Introduction
Immunhistokjemi (IHC) er en standard lab teknikk for påvisning av protein i vev, og IHC er fortsatt mye brukt i både forskning og diagnostisk patologi. Evalueringen av IHC-farging er ofte semikvantitativ, innføre mulig skjevhet i tolkning av resultater. Mange semi-kvantitative metoder har blitt utviklet som innlemme både fargeintensitet og farging grad til endelig diagnose 1-4. Andre systemer inkluderer scoring intensitet og subcellulære sted for å bedre lokalisere uttrykket 5. Inkorporering av gjennomsnittlige poeng fra flere seere er ofte benyttet for å minimalisere virkningene av enkelt betrakteren skjevhet 6. Til tross for dette, er fremdeles subjektivitet i analysen, spesielt når man skal vurdere omfanget av flekker 7. Protokoll standardisering og minimere subjektivitet fra menneskelig input er avgjørende for å skape nøyaktige og reproduserbare IHC resultater.
innhold "> Det finnes andre muligheter i tillegg til IHC for bestemmelse av protein ekspresjon i vev. Innenfor forskning innstilling, har immunhistokjemi tradisjonelt blitt sett på som et middel for å undersøke protein lokalisering 8, mens andre teknikker så som immunoblotting blir sett på som gullstandard for å undersøke protein ekspresjon . Bestemme vev eller cellerommet spesifikke uttrykk er vanskelig uten å innlemme avanserte teknikker som cellefraksjonering eller laser capture mikrodisseksjon 9,10. bruken av fluorescerende antistoffer på vev lysbilder tilbyr et rimelig kompromiss, men bakgrunnen autofluorescence grunn av NADPH, lipofuscins, retikulære fiber, kollagen og elastin kan gjøre nøyaktig kvantifisering vanskelig 11.Automatiserte beregnings patologi plattformer er en lovende retning for mer objektiv kvantifisering av patologi farging 12-15. Kombinere multispektrale bildebehandling med microarraymuliggjør high-throughput analyser av protein uttrykk i store utvalgsstørrelser. Med disse teknikkene, er analyse av protein co-lokalisering, beising heterogenitet, og vev og subcellulær lokalisering mulig samtidig vesentlig reduksjon både iboende skjevheter og tiden som er nødvendig for analyse, mens retur av data i en kontinuerlig snarere enn kategoriske format 16. Derfor er hensikten med denne studien var å demonstrere nytten av og metode for å utføre multipleksede immunhistokjemi med analyse, ved hjelp av multispektrale bildebehandling.
Denne protokollen er skrevet for manuell, multipleks immunhistokjemisk farging av en enkelt vev seksjon lysbilde med fire optimaliserte monoklonale antistoffer. Som et representativt eksperiment, blir kjernefysisk-anti-kanin østrogen reseptor alfa (ERα) og androgenreseptoren (AR) multiplekset med membran-bundet anti-mus CD147 og membran-bundet anti-mus-E-cadherin. Enhver antistoff av valget kan substituted for antistoffer oppført her, men hver kombinasjon av antistoffer krever egen optimalisering. Forbehandling for alle antistoffene må være identiske. De AR og CD147 antistoffer bør optimaliseres individuelt og deretter som en cocktail. Hvert antistoff blir påvist ved å bruke et biotin-fri polymer-system og en av 4 unike kromogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen her beskriver farging og analyse av en vev microarray (TMA), beskrevet tidligere 12,17,18. Den 4 mikrometer tykk TMA delen ble hentet fra en parafinblokken ved hjelp av en standard mikrotom.
MERK: En spektral bibliotek for de 4 kromogenene og farge bør opprettes for bilde kvantifisering. For å gjøre dette, bør den optimalisert protokoll for hver enkelt antistoff kjøres med en antistoff per lysbilde, minus den endelige counterstain. En femte lysbildet skal være farget med hematoksylin å generere de 5 bilder som er nødvendig for å skape den spektrale biblioteket.
1. Multiplex Immunohistokjemi
- Bake lysbilder i en 60 ° C ovn i 20 min. Ved hjelp av en kjemisk avtrekkshette, fordype raset i 100% xylen. Gjenta for 2 endringer xylen. Fordyp raset i 100% etanol i 5 min. Gjenta med frisk 100% etanol.
- Fordyp raset i 95% etanol i 3 min. Gjenta med frisk95% etanol. Fordyp raset i 70% etanol i 3 min. Fordyp raset i destillert vann i 3 min. Gjenta med frisk destillert vann. Tap lysbildet vertikalt for å drenere vann fra raset. Påfør 200 ul klar til bruk endogen peroksidase blocker i 5 min.
- Drain peroksidase blocker fra raset og dyppe i 45 ml klar til bruk henting buffer (pH mindre enn 7,0). Sted lysbilde beholder i en trykkoker og starte program innstilt på 124 ° C i 4 min. Tillat trykkoker avkjøles i 20 min. før åpning.
- Fjern beholder med henting buffer og la den avkjøles ytterligere 10 min. Skyll lysbildet i destillert vann i 10 min. Tapp vann fra raset og nøye avgrense vev på lysbildet med en hydrofob barriere penn.
- Tilsett 200 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) .Transfer lysbilde til en flat beholder med lokk (inkubasjon kammer) med fuktig gasbind.
- Forbered en liter 1x Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST) ved å fortynne 50 ml 20x Tris-bufret saltvann inneholdende 1% Tween-20 og 950 ml destillert vann.
- Drain PBS fra lysbilde og gjelder 200 mL av 1x TBST. Inkuber 2 min. Drain TBST fra lysbilde og returnere lysbilde til inkubasjon kammer. Påfør 200 ul klar til bruk universell protein blokk, tett kammer og inkuber i 7 min.
- Drain protein blokk og tilbake lysbilde til inkubasjon kammer. Fortynn anti-ERα antistoff 1: 400 ved tilsetning av 0,6 pl av antistoff til 239,4 mL av antistoff-fortynningsmiddel. Anvende 200 pl fortynnet antistoff til å gli og tett kammer.
- Inkuber lysbilde ved romtemperatur i 2 timer. Drain antistoff fra raset og skyll med TBST fulgt av nedsenking i 5 min i TBST.
- Drain TBST fra lysbilde og returnere lysbilde til inkubasjon kammer. Anvende 200 ul klar-til-bruk geite-anti-kanin-pepperrot peroksydase polymer og tett kammer. Inkuber i 30 min. ved romtemperatur. Skyll lysbilde med TBST og sted lysbilde i beholder med TBST i 5 min. </ Li>
- Forbered brun pepperrotperoksidase-3,3'-diaminobenzidin (HRP-DAB) kromogen ved å legge til 8 mL DAB kromogen til 250 mL DAB substrat buffer og blande godt.
- Drain TBST fra raset, retur lysbilde for inkubasjon kammer og anvende 200 ul brun HRP-DAB kromogen for 6 min. Skyll lysbildet med destillert vann og sted lysbilde i en beholder med destillert vann.
- Bland denaturerende oppløsning ved å kombinere 50 pl av den første reagensen eluering med 150 pl av den andre buffer reagens. Tapp vann av raset og bruke fortynnet denaturering løsning på lysbildet for 3 min. ved romtemperatur. Dekanter og skyll denaturering reagens med TBST. Fordyp raset i TBST i 5 min.
- Forbered AR / CD147 antistoff cocktail ved å fortynne 4,2 ul av anti-AR-antistoff og 2,8 ul av anti-CD147 antistoff med 203 ul av antistoff-fortynningsmiddel. Tapp TBST fra raset, tilbake lysbilde for inkubasjon kammer og anvende 200 ul AR / CD147 cocktail til raset. Lukk kammeret og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Skyll lysbilde med TBST og lev i TBST i 5 min.
- Drain TBST, retur lysbilde for inkubasjon kammer og anvende 200 ul klar til bruk geit anti-kanin alkalisk fosfatase polymer. Lukk kammer og inkuber lysbildet i 30 min. ved romtemperatur. Skyll lysbilde med TBST og lev i TBST i 5 min.
- Forbered rød alkalisk fosfatase kromogen ved å tilsette 3,2 mL av rød kromogen til 250 mL rød kromogen buffer og bland godt.
- Drain TBST fra lysbilde og returnere lysbilde til inkubasjon kammer. Påfør 200 mL fortynnet rød alkalisk fosfatase kromogen til raset, tett kammer og inkuber i 7 min.
- Drain kromogen og skyll grundig lysbilde med destillert vann. Plasser lysbilde i en beholder med destillert vann i 5 minutter. Tapp vann fra raset, skyll med TBST og gå tilbake til inkubasjon kammer. Påfør 200 mL geit anti-mus-HRP polymer til raset og close kammeret. Inkuber i 30 min. ved romtemperatur.
- Tapp polymer fra raset og skyll med TBST. Plasser lysbilde i TBST i 5 min. Fremstille 200 ul lilla HRP-bundet kromogen ved tilsetning av 3,2 pl av den stabiliserende reagens til 250 ul av bufferen og bland godt. Legg 3.2 mL av lilla kromogen og bland godt, deretter 3,2 pl av hydrogen peroxide reagens og bland godt.
- Tapp TBST på skyv og anvende 200 ul forberedt lilla kromogen å skyve og inkuberes i 7 min. ved romtemperatur. Skylling lysbilde med destillert vann og plass lysbilde i en beholder med destillert vann i 5 minutter.
- Bland denaturerende oppløsning ved blanding av 50 pl av den første reagensen eluering med 150 pl av den andre buffer reagens. Tapp vann av raset og bruke fortynnet denaturering løsning på lysbildet for 3 min. ved romtemperatur.
- Skyll denaturering reagens med TBST. Plasser lysbilde i beholder med TBST i 5 min. Fortynnet anti-E-cadherin antistofftil 1: 200 ved tilsetning av 1,1 ul antistoff til 218,9 mL antistoff-fortynningsmiddel. Tapp TBST fra raset, retur lysbilde for inkubasjon kammer og anvende 200 ul E-cadherin til raset. Lukk kammeret og inkuber i 30 minutter. ved romtemperatur.
- Skyll lysbilde med TBST og sted lysbilde i beholder med TBST i 5 min. Tapp TBST fra raset, tilbake lysbilde for inkubasjon kammer og anvende 200 ul geit anti-mus HRP polymer. Inkuber ved romtemperatur i 30 min. Skyll lysbilde med TBST og sted lysbilde i beholder med TBST i 5 min.
- Forbered svart HRP-linked kromogen ved å legge til 8 mL av kromogen til 250 mL buffer. Anvende 200 pl kromogen for å skyve og utvikle seg i 2 min. Skyll lysbildet med destillert vann og legg de i beholder med destillert vann.
- Fortynn hematoxylin ved å tilsette 40 ul hematoxylin til 200 pl destillert vann. Tapp vann fra sklie og gjelder 200 mL fortynnet hematoxylin å gli i 30 sekunder. Skyll lysbildegrundig rennende vann i 2 min., skyll deretter i destillert vann i 30 sekunder. Plasser lysbilde i en 60 ° C ovn i 15-30 min.
- Fordyp raset i nylaget 100% xylen i 30 sekunder, og tørk overflødig xylen av og legge en dråpe permanente monterings medier. Dekkglass med en nr 1,5 dekkglass.
2. Automated Image Acquisition og analyse
- Last farget lysbilder på en automatisert lysbilde skanner. Basert på diameter, separasjon, og antall TMA kjerner, opprette en automatisk skanning protokollen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Åpne multispektrale bildebehandling programvare for å bygge en spektral bibliotek fra slides farget med individuelle kromogenene og hematoxylin farget lysbilde. Åpne et bilde kube kjøpt fra en kontroll lysbilde, og velg fire til fem positivt fargede områdene til optisk definere som kromogen. Gjenta med bilde kuber fra andre slides til en komplett spektral bibliotek representing alle kromogenene er opprettet, og deretter lagre den spektrale biblioteket.
- Begynn et nytt prosjekt innen multispektrale bildebehandling. Velg "multispektrale (.im3)" for bildeformat alternativet og "Lysfelt" for prøven format. Først konfigurerer prosjektet ved å velge ønskede alternativer: "Segment Tissue", "Finn funksjoner", "fenotyping", "Score" og "Export". På dette punktet kan bildeoppløsningen bli endret for å påskynde analysetid hvis ønskelig.
3. Tissue Segmentering
- Importer tidligere opprettet spektral biblioteket og velge alle kromogenene å bli inkludert i analysen.
- Åpne bilde kuber som skal inngå i opplæringsdatasettet ved å velge "Åpne bilde Cube" alternativet. For å sikre nøyaktighet trening ved å velge minst 18% av det totale antall bilder som skal analyseres. Velg bilder som representerer alle sykdomstilstander å øke segmentering nøyaktighet. Denne delen av bilder is kalt opplæring sett med bilder.
- Hvitbalanse bilder i treningssett ved å velge pipetteikonet og velge et område i ett bilde som er hvit.
- Velg "Advance" -knappen for å flytte til vev segmentering. Bruk "Tissue kategorier" panel for å velge vevstyper som skal bli analysert (dvs. "tissue" og "ikke-vevet"). For en mer nøyaktig lokalisering protein vev, kan flere vev kategorier brukes (f.eks. "Epitel", "stroma," og "ikke-vevet").
- Begynne å lage algoritmen og definere vev kategorier ved å tegne rundt grupper av celler i treningsbilder. Når du er ferdig med en vev kategori, gjenta for andre vev kategorier. Pass på å velge grupper av celler i bilder som er karakteristisk for at vevet kategorien type.
- Gjenta denne prosessen for alle bildene i opplæringen sett med bilder.
- Velg komponenter (kromogene) skal inngå i training for den "Tissue Segmenter». Når du utfører analyser av lysfelt immunhistokjemi bilder, er alle komponenter som normalt inngår i opplæringen. Omfatte rikelig negativ fargebilder i treningssettet for å unngå skjevhet under dette trinnet.
- Velg en passende "Oppskrifts Scale" for trening av vev Segmenter. Under 20X forstørrelse, er et stort mønster skala vanligvis hensiktsmessig. Når du arbeider med vev med en fin arkitektur i henhold til høyere forstørrelse, er et mindre mønster skala mer hensiktsmessig.
- Velg "Train Tissue Segmenter" -knappen for å begynne å trene vevet Segmenter. Observere en pop-up boks som viser nøyaktig gjenspeiler andelen av piksler innenfor opplærings regioner som er riktig klassifisert.
MERK: Programvaren stadig forsøk på å forbedre nøyaktigheten til algoritmen til stoppes manuelt. Vi har tidligere vist at trening på 18% av bildene resulterer i 97% opplæring nøyaktighet 12. Etter vevet Segmenter er trent, velge en passende segment oppløsning. Segment oppløsning tilsvarer tiden som kreves for å segmentere bilder med grov oppløsning krever mindre tid og fin oppløsning krever mer tid. - Segment hele opplæringen sett med bilder ved å klikke på "Segment bilder". La programvaren tilstrekkelig tid til å bruke algoritmen til alle treningsbilder. Når du er ferdig, kan du gjennomgå treningssett for å finne eventuelle feilklassifisert vev med dagens trening algoritmen.
- For å finjustere vev segmentering prosessen, legge til, redigere eller fjerne vev trening regioner. Bruk "trimme kantene" alternativ hvis piksler utvide på kantene av en vev kategori til en annen. Hvis små grupper av piksler er feilklassifisert, justere terskelen på minimum segmentstørrelsen.
- Når endringene er fullført, velg "Segment Bilder", dette vil re-trene vev Segmenter for å opprette en ny algoritme for vev segmentering. Den forrige algoritmelagres automatisk og kan returneres til om nødvendig.
- Når trygg med vev segmentering algoritmen resultater, videre til celle segmentering ved å velge "Advance" -knappen.
4. Cell Segmentering
- Velg de subcellulære avdelinger som skal inkluderes i celle segmentering. Pass på at "Nuclei" allerede er valgt for å velge "Cytoplasm" eller "Membran".
NB: "Membran" segmentering bør bare velges når en membran-spesifikt protein markør ble inkludert i IHC, for eksempel E-cadherin. - Innenfor "Nuclei" -kategorien, er det flere alternativer. Begynn med å velge riktige innstillinger for atom segmentering (se trinn 4.3). Velg om individuelle eller alle vev kategoriene vil bli inkludert i segmentering.
- Velg en tilnærming for atom segmentering
- Velg counterstain "Pixel-basert (Threshold)" tilnærming for en forenklet metode for å oppnå godresultater uten å vite mye om bildebehandlingsinnstillinger.
MERK: Dette gjør ofte et godt førstevalg. Når du velger en tilnærming, "Pixel-basert (Threshold)" er mer hensiktsmessig når det er en pålitelig atom mot flekken, mens "objektbasert" bør brukes hvis det er en mangel på konsekvent atom counterstain. - Velg "Pixel-Based (Threshold)" tilnærming når det er en pålitelig atom counterstain.
MERK: Denne tilnærmingen er rent pikselbasert. Denne tilnærmingen kan også brukes til andre bildeanalyse behov som kan være fornøyd med en enkel terskel, slik som å oppdage alle piksler i en vev kategori som beis positivt for en IHC flekken. - Velg Objekt-basert tilnærming hvis atom counterstain ikke gir konsistent og spesifikk farging av kjernefysiske objekter, og mer avanserte morfometri baserte tilnærminger er nødvendig for å oppdage kjerner.
- Velg "Komponenter for Nuclear Segmentering", "Nucløre Size "og" Clean-up "hvis brukeren ønsker å ytterligere definere kjerner segmentering innstillinger.
- Velg counterstain "Pixel-basert (Threshold)" tilnærming for en forenklet metode for å oppnå godresultater uten å vite mye om bildebehandlingsinnstillinger.
- Velg cytoplasma form parametere
- Velg "Advance" -knappen for å flytte til cytoplasma segmentering.
MERK: Det er flere alternativer innenfor cytoplasma segmentering å velge mellom. Alternativet kalles "indre avstand til kjernen" er pikselbasert. Det gjenspeiler avstanden mellom utsiden av kjernen og innsiden av cytoplasma. Øke denne verdien reduseres sannsynligheten for at kjernefysisk signal går over i cytoplasma rommet. - Neste velg "ytre avstand til Nucleus".
MERK: Dette er også pikselbasert. Den ytre avstand til kjernen reflekterer avstanden mellom utsiden av kjernen og på utsiden av cellen. Denne verdien kan settes stor eller liten nok til å inkludere eller ekskludere membran signaler om ønskelig. - Neste velg "minimumsstørrelse".
MERK: Den minste størrelsen, Pixel baserte, gjenspeiler den minste cytoplasma prøvestørrelsen som skal inkluderes i analysen. Dersom cytoplasma størrelsen er mindre i en bestemt celle, for eksempel når cellene er tett pakket sammen, er denne cytoplasma segmentering ekskludert fra analysen. - Velg neste alternativ, "Komponent" med "Primary", "Sekundær", og velg "tertiær" som sekundære alternativer.
MERK: Her kan man velge et spesifikt cytoplasma markør. I likhet med atom segmentering, hvis en spesifikk cytoplasmisk IHC markør har vært benyttet, denne komponent kan brukes til å definere cytoplasma ved å finne en minimumsterskelverdi. Dette bidrar til å definere cytoplasma, men er ikke nødvendig for akseptabel nøyaktighet. - Flytte til den siste av de tre faner alternativene er "Membran". Her definerer brukeren membranlomme med et protein markør. Velg "Primær", "sekundær" og / eller "tertiær" for hver membran spesifikk markør som brukes. Juster "Full Scale OD "for å finne et minimum terskel eller et positivt for hver markør på cellemembraner.
- Fortsetter under "Membrane" -fanen og velg alternativet "Maksimal Cell Size".
MERK: Dette er avstanden til membranen verdi i piksler, som angir den maksimale størrelsen på cellene. En verdi på 12 er normalt passende for bilder som er tatt på 20X forstørrelse. - Når du har valgt alle alternativene, velg "Segment Image" eller "Segment All". Bruke innstillingene på bildene og observere dem "enkeltvis" eller i "Galleri" modus.
MERK: Juster innstillinger og terskler om nødvendig, og re-segmentet før fornøyd med cellesegmenterings resultater i opplæringen sett med bilder.
- Velg "Advance" -knappen for å flytte til cytoplasma segmentering.
5. fenotyping Celler
MERK: Nøyaktig celle segmentering er nødvendig for å få nøyaktig celle fenotyping, og fenotyping funksjonen er trainable.
- Bruk "Legg &# 34; knappen for å legge fenotyper til "fenotyper" -listen. Brukere kan velge en farge for fenotype.
- Klikk på "Edit fenotyper" for å tildele en fenotype til en celle. Klikk på en bestemt celle for å få opp en rullegardinmenyen, slik at brukeren kan velge fenotype og deretter gå videre. Identifisere minst fem (5) celler i hver fenotype for å fortsette. Valg av 25 eller flere celler i hver fenotype er nødvendig for å oppnå optimale resultater.
6. Skåring IHC og samlokalisering
- Velg "Advance" for å flytte til "Score IHC eller HVIS" trinn. Velg en "Tissue Kategori" for å score.
MERK: Bare én vev kategorien kan bli scoret i løpet av en bestemt analyse, men hvis scoring resultatene i et annet vev kategorien er ønskelig, kan analysen gjentas senere med ulike innstillinger. - Velg en ønsket "scoring" type.
MERK: Positivitet skaper to binger (positive og negative) for en komponent av interesse, Mens dobbel positivitet anvendes for ko-lokalisering analyse. Andre muligheter er 4-bin, 10-bin, og 50-bin analyser for en markør av valget. - Velg cellen "Kammer" som skal brukes i scoring analyse.
- Ligner på å finne en minimumsgrense for den primære kjernefysisk komponent, velg "Vis Component Data" og flytte markøren over treningsbilder for å finne passende optisk tetthet minimumsgrensen på farging for positive celler om komponenten (e) av interesse.
- Hvis intenst fargede celler er å bli ekskludert, senke terskelen max til et passende nivå. Ellers bruker auto-knappen for å velge en terskel maksimum for analyse.
- Velg treningsbilder å score for å validere Terskelverdier verdier.
MERK: Prosentandelen av celler i en bestemt bin vil bli returnert, og kan sammenlignes ved visuell inspeksjon eller manuell telling. Når du er ferdig, velger du "Advance" for å gå videre til "Export" trinn.
- Test algoritmen skapt gjennom vev segmentering, celle segmentering, og poengverdier ved å eksportere data for treningssettet. Følg instruksjonene for å opprette en ny mappe for eksport katalogen. Velg bilder og tabeller som skal opprettes og inkludert i analysen. Utfør analyse ved å velge "Export for alle".
- Tabeller er eksportert i tab-separerte tekstfiler og kan åpnes i de fleste dataanalyseprogrammer.
- Når analysen er ferdig, viser cellen segmentering og scoring data for bilder med både høy og lav flekker å evaluere nøyaktigheten av innstillinger.
- Når du er fornøyd med innstillingene, gjelder algoritmen opprettet fra treningen sett med bilder til hele settet med bilder via batch-analyse. Klikk på "Batch Analysis" -fanen og åpnet algoritmen vil bli kopiert fra det aktive prosjektet.
- Velg en ny eksport katalog og velge hvilke bilder og tables som skal inngå i analysen. Under alternativet innspill filer, velger du "Legg til bilder" og velge alle bilder som skal inkluderes i batchen analyse.
- Utføre analysen ved å velge "Run" alternativet. Som med analysen av treningssettet, vil dette trinnet kreve en variabel mengde av gangen, avhengig av spesielle innstillinger og antall bilder som er inkludert i analysen.
- Når du er ferdig, gå til "Review / Merge" -kategorien. De batch katalog som standard eksport katalog fra batch analyse og kan endres hvis ønskelig. Velg "Inkluder All" og velg "Slå sammen" for å lage datablad med sammendragsdata for analyse.
8. Analyse av eksporterte data
- Åpne eksporterte tabeller i dataanalyse programvare og fjerne eller skjule datakolonner som er irrelevante for analyse, for eksempel minimums- og maksimumsverdier for hver komponent. Den primære data anvendt i analysen er i den midlere optiske tetthet column for hver komponent.
- Gjennomgang eksportert segmentering kart og RAW-bilder for å finne ut hvilke prøver eller TMA kjerner er å bli ekskludert fra analysen. Tissue prosentverdier bistå i å avgjøre om en prøve skal tas med eller ikke, med en vilkårlig cutoff på <5% brukes oftest for eksklusjonskriteriene.
- Fjern irrelevante data eller rader som inneholder prøver å bli ekskludert fra dataanalysen.
- Bruk protein kvantifisering data for å undersøke endringer i sykdomstilstand eller forholdet til klinisk-patologisk karakteristikk av sykdom 12,18-21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 er trening utført på prostata vev til å segmentere bilder til epitelceller og stromal deler, sammen med ikke-vevet rommet. Ved hjelp av epiteliale membran markør E-cadherin, ble cellesegmenterings utført for å skille kjernen, cytoplasma, og membranpartier, som er vist i figur 2.
I ett eksperiment brukte vi multiplekset IHC å undersøke ekspresjon og lokalisering av AR, ERα, E-cadherin, og CD147, som vist i figur 3. Ved å bruke disse teknikkene, er vi i stand til å identifisere celler som var positive for atom ekspresjon av både ERα og AR (figur 3B - 3C) til tross for overlapp kolorimetriske signaler, slik som vist med grønne piler i figur 3A. Vi fant tydelige forskjeller i andelen dobbelt positive stromale celler i ulike tilstander av prostate sykdom (figur 3D). Vi kvantifisert cellemembranen spesifikke uttrykk for CD147 ved hjelp av E-cadherin som en markør protein (røde piler i figur 3A), og vi var den første gruppen til å undersøke membran bestemt CD147 uttrykk i prostata vev. Vi har funnet en signifikant reduksjon i CD147 uttrykk i forbindelse med prostatakreft progresjon (figur 3E), og funnet en viktig sammenheng med post-kirurgiske prognose 19.
Det finnes tilfeller hvor dårlig eksperiment design kan føre til unøyaktig vev segmentering. I figur 4 algoritmen anvendt på et sett av vev ikke nøyaktig segment epitelisk og stromal kamrene (figur 4C). I dette eksperimentet, ble α-glattmuskel aktin (α-SMA) som brukes til å markere stromal rommet. Fordi α-SMA og glatt muskulatur er redusert eller tapt i noen tumorer (Figure 4A), algoritmen skapt gjennom vev segmentering (figur 4B) var ikke i stand til nøyaktig å skille mellom epiteliale og stromale kamrene fra morfometriske data alene. Forsiktighet bør utvises ved valg av proteinmarkører for vev eller cellekamre.
Figur 1: Tissue Segmentering Bruke multispektrale bildebehandling. En prostata vev microarray var farget ved hjelp av multiplex immunhistokjemi for androgen reseptor (AR), østrogen reseptor-alpha (ERα), E-cadherin og CD147. Et sett med treningsbilder ble importert til multispektrale bildebehandling representerer vevstyper og sykdomstilstander i hele sett med bilder (A). Tissue kategorier ble opprettet inkludert stroma (grønn), epitel (rød), og ikke-vevet (blå), og kategoriene ble definert ved manuelt å trekke på toppmed trening bilder (b). Etter tegning på treningsbilder, ble en algoritme for vev segmentering opprettet og brukt til opplæring sett med bilder (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Cell Segmentering i Nuclear, Cytoplasmatiske, og Membran avdelinger. Atomrommet ble definert for celle segmentering ved å sette en nedre grense for hematoxylin kontra (A). Cytoplasma ble definert i forhold til kjernen ved hjelp av forhåndsinnstilte algoritmer innenfor programvaren (B). E-cadherin ble anvendt som en membran markør og et minimum gjennomsnitts OD terskel ble brukt for å definere membrankammeret (C). Denne teknikken allestrømmer samtidig kvantifisering av protein uttrykk i alle subcellulære avdelinger (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Analyse av samlokalisering og Membran spesifikke Protein Expression. Multiplekset IHC ble anvendt for å undersøke ekspresjon og lokalisering av androgenreseptoren (AR), østrogenreseptor-alfa (ERα), E-cadherin, og CD147 (A). DAB (brun kromogen) ble anvendt for å markere AR (B) og en rød kromogen brukes til å markere ERα (C). Vi var i stand til å identifisere romlig overlappende biomarkører (grønne piler i A) og kvantifisere (D) andelen av celler med atom samlokalisering av ERα og ARinnen prostata stroma. Ved hjelp av E-cadherin (sort kromogen) for å definere plasmamembranen (røde piler i A), kvantifisert vi membran-spesifikk ekspresjon av CD147 i prostatavevet (E) 19. Enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for statistisk analyse, feilfelt reflektere standard feil av gjennomsnittet, og stjernene representerer p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Utilstrekkelig Tissue Segmentering Som følge av eksperimentell design. Godartet og ondartet prostata vev ble farget for α-glatt muskel aktin (α-SMA, grønn kromogen), androgen reseptor (rød kromogen), og androgen reseptor variant 7 (DAB kromogen). a-SMA ble anvendt somen markør av stroma og reduseres i noen tumorer, inkludert prostata (A). Når treningen ble utført (B) og vevet segmentering algoritme ble brukt, stromal og epitelceller avdelinger var tilsidesatt segmentert på grunn av fravær av α-SMA farging (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av tradisjonelle immunhistokjemi for å evaluere protein ekspresjon er begrenset av subjektive, semi-kvantitative analysemetoder 22,23. Advance plattformer har blitt opprettet for high-throughput analyser av biomarkør uttrykk og lokalisering. Detaljert segmentering av både vev og subcellulære avdelinger tillater brukere å studere biomarkør uttrykk, lokalisering og samlokalisering med andre markører av interesse. I tidligere studier har vi demonstrert nytten av IHC og multispektrale bildebehandling, spesielt når den brukes til å studere proteiner lokalisert til den samme cellulære rom 18,20,21. Når det kombineres med microarray for 24, disse teknikkene gi raskere og mer objektiv kvantifisering av protein uttrykk enn det som tillates manuell analyse av en patolog.
Ett problem med bruk av immunhistokjemi for protein kvantifisering er ureproduserbarhet resultater på grunn av subjective natur av analyse og iboende forskjeller i teknikken og reagenser. En vesentlig fordel ved bruk av plattformer som multispektrale avbildning for å måle protein ekspresjon er reproduserbarheten av resultatene. Data fra datastyrte patologi plattformer korrelerer sterkt med manuell analyse av en patolog ved retur data i en kontinuerlig format og betydelig redusere arbeidstiden, spesielt når du arbeider med store prøvestørrelser 12,16,25. Studier har vist høy total samstemmighet i resultater mellom ulike multispektrale plattformer 14. Videre har vi tidligere har demonstrert at fargingsresultater er meget reproduserbar, selv når det er variasjon i antall proteiner undersøkt 12. Bruken av automatiske patologi plattformer for både farging og analysen vil ikke eliminere alle avvik i resultatene, slik som de som stammer fra antistoffer opprettet mot forskjellige epitoper, men disse plattformene i vesentlig grad redusere skjevhet og irreproduserbarhet vanligvis forbindes med immunhistokjemi.
Det er særlig trinnene i protokollen som er avgjørende for å returnere nøyaktige og reproduserbare resultater. Passende eksperimentell design gjennom valg av proteiner for å bli inkludert som vev eller subcellulære markører er viktig for nøyaktig segmentering. Ved utførelse av positivitet analyse, valg av en lavere terskel for positiv farging har en stor innvirkning på de endelige resultatene. Mens velge en terskel for "on / off" proteiner som atomtranskripsjonsfaktorer er ganske grei, finne en terskel for mer heterogent uttrykte proteiner er vanskelig. Dette bør helst utføres i samarbeid med en bord-sertifisert urin patolog eller som en gjennomsnittlig poengsum på tvers av flere observatører for å finne den ideelle terskelen for analyse.
Det er viktig å erkjenne noen begrensninger av dagens utgaver av denne teknologien. når deraffinerings cytoplasma rommet kan tre tilnærminger benyttes: (1) farging med et cytoplasma-spesifikk markør, (2) farging med en membran-spesifikk markør, og ved hjelp av kjerne-til-membran markør distanse som cytoplasma, og (3) ved hjelp en tegning tilnærming for å definere manuelt grensene for cytoplasma i forhold til kjernen. Fra vår erfaring, ved hjelp av en membran-spesifikk markør er den mest nøyaktige teknikk. Den manuelle tegne tilnærmingen er vanligvis nøyaktig hvis kjerner er sentralt plassert, eller hvis biomarkør av interesse er jevnt fordelt i hele cytoplasma. Nøyaktig definere cytoplasmaet til stromale celler som fibroblaster og glattmuskelceller forblir vanskelig og bør tas i betraktning ved utformingen av et eksperiment.
En annen begrensning av teknologien er det avhengighet av kjerner for cellesegmentering. Hvis snittplanet utelukker kjernen av en spesiell celle, vil denne cellen ikke bli inkludert i analysen. Hvis det ikke er noensynlig cytoplasma mellom tilstøtende kjerner eller klumper av kjerner, er disse ofte anerkjent som en stor atom klump, snarere enn forskjellige kjerner. Generelt er hematoxylin counterstain normalt tilstrekkelig for akseptabel atom segmentering, og manipulering av programvareinnstillinger som maksimal terskel for kjernestørrelse kan løse de fleste problemer med atom segmentering.
En endelig begrensning av automatiserte patologi plattformer er upålitelig segmentering av vev som følge av dårlig eksperimentell design. Betydningen av å velge riktig vev og celle biomarkører for å svare på spørsmålet av interesse kan ikke overvurderes. Som vi viste i våre representative resultater, kan en epitelial eller stromal markør som i vesentlig grad endrer uttrykk mellom sykdomstilstander medføre problemer når du oppretter en algoritme for vev segmentering. Det er verdt å merke seg at det finnes alternative muligheter når vanskelig analyser som dette oppstår. For eksempel enkelte images kan analyseres ved manuelt å trekke alle vevsområder, snarere enn ved å anvende en algoritme fra et treningssett med bilder. Dette gir fordelen av segmentering som er helt i tråd med hva brukeren ønsker, men det introduserer også subjektivitet og i betydelig grad kan øke tiden det tar å fullføre en analyse. Passende eksperimentell design er den enkleste måten å fremskynde analyse og maksimere nøyaktigheten av vev og celle segmentering.
Denne teknologien og protokollen har mange fremtidige søknader. Mange biomarkører for spesielle sykdomstilstander har blitt identifisert, men ikke validert. Høy throughput objektiv analyse med multispektrale plattformer muliggjør validering av disse biomarkører. Videre kan bedømmelsen av uttrykk og ko-lokalisering av flere proteiner gir innsikt i dårlig forståtte signalveier. Utvilsomt, redusere den iboende subjektivitet i forbindelse med analyse av immunhistokjemiske staining er verdifull for å forstå ekspresjon og lokalisering av et bredt spekter av proteinmarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker University of Wisconsin translasjonsforskning Initiatives i patologi laboratorium, delvis støttet av UW Avdeling for patologi og laboratoriemedisin og UWCCC bevilgning P30 CA014520, for bruk av sine fasiliteter og tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
