Abstract
इन्ट्रासेरेब्रल parenchymal धमनियों (पीए) है, जो धमनियों parenchymal, मर्मज्ञ धमनियों और पूर्व केशिका धमनियों में शामिल हैं, उच्च प्रतिरोध रक्त मस्तिष्क पैरेन्काइमा में pial धमनियों और धमनियों और गोताखोरी से बाहर शाखाओं में बंटी जहाजों कर रहे हैं। व्यक्तिगत पीए पैरेन्काइमा के एक असतत बेलनाकार क्षेत्र और भीतर निहित न्यूरॉन्स छिड़कना। इन धमनियों मस्तिष्क में रक्त प्रवाह दोनों विश्व स्तर पर (cerebrovascular autoregulation) और स्थानीय स्तर पर (कार्यात्मक hyperemia) के नियमन में एक केंद्रीय खिलाड़ी हैं। पीए neurovascular इकाई, एक संरचना है कि मस्तिष्क के भीतर चयापचय गतिविधि के लिए क्षेत्रीय रक्त के प्रवाह के मैचों का हिस्सा हैं और यह भी न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और astrocytes भी शामिल है। पीए के माध्यम से छिड़काव सीधे स्थानीय फ़ीड पीए के फैलाव की वजह से छिड़काव में एक वृद्धि करने के लिए है कि विशेष क्षेत्र में न्यूरॉन्स और न्यूरोनल चयापचय नेतृत्व में बढ़ जाती है की गतिविधि से जुड़ा हुआ है। पीए के नियमन की बेहतर से विशेषता है कि से अलग हैpial धमनियों। दबाव प्रेरित वाहिकासंकीर्णन पीए में अधिक से अधिक है और vasodilatory तंत्र से भिन्न हो। इसके अलावा, पीए परिवाहकीय नसों से बाह्य इन्नेर्वतिओन प्राप्त नहीं है - इन्नेर्वतिओन astrocytic endfeet के साथ संपर्क के माध्यम से आंतरिक और प्रकृति में अप्रत्यक्ष है। इस प्रकार, सिकुड़ा विनियमन के बारे में डेटा pial धमनियों का उपयोग अध्ययन द्वारा संचित सीधे पीए समारोह को समझने के लिए अनुवाद नहीं है। इसके अलावा, यह अनिर्धारित रहता है कि कैसे इस तरह के उच्च रक्तचाप और मधुमेह जैसे रोग राज्यों, पीए संरचना और जेट प्रभावित करते हैं। यह ज्ञान की खाई हिस्से में तकनीकी पीए अलगाव और केन्युलेशन से संबंधित कठिनाइयों का परिणाम है। इस पांडुलिपि में हम अलगाव और कृंतक क़दम के केन्युलेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्रयोगों है कि एगोनिस्ट प्रेरित कसना और myogenic जेट सहित इन धमनियों के साथ किया जा सकता है के उदाहरण दिखाते हैं। हालांकि इस पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित पीए केन्युलेशन और दबाव myography पर है, पीए अलग-थलगभी, जैव रासायनिक biophysical, आणविक, और इमेजिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क परिसंचरण अनोखे केंद्रीय न्यूरॉन्स, कोशिकाओं है कि ऊर्जा भंडार सीमित है और इसके परिणामस्वरूप अत्यधिक ऑक्सीजन दबाव और आवश्यक पोषक तत्वों की आपूर्ति में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं की चयापचय की मांग का समर्थन करने के लिए आयोजित किया जाता है। विशेष न्यूरोनल उप-जनसंख्या सक्रिय हो जाता है जब विशिष्ट कार्यों प्रदर्शन कर रहे हैं, वाहिका स्थानीय हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी को रोकने के लिए 1 छिड़काव में एक अत्यधिक स्थानीय वृद्धि को बढ़ावा देता है। यह कार्यात्मक neurovascular युग्मन के रूप में जाना hyperemia के एक फार्म सक्रिय न्यूरॉन्स, astrocytes, और मस्तिष्क धमनियों 2 से बना है, और neurovascular इकाई के समुचित संचालन पर निर्भर है। इन्ट्रासेरेब्रल parenchymal धमनियों, रक्त वाहिकाओं, parenchymal शामिल मर्मज्ञ और पूर्व केशिका धमनियों का एक समूह है, इस प्रतिक्रिया के लिए केंद्रीय रूप से महत्वपूर्ण हैं और यह उनके आदेश neurovascular युग्मन 3 की जांच करने में व्यक्तिगत रूप से अध्ययन करने के लिए तो महत्वपूर्ण है।
<(- 70 माइक्रोन आंतरिक व्यास 20) उच्च प्रतिरोध रक्त वाहिकाओं है कि मस्तिष्क के भीतर अलग neuronal आबादी छिड़कना पी वर्ग = "jove_content"> Parenchymal धमनियों छोटे हैं। सतह पर pial धमनियों से बाहर शाखाओं में बंटी, parenchymal धमनियों उपसतह microcirculation (चित्रा 1) को खिलाने के लिए एक लगभग 90 ᵒ कोण पर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में घुसना। इन धमनियों उचित छिड़काव दबाव बनाए रखने के रूप में वे सबसे बाहर का चिकनी मांसपेशियों युक्त केशिकाओं की रक्षा जहाजों कर रहे हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सतह pial संचलन के विपरीत, parenchymal धमनियों जमानत के शाखाओं और anastomoses की कमी है, और फलस्वरूप मस्तिष्क परिसंचरण 4 की "बाधाओं" कर रहे हैं। नतीजतन, parenchymal धमनियों के रोग ऐसे संवहनी संज्ञानात्मक हानि और छोटे इस्कीमिक स्ट्रोक (यह भी चुप या lacunar स्ट्रोक के रूप में जाना जाता है) के रूप में cerebrovascular रोग के विकास के लिए योगदान देता है। अध्ययन indicatई है कि parenchymal धमनियों में शिथिलता आवश्यक उच्च रक्तचाप 5, 6 पुराने तनाव से प्रेरित किया जा सकता है, और छोटे वाहिका रोग आनुवंशिक माउस मॉडल 7 में एक प्रारंभिक घटना है। चूहों में एकल मर्मज्ञ धमनियों के अलावा, प्रयोगात्मक प्रेरित रोड़ा छोटे इस्कीमिक स्ट्रोक कि आकार में बेलनाकार, समान हैं पुराने मनुष्य 8 में मनाया उन लोगों पैदा करने के लिए पर्याप्त है।इन संरचनात्मक भेद के अलावा, सिकुड़ा समारोह को विनियमित तंत्र pial धमनियों और parenchymal धमनियों के बीच मतभेद है। Myogenic वाहिकासंकीर्णन संभवतः intracellular सीए में बाह्य तंत्रिका वितरण 10, 11 mechanotransduction के अलग मोड, और मतभेदों की कमी 2+ संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में 12,13 संकेत की वजह से parenchymal धमनियों 9 में अधिक से अधिक है। सबूत बताते हैं कि endothelium निर्भर vasodilator तंत्र भी इन vascu के बीच अलगLAR क्षेत्रों, सीए 2 से जुड़े तंत्र पर अधिक निर्भरता का प्रदर्शन करते parenchymal धमनियों के साथ इस तरह नाइट्रिक ऑक्साइड और prostacyclins 14 के रूप में प्रसारण कारकों के साथ तुलना कश्मीर + चैनलों और इलेक्ट्रोटोनिक संचार -activated संवहनी दीवार के भीतर। इसलिए, डेटा pial धमनियों का उपयोग कर जरूरी धमनियों Parenchymal करने के लिए लागू नहीं हो सकता प्रयोगों में इकट्ठे हुए, प्रमस्तिष्क छिड़काव के स्थानीय नियंत्रण के हमारे ज्ञान में एक अंतराल छोड़ने।
उनके महत्व के बावजूद, parenchymal धमनियों बेहद तहत अध्ययन किया है, मुख्य रूप से अलगाव और पूर्व vivo अध्ययन के लिए बढ़ते के साथ तकनीकी चुनौतियों के कारण हैं। इस पांडुलिपि में हम अलग-थलग और मस्तिष्क धमनियों parenchymal cannulate, जो दबाव myography के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या immunolabeling, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक जीव विज्ञान, और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए ऊतक को अलग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है।
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Protocol
1. प्रवेशनी और चैंबर तैयार
- स्वच्छ borosilicate ग्लास केशिकाओं डालें (बाहरी व्यास: 1.2 मिमी, आंतरिक व्यास: 0.69 मिमी, लंबाई में 10 मिमी) एक प्लैटिनम रेशा (100 माइक्रोन व्यास) के साथ एक विंदुक खींचने के खांचे में।
- उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करना, केशिका खींच एक लंबी और पतली टिप (चित्रा 2) एक micropipette खींचने का उपयोग के साथ एक प्रवेशनी उत्पन्न करते हैं। इस्तेमाल किया सेटिंग्स हैं: हीट - 700, खींचो - 100, वेग - 50, समय - 10।
- दबाव myograph चैम्बर के धारक में प्रवेशनी डालें। उचित रूप से cannulas संरेखित करें।
- ध्यान से वांछित व्यास को विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक संदंश का उपयोग करके cannulas के सुझावों को तोड़ने। यहाँ हम एक 10 माइक्रोन टिप के साथ एक प्रवेशनी (चित्रा 2) दिखा।
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) युक्त 1.8 मिमी सीए 2 के साथ दोनों cannulas भरें; 1% गोजातीय सीरम के साथ पूरक सीए 2 + मुक्त aCSF के साथ चैम्बर भरेंएल्बुमिन (बीएसए) + 10 माइक्रोन diltiazem (सभी समाधान प्रयोग के शुरू होने से पहले नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए)। चैम्बर के आकार पर निर्भर करता है, 5 से 20 मिलीलीटर के बीच aCSF की मात्रा बदलती हैं। 4 ᵒ सेल्सियस पर चैम्बर स्टोर केन्युलेशन शुरू करने के लिए तैयार है जब तक।
नोट: diltiazem एक प्रतिवर्ती एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम अवरोध कि धमनियों के फैलाव का कारण होगा, जो केन्युलेशन की सुविधा है
2. Parenchymal धमनियों का अलगाव
- प्रयोगशाला है कि संस्था के जानवरों की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग पशु विच्छेदन के लिए तुरंत पहले euthanize। Barbiturates या कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग पसंद किया जाता है, के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल anesthetics मस्तिष्क परिसंचरण 15 में vasodilatory प्रभाव पड़ सकता है। यहाँ दिखाया गया है सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और चिकित्सा के नेवादा स्कूल के विश्वविद्यालय से प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और एजी में हैं"देखभाल और पशु के उपयोग में मार्गदर्शी सिद्धांत" के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के साथ reement।
- कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर पशु euthanize। कत्ल से पहले, यह सुनिश्चित करें कि पशु साँस लेने में बंद कर दिया और जब अपने पंजे बन्द रखो अनुत्तरदायी है।
- जानवर एक तेज कैंची (माउस) या गिलोटिन (चूहा) का उपयोग कर सिर काटना। पशु के सिर से त्वचा निकालें और midline कपाल सिवनी ठीक एक टिप कैंची का उपयोग कर के साथ काटा। एक कुंद संदंश (माउस) या एक हड्डी plier का प्रयोग सावधानी से कपाल हड्डियों को हटाने और मस्तिष्क को बेनकाब। मस्तिष्क धीरे धीरे और सावधानी के रूप में सतह pial धमनियों को नुकसान नहीं करने के लिए निकालें। मस्तिष्क बर्फ पर 1% BSA के साथ पूरक सीए 2 + मुक्त aCSF के 20 मिलीलीटर से भरा एक कंटेनर में रखें।
- 1% BSA के साथ पूरक ठंडा सीए 2 + मुक्त aCSF के साथ एक पैड से युक्त एक विच्छेदन पकवान भरें और उदर की सतह इस डिश (2A चित्रा) के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ मस्तिष्क हस्तांतरण। एक dissec तहत पकवान प्लेसटिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए)। पैड 27 गेज सुई का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क पिन। मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के पास रखने पिन से बचने के लिए सावधान रहें।
- विलिस और एमसीए इसे से शाखाओं में बंटी के सर्किल स्थानीय बनाना। तेज और गठबंधन Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, एमसीए के चारों ओर एक छोटे आयत काटा। सुनिश्चित करें कि आयत एमसीए की पूरी लंबाई के माध्यम से भर में 5 मिमी के करीब है। आयत के शीर्ष भाग अतीत (विलिस, चित्रा 2 बी, तीर के सर्किल के लिए समीपस्थ) विलिस के सर्किल से शाखाओं में बंटी बिंदु होना चाहिए।
- 3 मिमी - Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, लगभग 2 के लिए ऊतक की गहराई में एक काटकर प्रदर्शन करते हैं।
नोट: इस भाग parenchymal धमनियों की भलाई के अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है, और यह इसे ठीक से करने के लिए कुछ परीक्षणों लग सकता है। कटौती गहरी पर्याप्त किए गए नोट है, तो अलग-थलग parenchymal धमनियों कम हो जाएगा; यदि कटौती भी गहरी है, धमनियों उनकी शाखाओं में बंटी बिंदु पर टूट जाएगा जब विच्छेदितऊतक निकाल दिया जाता है। - ऊपर की ओर का सामना करना पड़ (विलिस के सर्किल से बाहर का) कीट पिन का उपयोग कर एमसीए के साथ विदारक डिश में मस्तिष्क टुकड़ा का सबसे बाहर का अंत नीचे पिन। एक उथले चीरा पिन के पास पिया कटौती करने के लिए, अंतर्निहित सेरेब्रल कॉर्टेक्स (अन्यथा पिन पकड़ नहीं होगा) में भी गहरी कटौती करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है।
- ध्यान से छोटे संदंश के साथ पिया के प्रत्येक पक्ष हड़पने के लिए और छाल से पिया छीलने लगते हैं। यदि आवश्यक हो, एमसीए के लिए पर पकड़, यह सुनिश्चित करना है कि आसपास के pial झिल्ली क्षतिग्रस्त नहीं है।
- छीलने तक पिया एमसीए युक्त कोर्टेक्स से मुक्त है रखें। ध्यान दें कि छीलने के खिलाफ प्रतिरोध सर्किल विलिस के करीब वृद्धि होगी। इस बिंदु पर अतिरिक्त सावधान रहो, क्योंकि अब parenchymal धमनियों इस क्षेत्र में होगा।
- एक बार जब पिया नि: शुल्क है, इसे ध्यान से (चित्रा 2 बी) के नीचे का सामना करना पड़ धमनियों Parenchymal के लिए सतह विपरीत साथ विदारक पकवान पर पैड के शीर्ष पर जगह है। <li> Vannas वसंत कैंची का प्रयोग, एमसीए से मुक्त विच्छेदित धमनियों में कटौती से बाहर, यकीन है कि पोत के सिरों दो टूक काट रहे हैं बना रही है।
- एकत्र धमनियों दबाव myography, आणविक विश्लेषण, या देशी चिकनी मांसपेशियों या endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
3. दबाव Myography
- सिवनी समय से आगे की तैयारी। 5 मिमी टुकड़ों में गहरे हरे रंग नायलॉन के धागे में कटौती और एक पेट्री डिश पर एक डबल पक्षीय टेप का चिपचिपा पक्ष पर जगह है। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, अपने तंतु ठीक संदंश का उपयोग में प्रत्येक टुकड़ा अलग, और शिथिल एक छोर दूसरे में रेशा से गुजर रहा एक सरल आधा अड़चन गाँठ तैयार करते हैं।
- संदंश का प्रयोग, दो तरफा टेप से एक गाँठ लेने, बहुत अधिक दबाव के साथ यह हड़पने के लिए यकीन नहीं कर रही है। प्रवेशनी पर स्नान समाधान, स्लाइड गाँठ में सीवन खींचो और प्रवेशनी की नोक से एक दूरी पर यह कस लें। इस प्रक्रिया को दोहराएं प्रत्येक प्रवेशनी पर 2 टांके है।
- एक गिलास कोटएक 10% बीएसए समाधान के साथ micropipette और फिर सीए 2 + मुक्त aCSF 1% BSA के साथ पूरक के साथ बंद अतिरिक्त कुल्ला।
- कांच micropipette में समाधान के 50 μl खींचो, एक parenchymal धमनिका ऊपर खींचने के लिए और दबाव myography चैम्बर के लिए स्थानांतरण। चैम्बर में parenchymal धमनिका बग़ैर यह कांच micropipette के आंतरिक कक्ष से चिपके से रोकने के लिए एक द्रव गति में सवार धक्का।
- दो सुपर ठीक संदंश का प्रयोग, पीए के लुमेन खोलने सावधान किया जा रहा केवल पोत के बहुत अंत छूने के लिए।
- संदंश का प्रयोग parenchymal धमनिका के किनारों धारण करने के लिए, ध्यान से प्रवेशनी पर पोत खींच। प्रवेशनी पर काफी दूर तक खींच इतना है कि पोत प्रवेशनी (चित्रा 3 ए) का बहुत पतला अंत में नहीं है।
- प्रवेशनी पर 2 टांके ढीला और पोत (चित्रा 3 बी) पर उन्हें कस लें। अंतरिक्ष पोत पर अलग टांके एक छोटे से, और ऑपरेटर की ओर खींच जबकि Tighयह दस। सुनिश्चित करें कि किसी भी शाखाओं parenchymal धमनिका के विपरीत छोर बंद करने से पहले बंद बंधे हैं बनाओ।
- चारों ओर मुड़ें और चैम्बर एक अंधे थैली के रूप में parenchymal धमनिका के विपरीत अंत करीब है। उस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, विपरीत प्रवेशनी पर संबंधों को खोलने के लिए और भी धमनियों पर इसे पारित। धीरे-धीरे इस तरह है कि parenchymal धमनिका प्रवेशनी की ओर से बंधा हो जाएगा में गाँठ को बंद करें। धमनिका के अनुदैर्ध्य खिंचाव से बचें। (चित्रा 3 सी)।
नोट: अध्ययन के लक्ष्य लुमेन के माध्यम से दवाओं छिड़कना है, तो विपरीत अंत बजाय प्रवेशनी की ओर से parenchymal धमनिका बांधने की cannulate। सुनिश्चित करें कि किसी भी cannulas नमक क्रिस्टल या आंतरिक बिल्ड-अप है कि intraluminal प्रवाह को ब्लॉक की जरूरत नहीं है सुनिश्चित करें। प्रवाह की दर को उचित विनियमन आदेश शारीरिक स्तर के भीतर कतरनी तनाव बनाए रखने के लिए। शिह एट अल। द्वारा एक अध्ययन चूहों 8 में धमनियों के अंदर मर्मज्ञ प्रवाह की दर से पता चलता है, और गड़बड़ी के लिए एक प्रारंभिक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैंबहुत अध्ययन करता है। - ध्यान से पोत व्यास की रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए माइक्रोस्कोप के मंच करने के लिए चैम्बर हस्तांतरण। खुर्दबीन मंच पर चैम्बर देते हैं, सही ट्यूबों के छिड़काव के लिए तापमान जांच और इनलेट और आउटलेट को जोड़ने। या माउस parenchymal धमनियों के लिए 40 एमएमएचजी intraluminal दबाव चूहे धमनियों के लिए 50 एमएमएचजी को भी धमनियों पर दबाव, प्रयोगशाला में एक दबाव प्रणाली उपलब्ध का उपयोग कर (जल स्तंभ, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप एक दबाव transducer के लिए युग्मित, आदि।)। चित्रा 4D एक का एक उदाहरण से पता चलता है क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप एक दबाव transducer करने के लिए मिलकर cannulated धमनिका दबाव डालने के लिए।
- व्यास (चित्रा 3E) में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली चालू करें। क्रम में सबसे अच्छा पता लगाने के लिए संभव प्राप्त करने के लिए, इस तरह की रोशनी और इसके विपरीत के रूप में माइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स, समायोजित करें। आदर्श रूप में भी धमनियों की दीवारों अंधेरे और लुमेन पारदर्शी होना चाहिए। एक बार जब पता लगाने के लिए उपयुक्त है, रिकॉर्डिंग टी शुरूवह प्रयोग।
- superfusion प्रणाली शुरू। 5 मिलीग्राम / मिनट - गर्म (37 ᵒ सी) 3 के बीच एक प्रवाह दर पर 15 से 20 मिनट के लिए 1.8 मिमी सीए 2 + युक्त ACSF के साथ cannulated, दबाव parenchymal धमनिका धो लें। इस aCSF diltiazem या बीएसए को शामिल नहीं करना चाहिए।
- तैयारी की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए 60 मिमी KCl ACSF के साथ नियमित रूप से aCSF बदलें। 60 मिमी KCl करने के लिए 20% कसना - इस बिंदु पर पीए 10 का प्रदर्शन करना चाहिए। धमनिका उस हद तक कसना नहीं है, हटाने और एक अन्य धमनिका cannulate।
- नियमित aCSF के साथ 60 मिमी KCl बाहर धो लें। सहज myogenic स्वर है, जो एक घंटे तक का समय लग सकता है की पीढ़ी तक प्रतीक्षा करें। धमनिका तब तक myogenic स्वर नहीं है, तो एक और धमनियों के साथ बदलें।
नोट: Myogenic स्वर धीरे-धीरे, और कभी कभी धीमी गति से, सिकुड़ा एगोनिस्ट या उच्च KCl समाधान द्वारा उत्तेजना के बिना पोत के लुमेन व्यास में कमी के रूप में मनाया जाता है। Myogenic स्वर निम्नलिखित च द्वारा गणना की जाती हैormula: (1 - (सक्रिय लुमेन व्यास / निष्क्रिय लुमेन व्यास)) x 100 5 myogenic स्वर का एक उचित मात्रा उपचार, तनाव, प्रजाति, ट्रांसजेनिक्स, आदि के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।। 30% 5 - सामान्य में, शारीरिक myogenic स्वर 15 से चलता है।
4. उदाहरण दबाव Myography प्रयोगों: Agonist प्रेरित कसना और myogenic जेट
- aCSF में पसंद की एक agonist उपयुक्त सांद्रता का उपयोग करने का dilutions की एक श्रृंखला तैयार करें। वर्तमान उदाहरण के लिए thromboxane एक 2 रिसेप्टर agonist U46619 इस्तेमाल किया गया था। 1 मिमी की एकाग्रता में U46619 के 1 मिलीलीटर के एक शेयर समाधान तैयार किया गया था। स्थानांतरण नशीली दवाओं की एक 10 गुना कमजोर पड़ने के लिए एक समाधान 100 माइक्रोन के U46619 युक्त है, जिसके परिणामस्वरूप बनाने के लिए, aCSF के 900 μl युक्त एक नया ट्यूब 1 मिमी समाधान के 100 μl। 6 dilutions के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं, एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया कंस्ट्रिकटर वक्र तैयार करने के लिए 1 मिमी से 100 एनएम को लेकर।
- जोड़ेंसमाधान aCSF superfusing के 100 मिलीलीटर के लिए एगोनिस्ट (पहली खुराक के लिए 1 मिलीलीटर, बाद में सभी खुराक के 900 μl के बाद) की पूरी मात्रा युक्त। इस एगोनिस्ट की एक अतिरिक्त 100 गुना कमजोर पड़ने को बढ़ावा मिलेगा। इस प्रकार, 10 बजे से 10 माइक्रोन के लिए स्नान रेंज में एगोनिस्ट के अंतिम सांद्रता। धमनियों के लिए ~ प्रत्येक एकाग्रता में 10 मिनट सेते दें, जब तक ल्यूमिनल व्यास एक स्थिर राज्य पहुंचता है।
- किसी भी दवाओं के बिना ACSF के साथ पीए superfusing तक पीए व्यास पीठ मूल मूल्य के लिए है से बाहर एगोनिस्ट धो लें। अधिकतम फैलाव प्रेरित और धमनियों के निष्क्रिय व्यास रिकॉर्ड करने के लिए (बीएसए के बिना) सीए 2 + मुक्त aCSF में parenchymal धमनिका 10 माइक्रोन diltiazem + 2 मिमी EGTA के साथ पूरक सेते हैं।
- ध्यान से, जबकि संबंधों के अंत में पकड़े इसे बाहर खींच कर प्रवेशनी से parenchymal धमनिका निकालें। डबल विआयनीकृत पानी के साथ पोत चैम्बर धो मलबे और एगोनिस्ट से अधिक दूर करने के लिए। सीए के साथ चैम्बर भरें2 + मुक्त aCSF + बीएसए और एक अन्य धमनिका cannulate। यह भी धमनियों प्रति एक से अधिक प्रयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है।
- एक myogenic जेट प्रयोग करने के लिए, parenchymal धमनिका 40 एमएमएचजी intraluminal दबाव में संतुलित करने के लिए जब तक सहज myogenic स्वर उत्पन्न होता है (ऊपर वर्णित) की अनुमति है। 5 एमएमएचजी को intraluminal दबाव को कम करने और पीए ~ 5 के लिए संतुलित करने की अनुमति - 10 मिनट, जब तक ल्यूमिनल व्यास स्थिर अवस्था तक पहुँचता है। (20 एमएमएचजी वेतन वृद्धि में 5 से 140 एमएमएचजी से उदाहरण के लिए) पसंद के अंतराल का उपयोग कर intraluminal दबाव चरणबद्ध बढ़ाएँ।
- 5 एमएमएचजी नीचे intraluminal दबाव के धमनिका बेनकाब कि के रूप में पतन का कारण बन सकता है और नुकसान endothelium, इस प्रकार प्रयोग के परिणामों में फेरबदल मत करो।
- दबाव की अवस्था के अंत में, सीए 2 + मुक्त aCSF (बीएसए के बिना) 10 माइक्रोन diltiazem + 2 मिमी EGTA के साथ पूरक के साथ parenchymal धमनिका superfuse और दबाव चरणों को दोहराएँ, Lowes से शुरूटी दबाव।
नोट:% टोन = (1 - (सक्रिय व्यास / निष्क्रिय व्यास)) x 100: इस पीए के निष्क्रिय व्यास, जो% myogenic स्वर गणना करने के लिए आवश्यक हैं, सूत्र द्वारा परिभाषित दे देंगे।
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Representative Results
चित्रा 5 ए तैयारी की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए 60 मिमी KCl aCSF करने के लिए माउस पीए के एक प्रतिनिधि कसना चलता। 60 मिमी KCl की उपस्थिति में 30% - पीए 15 के बीच कसना चाहिए। कसना 15% नीचे है, पीए त्यागने और एक दूसरे cannulate, के रूप में यह पता चलता है कि धमनिका अलगाव और केन्युलेशन प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया था।
चित्रा 5 ब superfusing स्नान में thromboxane की बढ़ती सांद्रता एक 2 एनालॉग यू-46619 (10 बजे 1 माइक्रोन के लिए) के लिए पीए कसना को दिखाता है। कसना प्रत्येक एकाग्रता के साथ ऊष्मायन के बाद लुमेन व्यास में एक कमी के रूप में मनाया गया। पीए 10 मिनट के लिए प्रत्येक एकाग्रता में संतुलित करने के लिए अनुमति दी गई थी। इन आंकड़ों का विश्लेषण किया और व्यास (ΔDiameter) में एक परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत करने के लिए या KCl एक% वाहिकासंकीर्णन, जो चांग normalizes के रूप में किया जा सकता60 मिमी KCl को अधिकतम कसना द्वारा व्यास में ई।
चित्रा 6 एक myogenic जेट प्रयोग में एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लुमेन व्यास के एक प्रतिनिधि ट्रेसिंग से पता चलता है। Intraluminal दबाव में चरणबद्ध बढ़ जाती है 1.8 मिमी कोशिकी सीए 2 (6 चित्रा, कम ट्रेसिंग) की उपस्थिति में पीए के एक वर्गीकृत कसना कारण बनता है। सीए 2 बिना aCSF के साथ एक ही पीए की ऊष्मायन और 10 माइक्रोन के diltiazem + 2 मिमी EGTA के साथ पूरक myogenic स्वर पीढ़ी को समाप्त करता है, और जो निष्क्रिय है intraluminal दबाव (चित्रा 5, ऊपरी ट्रेसिंग), के अनुसार पीए बढ़ जाती है की लुमेन व्यास धमनिका के व्यास लुमेन।
चित्रा 1: Parenchymal धमनियों के योजनाबद्ध। सतह गड़बड़ी के बाहर पीए शाखाअल धमनियों और अंतर्निहित मस्तिष्क पैरेन्काइमा में गोता। प्रत्येक पीए अपने स्तंभ राज्यक्षेत्र के भीतर एक छोटा सा न्यूरोनल जनसंख्या perfuses (प्रकाश डाला क्षेत्रों)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 2:। माउस सेरेब्रल पीए के अलगाव (तीर ए) उदर की सतह का सामना करना पड़ ऊपर की तरफ विलिस के सर्किल दिखाने के साथ मस्तिष्क की छवि 1) और एमसीए (एरो 2) इसे से बाहर शाखाओं में बंटी। बी) अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों के साथ एमसीए की छवि। विलिस के सर्किल से एमसीए के सबसे समीपस्थ क्षेत्र के लिए तीर अंक। सी) पीए एमसीए (तीर से बाहर शाखाओं में बंटी)। बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 3:। के एक गांव cannulated लेकिन अभी तक टांके के साथ बंधा हुआ नहीं की पृथक माउस पीए ए) छवि नलिका। इस छवि को दिखाता है पीए की लंबाई के टांके के साथ इसे बंद करने से पहले प्रवेशनी पर डाला जाएगा। बी) के पीए अब गारंटी नहीं है कि यह दबाव के बाद प्रवेशनी बंद स्लाइड नहीं होगा 2 टांके के साथ प्रवेशनी पर बंद कर दिया है। सी) एक अंधे थैली प्रयोगात्मक विन्यास में एक cannulated, दबाव माउस पीए की छवि। बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: उपकरण पीए प्रयोगों एक) के साथ विच्छेदन खुर्दबीन के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया।प्रकाश स्रोत। बी) तापमान नियंत्रक। सी) aCSF के स्नान superfusion के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप। डी) दबाव इमदादी नियंत्रण, रहने वाले सिस्टम इंस्ट्रूमेंटेशन। ई) वीडियो आयाम विश्लेषक (नीचे सही) की निगरानी (ऊपरी दाएं) और वीडियो छोर का पता लगाने प्रणाली एक लैपटॉप (बाएं) पर भरा हुआ है। एफ) छोटे पोत चैम्बर (रैखिक संरेखण कक्ष)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:। KCl प्रेरित विध्रुवण और thromboxane एक 2 एनालॉग U46619 ए) 60 मिमी KCl aCSF करने के लिए माउस क़दम के प्रतिनिधि कसना तैयारी की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए पीए के कसना। 60 मिमी KCl की उपस्थिति में 30% - पीए 15 के बीच कसना चाहिए। बी) U46619 प्रेरित क़दम के कसना; के रूप में पता लगाने में मनाया, U46619 एक कारण बनता हैएकाग्रता पर निर्भर पीए के कसना, प्रत्येक एकाग्रता के साथ ऊष्मायन के बाद लुमेन व्यास में एक कमी के रूप में मनाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6:। क़दम के Myogenic जेट intraluminal दबाव में चरणबद्ध बढ़ जाती है 1.8 मिमी कोशिकी सीए 2 (कम ट्रेसिंग) की उपस्थिति में पीए के एक वर्गीकृत कसना कारण बनता है। इस दबाव प्रेरित कसना प्रतिरोध धमनियों की विशेषता है। बिना 1.8 मिमी सीए 2 + ACSF के साथ ही पीए की ऊष्मायन और 10 माइक्रोन के diltiazem + 2 मिमी EGTA के साथ पूरक myogenic स्वर पीढ़ी को समाप्त करता है, और जो निष्क्रिय लुमेन है intraluminal दबाव (ऊपरी ट्रेसिंग), के अनुसार पीए बढ़ जाती है की लुमेन व्यास वें के व्यासई धमनिका। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सेरेब्रल parenchymal धमनियों कुछ anastomoses और शाखाओं कि अलग neuronal आबादी छिड़कना के साथ उच्च प्रतिरोध धमनियों हैं। ये विशेष रक्त वाहिकाओं astrocyte की मध्यस्थता वैसोडायलेटेशन 1 के माध्यम से cerebrovascular autoregulation और neurovascular युग्मन में केंद्रीय खिलाड़ी हैं। मस्तिष्क रोग में इन विशेष रक्त वाहिकाओं के महत्व को लगभग 50 वर्षों के लिए जाना जाता रहा है, जब डॉ मिलर फिशर की अग्रणी काम उच्च रक्तचाप से ग्रस्त रोगियों को पोस्टमार्टम 16 के दिमाग में lacunar दौरे के प्रदेशों के भीतर parenchymal धमनियों में संरचनात्मक परिवर्तन वर्णित । ये परिवर्तन, कार्यात्मक हानि के लिए युग्मित, गहरी सफेद पदार्थ की hypoperfusion, नाड़ी संबंधी dementias 17 के विकास के लिए एक बड़ा जोखिम कारक हो सकता है। Parenchymal धमनियों बड़े intracranial और pial धमनियों के साथ ही सतह धमनियों, इस प्रकार संचित डी से कार्यात्मक अलग कर रहे हैंअता cerebrovascular पेड़ के इन सदस्यों का उपयोग कर आसानी से parenchymal microcirculation के लिए extrapolated नहीं किया जा सकता है। उचित मस्तिष्क homeostasis को बनाए रखने में उनकी स्पष्ट महत्व के बावजूद, शरीर क्रिया विज्ञान पर ध्यान केंद्रित अध्ययन और इन धमनियों के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं हाल के वर्षों तक दुर्लभ हो गया है, मुख्य रूप से अलगाव और हेरफेर के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों के कारण।
वर्तमान पांडुलिपि में हम अलगाव और parenchymal धमनियों की केन्युलेशन दबाव myography के अध्ययन के लिए, आणविक विश्लेषण, या देशी चिकनी मांसपेशियों या endothelial कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन है। इसके अलावा, हम इस तकनीक के उपयोग पर डेटा मौजूद myogenic विनियमन, कंस्ट्रिकटर, और parenchymal धमनियों में टालमटोल तंत्र की जांच करने के लिए। हम पालन कि इन जहाजों myogenically सक्रिय हैं, सहज myogenic स्वर पैदा जब intraluminal दबाव एक निरंतर स्तर पर बनाए रखा है, साथ ही अपने बदलतेmyogenic intraluminal दबाव में परिवर्तन का सामना करना पड़ स्थिति, एक घटना प्रतिरोध धमनियों myogenic जेट 18 कहा जाता है के लिए अच्छी तरह से वर्णित। Myogenic जेट, मस्तिष्क भीतर छिड़काव दबाव को विनियमित करने प्रणालीगत धमनी दबाव में यह लगातार सामना करना पड़ रहा उतार-चढ़ाव रखते हुए, इस प्रकार उच्च दबाव के 18 में कम दबाव पर छिड़काव की हानि, या vasogenic शोफ को रोकने में एक महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि इन धमनियों ऐसे endothelin -1, एक महत्वपूर्ण अंतर्जात vasoconstrictor endothelial कोशिकाओं द्वारा उत्पादित के रूप में, vasoactive पदार्थों का जवाब। तैयारी यहाँ वर्णित का एक प्रमुख सीमा है कि parenchymal धमनियों neurovascular इकाई के महत्वपूर्ण घटक अलग से खो रहे हैं और कार्यात्मक hyperemic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन नहीं किया जा सकता है। इस तरह के मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में अन्य की तैयारी, बरकरार neurovascular इकाई की संरचना को बनाए रखने और अधिक मस्तिष्क arteriolar व्यास 19 की astrocytic नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं। होwever, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में, parenchymal धमनियों दबाव नहीं कर रहे हैं और रिसेप्टर पर निर्भर vasoconstrictor एजेंटों की बहिर्जात प्रशासन vasodilatory प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के क्रम में बेसल स्वर की नकल करने की जरूरत है। दबाव myography और मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी मस्तिष्क microcirculation के अध्ययन के लिए पूरक पर विचार किया जाना चाहिए।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक तैयारी पहली बार 1982 में 20 Dacey और Duling द्वारा वर्णित से अनुकूलित, और Coyne एट अल। 21 द्वारा बदल दिया गया था। । प्रमुख अंतर इस्तेमाल किया केन्युलेशन तकनीक में निहित है: जबकि Dacey और Duling और Coyne एट अल pipettes के दो अलग अलग सेट का इस्तेमाल किया, एक होल्डिंग बाहरी पिपेट और एक intraluminal केन्युलेशन पिपेट, हम केवल intraluminal पिपेट का उपयोग करें और मैन्युअल पिपेट में पीए स्लाइड । इस तकनीक को हाल ही में मस्तिष्क ischemia के बाद चूहे पीए में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है - reperfusion चोट 22, इति से पीएically उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों 5, दूसरों के बीच में। चूहों में, हम सीए शारीरिक स्थिति और एसिडोसिस के तहत दबाव पीए चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के लिए पीए केन्युलेशन युग्मन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में 13 सीए 2 लहरों और स्पार्क्स का आकलन करने से आकलन करने के लिए 2 + संकेतों इस तकनीक का उपयोग किया। , कि cerebrospecific अप-विनियमन वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों की कश्मीर वी 1 छोटा वाहिका रोग आनुवंशिक मॉडल 7 में एक channelopathy की तरह दोष का कारण बनता है हम भी कई neurovascular युग्मन एजेंट 3 का परीक्षण किया और प्रदर्शन किया, झिल्ली क्षमता रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन के रूप में औषधीय उपकरण का उपयोग कर। ये उदाहरण इस तैयारी की व्यवहार्यता विभिन्न अनुसंधान सवालों के जवाब देने को दर्शाते हैं।
यह मस्तिष्क के ऊतकों से मस्तिष्क पीए के उस अलगाव को उजागर करना है केन्युलेशन की आसानी के रूप में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, संख्या और क़दम इसोला की लंबाई पर निर्भर करेगा महत्वपूर्ण हैटेड। यह अलगाव का अनुकूलन करने के लिए कुछ परीक्षणों लग सकता है। इसके अलावा, केन्युलेशन के लिए सीखने की अवस्था लंबी और निराशा हो सकती है, और प्रारंभिक सफलता दर के रूप में कम के रूप में 50% हो सकता है। हालांकि, एक बार में महारत हासिल है, reproducibility और इस तकनीक के throughput अधिक है, और कई प्रयोगों एक दिन में किया जा सकता है।
सारांश में, वर्तमान पांडुलिपि अलगाव और मस्तिष्क parenchymal धमनियों की केन्युलेशन के लिए एक तकनीक का वर्णन है। इस तरह की तैयारी neurovascular इकाई के संवहनी घटक अलग-थलग, दबाव धमनियों की प्रतिक्रियाएं बरकरार बनाए रखने। पृथक पीए का उपयोग अध्ययन मस्तिष्क parenchymal संचलन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
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