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Biology

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

doi: 10.3791/53837 Published: April 8, 2016

Introduction

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면역 조직 화학 (IHC)는 조직 내 단백질의 검출을위한 표준 실험실 기술이며, IHC 여전히 널리 연구 및 진단 병리학 모두에 사용된다. IHC 염색의 평가 결과의 해석에 잠재적 인 편견을 도입, 자주 반 정량적이다. 많은 반 정량적 인 접근 방식은 최종 진단 1-4로 염색 강도 및 염색 정도를 모두 통합하는 개발되었다. 다른 시스템은 더 나은 식 (5)를 국산화하기 위해 채점 강도와 세포 내 위치를 포함한다. 다수 시청자의 평균 점수의 혼입은 종종 단일 뷰어 바이어스 (6)의 효과를 최소화하기 위해 이용된다. 이러한 노력에도 불구하고, 분석 주관 여전히 7 오염의 정도를 평가하는 특히, 남아있다. 인간의 입력에서 프로토콜 표준화 및 최소화 주관 정확하고 재현성 IHC 결과를 만드는 중요합니다.

콘텐츠 "> 조직 내 단백질 발현을 결정하기위한 IHC 이외에 다른 옵션이있다. 이러한 면역과 같은 다른 기술은 단백질 발현을 조사하는 금 표준으로 간주되는 동안 연구 설정 내 면역 전통적 단백질 지역화 8을 조사하는 수단으로 간주되어 . 결정 조직 또는 세포 구획 별 발현 조직 슬라이드 형광 항체의 사용은 합리적인 타협을 제공한다. 이러한 세포 분획 또는 레이저 캡처 미세 절제 9,10와 같은 고급 기법을 도입하지 않고 어렵지만 의한 NADPH에 배경 형광도, lipofuscins, 망상 섬유, 콜라겐과 엘라스틴은 11 정확한 정량 어렵게 만들 수 있습니다.

자동 계산 병리 플랫폼은 병리 염색 12-15의보다 객관적인 정량을위한 유망 방향입니다. 조직 마이크로 어레이와 멀티 스펙트럼 영상을 결합큰 샘플 크기에서 단백질 발현의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 범주 형 포맷 (16)보다 연속적으로 데이터를 리턴하는 동안 실질적으로 고유 편향 및 분석에 필요한 시간의 양을 줄이면서 이러한 기술로 단백질 공동 지역화 염색 얼룩이, 조직 및 세포 내 편재 분석이 가능하다. 따라서, 본 연구의 목적은 멀티 스펙트럼 영상 소프트웨어를 사용하여 분석 면역 다중화를 수행하는 유틸리티의 방법을 설명 하였다.

이 프로토콜은 네 개의 최적화 된 단일 클론 항체와 단일 조직 섹션 슬라이드 설명서, 멀티 플렉스 면역 조직 화학 염색을 위해 작성되었습니다. 대표 실험으로서, 핵 항 - 토끼 에스트로겐 수용체 알파 (ERα) 및 안드로겐 수용체 (AR)은 막 - 결합 항 - 마우스 CD147 및 막 - 결합 항 - 마우스 E-cadherin과 함께 다중화된다. 선택의 항체는 SUBSTITUT 할 수있다여기에 나와있는 항체 에드하지만, 항체의 각 조합은 별도의 최적화가 필요합니다. 모든 항체에 대한 사전 처리는 동일해야합니다. 아칸소와 CD147 항체 칵테일로 개별적으로하고 최적화해야합니다. 각 항체는 비오틴없는 중합체 시스템 및 4 고유 발색제 중 하나를 사용하여 검출된다.

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Protocol

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참고 :이 프로토콜은 여기에 이전에 12,17,18 설명 염색 및 조직 마이크로 어레이 (TMA)의 분석에 대해 설명합니다. 4 μm의 두께 TMA 부는 표준 마이크로톰을 이용하여 파라핀 블록으로부터 얻었다.

참고 : 4 원체 및 Counterstain과에 대한 스펙트럼 라이브러리는 이미지 정량 생성해야합니다. 이를 위해, 각 항체에 대한 최적의 프로토콜은 슬라이드 당 항체 뺀 최종 Counterstain과 함께 실행한다. 다섯 번째 슬라이드는 스펙트럼 라이브러리를 만드는 데 필요한 5 이미지를 생성하기 위해 헤 마톡 실린 염색을해야합니다.

1. 멀티 플렉스 면역 조직 화학

  1. 20 분 동안 60 ° C 오븐에서 구워 슬라이드. 화학 흄 후드를 사용하여 100 % 크실렌에 슬라이드를 담가. 자일 렌이 변화를 반복합니다. 5 분 동안 100 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 신선한 100 % 에탄올로 반복한다.
  2. 3 분 95 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 신선한으로 반복95 % 에탄올. 3 분 동안 70 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 3 분 동안 증류수에 슬라이드를 담가. 신선한 증류수로 반복합니다. 탭 슬라이드 수직 슬라이드에서 물을 드레인. 5 분 동안 즉시 사용 내인성 과산화 효소 차단제의 200 μl를 적용합니다.
  3. 슬라이드에서 퍼 옥시 다제 억제제 드레인 (7.0 미만의 pH)를 45 ㎖에 바로 사용할 수있는 검색 버퍼를 체험. 압력 밥솥에 넣어 슬라이드 컨테이너 및 시작 프로그램은 4 분 동안 124 ° C로 설정. 압력 밥솥은 20 분 동안 냉각시킵니다. 열기 전에.
  4. 검색 버퍼의 용기를 제거하고 추가로 10 분을 냉각 할 수 있습니다. 10 분 동안 증류수에 슬라이드를 씻어. 슬라이드에서 물을 배수 조심스럽게 소수성 장벽 펜으로 슬라이드에 조직을 묘사.
  5. 촉촉한 거즈를 포함 뚜껑 (배양 챔버)와 평면 콘센트에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) .Transfer 슬라이드의 200 μl를 추가합니다.
  6. 1 배 1 리터 준비 50m를 희석하여 트윈 20 (TBST)와 식염수 트리스 버퍼20 배 트리스 L의 1 % 트윈 -20을 950 ml의 증류수를 포함하는 완충 식염수.
  7. 슬라이드에서 PBS를 배출하고 1 배 TBST 200 μl를 적용합니다. 2 분을 품어. 슬라이드에서 TBST을 배출하고 배양 챔버에 슬라이드를 반환합니다. 바로 사용할 수있는 보편적 인 단백질 블록, 근접 챔버의 200 μl를 적용하고 7 분 동안 품어.
  8. 단백질 블록을 배출하고 배양 챔버에 슬라이드를 반환합니다. 안티 ERα 항체 희석 1 : 400 항체 희석제 239.4 μL을 항체의 0.6 μl를 첨가하여. 밀어 희석 항체와 가까운 챔버의 200 μl를 적용합니다.
  9. 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션 슬라이드. 슬라이드에서 항체를 배출하고 TBST에서 5 분간 침지 한 다음 TBST 씻어.
  10. 슬라이드에서 TBST을 배출하고 배양 챔버에 슬라이드를 반환합니다. 즉시 사용 가능한 염소 항 - 토끼 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 폴리머와 가까운 챔버의 200 μl를 적용합니다. 30 분 동안 품어. 실온에서 첨가 하였다. 5 분 TBST의 용기에 TBST과 장소 슬라이드와 린스 슬라이드. </ 리>
  11. 250 μL DAB 기질 완충액에 DAB의 원체 8 ㎕를 첨가하고 잘 혼합하여 발색 갈색 냉이 퍼 옥시 다제 -3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB-HRP)를 준비한다.
  12. 배양 챔버 슬라이드, 반환 슬라이드에서 TBST을 배출하고 6 분 동안 갈색 HRP-DAB의 발색의 200 μl를 적용합니다. 충분히 증류수 용기에 증류수 장소 슬라이드 슬라이드를 헹군다.
  13. 제 2 버퍼 시약 150 μL와 제 용출 시약 50 μl를 조합함으로써 변성 용액을 혼합한다. 슬라이드 떨어져 물을 배수하고 3 분 동안 슬라이드로 희석 된 변성 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 실온에서 첨가 하였다. 가만히 따르다 및 TBST와 시약을 변성 씻어. 5 분 동안 TBST에 슬라이드를 담가.
  14. 안티 AR 항체의 4.2 μL 및 항체 희석액 203 μL와 안티 CD147 항체의 2.​​8 μl를 희석하여 AR / CD147 항체 칵테일을 준비합니다. 슬라이드에서 TBST을 배출 배양 챔버에 슬라이드를 반환 및 AR / CD147 (c)의 200 μl를 적용슬라이드에 ocktail. 근접 챔버와 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 5 분 동안 TBST에 린스 TBST와 슬라이드를 체험.
  15. TBST, 배양 챔버로 복귀 슬라이드를 배출하고 즉시 사용 가능한 염소 항 - 토끼 알칼리 포스 파타 아제 폴리머의 200 μl를 적용합니다. 닫기 챔버와 30 분 동안 품어 슬라이드. 실온에서 첨가 하였다. 5 분 동안 TBST에 린스 TBST와 슬라이드를 체험.
  16. 250 μL에 붉은 발색 버퍼를 붉은 발색의 3.2 μl를 첨가하여 발색 빨간색 알칼리 포스 파타 아제를 준비하고 잘 섞는다.
  17. 슬라이드에서 TBST을 배출하고 배양 챔버에 슬라이드를 반환합니다. 슬라이드, 가까운 챔버에 희석 빨간색 알칼리 포스 파타 아제 발색의 200 μl를 적용하고 7 분 동안 품어.
  18. 발색을 배출하고 철저하게 증류수로 슬라이드를 씻어. 5 분 동안 증류수 용기에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에서 물을 배수 TBST로 세척하고 배양 챔버로 돌아갑니다. 슬라이드와 클에 200 ㎕의 염소 항 - 마우스 - HRP 폴리머를 적용전자 챔버. 30 분 동안 품어. 실온에서 첨가 하였다.
  19. 슬라이드에서 폴리머를 배출하고 TBST 씻어. 5 분 TBST에 넣어 슬라이드. 버퍼 250 μL에 안정화 시약 3.2 μl를 추가하여 보라색 HRP-연결 발색의 200 μl를 준비하고 잘 섞는다. 보라색 ​​발색의 3.2 μl를 추가하고, 잘 과산화수소 시약 3.2 μl를 혼합하고 잘 섞는다.
  20. 슬라이드를 TBST를 배출하고 밀어 7 분 동안 품어 할 준비 보라색 발색의 200 μl를 적용합니다. 실온에서 첨가 하였다. 5 분 동안 증류수 용기에 증류수 대신 슬라이드 린스 슬라이드.
  21. 제 2 버퍼 시약 150 μL와 제 용출 시약 50 μL를 혼합하여 변성 용액을 혼합한다. 슬라이드 떨어져 물을 배수하고 3 분 동안 슬라이드로 희석 된 변성 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 실온에서 첨가 하였다.
  22. TBST와 시약을 변성 씻어. 5 분 동안 TBST의 용기에 슬라이드를 놓습니다. 안티 E-cadherin의 항체 희석항체 희석제 218.9 ㎕를 1.1 μL 항체를 첨가하여 200 : 1이다. 배양 챔버 슬라이드, 반환 슬라이드에서 TBST을 배출하고 슬라이드에 E-cadherin의 200 μl를 적용합니다. 닫기 챔버와 30 분 품어. 실온에서 첨가 하였다.
  23. 5 분 TBST의 용기에 TBST과 장소 슬라이드와 린스 슬라이드. 배양 챔버에 슬라이드를 반환 슬라이드에서 TBST을 배출하고 200 ㎕의 염소 항 마우스 HRP 폴리머를 적용합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 5 분 TBST의 용기에 TBST과 장소 슬라이드와 린스 슬라이드.
  24. 블랙 250 μL 버퍼 원체 8 μL를 첨가하여 발색 HRP가 결합 준비한다. 밀어 넣고 2 분 동안 개발 발색 200 μl를 적용합니다. 철저하게 증류수로 슬라이드를 씻어 증류수 용기에 젖어.
  25. 증류수 200 μL에 40 μL의 헤 마톡 실린을 첨가하여 희석 마톡. 슬라이드에서 물을 배출하고 30 초 동안 슬라이드 희석 헤 마톡 실린 200 μl를 적용합니다. 린스 슬라이드철저 2 분간 흐르는 수돗물. 후 30 초간 증류수로 헹군다. 15 ~ 30 분 동안 60 ℃로 오븐에 넣어 슬라이드.
  26. 30 초 동안 새로 제조 된 100 % 크실렌에서 슬라이드를 빠져 초과 자일 렌을 닦아 영구 장착 미디어의 한 방울을 추가합니다. 호 1.5 coverslip에와 커버 슬립.

2. 자동 이미지 인식 및 분석

  1. 자동 슬라이드 스캐너에 스테인드 슬라이드를로드합니다. TMA 코어의 직경을 분리하고, 수에 기초하여, 제조자의 설명서에 따라 자동 검색 프로토콜을 생성한다.
  2. 열기 다중 분광 이미징 소프트웨어는 개인 발색제와 헤 마톡 실린 염색 슬라이드로 염색 제어 슬라이드에서 스펙트럼 라이브러리를 빌드합니다. 제어 슬라이드에서 획득 된 영상 큐브를 열고 광학적 그 발색을 정의하는 데 4 ~ 5 긍정적으로 스테인드 영역을 선택합니다. 전체 스펙트럼 라이브러리 representi 때까지 다른 제어 슬라이드에서 이미지 큐브 반복모든 원체을 ng를하면 생성 한 다음 스펙트럼 라이브러리를 저장한다.
  3. 멀티 스펙트럼 이미징 소프트웨어에서 새 프로젝트를 시작합니다. 선택 "멀티 스펙트럼을 (.im3)"샘플 형식의 이미지 포맷 옵션 "브라이트"에 대한. "점수", "표현형", "기능 찾기", "세그먼트 조직"과 "수출"첫째, 원하는 옵션을 선택하여 프로젝트를 구성합니다. 이 시점에서, 화상 해상도가 필요한 경우 분석 시간을 신속하게 변경할 수있다.

3. 조직 분할

  1. 이전에 생성 된 스펙트럼 라이브러리를 가져 오기 및 분석에 포함 할 모든 원체을 선택합니다.
  2. 오픈 화상 큐브 "열기 이미지 큐브"옵션을 선택하여 설정된 트레이닝 데이터에 포함된다. 트레이닝의 정확성을 보장하기 위해, 이미지의 총 수의 적어도 18 %를 선택 분석한다. 분할 정확도를 높이기 위해 모든 질병 상태를 나타내는 이미지를 선택합니다. 이미지의이 부분 내가의 이미지의 트레이닝 세트라고합니다.
  3. 스포이드 툴을 선택하고 백색 하나의 화상 내의 영역을 선택하여 설정된 트레이닝 화이트 밸런스 이미지.
  4. 조직 세분화로 이동 "고급"버튼을 선택합니다. 조직 유형을 선택합니다 "조직 카테고리"패널을 사용하여 (예 : "조직"과 "비 조직")를 분석한다. 보다 정확한 단백질 조직의 현지화를 들어, 여러 조직 범주 (예. "상피", "기질"및 "비 조직")를 사용할 수 있습니다.
  5. 알고리즘을 작성하고 교육 이미지 내에서 세포의 그룹을 주변에 그림으로써 조직의 범주를 정의 시작합니다. 하나의 조직 범주와 완료되면, 다른 조직 범주에 대해 반복합니다. 그 조직 카테고리 형의 특징 이미지 내에서 세포의 그룹을 선택해야합니다.
  6. 이미지 트레이닝 세트 내의 모든 이미지에 대해이 과정을 반복합니다.
  7. 선택 요소 (발색제)는 TRAI에 포함 할은 "조직 분할기"에 대한 닝. 시야 면역 화상의 분석을 수행 할 때, 모든 구성 요소는 일반적으로 트레이닝에 포함된다. 이 단계에서 편견을 방지하기 위해 설정 한 훈련 풍부한 음의 염색 이미지를 포함합니다.
  8. 조직 분할기 훈련에 적절한 "패턴의 스케일"을 선택합니다. 20X 배율에서 큰 패턴 크기는 일반적으로 적절하다. 높은 배율에서 미세 구조와 조직에 대해 작업 할 때, 작은 패턴 규모가 더 적합합니다.
  9. 조직 분할기 훈련을 시작합니다 "기차 조직 분할기"버튼을 선택합니다. 제대로 분류되는 교육 영역 내의 픽셀의 비율을 반영하는 팝업 상자 표시의 정확성을 확인하십시오.
    주 : 소프트웨어가 지속적 수동으로 정지 될 때까지 알고리즘의 정확성을 개선하기 위해 시도한다. 우리는 이전에 97 %의 훈련 정확도 (12)의 이미지 검색 결과의 18 %에 해당 교육을 증명하고있다. 조직 분할기가 훈련 후, 적절한 세그먼트 해상도를 선택합니다. 세그먼트 해상도는 더 적은 시간과 미세한 분해능에 더 많은 시간을 요구하는 요구를 거친 해상도 세그먼트 이미지에 필요한 시간에 대응한다.
  10. 세그먼트 "세그먼트 이미지"를 클릭하여 이미지의 전체 훈련입니다. 소프트웨어 충분한 시간이 모든 훈련 영상에 알고리즘을 적용 할 수 있습니다. 완료되면, 현재의 교육 알고리즘을 어떤 잘못 분류 된 조직을 찾기 위해 설정 한 훈련을 검토합니다.
  11. 미세 조정으로 조직 세분화 과정은, 추가, 편집 또는 조직 교육 영역을 제거합니다. 픽셀이 다른에 하나의 조직 카테고리의 가장자리에 확장 할 경우 "트림 가장자리"옵션을 사용합니다. 픽셀의 작은 그룹이 잘못 분류되면, 최소 세그먼트 크기의 임계 값을 조정한다.
  12. 편집이 선택 "세그먼트 이미지"완료되면,이 조직 세분화를위한 새로운 알고리즘을 만들려면 조직 분할기를 다시 훈련 할 것이다. 이전 알고리즘자동으로 저장하고 필요시에 리턴 될 수있다.
  13. 경우 자신감 조직 분할 알고리즘의 결과는 "전진"버튼을 선택하여 셀 분할로 진행.

4. 셀 분할

  1. 선택 세포 내 구획이 셀 분할에 포함될 수있다. "핵"은 이미 "세포질"또는 "막"을 선택하는 선택되어 있는지 확인합니다.
    참고 : 막 - 특정 단백질 마커 같은 E-cadherin의로, IHC에 포함되었을 때 "막"분할 만 선택해야합니다.
  2. 은 "핵"탭 내에서 여러 가지 옵션이 있습니다. 핵 분할에 적합한 설정을 선택하여 시작 (단계 4.3 참조). 개인 또는 모든 조직 카테고리가 세분화에 포함할지 여부를 선택합니다.
  3. 핵 분할에 대한 접근 방식을 선택
    1. 좋은 얻기위한 단순화 된 방법에 대한 Counterstain과 "픽셀 기반 (임계 값)"접근 방식을 선택이미지 처리 설정에 대해 잘 모르고 결과.
      주 : 이것은 종종 좋은 첫 번째 선택을합니다. 접근 "픽셀 기반 (임계 값)"를 선택하면 안정적인 핵 이의 얼룩이있을 때 핵 Counterstain과 일관성의 부족이있는 경우 "기반 개체"표기하고 있지만, 더 적합하다.
    2. 신뢰할 수있는 핵 Counterstain과있을 때 "픽셀 기반 (임계 값)"접근 방식을 선택합니다.
      참고 :이 방법은 순수 픽셀 기반이다. 이 방법은 또한 이러한 IHC 염색 양성 염색 조직 카테고리 내의 모든 화소를 검출 같은 간단한 임계 만족할 수있는 다른 이미지 분석 요구를 위해 사용될 수있다.
    3. 핵 Counterstain과 핵 객체의 일관성 및 특정 염색을 제공하지 않는 경우 개체 기반 접근 방식을 선택하고 더 진보 된 형태 계측 기반의 접근 방식은 핵을 검출하기 위해 필요하다.
    4. "Nucl을"핵 분할에 대한 구성 요소 "를 선택귀 크기 "및"정리 "사용자가 추가 핵 분할 설정을 정의하고자하는 경우.
  4. 세포질 형상 매개 변수를 선택
    1. 세포질 분할로 이동 "고급"버튼을 선택합니다.
      주 : 선택할 수있는 세포질 세그먼트 내에서 여러 가지 옵션이 있습니다. "핵 내부 거리"라고 옵션은 픽셀 기반으로합니다. 이 핵의 외측 세포질 내부 사이의 거리를 반영한​​다. 이 값을 증가시키는 것은 신호가 핵 세포질 구획에 걸쳐 교차하는 확률을 감소시킨다.
    2. 다음 선택 "바깥 거리가 핵".
      참고 :이 또한 픽셀 기반으로합니다. 핵 외부 거리는 핵의 외부 셀의 외부 사이의 거리를 반영한​​다. 이 값을 포함하거나 필요하다면 막 신호를 제외하는 크고 충분히 작게 설정 될 수있다.
    3. 다음을 선택, "최소 크기".
      참고 : 최소 크기, pixe기반 L은 분석에 포함되는 최소의 세포질 샘플 크기를 반영한​​다. 세포질의 크기는 셀들이 서로 밀접하게 포장되는 경우와 같은 특정 셀이 작은 경우,이 세포질 세그먼트는 분석에서 제외된다.
    4. 다음 옵션, "차", "차"와 "구성 요소"를 선택하고, 보조 옵션으로 "고등"를 선택합니다.
      참고 : 여기에 하나가 특정 세포질 마커를 선택할 수 있습니다. 특정 세포질 IHC 마커가 사용 된 경우 핵 세그먼트와 유사하게,이 구성 요소는 최소한의 임계 값을 구함으로써 세포질을 정의하는데 사용될 수있다. 이것은 세포질을 정의하는데 도움되지만 허용 가능한 정확성을 위해 필요하지 않다.
    5. 세 개의 탭 옵션의 마지막으로 이동하면 "멤브레인"입니다. 여기서, 사용자는 단백질 마커 막 구획을 정의한다. "기본"을 선택 "보조", 및 / 또는 사용 된 각각의 멤브레인 특정 마커 "고등". 조정 "전체 규모 OD는 "최소 임계 값 또는 세포막의 각 마커에 대한 긍정적를 찾을 수 있습니다.
    6. 은 "멤​​브레인"탭에서 계속하고 옵션 "최대 셀 크기"를 선택합니다.
      주 :이 셀의 최대 크기를 지정 픽셀 막 값의 거리이다. (12)의 값은 20 배 배율로 촬영 한 이미지에 일반적으로 적합하다.
    7. 모든 옵션을 선택한 후, "세그먼트 이미지"또는 "세그먼트 모두"를 선택합니다. 이미지에 설정을 적용하고 "개별적"또는 "갤러리"모드를 관찰합니다.
      참고 : 필요한 경우 설정 및 임계 값을 조정하고 이미지 트레이닝 세트에서 셀 분할 결과에 만족 때까지 다시 세그먼트.

세포의 5 표현형

주 : 정확한 셀 분할 정확한 세포 표현형을 얻기 위해 필요하고, 표현형 학습 가능한 기능이다.

  1. 사용 "추가 &# 34; 버튼은 "표현형"목록에 표현형을 추가 할 수 있습니다. 사용자는 표현형의 색상을 선택할 수 있습니다.
  2. 셀에 표현형을 할당 "편집 표현형"을 클릭합니다. 표현형을 선택한 다음에 이동하는 사용자를 허용, 드롭 다운 메뉴를 표시하기 위해 특정 셀을 클릭합니다. 진행하기 위해 각 표현형 적어도 5 세포를 식별합니다. 각 표현형 25 이상의 셀을 선택하는 것은 최적의 결과를 달성하기 위해 필요하다.

6. 점수 IHC 및 공동 현지화

  1. 스텝은 "점수 IHC 또는 경우"로 이동 "고급"을 선택합니다. 점수는 "조직 카테고리"를 선택합니다.
    주 : 하나의 조직 종류는 특정 분석에서 획득 될 수 있지만, 다른 조직 카테고리의 채점 결과가 요구되는 경우, 분석은 나중에 다른 설정으로 반복 될 수있다.
  2. 원하는 "점수"유형을 선택합니다.
    참고 : 긍정 관심의 구성 요소 (양극과 음극)이 쓰레기통을 만듭니다이중 양성 공동 지역화 분석에 사용된다. 다른 옵션은 4 단, 10 단, 50 단의 선택의 마커에 대한 분석을 포함한다.
  3. 분석을 처치에 사용되는 셀 "구획"를 선택합니다.
  4. 차 핵 구성 요소에 대한 최소 임계 값을 찾는 마찬가지로, "보기 구성 요소 데이터"를 선택하고 관심이있는 구성 요소 (들)에 대한 긍정적 인 세포 염색의 적절한 광학 밀도 최소 임계 값을 찾기 위해 훈련 이미지 위에 커서를 이동합니다.
  5. 강하게 염색 된 세포는 제외 할 경우, 적절한 레벨 임계치 이하 최대. 그렇지 않으면, 분석을위한 임계 값의 최대 값을 선택하는 자동 버튼을 사용합니다.
  6. 임계 값의 유효성을 검증하기 위해 점수 이미지 훈련을 선택합니다.
    참고 : 특정 빈 내에서 세포의 비율은 반환됩니다 및 육안 검사 또는 수동 계산에 의해 비교 될 수있다. 완료되면, "내보내기"단계로 진행하는 "사전"을 선택합니다.
<P 클래스 = "jove_title"> 7. 알고리즘 및 배치 분석을 적용

  1. 학습 집합에 대한 데이터를 내보내 조직 세분화, 셀 분할 및 점수 값을 통해 생성 알고리즘을 테스트합니다. 수출 디렉토리에 새 폴더를 만들 지시를 따릅니다. 이미지를 선택하고 테이블 생성 및 분석에 포함된다. "모든 내보내기"를 선택하여 분석을 수행합니다.
  2. 테이블 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 내 보낸 대부분의 데이터 분석 프로그램에서 열 수 있습니다.
  3. 분석이 완료되면, 설정의 정확성을 평가하는 높고 낮은 염색 모두 이미지 셀 분할 및 채점 데이터를 볼 수 있습니다.
  4. 설정에 만족하는 경우, 배치 분석을 통해 이미지의 전체 집합에 대한 이미지 트레이닝 세트에서 생성 알고리즘을 적용합니다. 은 "일괄 분석 '탭을 클릭하고 개방 된 알고리즘은 활성 프로젝트에서 복사됩니다.
  5. 새로운 수출 디렉토리를 선택하고있는 이미지와 TABL를 선택ES는 분석에 포함되어야한다. 입력 파일 옵션에서 선택 "이미지 추가"모든 이미지가 배치 분석에 포함하도록 선택합니다.
  6. "실행"옵션을 선택하여 분석을 수행합니다. 트레이닝 세트의 분석과 마찬가지로,이 단계는 특별한 설정 및 분석에 포함 된 화상의 수에 따라, 시간의 가변 량을 필요로한다.
  7. 완료되면 "검토 / 병합"탭으로 이동합니다. 원하는 경우 일괄 분석에서 수출 디렉토리에 배치 디렉토리의 디폴트는 변경 될 수 있습니다. 선택 "모든 포함"및 분석을위한 요약 데이터와 데이터 시트를 만드는 "병합"을 선택합니다.

내 보낸 데이터의 8 분석

  1. 데이터 분석 소프트웨어에서 내 보낸 테이블을 열고 제거 또는 각 구성 요소에 대한 최소 및 최대 값으로 분석 관련이없는 데이터 열을 숨 깁니다. 분석에 사용되는 기본 데이터는, 평균 광학 밀도 C 인모든 구성 요소에 대한 olumn.
  2. 검토 수출 분할지도와 원시 이미지는 분석에서 제외 될 수있는 샘플 또는 TMA 코어를 확인합니다. 티슈 백분율 값은 제외 기준을 위해 가장 자주 사용되는 <5 %의 임의의 절단과, 시료에 포함되어야하는지 결정 여부를 돕기.
  3. 관련성이없는 데이터 나 샘플을 포함하는 행이 데이터 분석에서 제외 될 제거합니다.
  4. 질병 상태의 변화 또는 질병 12,18-21의의 임상 병리학 적 특성과의 관계를 조사하기 위해 단백질 정량 데이터를 사용합니다.

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Representative Results

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도 1에서, 트레이닝이 아닌 조직 함과 함께, 상피 및 간질 부분으로 분할 이미지 전립선 조직에 대해 수행된다. 상피 막 마커 E-cadherin의를 사용하여 세포 분할이도 2에 도시 된 핵, 세포질 및 막 부분을 분리 하였다.

실험에서는도 3에 도시 한 바와 같이, AR, ERα, E 헤린 및 CD147의 발현 및 위치 파악을 조사 다중화 IHC를 사용 하였다. 이러한 기술을 사용하여, 우리는 ERα 모두 핵 발현 양성 세포를 식별 할 수있다 AR (그림 3B - 3C)도 3a에 녹색 화살표와 같이 비색 신호를 중첩에도 불구하고. 우리는 홍보의 다른 상태에서 더블 긍정적 인 기질 세포의 비율에 현저한 차이를 발견ostate 질환 (그림 3D). 우리는 마커 단백질 (그림 3A에서 빨간색 화살표)로 E-cadherin의를 사용하여 CD147의 세포막 - 특이 적 발현을 정량, 우리는 전립선 조직에서 막 특정 CD147의 발현을 조사하는 최초의 그룹이었다. 우리는 전립선 암의 진행 (도 3E)에 관련 CD147의 발현이 유의하게 감소하는 결과 및 수술의 예후 (19)의 중요한 관계를 발견 하였다.

가난한 실험 설계가 부정확 조직 세분화로 이어질 수있는 경우가 있습니다. 도 4에서, 상기 알고리즘은 조직의 집합에 적용하지 않았다 정확하게 세그먼트 상피 및 간질 구획 (도 4C). 이 실험에서, α-평활근 액틴 (α-SMA)은 간질 함을 표시하기 위해 사용되었다. α-SMA 및 평활근은 Figu (일부 종양 감소 또는 손실되기 때문에) 4A 재, 조직 세분화 (그림 4B)를 통해 생성 알고리즘은 정확하게 혼자 형태 계측 학적 데이터로부터 상피와 기질 구획을 구별 할 수 없습니다. 조직 또는 세포 구획을위한 단백질 마커를 선택할 때주의해야합니다.

그림 1
그림 1 : 멀티 스펙트럼 이미징 소프트웨어를 사용하여 조직의 분할. 전립선 조직 마이크로 어레이는 안드로겐 수용체 (AR), 에스트로겐 수용체 알파 (ERα), E-cadherin의, CD147 및 다중화를 이용하여 면역 염색 하였다. 트레이닝 이미지의 집합 조직 유형 및 이미지의 전체 세트 (A)의 질환 상태를 나타내는 멀티 스펙트럼 영상 획득 소프트웨어에 반입 하였다. 조직 카테고리는 기질 (녹색), 상피 세포 (적색), 및 비 - 조직 (청색)를 포함하여 생성하고, 카테고리는 수동 위에 드로잉에 의해 규정 된교육 이미지 (B). 교육 이미지를 그린 후, 조직 세분화하는 알고리즘 제작 한 이미지 (C)의 훈련 집합에 적용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 핵, 세포질 및 막 구획에 셀 분할. 핵 구획 헤 마톡 실린 대조 염색 (A)에 대한 최소 임계 값을 설정하여 셀 분할에 대해 정의되었다. 세포질은 소프트웨어 (B) 내에서 미리 설정된 알고리즘을 이용하여 핵 관련하여 정의 하였다. E-cadherin의 멤브레인 마커로 사용하고 최소 OD 임계치 막 실 (C)을 정의하는 도포 의미한다. 이 기술은 모든모든 세포 내 구획 (D)에서 단백질 발현의 동시 정량 OWS. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 공동 현지화 및 멤브레인 관련 단백질 발현 분석. 다중화 IHC는 안드로겐 수용체 (AR), 에스트로겐 수용체 알파 (ERα), E-헤린 및 CD147 (A)의 발현 및 위치 파악을 조사 하였다. DAB (브라운 원체)은 AR (B) 및 ERα (C)를 ​​표시하는 데 사용 붉은 색 원체를 표시하는 데 사용 하였다. 우리는 ERα와 AR의 핵 공동 현지화와 세포의 비율을 (A 녹색 화살표) 공간적으로 중복되는 바이오 마커를 확인하고 (D) 정량화 할 수 있었다전립선 기질 내에서. 플라즈마 막 (A에서 빨간색 화살표)를 정의하는 E-cadherin의 (검은 색 발색)를 사용하여, 우리는 전립선 조직 (E) (19) 내에서 CD147의 막 - 특이 적 발현을 정량화. 분산 분석 (ANOVA)을 통계 분석에 사용 된 편도는, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 반영하고, 별표가 P <0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 실험 설계에 의한 부적절한 조직 분할. , 안드로겐 수용체 (적색 발색), 및 안드로겐 수용체 변이 7 (DAB의 발색), 양성 및 악성 전립선 조직은 α-평활근 액틴 (녹색 발색 α-SMA)에 대한 염색 하였다. α-SMA가 사용 하였다기질 마커 및 전립선 (A)를 포함한 일부 종양에서 감소된다. 훈련을 실시 하였다 (B) 및 조직 분할 알고리즘이 적용되었을 때, 기질과 상피 구획으로 인해 α-SMA 염색 (C)의 부재에 부적절하게 분할 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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단백질 발현을 평가하기위한 기존의 면역 조직 화학의 사용은 분석 22,23 주관적 반 정량 방법에 의해 제한된다. 사전 플랫폼은 바이오 마커의 발현 및 지역화의 높은 처리량 분석을 위해 만들어졌습니다. 조직과 세포 내 구획 모두의 상세한 분할은 사용자가 관심의 다른 마커와 바이오 마커의 발현, 현지화 및 공동 현지화를 연구 할 수 있습니다. 이전의 연구에서, 우리는 같은 세포 구획 18,20,21에 지역화 된 단백질을 연구하는 데 특히 IHC 및 다중 분광 영상의 유틸리티를 증명하고있다. 조직 마이크로 어레이 (24)와 결합하면, 이러한 기술은 병리학 자에 의해 수동 분석에 의해 허용 된 것보다 단백질 발현의 신속하고 객관적인 정량 허용합니다.

단백질 정량에 대한 면역 조직 화학 염색의 사용과 한 가지 문제 때문에 subjec에 결과 irreproducibility입니다분석과 기술 및 시약의 고유 한 차이점적인 성격. 단백질 발현을 측정하는 멀티 스펙트럼 영상 획득 등의 플랫폼을 사용하는 중요한 장점은 결과의 재현성이다. 12,16,25 크기 연속 형식으로 데이터를 반환 실질적 특히 대형 샘플로 작업 할 때, 작업 시간을 줄일 병리 컴퓨터 플랫폼 데이터는 병리학 수동 분석이 매우 상관. 연구는 서로 다른 멀티 스펙트럼 플랫폼 (14) 사이의 결과에서 전반적으로 높은 일치도를 보여 주었다. 더욱이, 우리는 이전에 단백질의 수가 12 조사에 변동이있는 경우에도 염색 결과는 재현성이 높은 것을 보여 주었다. 염색 및 분석 모두 자동 병리 플랫폼의 사용은 다른 에피토프으로 생성 된 항체에 따른 것과 같은 결과, 모든 불일치를 제거하지 않습니다 만,이 플랫폼은 편견과 적외선을 줄일 수 실질적 않습니다재현성은 일반적으로 면역과 관련된.

정확하고 재현성있는 결과를 반환하기위한 필수적인 프로토콜 내에서 특정 단계가 있습니다. 조직 또는 세포 내 마커가 정확한 분할 중요하다으로 단백질의 선택을 통해 적절한 실험 설계 포함한다. 양성 분석을 수행 할 때, 양성 염색에 대한 낮은 임계 값의 선택은 최종 결과에 큰 영향을 미친다. 에 대한 임계 값을 선택하는 동안 핵 전사 인자와 같은 단백질 "온 / 오프"더 이질 발현 된 단백질에 대한 임계 값을 어렵다 발견, 오히려 간단합니다. 이 이상적으로 보드 인증 비뇨 병리학 또는 분석을위한 최적의 임계 값을 찾을 수있는 여러 관찰자에 걸쳐 평균 점수로 공동으로 수행되어야한다.

이 기술의 현재 버전의 몇 가지 제한을 인식하는 것이 중요하다. 해제 할 때세포질 구획 미세화, 세 가지 방법을 사용할 수있다 : (1) (2) 막 특이 마커 염색하는 세포질 특이 마커 염색 핵 대 막의 세포질 등의 마커의 거리를 이용하여, (3)을 사용하여 연신 방법은 수동 핵 관련 세포질의 경계를 정의한다. 우리의 경험에서, 막 - 특정 마커를 사용하는 것은 가장 정확한 기술이다. 핵은 중앙에 위치한 경우 또는 관심있는 바이오 마커가 균일하게 세포질에 걸쳐 분산되어있는 경우 수동 그리기 방법은 일반적으로 정확합니다. 정확하게 섬유 아세포 및 평활근 세포 등 간질 세포의 세포질을 정의하는 것은 곤란 남아 실험을 설계 할 때 고려되어야한다.

이 기술의 또 다른 한계는 세포 분할을위한 핵시 의존성이다. 평면 부의 특정 세포의 핵을 제외하면,이 셀은 분석에 포함되지 않을 것이다. 이 경우 없음인접한 핵 또는 핵의 덩어리 사이 보이는 세포질은,이 종종 아니라 별개의 핵보다, 하나의 큰 핵 덩어리로 인식하고 있습니다. 일반적으로, 헤 마톡 실린의 Counterstain과는 핵 세분화와 대부분의 문제를 해결할 수 있습니다 핵 크기에 대한 최대 임계 값으로 허용 핵 분할 및 소프트웨어 설정의 조작 일반적으로 적절하다.

자동 병리 플랫폼의 최종 한계는 가난한 실험 설계에 의한 조직의 신뢰할 수없는 세그먼트입니다. 관심의 질문에 대답에 적합한 조직과 세포 바이오 마커를 선택의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않을 것입니다. 우리는 우리의 대표적인 결과에서 입증 된 바와 같이 조직 분할하는 알고리즘을 만들 때, 크게 질병 상태 사이의 표현을 변경하는 상피 또는 기질 마커는 문제를 제기 할 수 있습니다. 그것은 어려운 문제는 발생 때와 같이 분석 대안이 있다는 것을 주목할 필요가있다. 예를 들어, 개별 IMAGES 수동보다는 이미지 트레이닝 세트로부터의 알고리즘을 적용하는 것보다, 모든 조직 구획의 도면에 의해 분석 될 수있다. 이것은 완벽하게 사용자가하고자하는 것과 일치한다 분할의 이점을 제공하지만, 그것은 또한 주관 도입 크게 분석을 완료하는 데 필요한 시간을 증가시킬 수있다. 적절한 실험 설계 분석을 촉진하고 조직과 세포 분할의 정확성을 극대화 할 수있는 가장 쉬운 방법입니다.

이 기술 및 프로토콜은 많은 미래의 응용 프로그램이 있습니다. 특정 질병 상태에 대한 다수의 바이오 마커는 식별하지만 검증되지 않은. 멀티 스펙트럼 플랫폼과 높은 처리량 목표 분석은 이러한 바이오 마커의 유효성 검사를 용이하게한다. 또한, 표현과 여러 단백질의 공동 지방화의 평가는 저조한 이​​해 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 의심 할 여지없이, 면역 staini의 분석과 관련된 고유의 주체성을 감소NG는 단백질 마커의 넓은 범위의 발현 및 위치 파악을 이해하는데 유용하다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 시설과 서비스 사용을 위해, 병리 및 진단 검사 의학의 UW 부에 의해 지원되는 부분 UWCCC 부여 P30의 CA014520에, 병리 실험실에서 위스콘신 중개 연구 이니셔티브의 대학 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3F1GAL NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
Ethyl Alcohol-200 proof Fisher Scientific 4355223 NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0
Tris Base Fisher Scientific BP152-500 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl Fisher Scientific BP153-1 NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0
Tween 20 Chem-Impex 1512 NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP2944-100 NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0
Peroxidazed Biocare Medical PX968 Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage.
Estrogen Receptor alpha Thermo Fisher Scientific-Labvision RM9101 Not classified as hazardous
Androgen Receptor SCBT sc-816 Not classified as hazardous
CD147 Biodesign P87535M Not classified as hazardous
E-cadherin Dako M3612 Not classified as hazardous
Renoir Red Andibody Diluent Biocare Medical PD904 It is specially designed to work with Tris-based antibodies
DeCloaking Chamber  Biocare Medical Model DC2002 Take normal precautions for using a pressure cooker
Barrier pen-Immuno Edge  Vector Labs H-4000
Denaturing Kit-Elution step Biocare Medical DNS001H Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer Biocare Medical RHRP520 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer Biocare Medical RALP525 Not classified as hazardous
Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer Biocare Medical M3M530 Not classified as hazardous
Betazoid DAB Chromogen Kit Biocare Medical BDB2004 1. DAB is known to be a suspected carcinogen.
2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight.
3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing.
4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes.
5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal
Warp Red Chromogen Kit Biocare Medical WR806 Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. 
Vina Green Chromogen Kit Biocare Medical BRR807 Harmful if swallowed
Bajoran Purple Chromogen Kit Biocare Medical BJP807 Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation.
Cat Hematoxylin Biocare Medical CATHE Purple  solution  with  a  mild  acetic  acid  (vinegar)  scent.  May  be
 irritating  to  skin  or  eyes.  Avoid  contact  with  skin  and  eyes.  Avoid  ingestion.
XYL Mounting Media Richard Allen 8312-4 NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0
1.5 Coverslips Fisher Brand 22266858 Sharp edges
Incubation (Humidity)Chamber obsolete obsolete Multiple vendors available
Convection Oven Stabil- Therm C-4008-Q
Background Punisher Blocking Reagent Biocare Medical BP974 This product is not classified as hazardous. 
inForm software PerkinElmer CLS135781 Primary multispectral imaging software used in manuscript
Nuance software PerkinElmer Nuance EX Software used for making spectral libraries within manuscript
Vectra microscope and slide scanner PerkinElmer VECTRA Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes

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References

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멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량
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Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).More

Bauman, T. M., Ricke, E. A., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53837, doi:10.3791/53837 (2016).

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