSF aşırı durulayın.
  4. Cam mikropipet içine çözeltinin 50 ul çekin bir parankimal arteriolden yukarı çekin ve basınç myography odasına transfer. Cam mikropipet iç odaya yapışmasını önlemek için odasına parankimal arteri dağıtmak için bir sıvı hareket pistonu itin.
  5. iki süper ince forseps kullanarak, sadece geminin çok ucunu dokunmaya özen göstererek, PA lümen açın.
  6. forseps kullanarak dikkatli bir şekilde kanül üzerine gemi çekme, parankimal arteriyol kenarlarını tutun. Damar kanül (Şekil 3A) çok konik sonunda olmayacak şekilde kanül üzerinde yeterince çekin.
  7. Kanül 2 sütür gevşetin ve gemi (Şekil 3B) onları sıkın. Uzay gemi üzerinde ayrı sütür biraz ve operatöre doğru çekin tigh ikenOn onu. herhangi bir dalları parankimal arteriole diğer ucunu kapatmadan önce kapalı bağlı olduğundan emin olun.
  8. etrafında odasına dönün ve bir kör-sac olarak parankimal arteriole diğer ucunu kapatın. Bunu başarmak için, ters kanül üzerinde bağları açıp arteriole üzerine geçmektedir. Yavaş yavaş parankimal arteriol kanülün tarafına bağlı olacaktır şekilde düğüm kapatın. arteriole boyuna streç kaçının. (Şekil 3C).
    NOT: Bu çalışmanın amacı, lümen yoluyla ilaç perfüze edilmesi için ise, kanülün tarafına parankimal arteri bağlama yerine ucunu kanüle. kanüller herhangi bir tuz kristalleri veya intraluminal akışını engellemek iç yapı-up yok emin olun. Fizyolojik seviyelerde kesme gerilimi muhafaza etmek için uygun bir şekilde akış hızını düzenler. Shih ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada sıçanlarda 8 Arteriolleri delici içinde debileri gösterir ve pi için bir başlangıç ​​rehber olarak hizmet verebilirlot çalışmaları.
  9. Dikkatle damar çapı kayıt için kullanılmak üzere mikroskop aşamasına odası aktarın. Doğru tüplere perfüzyon için sıcaklık probu ve giriş ve çıkışları bağlamak, mikroskop sahneye odasına takın. (Bir basınç transdüktörüne bağlanan, peristaltik pompa, vb. Su sütunu) laboratuarda uygun bir basınç sistemi kullanılarak, 40 mm Hg lümen içi bir fare parankimal arteriyollerin için basınç veya sıçan arteriyollerin 50 mmHg arteri zorlar. Şekil 4D bir örneğini göstermektedir bir basınç transdüktörüne bağlı peristaltik pompa kanül arteri basınç uygulamak için.
  10. Çapı (Şekil 3E) değişiklikleri tespit etmek için kullanılan sistemi açın. Mümkün olan en iyi algılama elde etmek amacıyla, bu tür aydınlatma ve kontrast gibi mikroskop ayarları ayarlayın. İdeal arteriole duvarları karanlık ve lümen saydam olmalıdır. algılama uygun olduğunda, t kaydetmeye başlamakO deneme.
  11. superfusion sistemini başlatın. 5 ml / dak - 3 arasında bir akış hızında 15 ila 20 dakika süreyle 1.8 mM Ca2 + içeren sıcak (37 C) ACSF kanüllenmiş, basınçlı parankimal arteri yıkayın. Bu CSF diltiazem ve BSA içermemelidir.
  12. hazırlık canlılığı değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF düzenli aCSF değiştirin. 60 mM KCI% 20 ​​daralma - Bu noktada PA 10 sergilemelidir. arteriole ölçüde daraltıyor vermezse, kaldırmak ve başka arteri cannulate.
  13. Düzenli aCSF ile 60 mM KCl yıkayın. bir saat kadar sürebilir spontan miyojenik ton, üretimi kadar bekleyin. arteriole o zamana kadar miyojenik sesi yoksa, başka bir arteriyol ile değiştirin.
    Not: miyojenik sesi kontraktil agonistleri veya yüksek KCI çözeltisi uyarı olmaksızın kabın lümen çapına kademeli bir ve bazen yavaş azalma olarak görülmektedir. Miyojenik tonu aşağıdaki f hesaplanırormula: (1 - (aktif lümen çapından / pasif lümen çapı)) 100 5 x miyojenik sesi uygun miktarda vb tedaviler, suşlar, türler, transgenik göre değişebilir.. % 30 5 - Genel olarak, fizyolojik miyojenik ton 15 arasında değişmektedir.

4. Örnek Basınç myography deneyler: agonist kaynaklı Daralma andMyogenic reaktivite

  1. uygun konsantrasyonlarda ACSF tercih edilen bir agonistin bir seyreltme serisi hazırlanır. Bu örnek için tromboksan A2 reseptörü agonisti U46619 kullanılmıştır. 1 mM'lik bir konsantrasyonda U46619 1 ml stok çözeltisi elde edilmiştir. Aktarım 100 uM U46619 ihtiva eden bir çözelti elde ilacın 10 kat seyreltme yapmak aCSF 900 ul ihtiva eden yeni bir tüpe 1 mM çözeltisinin 100 ul. Bir konsantrasyon-yanıt konstriktör eğrisi hazırlamak için 1 mM'den 100 nm arasında değişen, 6 dilüsyonları için bu işlemi tekrar edin.
  2. EkleaCSF superfusing 100 ml (daha sonraki bütün doz 900 ul ve ardından ilk doz için 1 ml) agonist içeren çözeltinin tüm hacmi. Bu agonistin ilave 100 kat seyreltildikten yol açacaktır. Bu durumda, 10 pM ila 10 uM banyosu aralığında agonist nihai konsantrasyonlar. lümen çapı kararlı duruma ulaşıncaya kadar, arteriol ~ her konsantrasyonda 10 dakika inkübe izin verin.
  3. PA çapı özgün değerine geri gelene kadar herhangi bir ilaç vermeden aCSF PAS superfusing ile agonist yıkayın. Maksimum genişlemeyi başlatıcı ve arteriole pasif çapı kaydetmek için 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile desteklenmiş (BSA) olmadan Ca 2 + içermeyen aCSF parankimal arteri kuluçkaya yatmaktadır.
  4. dikkatlice ilişkilerin ucuna tutarak çekerek kanül parankim arteri çıkarın. artıkları ve agonist fazlasının ayrılması için çift deiyonize su ile damar haznesi yıkayın. Ca odasına doldurun2 + içermeyen aCSF + BSA ve başka bir arteri cannulate. Arteriol başına birden fazla deney yapılması tavsiye edilmez.
  5. Bir miyojenik tepkime deneyi gerçekleştirmek için, kendiliğinden miyojenik tonu (yukarıda tarif edilen) oluşturulana kadar parankimal arteriol 40 mmHg lümen içi basınçta dengelenmeye gelmeye bırakın. lümen çapı kararlı duruma ulaşana kadar, 10 dakika - 5 mmHg intraluminal basıncı azaltmak ve PA ~ 5 için gelmesini sağlayınız. (20 mmHg artışlarla 5 140 mmHg örneğin) tercih aralığını kullanarak intraluminal basınç kademeli artırın.
  6. Bu nedenle deney sonuçlarını değiştirerek, endotel çökmesine neden olabilir ve zarar verebileceğinden, 5 mmHg'nin altında intraluminal basınç arteri maruz bırakmayın.
  7. Basınç eğrisinin sonunda lowes başlayarak 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile takviye edilmiş Ca (BSA'sız) 2 + içermeyen ACSF parankimal arteri superfuse ve basınç adımları tekrarlayınt basıncı.
    NOT: Bu formülle belirlenen% myojenik sesi hesaplanması için gerekli olan PA pasif çapları, verecektir:% tonu = (1 - (aktif çap / pasif çap)) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 5A hazırlık bütünlüğünü değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF fare PA olgularının temsili daralmasını gösterir. 60 mM KCI mevcudiyetinde% 30 - PA 15 arasında büzülür gerekir. daralma% 15 altında ise, PA atmak ve arteriole izolasyon ve kanülasyon sırasında zarar gördüğünü anlaşılacağı gibi, başka bir cannulate.

Şekil 5B, superfusing banyosuna tromboksan A 2 analog U 46619 (22:00 uM 1'e) artan konsantrasyonlarda PA daralma göstermektedir. daralma her bir konsantrasyonu ile inkübe edildikten sonra lümen çapından bir azalma gözlenmiştir. PA, 10 dakika boyunca, her bir konsantrasyonda dengelenmeye bırakıldı. Bu veriler analiz edilerek çapı (ΔDiameter) bir değişim olarak sunulan veya chang normalleştirir KCI bir% vazokonstriksiyona olarak alınabilir60 mM KCI maksimum tazyikinin çapı örn.

Şekil 6, miyojenik reaktivite deneyinde bir PA lümen çapına ait temsili bir izleme gösterir. Intraluminal basınç sırada adım adım artışlar 1,8 mM hücre dışı Ca2 + (Şekil 6, düşük değerli izleme) varlığında Pas bir kademeli daralma neden olur. Ca2 + olmadan aCSF aynı PA Kuluçka ve 10 uM diltiazem + 2 mM EGTA ile takviye miyojenik sesi üretimini ortadan kaldırır, ve PA artar lümen çapından pasif lümen içi basıncı (Şekil 5, üst izleme) 'ya göre arteriole çapını lümen.

Şekil 1
Şekil 1: Parankimal arteriollerin şematik. Yüzey pi üzerinden genelge dalıaltta yatan beyin parankimi içine al arterler ve dalış. Her PA kendi sütunlu toprakları içinde küçük bir nöronal nüfus perfuses (bölgeleri vurgulanmıştır). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Fare Serebral PA olgularının izolasyonu ventral yüzeyi Willis Çemberi gösteren yukarı bakacak şekilde beyin A) Resim (1 ok) ve MCA (ok 2) ondan dallanma. altta yatan beyin dokusu ile MCA B) Görüntü. Willis poligonu gelen MCA en yakın bölgeye ok işaret eder. MCA (okların dallanma C) PA). Bar = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3,
Şekil 3:. Kanüle ancak henüz dikiş ile bağlı olmayan bir PA İzole Fare PA A) Görüntü kanülasyonu. Bu görüntü PA uzunluğu dikişlerle kapatmadan önce kanül üzerinde eklenecek göstermektedir. B) PA şimdi basınçlandırma sonra kanül kapalı slayt olmayacağını garanti 2 dikişlerle kanül kapalıdır. kör-kese deneysel konfigürasyonda bir kanül, basınçlı fare PA C) Görüntü. Bar = 50 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Pensilvanya Deneyleri A) Diseksiyon mikroskobu için Laboratuvarımızda Kullanılan EkipmanlarIşık kaynağı. B) Sıcaklık kontrolörü. C) aCSF banyo süperfüzyomu için Peristaltik pompa. D) Basınç Servo Kontrol, Yaşayan Sistemleri Enstrümantasyon. E) video Boyut Analiz (sağ alt), monitör (sağ üst) ve video Edge Detection sistemi dizüstü (solda) üzerine yüklenir. F) Küçük damar odası (doğrusal hizalama odası). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Daralma KCI-kaynaklı depolarizasyon ve tromboksan 2 Analog U46619 Hazırlanması a) bütünlüğünü değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF fare PA olgularının Örnek daralma Pas 'lık. 60 mM KCI mevcudiyetinde% 30 - PA 15 arasında büzülür gerekir. B) U46619 pleomorfik daralma neden olduğu; izleme de görüldüğü gibi, U46619 bir nedenkonsantrasyona bağlı PA olgularının daralma, her bir konsantrasyon ile inkübasyon sonrası lümen çapı bir azalma olarak gözlemledik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6:. PA olgularının miyojenik REAKTİVİTE intraluminal basınç sırada adım adım artışlar 1,8 mM hücre dışı Ca2 + (alt izleme) varlığında Pas bir kademeli daralma neden olur. Bu basınca neden daralma direnci arteriyollerin özelliğidir. 2+ 1.8 mM Ca olmadan aCSF ile aynı PA Kuluçka ve 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile desteklenmiş miyojenik ton nesil ortadan kaldırır ve PA artar lümen çapı pasif lümen olan intraluminal basınç (üst izleme) göre th çapıe arteriole. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Serebral parankimal arteriyollerde farklı nöron popülasyonları serpmek birkaç anastomoz ve şubeleri ile yüksek direnç arteriyollerinde vardır. Bu özel kan damarları astrosit aracılı vazodilatasyon 1 ile serebrovasküler otoregülasyonun ve nörovasküler kaplin merkezi oyuncular. Serebral vasküler hastalık bu özel kan damarlarının önemi Doktor Miller Fisher öncü çalışması hipertansif hastalarda ölüm sonrası 16 beyinlerinde laküner infarkt topraklarında parankimal arteriyollerde yapısal değişiklikler açıklanan zaman, yaklaşık 50 yıldır biliniyor . Fonksiyonel bozulma birleştiğinde bu değişiklikler, derin beyaz cevherin hipoperfüzyon, vasküler-ilişkili demanslardan 17 gelişimi için önemli bir risk faktörü neden olabilir. Parankimal Arteriol büyük intrakranial ve pial arterler yanı sıra yüzey arteriol, böylece birikmiş d işlevsel farklıdırata serebrovasküler ağacın bu üyeleri ile kolayca parankimal mikrosirkülasyonda ekstrapole olmayabilir. uygun beyin vücut dengesinin sürdürülmesinde onların açık önemine rağmen, fizyoloji odaklanan çalışmalar ve bu arteriollerin fonksiyonel yanıtları öncelikle izolasyon ve manipülasyon ile ilgili teknik zorluklar, son yıllara kadar kıt olmuştur.

Bu yazıda; izolasyonu ve parenkimal arteryollerin kanül basıncı myography çalışmaları için, moleküler analiz, ya da yerli düz kas veya endotel hücrelerinin hazırlanması için basit ve yeniden üretilebilir bir tekniği açıklar. Ayrıca, biz parankimal arteriyollerde miyojenik düzenleme, yılanı ve bekletici mekanizmaları araştırmak için bu tekniğin kullanımı ile ilgili veri mevcut. Biz bu gemiler intraluminal basınç sabit bir seviyede muhafaza edildiğinde kendiliğinden miyojenik sesi üreten, yanı sıra değişen, miyojenik aktif olduğunu gözlemlemekintraluminal basınç değişikliklerini karşı karşıya myojenik durum, bir fenomen myojenik reaktivite 18 olarak adlandırılan direnç arterlerde için iyi tanımlanmış. Miyojenik reaktivite, beynin içinde perfüzyon basıncını düzenleyen sistemik arteriyel basınç o sabit bakan dalgalanmaları tutarak, böylece yüksek basınçlarda 18 düşük basınçlarda perfüzyon kaybı, ya da vazojenik ödem önlemede önemli bir faktördür. Buna ek olarak, bu arteriol örneğin endotelin-1, endotelial hücreler tarafından üretilen önemli endojen vazokonstriktör olarak, vazoaktif maddelerin yanıt olduğunu göstermektedir. Burada anlatılan hazırlama önemli bir sınırlama parankimal arteriollerin nörovasküler birimin hayati bileşenleri izole ederek kaybolur ve fonksiyonel hiperemi tepkiler okudu edilemez olmasıdır. Beyin dilim gibi diğer preparatlar, bozulmamış nörovasküler birimin yapısını korumak ve serebral arteriyoler çapı 19 astrositik kontrolünü incelemek için daha uygundur. HoWever, beyin kesit hazırlanmasında, parenkimal arteriol basınçlı olmayan ve reseptör bağlı vazokonstriktör ajan eksojen vazodilatör yanıtları incelemek için bazal tonu taklit etmek için gereklidir. Basınç myography ve beyin dilim hazırlık serebral mikrosirkülasyon çalışma için tamamlayıcı göz önünde bulundurmalıdır.

Burada açıklanan protokol ilk kez 1982 yılında 20 Dacey ve Duling tarafından tarif edilen bir hazırlama uyarlanan ve Coyne ve ark., 21 ile değiştirilmiştir. . En önemli fark kullanılan kanülasyon tekniği yatıyor: Dacey ve Duling ve Coyne ve ark pipetler iki farklı ayarlar kullanılan süre, bir holding dış pipet ve bir lümen içi kanulasyon pipet, biz pipet içine PA slayt elle sadece intraluminal pipet kullanın ve . Bu teknik en son serebral iskemi sonrası sıçan PA olgularında çalışmalar yapmak için kullanılmıştır - reperfüzyon yaralanması 22, Chron gelen PAdiğerleri arasında ically hipertansif sıçanları 5. Farelerde, biz düz kas hücreleri 13 Ca 2 + dalgalar ve kıvılcım değerlendirmek için lazer tarama konfokal mikroskopi PA kanül bağlanmasıyla fizyolojik koşullar ve asidoz altında basınçlı PA düz kas hücrelerinde Ca 2 + sinyalleri değerlendirmek için bu tekniği kullanılmıştır. Ayrıca membran potansiyeli kayıtları ile birlikte farmakolojik araçlar kullanılarak, birçok nörovasküler bağlama maddeleri 3 test edilmiş ve gösterilmiştir, k V 1 küçük damar hastalığı genetik modelinde 7'de bir kanalopati gibi bozukluklara yol açan yukarı regülasyonu voltaj kapılı potasyum kanallarının bu cerebrospecific. Bu örnekler, farklı araştırma soruları cevaplamak için bu hazırlık canlılığı göstermektedir.

Kanülasyon kolaylığı gibi en kritik adım, sayısı ve KA'ların isola uzunluğuna bağlıdır olduğu beyin dokusundan beyin PA olgularının o izolasyonunu vurgulamak önemlidirTed. Bu izolasyon optimize etmek için bir kaç denemeler sürebilir. Dahası, kanülasyon için öğrenme eğrisi uzun ve sinir bozucu olabilir ve ilk başarı oranları düşük 50 olarak% olabilir. Bununla birlikte, bir kez hakim bu tekniğin tekrarlanabilirliği ve verim yüksektir ve çok sayıda deney bir gün içinde gerçekleştirilebilir.

Özetle, bu yazıda serebral parenkimal arteryollerin izolasyonu ve kanülasyon için bir yöntem açıklanır. Böyle bir hazırlık basınçlı arteriollerin bozulmamış yanıtları koruyarak, nörovasküler ünitenin damar bileşeni izole edilmiştir. İzole PA'ların kullanılarak yapılan çalışmalar, hem fizyolojik ve patolojik durumlarda, beyin parankimal dolaşıma değerli bilgiler sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl Fisher Scientific S-640
KCl Fisher Scientific P217
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M-8266
NaHCO3 Fisher Scientific S233
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G2870
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope Olympus SZX7
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Wiretrol 50 μl VWR Scientific 5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter VWR Scientific 28145-477
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Dark Green Nylon Thread Living Systems Instrumentation THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Video Dimension Analyzer Living Systems Instrumentation VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software Living Systems Instrumentation DAQ-IWORX-404
Heating Unit Warner Instruments 64-0102
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
  2. Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
  3. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
  5. Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
  6. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
  7. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
  8. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
  9. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
  10. Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
  11. Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
  12. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
  13. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
  14. You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
  15. Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
  16. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
  17. Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
  18. Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
  19. Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
  20. Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  21. Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
  22. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).

Tags

Nörobilim Sayı 111 serebral parankimal Arterioller basınç myography miyojenik reaktivite agonist kaynaklı daralma izolasyon damar kanülasyonu
İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, P. W., Dabertrand, F.,More

Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter