Introduction
免疫组织化学（IHC）是组织中检测蛋白质的标准实验室技术，IHC仍广泛用于研究和诊断病理学。 IHC染色的评价往往是半定量，引入潜在的偏见到结果的解释。许多半定量方法已经开发了包含两个染色强度和染色程度成最终诊断1-4。其它系统包括，以更好地定位表达5得分强度和亚细胞定位。从多个观看者平均分数的掺入通常被用于以最小化单个观察者偏倚6的影响。尽管有这些努力，主观性分析仍然存在，评估染色7的程度时尤为如此。协议的标准化和减少主观性的人力投入是极为重要的创造准确，重现IHC结果。
内容“>还有除了IHC其他选项来确定组织中的表达。在研究设置，免疫组化历来被视为检验蛋白定位8的一种手段，而其他技术，如免疫印迹被视为黄金标准调查的表达。确定组织或细胞特异性车厢表达很难不采用先进的技术，如细 胞分馏或激光捕获显微切割9,10。在组织切片中使用荧光抗体提供了一个合理的妥协，但背景自发荧光由于NADPH，lipofuscins，网状纤维，胶原和弹性蛋白可以作出准确的定量困难11。自动计算病理平台是病理染色12-15的更客观的定量一个有前途的方向。结合组织芯片多光谱成像便于在大样本蛋白表达的高通量分析。用这些技术，蛋白的共定位，染色不均匀性，以及组织和亚细胞定位的分析是可能的，同时基本上降低了两个固有偏差和必要的分析时间，同时在连续返回数据，而不是绝对的格式16。因此，本研究的目的是为了展示与分析进行复用免疫组化，采用多光谱成像软件工具和方法。
该协议具有四个优化单克隆抗体单一组织切片上的手册，复用免疫组化染色写的。作为一个代表性实验，核抗兔雌激素受体α（ERα）和雄激素受体（AR）被复用膜结合的抗小鼠CD147和膜结合的抗小鼠E-钙粘蛋白。选择的任何抗体可substitut编为本文所列的抗体，但是抗体的每一个组合都需要单独的最优化。前处理的所有抗体必须相同。 AR和CD147抗体应单独再优化为鸡尾酒。每种抗体是使用无生物素的聚合物系统和4个独特的色原一个检测到。
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Protocol
注：此协议描述了染色和组织芯片（TMA）的分析，先前12,17,18描述。从使用标准切片石蜡块获得4微米厚的TMA部分。
注：对于4色原和染液谱库应进行图像定量创建。为了做到这一点，对于每个单独的抗体的优化的协议，应每滑动一种抗体，减去最终染液运行。第五幻灯片应该用苏木染色生成创建谱库所需要的5张图像。
1.多重免疫组化
- 烘烤载玻片在60℃的烘箱中20分钟。使用化学通风橱，浸泡在100％二甲苯滑动。重复二甲苯2的变化。浸泡在100％的乙醇滑动5分钟。用新鲜的100％乙醇重复。
- 沉浸在95％乙醇的幻灯片3分钟。用新鲜的重复95％的乙醇。沉浸在70％乙醇幻灯片3分钟。浸入蒸馏水幻灯片3分钟。用新鲜蒸馏水重复。点击幻灯片垂直于从幻灯片沥干水分。应用200微升准备使用的内源性过氧化物酶阻断剂5分钟。
- 从滑漏过氧化物阻断剂和在45ml浸入现成使用检索缓冲液（pH值小于7.0）。在高压锅地方滑动容器并开始程序设定为124℃进行4分钟。允许压力锅冷却20分钟。开幕前。
- 除去检索缓冲器的容器，并允许冷却另外10分钟。在冲洗蒸馏水滑10分钟。从幻灯片沥干水分，仔细勾画具有疏水屏障笔幻灯片组织。
- 加入200μl的磷酸缓冲盐水（PBS）.Transfer滑动的与盖（孵育室）含有湿润纱布扁平容器。
- 通过稀释50米1升的1x Tris缓冲盐水与吐温20（TBST）20倍的Tris l的缓冲含有1％吐温20和950毫升蒸馏水盐水。
- 从幻灯片排水PBS并应用200微升1X TBST的。孵育2分钟。从幻灯片排水TBST并返回到幻灯片孵化室。应用200微升准备使用的通用蛋白块，接近室孵育7分钟。
- 排水蛋白块，并返回到幻灯片孵化室。通过加入0.6微升抗体与239.4微升抗体稀释剂的400：稀释抗ERα抗体1。应用200微升稀释的抗体滑动并关闭室。
- 在室温下孵育幻灯片2小时。从滑漏抗体并用TBST随后浸渍在TBST 5分钟冲洗。
- 从幻灯片排水TBST并返回到幻灯片孵化室。应用200微升准备使用的山羊抗兔辣根过氧化物酶聚合物和关闭腔室。温育30分钟。在室温下。用TBST和地点滑动5分钟冲洗幻灯片在TBST的容器中。</ LI>
- 准备棕色辣根加入8微升DAB显色的250微升DAB底物缓冲液和混合以及色原过氧化物酶3,3'-二氨基联苯胺（HRP-DAB）。
- 从幻灯片，返回滑动到孵育室漏TBST和应用200μl的棕色HRP-DAB色原体的6分钟。彻底冲洗用蒸馏水和地方滑动的滑动中的蒸馏水的容器中。
- 通过组合50μl的用150微升第二缓冲试剂的第一次洗脱试剂的混合的变性溶液。排水关闭滑动并应用稀释变性溶液在滑动3分钟。在室温下。倒出和冲洗变性试剂与TBST。沉浸在TBST滑动5分钟。
- 通过稀释抗AR抗体的4.2微升和2.8微升抗CD147抗体与203微升抗体稀释剂准备AR / CD147抗体的鸡尾酒。从幻灯片排水TBST，返回幻灯片孵化室，并应用200微升AR / CD147的cocktail的幻灯片。靠近腔和孵育在室温下1小时。用TBST漂洗滑动并在TBST浸泡5分钟。
- 漏TBST，返回滑动到孵育室和应用200微升准备使用的山羊抗兔碱性磷酸酶聚合物。关闭室和30分钟孵蛋幻灯片。在室温下。用TBST漂洗滑动并在TBST浸泡5分钟。
- 准备加入3.2微升红色发色的250微升发色红缓冲色原红碱性磷酸酶拌匀。
- 从幻灯片排水TBST并返回到幻灯片孵化室。应用200微升稀释红色碱性磷酸酶色原到滑动，关闭腔室孵育7分钟。
- 排水显色进行彻底的冲洗用蒸馏水幻灯片。放置幻灯片中的蒸馏水的容器中5分钟。从滑动沥干水分，用TBST冲洗，并返回到孵育室。应用200微升山羊抗小鼠-HRP聚合物在滑动和闭Ë室。温育30分钟。在室温下。
- 从滑动漏极聚合物并用TBST冲洗。在TBST地方滑动5分钟。加入3.2微升稳定剂250微升缓冲的准备200微升紫色HRP联发色拌匀。加入3.2微升紫色显色拌匀，然后3.2微升过氧化氢试剂拌匀。
- 漏TBST关滑和应用200微升制备的紫色原的滑动并孵育7分钟。在室温下。用蒸馏水进行5分钟的容器蒸馏水和地方滑动漂洗幻灯片。
- 通过混合50微升用150微升第二缓冲试剂的第一次洗脱试剂的混合的变性溶液。排水关闭滑动并应用稀释变性溶液在滑动3分钟。在室温下。
- 变性冲洗掉试剂用TBST。放置在TBST的容器滑动5分钟。稀释抗E-cadherin抗体到1：200，加入1.1微升抗体218.9微升抗体稀释剂。从幻灯片，幻灯片回报孵化室沥干TBST并应用200微升E-cadherin的的幻灯片。关闭室和孵化30分钟。在室温下。
- 在TBST集装箱TBST和地点滑动5分钟冲洗幻灯片。从滑漏TBST，返回滑动到孵育室和应用200μl的山羊抗小鼠HRP聚合物。在室温下孵育30分钟。在TBST集装箱TBST和地点滑动5分钟冲洗幻灯片。
- 准备黑HRP联通过添加8微升显色的250微升缓冲色原。应用200微升色原滑动并开发2分钟。彻底冲洗用蒸馏水滑梯和蒸馏水浸泡的容器。
- 加入40微升苏木200微升蒸馏水稀释苏木。从幻灯片沥干水分，并应用200微升稀释苏木以30秒滑动。幻灯片冲洗彻底自来水进行2分钟，然后在蒸馏水中漂洗30秒。在60℃的烘箱中15-30分钟处滑动。
- 浸入新鲜配制的100％二甲苯幻灯片30秒，擦去多余的二甲苯起飞和永久性补充安装介质一滴。用1.5号盖玻片盖玻片。
2.自动图像采集与分析
- 加载彩色幻灯片到自动幻灯片扫描仪。基于直径，分离和数目TMA核，创建根据制造商的说明书的自动扫描协议。
- 开放式多光谱成像软件构建同个别发色团和苏木精滑染色对照切片谱库。打开从控制幻灯片获取的图像立方体，并选择四到五个阳性染色领域，光学定义显色。与其他控制幻灯片图像立方体重复，直到一个完整的光谱库representi纳克所有的色原被创建，然后保存光谱库。
- 开始多光谱成像软件中的一个新项目。选择“多光谱（.im3）”为样本格式图像格式选项和“明场”。 “段组织”，“查找功能”，“表现型”，“分数”和“出口”：第一，选择需要的选项配置项目。在这一点上，图像分辨率可以改变，如果需要的，以加快分析时间。
3.组织分割
- 导入以前创建的光谱库，然后选择要包含在分析所有的色原。
- 要包含在训练数据通过选择“打开图像立方”选项设置打开的图像立方体。以保证训练精度，选择图像的总数的至少18％进行分析。选择一个代表所有疾病状态，以提高分割精度的图像。图像的这一部分我叫做图像的训练集。
- 白平衡图像通过选择吸管工具，并选择在一个图像是白色的区域设置了培训。
- 选择“高级”按钮移动到组织分割。用“组织类别”面板以选择的组织类型进行分析（ 即 “组织”和“非组织”）。为了更准确的蛋白质组织定位，多个组织类可以使用（ 即 ，“上皮”，“基质”和“非组织”）。
- 开始创建算法和训练图像中绘制细胞周围的群体界定组织类别。当一个组织类别完成后，重复其他组织类别。一定要属于该组织类别类型的特征图像中选择的细胞群体。
- 重复此过程训练组图像内的所有图像。
- 选择组件（发色团）被列入TRAI宁为“组织分段”。当执行明场免疫图像的分析中，所有部件通常包括在训练。包括设置，以避免在此步骤偏见培训丰富负染图像。
- 选择一个合适的“图案比例”用于训练组织分段。在20X的放大倍率，大格局规模通常是合适的。当组织更高的放大倍率下工作有精美的建筑，更小的图案比例是比较合适的。
- 选择“列车组织分段器”按钮，开始训练的组织分段。观察一个弹出框，显示精度反映训练区域内的像素被正确分类的比例。
注：该软件不断尝试提高算法的准确度，直到手动停止。之前我们已经证实的在97％训练精度12图像效果18％的培训。 组织分割器被训练后，选择相应的分段分辨率。段分辨率对应所需图像分割的时间，与需要较少的时间和精细的分辨率需要更多的时间粗分辨率。 - 段通过点击“图像分割”整个训练集图像。让软件充分的时间算法适用于所有训练图像。完成后，查看训练集找到与当前的训练算法错误分类组织。
- 要微调组织分割过程中，添加，编辑或删除组织培训的区域。如果像素在一个组织类别的边缘到另一个延长使用“修剪边”选项。如果小的像素组合会被误判，调整最小段大小的阈值。
- 当编辑完成后，选择“图像分割”，这将重新训练组织分段创建组织分割的新算法。以前的算法是自动保存，并且可以返回到如果需要的话。
- 当有信心组织分割算法的结果，通过选择“高级”按钮，进入到细胞分割。
4.细胞分割
- 被包括在小区分段选择亚细胞区室。确保“核”已被选中，选择“细胞质”或“膜”。
注意：当特定的膜蛋白标志物包括在IHC，如E-钙粘蛋白只应选择“膜”分割。 - 内的“核”选项卡中，有几个选项。通过选择核分割相应的设置开始（见步骤4.3）。选择单个或所有组织类别是否会被纳入分割。
- 选择核分割的方法
- 选择染液“基于像素（阈值）”的方式为获得良好的简化方法结果不知道太多关于图像处理的设置。
注：这往往使一个良好的第一选择。当选择的方法，“基于像素（阈值）”更合适时，有一个可靠的核反击污点，而如果是缺乏一致的核染液的“基于对象”应使用。 - 选择“基于像素（阈值）”的方法时，有一个可靠的核染液。
注：此方法是纯粹基于像素的。这种方法也可用于其它图像分析需要，可以用一个简单的阈值来满足，如组织类别，对于一个IHC染色染色阳性内检测所有像素。 - 选择基于对象的方法，如果核染液不提供核对象的一致性和特异性染色，并且需要更高级的基于形态的办法来检测核。
- 选择“组件核分割”，“Nucl果穗大小“和”清理“，如果用户想进一步确定核分段设置。
- 选择染液“基于像素（阈值）”的方式为获得良好的简化方法结果不知道太多关于图像处理的设置。
- 选择细胞质形状参数
- 选择“高级”按钮移动到细胞质分割。
注：有胞浆内分割几个选项可供选择。被称为“内距离核心”的选择是基于像素。它反映核的外侧和细胞质的内侧之间的距离。增加该值越小，核信号跨越到细胞质车厢的概率。 - 接着选择“外距离核心”。
注：这也是基于像素。到核外距离反映核的外侧和电池的外侧之间的距离。这个值可以被设置为大或小到足以包括或者如果需要排除膜的信号。 - 接着选择“最小尺寸”。
注：最小尺寸，PIXE基于升，反映了要包括在分析的最小细胞质样本大小。如果细胞质大小是在特定细胞较小，如当细胞被紧密地挤在一起，这种细胞质分割排除分析。 - 选择下一个选项，“分量”与“小”，“中等”，然后选择“第三”作为次要选项。
注：在这里，人们可以选择一个特定的细胞质标记。类似于核分割，如果特定胞质IHC标记已被使用，该组件可以用于通过寻找最小阈值来定义细胞质。这有助于限定细胞质但没有必要为可接受的准确度。 - 移动到最后的三个标签选项是“膜”。这里，用户可以定义与蛋白标记在膜隔室。选择“主要”，“次要”和/或“三级”为每个使用的膜特异性标记物。调整“满量程ØD“找到一个最低门槛，或积极为细胞膜上的每个标记。
- 在“膜”标签下继续并选择选项“最大单元格大小”。
注意：这是对膜的值的距离，以像素为单位，指定了细胞的最大尺寸。 12的值通常适合于在20X放大倍率拍摄的图像。 - 选择所有选项后，选择“图像分割”或“段全部”。应用设置图像和“单独”或“画廊”模式观察他们。
注：如有必要，调整设置和阈值，并重新细分，直至满足于训练集图像的细胞分割结果。
- 选择“高级”按钮移动到细胞质分割。
5.表型细胞
注：精确细胞分割中需要为了获得准确的细胞表型，和表型特性是可训练。
- 使用“添加＆＃34;按钮，表型添加到“表型”名单。用户可以选择用于表型的颜色。
- 点击“编辑表型”，以表型分配给小区。点击一个特定的细胞，弹出一个下拉菜单，允许用户选择的表型，然后继续前进。确定，以便继续在各表型至少五（5）细胞。选择每个表型的25个或更多的细胞，需要以达到最佳效果。
6.得分IHC和共定位
- 选择“高级”移动到“分数IHC或IF”的一步。选择一个“组织类别”得分。
注意：只有一个组织类别可在特定的分析期间进行评分，但是，如果在另一组织类别的得分结果需要，该分析可以在以后使用不同的设置重复。 - 选择所需的“得分王”的类型。
注意：正性对于感兴趣的组件创建两个仓（正和负），而双阳性用于共定位分析。其他选项包括4槽，10槽和50槽分析了选择的标记。 - 选择细胞“室”，在得分分析中使用。
- 寻找的主要核部件的最低门槛类似，选择“查看组件数据”移动光标在训练图像找到染色的适当的光学密度最低标准，为感兴趣的成分（S）阳性细胞。
- 如果强烈染色的细胞是被排除在外，将阈值降低最大到适当的水平。否则，使用自动按钮选择一个阈值最大的进行分析。
- 选择训练图像，以便验证阈值的得分。
注：细胞的特定仓中的百分比将被返回，并且可以通过目测或人工计数进行比较。完成后，选择“高级”，进入“导出”的一步。
- 通过导出数据对于训练集测试穿过组织分割，细胞分割，和得分值创建的算法。按照提示的出口目录中创建一个新的文件夹。要创建并包含在分析中选择的图像和表格。通过选择“导出为人人”进行分析。
- 表导出在制表符分隔文本文件，可以在大多数数据分析程序打开。
- 当分析完成后，查看电池分段和得分数据与高温和低温染色，以评估设置精度的图像。
- 当设置满意，从申请通过批量分析训练集图像，以整组图像创建的算法。点击“批量分析”选项卡，打开算法从活动项目中复制。
- 选择一个新的出口目录并选择图像和TABLES将被包括在分析中。在输入文件选项，选择“添加图片”，然后选择要包含在批次分析中的所有图像。
- 通过选择“运行”选项进行分析。与训练组的分析，这一步骤将要求可变的时间量，这取决于特定的设置和包括在分析中的图像的数目。
- 完成后，前进到“查看/合并”选项卡。批处理目录默认为从批次分析导出目录和如果需要，可以改变。选择“包含所有”，然后选择“合并”来创建用于分析数据的汇总数据表。
8.导出数据的分析
- 打开出口表中的数据分析软件，并删除或隐藏数据列是无关的分析，如最大和最小值为每个组件。在分析中使用的主要数据是在平均光密度Çolumn为每个组件。
- 回顾远销的分割地图和原始图像，以确定哪些样本或TMA核心是要从分析中排除。组织百分比值帮助确定样品是否应当包括或不与最常用于排除标准的<5％的任意截止。
- 删除不相关的数据或包含样本行从数据分析中排除。
- 使用蛋白质定量数据来研究疾病状态的变化或与疾病12,18-21的临床病理特征的关系。
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Representative Results
在图1中 ，训练是在前列腺组织进行图像分割成上皮细胞和基质部，与非组织隔室沿。通过使用上皮细胞膜标记物E-钙粘蛋白，进行小区分割至细胞核，细胞质和膜的部分，在图2所示分开。
在一项实验中，我们使用多路复用IHC研究AR，ERα，E-钙粘蛋白，和CD147的表达和定位， 如图3。使用这些技术，我们能够识别阳性细胞都ERα和核表达AR（ 图3B - 3C）尽管重叠比色信号，如示出在图3A绿色箭头。我们发现在双阳性基质细胞PR的不同状态中的比重显着差异ostate疾病（ 图3D）。我们量化CD147细胞特异膜表达通过使用E-cadherin的一个标志物蛋白（ 图3A红色箭头），以及我们要探讨前列腺组织细胞膜具体CD147表达第一组。我们发现在CD147表达相关联的前列腺癌的进展（ 图3E）一个显著下降，并发现与手术后的预后19的重要关联。
有些情况下可怜的实验设计，可导致不准确的组织分割。在图4中 ，施加到一组组织的算法没有准确段上皮细胞和基质区室（ 图4C）。在该实验中，α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）被用来标记基质隔室。因为α-SMA和平滑肌在一些肿瘤减小或丧失（Figu重新4A），通过组织分割（ 图4B）中创建的算法无法从单独形态数据上皮细胞和基质室之间准确区分。护理应组织或细胞室选择蛋白质标记时服用。
图1：组织分割使用多光谱成像软件 。前列腺组织芯片采用免疫组化复为雄激素受体（AR），雌激素受体α（ERα），E-cadherin的，和CD147染色。一组训练图像导入到代表组织类型和整组图像（A）的疾病状态的多光谱成像软件。组织类别创建包括基质（绿），上皮细胞（红色），以及非组织（蓝色），以及类是通过在顶部手动绘图定义的训练图像（B）。在训练图像绘制后，组织分割算法创建并应用到训练集图像（C）的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：小区分割成核，细胞质，细胞膜和车厢 。核舱通过设置最低门槛为苏木复染（A）细胞分割定义。细胞质通过使用软件（B）的范围内预先设定的算法中所定义的核。 E-钙粘蛋白被用作膜标记和最小平均OD值阈值以确定适用于膜隔室（C）。这项技术的所有OWS在所有亚细胞器（D）蛋白表达的同时定量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：共定位和膜蛋白特异性表达分析 。复IHC被用来研究雄激素受体 （AR），雌激素受体α（ERα），E-cadherin的，和CD147（A）的表达和定位。 DAB（棕色发色）用于标记AR（B）和用于标记ERα（C）红色的发色。我们能够确定空间上重叠的生物标志物（绿色箭头A）和量化（D）的与ERα和AR的核的共定位细胞的比例前列腺内间质。通过使用E-钙粘蛋白（黑色原）来定义质膜（ 所述的红色箭头），我们量化前列腺组织（E）19中CD147的特异性膜表达。用于统计分析，方差分析（ANOVA）单向，误差线反映平均值的标准误差，以及星号表示P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：不足组织分割从实验设计所致 。良性和恶性前列腺组织进行染色α平滑肌肌动蛋白（α-SMA;绿色原），雄激素受体（红色原），和雄激素受体变异体7（DAB色原）。 α-SMA用作和基质的标记物在某些肿瘤减小，包括前列腺（A）中。当进行培训（B），并应用组织分割算法，基质和上皮车厢都充分分段由于没有α-SMA染色（C）的。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
使用用于评估蛋白表达的传统免疫组织化学被分析22,23的主观的，半定量法的限制。提前平台已经为生物标志物的表达和定位的高通量分析创建。两个组织和亚细胞区室的详细分割允许用户来研究生物标志物表达，定位，和共定位与其他感兴趣的标记。在以前的研究中，我们已经证明IHC和多光谱成像，用于研究定位于相同的细胞隔室18,20,21的蛋白质尤其是当的效用。当组织芯片结合24，这些技术允许蛋白表达的更快，更客观的定量所允许的人工分析由病理学家。
与使用免疫组化的蛋白定量的一个问题是结果的不可再现由于subjec分析及技术和试剂的内在差异性略去。使用如多光谱成像的平台，用于测量蛋白表达的显著优点是结果的可重复性。从计算机化病理平台的数据与手动分析由病理学家高度相关，而在连续的格式返回数据，并且基本上减少了工作时间，特别是在大样本时大小12,16,25。研究在不同的多光谱平台14之间的结果表明高的整体一致性。此外，我们已经证实了染色结果是高度可重复的，即使在有变异蛋白的数量调查12。使用两种染色和分析的自动化病理平台不会消除在结果中，如那些从对不同的表位产生的抗体所产生的所有差异，但这些平台基本上减少偏差和红外重复性通常与免疫有关。
但是也有一些用于返回准确的，可重复的结果所必需的协议中的特定步骤。要包含通过蛋白质的选择合适的实验设计的组织或亚细胞标记是准确的分割很重要的。当执行阳性分析，为阳性染色低级阈的选择对最终结果有很大的影响。而选择的阈值为“开/关”的蛋白质，如核转录因子是相当简单的，发现用于更不均匀表达的蛋白质的阈值是困难的。这最好应协同委员会认证的病理学家泌尿生殖或多个观察员的平均得分找到分析理想的门槛进行。
认识到这种技术的当前版本的一些限制是重要的。当取消澄清细胞质隔室，三种方法可用于：（1）与特定的细胞质标记物染色，（2）与特定的膜标记物染色和使用核到膜标记的距离为细胞质，和（3）使用绘图的方法来在相对于核手动定义细胞质的边界。根据我们的经验，使用特定的膜标记物是最准确的方法。的手工绘图方法通常是准确如果核被位于中央的，或者如果所关注的生物标记物被均匀地在整个细胞质分布。准确限定的基质细胞样的成纤维细胞和平滑肌细胞的细胞质中仍然是困难和设计实验时，应考虑。
该技术的另一个限制是用于小区分割在细胞核的依赖性。如果截面的平面中排除特定细胞的细胞核，该小区将不被包括在分析。如果不存在相邻的核或核的团块之间的可见细胞质中，这些通常被认为是一个大疙瘩核武器，而不是明显的细胞核。一般来说，苏木染液通常就足够可以接受的核分割，以及软件的设置操作，如为核心的大小可以解决核分割的大多数问题的最大阈值。
自动病理学平台的最后一个限制是来自贫困实验设计造成组织不可靠的分割。选择合适的组织和细胞生物标志物回答所关注的问题的重要性怎么强调也不过分。正如我们在代表性的结果表明，这种疾病状态之间显著改变表达上皮间质或可标记创建组织分割算法时产生问题。值得注意的是，有其他选择的时候很难分析是这样产生的。例如，个别IMAGES可以通过手动绘制所有组织区室，而不是通过从训练图像集的应用算法进行分析。这提供了分割的优点是完全符合用户期望什么线，但它也介绍了主体和可显著增加来完成的分析所需的时间。合适的实验设计是加快分析和最大化组织和细胞分割的准确度的最简单的方法。
该技术和协议有许多未来的应用。特定疾病状态的生物标志物的许多已经确定，但不进行验证。多光谱平台的高通量客观分析，有利于这些生物标志物的验证。此外，表达和多种蛋白质的共定位的评估可以提供深入了解难以理解的信号通路。毫无疑问，降低免疫组化staini分析相关的内在主观性纳克对于理解广泛的蛋白质标志物的表达和定位有价值。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢威斯康星转化研究倡议的大学病理实验室，由病理及实验室医学系UW支持一部分，UWCCC授予P30 CA014520，使用其设施和服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
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