Introduction
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica de laboratório padrão para a detecção de proteína dentro do tecido, e IHC ainda é largamente utilizado tanto em pesquisa e de diagnóstico da patologia. A avaliação da coloração IHC é frequentemente semi-quantitativa, a introdução de potencial de polarização para interpretação dos resultados. Muitas abordagens semi-quantitativos foram desenvolvidos que incorporam tanto a intensidade da coloração e medida coloração em diagnóstico final 1-4. Outros sistemas incluem intensidade de pontuação e localização subcelular, a fim de melhor localizar a expressão 5. Incorporação de pontuações médias de vários espectadores é frequentemente utilizada, a fim de minimizar os efeitos da polarização único espectador 6. Apesar destes esforços, a subjetividade na análise ainda permanece, particularmente quando se avalia o grau de coloração 7. padronização do protocolo e minimizando a subjetividade da entrada humana é fundamental para a criação, resultados IHC reprodutíveis precisos.
conteúdo "> Há outras opções além de IHQ para determinar a expressão de proteínas no interior de tecidos. Dentro do contexto de investigação, a imunohistoquímica tem sido tradicionalmente considerado como um meio para analisar localização da proteína 8, enquanto que outras técnicas, tais como imunotransferência são vistos como padrão de ouro para investigar a expressão da proteína . tecido Determinar ou expressão específica do compartimento da célula é difícil sem incorporar técnicas avançadas, como fracionamento celular ou captura a laser microdissecção 9,10. O uso de anticorpos fluorescentes em lâminas de tecido oferece um compromisso razoável, mas o fundo autofluorescência devido à NADPH, lipofuscins, reticular fibras, colágeno e elastina pode fazer uma quantificação precisa difícil 11.Plataformas de patologia computacionais automatizados são uma direção promissora para a quantificação mais objetiva da coloração patologia 12-15. Combinando imagens multiespectrais com microarrays de tecidofacilita a análise de alto rendimento de expressão da proteína em grandes tamanhos de amostra. Com estas técnicas, a análise de co-localização de proteínas, a heterogeneidade coloração e tecidos e localização subcelular é possível, reduzindo substancialmente os preconceitos e tempo necessário para análise inerentes, ao retornar dados de uma contínua em vez de formato categórica 16. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi demonstrar a utilidade da metodologia e imuno-histoquímica para a realização de análises com multiplexado, utilizando software de imagem multi-espectral.
Este protocolo é escrito para coloração imuno-histoquímica manual, o multiplex de uma única secção de tecido de slides com quatro anticorpos monoclonais otimizados. Como uma experiência representativa, de coelho anti-alfa nuclear do receptor de estrogénio (RctE) e o receptor de androgénio (AR) são multiplexados com anti-rato de CD147 ligado à membrana e ligada à membrana anti-ratinho de E-caderina. Qualquer anticorpo de escolha pode ser Substituted para os anticorpos aqui listadas, mas cada combinação de anticorpos requer otimização separada. Pré-tratamento para todos os anticorpos têm de ser idênticos. Os anticorpos de AR e CD147 deve ser optimizado individualmente e, em seguida, como um cocktail. Cada anticorpo é detectado usando um sistema de polímero livre de biotina e um de 4 cromogénios exclusivos.
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Protocol
NOTA: O protocolo aqui descreve coloração e análise de um tissue microarray (TMA), descrito anteriormente 12,17,18. A seção TMA espessura 4 mm foi obtida a partir de um bloco de parafina usando um micrótomo padrão.
NOTA: A biblioteca espectral para os 4 cromógenos e contrastante deve ser criado para quantificação de imagem. A fim de fazer isso, o protocolo otimizado para cada anticorpo indivíduo deve ser executado com um anticorpo por slide, menos o counterstain final. Um quinto slide deve ser corado com hematoxilina para gerar as 5 imagens necessárias para criar a biblioteca espectral.
1. Multiplex Imunohistoquímica
- lâminas Asse em forno a 60 ° C durante 20 minutos. Usando um fume hood química, mergulhe de slides em 100% de xileno. Repita o procedimento para 2 mudanças de xileno. Mergulhe de slides em etanol 100% por 5 min. Repita a operação com etanol fresco de 100%.
- Imergir corrediça em etanol a 95% durante 3 min. Repita com fresco95% de etanol. Mergulhe de slides em etanol 70% por 3 min. Mergulhe de slides em água destilada por 3 min. Repita com água destilada fresca. Tap deslizar verticalmente para drenar a água do slide. Aplicar 200 ul de peroxidase endógena bloqueador de pronto-para-uso durante 5 min.
- Escorra bloqueador peroxidase de slide e mergulhe em 45 ml de tampão de recuperação de ready-to-use (pH inferior a 7,0). Colocar o recipiente slide em uma panela de pressão e de início do programa definido para 124 ° C durante 4 minutos. Permitir panela de pressão esfriar por 20 min. antes da abertura.
- Remover o recipiente de tampão de recuperação e deixa-se arrefecer adicional de 10 min. Lavar a lâmina em água destilada por 10 min. Drenar a água do slide e delinear cuidadosamente o tecido no slide com uma caneta barreira hidrofóbica.
- Adicionar 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) .Transfer corrediça para um recipiente com tampa plana (câmara de incubação) contendo gaze húmida.
- Prepare 1 litro de solução salina 1x com Tris com Tween-20 (TBST) por diluição de 50 ml de 20x tampão salino Tris contendo 1% de Tween-20 e 950 mL de água destilada.
- Escorra PBS a partir de slides e aplicar 200 mL de 1x TBST. Incubar 2 min. Escorra TBST de slides e retornar deslizante para câmara de incubação. Aplicar 200 mL de bloco de proteína universal ready-to-use, perto da câmara e incubar durante 7 min.
- Escorra bloco de proteína e retornar deslizante para câmara de incubação. Diluir anti-ERa de anticorpo de 1: 400 por adição de 0,6 ul de anticorpo de 239,4 ul de diluente de anticorpo. Aplicar 200 mL de anticorpo diluído a deslizar e perto da câmara.
- Incubar corrediça à temperatura ambiente durante 2 horas. Escorra anticorpo da lâmina e lavar com TBST seguido por imersão por 5 minutos em TBST.
- Escorra TBST de slides e retornar deslizante para câmara de incubação. Aplicar 200 mL de polímero anti-coelho peroxidase cabra-to-use pronto e perto da câmara. Incubar durante 30 min. à temperatura ambiente. slides lavagem com TBST e local de slides no recipiente de TBST por 5 min. </ Li>
- Prepare castanho peroxidase de rábano-3,3'-diaminobenzidina (DAB-HRP) cromogénio adicionando 8 ul de cromogénio DAB para 250 ul de tampão de substrato DAB e misturando bem.
- Escorra TBST de slide, slides retorno à câmara de incubação e aplicar 200 mL de marrom cromógeno HRP-DAB para 6 min. Enxaguar a lâmina com água destilada e lugar de slides em um recipiente de água destilada.
- Misturar a solução de desnaturação através da combinação de 50 ul do primeiro reagente de eluição com 150 ul do segundo reagente tampão. Drenar a água fora do slide e aplicar a solução de desnaturação diluído para o slide por 3 min. à temperatura ambiente. Decantar e enxaguar desnaturação do reagente com TBST. Mergulhe de slides em TBST por 5 min.
- Prepare AR / CD147 cocktail de anticorpos diluindo 4,2 ul de anticorpo anti-AR e 2,8 ul de anticorpo anti-CD147 com 203 ul de diluente de anticorpo. Escorra TBST do slide, slide para retornar câmara de incubação e aplicar 200 mL de AR / CD147 cocktail ao slide. Fechar a câmara e incuba-se durante 1 h à temperatura ambiente. slides lavagem com TBST e mergulhar em TBST por 5 min.
- Drenar TBST, retorno corrediça para a câmara de incubação e aplicar 200 ul de anti-coelho de fosfatase alcalina de cabra polímero pronto-para-uso. Fechar câmara e deslize incubar durante 30 min. à temperatura ambiente. slides lavagem com TBST e mergulhar em TBST por 5 min.
- Prepare fosfatase alcalina vermelho cromogênio adicionando 3,2 ul de cromogénio vermelho para 250 ul de tampão de cromogénio vermelho e misture bem.
- Escorra TBST de slides e retornar deslizante para câmara de incubação. Aplicar 200 mL de diluída fosfatase alcalina cromogénio vermelho para o slide, câmara de perto e incubar durante 7 min.
- Escorra cromógeno e enxaguar abundantemente lâmina com água destilada. Coloque slides em um recipiente de água destilada por 5 min. Drenar a água do slide, lavar com TBST e retornar à câmara de incubação. Aplicar 200 ul de cabra anti-ratinho de polímero-HRP para a corrediça e close de câmara. Incubar durante 30 min. à temperatura ambiente.
- Escorra polímero a partir da lâmina e lavar com TBST. Lugar de slides em TBST por 5 min. Preparar 200 ul de cromogénio-HRP ligada roxo por adição de 3,2 ul de reagente de estabilização para 250 l do tampão e misturar bem. Adicionar 3,2 mL de cromogénio roxo e misture bem, em seguida, 3,2 mL do reagente peróxido de hidrogênio e misture bem.
- Escorra TBST off de slides e aplicar 200 mL de cromogénio roxo preparado para deslizar e incubar durante 7 min. à temperatura ambiente. slides lavagem com água e coloque destilada diapositivos em um recipiente de água destilada por 5 min.
- Misturar a solução de desnaturação por mistura de 50 ul do primeiro reagente de eluição com 150 ul do segundo reagente tampão. Drenar a água fora do slide e aplicar a solução de desnaturação diluído para o slide por 3 min. à temperatura ambiente.
- Lavar desnaturação reagente fora com TBST. Coloque slide no recipiente de TBST por 5 min. Diluir anticorpo anti-E-caderinaaté 1: 200 por adição de 1,1 ul de anticorpo de 218,9 ul diluente de anticorpo. Escorra o TBST do slide, slides retorno à câmara de incubação e aplicar 200 mL de E-caderina ao slide. Fechar câmara e incubar 30 min. à temperatura ambiente.
- slides lavagem com TBST e local de slides no recipiente de TBST por 5 min. Escorra o TBST de slide, slide para retornar câmara de incubação e aplicar polímero HRP anti-rato de 200 ul cabra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. slides lavagem com TBST e local de slides no recipiente de TBST por 5 min.
- Prepare preto ligado a HRP cromogénio adicionando 8 ul de cromogénio para 250 ul de tampão. Aplicar 200 mL de cromogénio para deslizar e desenvolver por 2 min. Enxaguar lâmina com água destilada e mergulhe no recipiente de água destilada.
- Diluir hematoxilina pela adição de 40 ul a 200 ul de hematoxilina de água destilada. Drenar a água do slide e aplicar 200 mL de hematoxilina diluída para deslizar por 30 segundos. slides Rinsecorrendo bem água da torneira por 2 min., em seguida, lavar em água destilada por 30 segundos. Colocar a lâmina em uma estufa a 60 ° C durante 15-30 min.
- Mergulhe slide no recém-preparado 100% de xileno durante 30 segundos, limpe o excesso de xileno off e adicionar uma gota de meios de montagem permanentes. Lamela com um No. 1.5 lamela.
2. Automated Aquisição de Imagem e Análise
- Carregar lâminas coradas em um scanner de fotos automática. Com base no diâmetro, a separação, e o número de núcleos de TMA, criar um protocolo de análise automática de acordo com o manual de instruções do fabricante.
- Abra o software de imagem multiespectral para construir uma biblioteca espectral de lâminas de controlo coradas com cromógenos individuais e da hematoxilina corado slide. Abra um cubo de imagem adquirida a partir de uma lâmina de controlo e escolha de quatro a cinco áreas marcadas positivamente para definir opticamente que cromogénio. Repita com cubos de imagem de outras lâminas de controlo até que uma representi biblioteca espectral completang todos cromógenos é criado, e depois salvar a biblioteca espectral.
- Comece um novo projeto dentro do software de imagem multiespectral. Selecione "Multispectral (.im3)" para a opção de formato de imagem e "Brightfield" para o formato de amostra. Primeiro, configure o projeto, escolhendo opções desejadas: "Tissue Segmento", "Encontrar Recursos", "A fenotipagem", "Score" e "Export". Neste ponto, a resolução da imagem pode ser alterado para acelerar o tempo de análise, se desejada.
Segmentação 3. Tissue
- Importar a biblioteca espectral criado anteriormente e selecione todos os cromógenos a serem incluídos na análise.
- cubos imagem aberta para ser incluído nos dados de formação estabelecidas selecionando a opção "Open Cube Imagem". Para garantir a precisão de formação, seleccionar, pelo menos, 18% do número total de imagens a serem analisadas. Escolha imagens que representam todos os estados de doença para aumentar a precisão de segmentação. Esta parte de imagens is chamado o conjunto de treinamento de imagens.
- imagens balanço de brancos no conjunto de treinamento, selecionando a ferramenta conta-gotas e escolher uma área em uma imagem que é branco.
- Selecione o botão "Avançar" para ir para a segmentação de tecidos. Use o painel "Tissue Categorias" para escolher tipos de tecido a ser analisado (isto é, "tecido" e "não-tecidos"). Para a localização de tecido de proteína mais preciso, várias categorias de tecidos pode ser utilizado (isto é. "Epitélios", "estroma", e "não-tecido").
- Comece a criar o algoritmo e definir categorias de tecido desenhando em torno de grupos de células dentro de imagens de treinamento. Quando terminar com uma categoria de tecidos, repita para outras categorias de tecido. Tenha certeza de escolher grupos de células dentro de imagens que são característicos desse tipo de categoria de tecidos.
- Repita esse processo para todas as imagens dentro do conjunto de treinamento de imagens.
- Seleccionar componentes (cromogénios) a serem incluídas na Training para o "Tissue segmenter". Ao realizar a análise de imagens de campo claro de imunohistoquímica, todos os componentes são normalmente incluídos no treinamento. Incluir abundantes imagens coloração negativa no conjunto de treinamento de prevenção de erros durante esta etapa.
- Escolha uma adequada "Pattern Scale" para a formação do segmenter tecido. Sob ampliação de 20x, um grande escala do padrão é tipicamente apropriado. Ao trabalhar com tecidos com uma arquitetura fina em maior aumento, numa escala menor padrão é mais adequado.
- Selecione o "Trem Tissue segmenter" botão para começar a treinar o segmenter tecido. Observar uma precisão caixa de pop-up exibindo refletindo a proporção de pixels dentro de regiões de formação que estão devidamente classificados.
NOTA: O software tenta continuamente para melhorar a precisão do algoritmo até que seja parado manualmente. Nós já demonstraram que o treinamento em 18% das imagens resulta em 97% de precisão formação 12. Após a segmenter tecido é treinado, escolha uma resolução do segmento apropriado. resolução do segmento corresponde ao tempo necessário para segmentar imagens, com resolução grosseira que exige menos tempo e excelente resolução exigindo mais tempo. - Segmento de todo o conjunto de treinamento de imagens clicando em "Segmento de Imagens". Permitir que o software de tempo suficiente para se aplicar o algoritmo para todas as imagens de formação. Quando terminar, rever o conjunto de treinamento para encontrar qualquer tecido classificados erroneamente com o algoritmo de treinamento atual.
- Para afinar o processo de segmentação de tecidos, adicionar, editar ou remover regiões de formação de tecido. Usar a opção "bordos da guarnição" pixels se estende sobre as bordas de uma categoria de tecido para outro. Se pequenos grupos de pixels são classificados erroneamente, ajustar o limite no tamanho mínimo de segmento.
- Quando as edições estiverem concluídas, selecione "Segmento de Imagens", isso vai voltar a treinar o segmenter tecido para criar um novo algoritmo para segmentação de tecidos. O algoritmo anterioré guardada automaticamente e pode ser devolvida para, se necessário.
- Quando confiante com os resultados algoritmo de segmentação de tecidos, avançar para a segmentação de células, selecionando o botão "Avançar".
Segmentação 4. celular
- Escolha os compartimentos subcelulares para ser incluído na segmentação celular. Certifique-se de que "Núcleos" já está selecionado para escolher "citoplasma" ou "membrana".
NOTA: "Membrana" segmentação só deve ser escolhido quando um marcador específico da proteína-membrana foi incluído no IHC, tal como E-caderina. - Dentro da aba "Núcleos", existem várias opções. Comece escolhendo configurações apropriadas para segmentação nuclear (veja o passo 4.3). Escolha se categorias de tecidos individuais ou todos serão incluídos na segmentação.
- Escolha uma abordagem de segmentação nuclear
- Selecione o counterstain "baseado em pixels (Threshold)" abordagem de um método simplificado para a obtenção de bonsresultados sem saber muito sobre as configurações de processamento de imagem.
NOTA: Isso muitas vezes faz uma boa primeira escolha. Ao selecionar uma abordagem, "baseado em pixels (Threshold)" é mais apropriado quando há uma contra-coloração nuclear confiável, enquanto o "objeto com base em" deve ser usado se houver uma falta de contraste nuclear consistente. - Selecione a opção "Pixel-Based (Threshold)" abordagem quando há um contraste nuclear confiável.
NOTA: Esta abordagem é puramente baseado em pixel. Esta abordagem também pode ser utilizado para outras necessidades de análise de imagem que podem ser satisfeitas com um limite simples, como a detecção de todos os pixels dentro de uma categoria de tecido que se coram positivo para uma mancha de IHC. - Seleccione a abordagem baseada em objeto se o contraste nuclear não fornece coloração consistente e específica de objetos nucleares, e as abordagens mais avançadas à base de morfometria são necessários para detectar núcleos.
- Selecione "Componentes para Segmentação Nuclear", "Nuclorelha Size "e" Clean-up "se o usuário deseja definir melhor as configurações de segmentação núcleos.
- Selecione o counterstain "baseado em pixels (Threshold)" abordagem de um método simplificado para a obtenção de bonsresultados sem saber muito sobre as configurações de processamento de imagem.
- Selecione parâmetros de forma citoplasma
- Selecione o botão "Avançar" para ir para a segmentação do citoplasma.
NOTA: Existem várias opções dentro de segmentação citoplasma para escolher. A opção denominada "distância interior para núcleo" é pixel com base. Ela reflecte a distância entre o exterior do núcleo e o interior do citoplasma. Aumentando este valor diminui a probabilidade de que o sinal cruza nuclear para dentro do compartimento do citoplasma. - Em seguida, selecione, "distância exterior ao núcleo".
NOTA: Esta é também pixel com base. A distância ao núcleo exterior reflecte a distância entre a parte externa do núcleo e do exterior da célula. Este valor pode ser definido grande ou pequeno o suficiente para incluir ou excluir sinais de membrana, se desejar. - select ", tamanho mínimo de" Next.
NOTA: O tamanho mínimo, pixeL baseado, reflecte a dimensão mínima da amostra citoplasma para ser incluídas na análise. Se o tamanho do citoplasma é menor numa célula particular, tal como quando as células são hermeticamente embalados juntos, esta segmentação citoplasma é excluído da análise. - Selecione a próxima opção, "Componente" com "primário", "secundário", e selecione "terciário" como opções secundárias.
NOTA: Aqui pode-se escolher um marcador citoplasma específico. Semelhante a segmentação nuclear, se um marcador IHC citoplasmática específica foi usado, este componente pode ser utilizado para definir o citoplasma por encontrar um valor de limiar mínimo. Isto auxilia na definição do citoplasma, mas não é necessário para uma precisão aceitável. - Movendo-se para a última das três opções de guias é "Membrana". Aqui, o utilizador define o compartimento da membrana com um marcador de proteína. Escolha "Primary", "secundário" e / ou "terciária" para cada marcador específico membrana utilizada. Ajuste "Full Scale OD "para encontrar um limiar mínimo ou um positivo para cada marcador nas membranas celulares.
- Continuando sob a guia "Membrana" e selecione a opção "Tamanho máximo Cell".
NOTA: Este é o raio de valor membrana, em pixels, que especifica o tamanho máximo das células. Um valor de 12 é normalmente apropriado para imagens tiradas com ampliação de 20x. - Depois de selecionar todas as opções, selecione "Segmento de Imagem" ou "Segmento All". Aplicar as definições para imagens e observá-los "individualmente" ou no modo "Galeria".
NOTA: Ajustar as definições e limites, se necessário, e re-segmento, até ficar satisfeito com os resultados de segmentação de células no conjunto de treinamento de imagens.
- Selecione o botão "Avançar" para ir para a segmentação do citoplasma.
5. A fenotipagem de células
NOTA: Accurate segmentação de células é necessário para obter a fenotipagem celular preciso, e o recurso a fenotipagem é orientável.
- Use a opção "Adicionar &# 34; botão para adicionar fenótipos à lista "fenótipos". Os usuários podem selecionar uma cor para o fenótipo.
- Clique em "Editar fenótipos" para atribuir um fenótipo de uma célula. Clique em uma célula especial para abrir um menu drop-down, permitindo que o usuário escolha o fenótipo e, em seguida, seguir em frente. Identificar, pelo menos, cinco (5) as células em cada fenótipo, a fim de proceder. Escolhendo 25 ou mais células de cada fenótipo é necessária para alcançar resultados óptimos.
6. Scoring IHC e co-localização
- Escolha "Avançar" para ir para o "Score IHC ou IF" passo. Escolha um "Categoria Tissue" para marcar.
NOTA: Apenas uma categoria de tecido pode ser marcado durante uma análise particular, mas se os resultados de pontuação em outra categoria de tecido são desejados, a análise pode ser repetida posteriormente com configurações diferentes. - Escolha um tipo de "Scoring" desejado.
NOTA: A positividade cria duas caixas (positivas e negativas) de um componente de interesse, Enquanto a dupla positividade é usado para análise de co-localização. Outras opções incluem 4-bin, 10-bin, e 50-bin análises para um marcador de escolha. - Escolha da célula "Compartimento" para ser usado na análise de conseguir.
- Semelhante a encontrar um limite mínimo para o componente nuclear principal, selecione "View Data Component" e mova o cursor sobre as imagens de treinamento para encontrar densidade óptica níveis mínimos adequados de coloração para células positivas para o componente (s) de interesse.
- Se as células intensamente coradas devem ser excluídos, diminuir o limite máximo para um nível adequado. Caso contrário, use o botão de auto de escolher um máximo limite para análise.
- Escolha treinando imagens de marcar, a fim de validar os valores de limiar.
NOTA: A percentagem de células dentro de um compartimento específico irá ser devolvido e pode ser comparada com a inspecção visual ou a contagem manual. Uma vez concluída, selecione "Avançar" para avançar para o passo "Export".
- Testar o algoritmo criado através da segmentação de tecidos, segmentação de células, e os valores de pontuação por exportar os dados para o conjunto de treinamento. Siga as instruções para criar uma nova pasta para o diretório de exportação. Seleccionar imagens e tabelas a serem criados e incluídos na análise. Realizar a análise, selecionando "Exportar para Todos".
- Tabelas são exportados em arquivos de texto separado por tabulação e pode ser aberto na maioria dos programas de análise de dados.
- Quando a análise estiver concluída, visualizar os dados de segmentação celular e de pontuação para imagens com alta e baixa coloração para avaliar a precisão dos ajustes.
- Quando estiver satisfeito com as configurações, aplicar o algoritmo criado a partir do conjunto de treino de imagens para todo o conjunto de imagens por meio de análise de lotes. Clique na guia "Análise Batch" e o algoritmo abriu será copiado do projeto ativo.
- Escolha um novo diretório de exportação e selecionar quais imagens e tablES são para ser incluídas na análise. Sob a opção arquivos de entrada, selecione "Add Images" e escolha todas as imagens a serem incluídas na análise do lote.
- Realizar a análise selecionando a opção "Executar". Tal como acontece com a análise do conjunto de treino, este passo requer uma quantidade variável de tempo, dependendo das configurações, o número de imagens incluídos na análise particular.
- Quando concluída, avançar para a aba "Revisão / Merge". Os padrões de diretório lote para o diretório de exportação a partir da análise do lote e pode ser mudado se desejado. Selecione "Incluir Todos" e selecione "Merge" para criar folhas de dados com dados de resumo para análise.
8. Análise dos dados exportados
- Abra tabelas exportadas em software de análise de dados e remover ou ocultar colunas de dados que são irrelevantes para a análise, como valores mínimos e máximos para cada componente. Os dados primários utilizados em análise é na média densidade c ópticaolumn para cada componente.
- Revisão exportados segmentação mapas e imagens cruas para determinar quais amostras ou núcleos TMA devem ser excluídos da análise. valores percentuais de tecido ajudar a determinar se uma amostra deve ser incluído ou não, com um corte arbitrário de <5% mais utilizado para critérios de exclusão.
- Remover dados irrelevantes ou linhas contendo amostras a serem excluídos da análise de dados.
- Use dados de quantificação de proteínas para investigar mudanças no estado de doença ou a relação com as características clínico-patológicos da doença 12,18-21.
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Representative Results
Na Figura 1, a formação é realizada sobre os tecidos da próstata para segmentar imagens em porções epiteliais e do estroma, juntamente com o compartimento de não-tecido. Ao utilizar o marcador de membrana de E-caderina epitelial, a segmentação de células foi realizada para separar o núcleo, citoplasma, e porções de membrana, apresentados na Figura 2.
Numa experiência, foi utilizado multiplexado IHC para investigar a expressão e localização da AR, ERa, E-caderina, e CD147, como mostrado na Figura 3. Usando essas técnicas, que são capazes de identificar as células positivas para a expressão nuclear de ambos ERa e AR (Figura 3B - 3C), apesar de sobreposição de sinais colorimétricos, como mostrado com setas verdes na Figura 3A. Foram encontradas diferenças significativas entre a proporção de células do estroma positivas duplas dentro diferentes estados de prdoença ostate (Figura 3D). Foram quantificados expressão específica de membrana celular de CD147 usando E-caderina como uma proteína marcadora (setas vermelhas na Figura 3A), e fomos o primeiro grupo a investigar a expressão CD147 específico de membrana em tecidos da próstata. Encontramos uma redução significativa da expressão CD147 em associação com a progressão do câncer de próstata (Figura 3E), encontraram uma associação importante com o prognóstico pós-cirúrgico 19.
Há casos em que delineamento experimental pobres podem levar à segmentação do tecido impreciso. Na Figura 4, o algoritmo aplicado a um conjunto de tecidos epiteliais não exacta segmento e compartimentos do estroma (Figura 4C). Nesta experiência, actina de músculo liso-α (α-SMA) foi utilizado para marcar o compartimento estromal. Porque o músculo liso α-SMA e é diminuída ou perdida em alguns tumores (Figure 4A), o algoritmo criado através da segmentação de tecido (Figura 4B) era incapaz de se diferenciar com precisão entre epiteliais e estromais compartimentos de dados morfométricos sozinho. Cuidados devem ser tomados na escolha de marcadores de proteína para o tecido ou célula compartimentos.
Figura 1: Segmentação de tecidos Usando Multispectral Software Imaging. Um microarray tecido da próstata foi manchado usando imunohistoquímica multiplexado para o receptor de andrógeno (AR), o estrogênio receptor-alfa (ERa), E-caderina, e CD147. Um conjunto de imagens de treinamento foram importados para o software de imagem multiespectral representando tipos de tecidos e estados de doença de todo o conjunto de imagens (A). Categorias de tecido foram criados incluindo estroma (verde), epitélio (vermelho), e não-tecidos (azul), e as categorias foram definidos pelo desenho manualmente no topode formação de imagens (b). Depois de desenhar em imagens de treinamento, um algoritmo para segmentação tecido foi criado e aplicado ao conjunto de treinamento de imagens (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Segmentação celular em Nuclear, citoplasmática e Membrane compartimentos. O compartimento nuclear foi definida para a segmentação celular, definindo um limite mínimo para contracoloração de hematoxilina (A). O citoplasma foi definido em relação ao núcleo usando algoritmos pré-definidos dentro do software (B). E-caderina foi usada como um marcador de membrana e um comprimento médio mínimo limiar OD foi utilizada para definir o compartimento membrana r (C). Esta técnica tudoOWS quantificação simultânea de expressão da proteína em todos os compartimentos subcelulares (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de co-localização e específicos de membrana expressão da proteína. Multiplexado IHC foi utilizado para investigar a expressão e localização do receptor de andrógeno (AR), o estrogênio receptor-alfa (ERa), E-caderina, e CD147 (A). DAB (cromogénio castanho) foi utilizado para marcar AR (B) e um cromogénio vermelho usado para marcar ERa (C). Fomos capazes de identificar biomarcadores espacialmente sobrepostos (setas verdes em A) e quantificar (D) a proporção de células com co-localização nuclear de ERa e ARdentro do estroma da próstata. Usando E-caderina (cromogénio preto) para definir a membrana plasmática (setas vermelhas em A), quantificamos a expressão específica de membrana de CD147 dentro dos tecidos da próstata (E) 19. One-way análise de variância (ANOVA) foi utilizado para a análise estatística, barras de erro reflectem erro padrão da média, e os asteriscos representam p <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Segmentação de tecidos inadequada que resulta de Design Experimental. tecidos da próstata benignas e malignas foram coradas para actina α-músculo liso (α-SMA; cromógeno verde), receptor de andrógeno (cromogénio vermelho) e andrógeno receptor variante 7 (cromógeno DAB). a-SMA foi usado comoum marcador de estroma e é diminuída em alguns tumores, incluindo próstata (A). Quando o treinamento foi realizado (B) e do algoritmo de segmentação tecido foi aplicada, o estroma e compartimentos epiteliais foram inadequadamente segmentado devido à ausência de coloração α-SMA (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A utilização de imuno-histoquímica tradicional para avaliar a expressão de proteínas é limitado por métodos subjectivos, semi-quantitativos de análise 22,23. plataformas de avanço de ter sido criado por análise de alto rendimento de expressão de biomarcadores e localização. segmentação detalhada de ambos os tecidos e compartimentos subcelulares permite aos usuários estudar a expressão de biomarcadores, localização e co-localização com outros marcadores de interesse. Em estudos anteriores, que demonstraram a utilidade de IHC e de imagem multi-espectral, particularmente quando usado para estudar proteínas localizadas no mesmo compartimento celular 18,20,21. Quando combinado com micromatrizes de tecidos de 24, estas técnicas permitem a quantificação rápida e mais objectiva da expressão da proteína do que o permitido por análise manual, por um patologista.
Um problema com a utilização de imuno-histoquímica para a quantificação de proteína é irreproducibility dos resultados devido à subjetividadenatureza tiva de análise e diferenças inerentes na técnica e reagentes. Uma vantagem significativa da utilização de plataformas como imagem multi-espectral para medir a expressão da proteína é a reprodutibilidade dos resultados. Os dados de plataformas informatizadas patologia correlacionam altamente com a análise manual por um patologista ao retornar dados em um formato contínuo e reduzindo substancialmente o tempo de trabalho, especialmente quando se trabalha com grandes tamanhos de amostra 12,16,25. Estudos têm mostrado alta concordância geral entre os resultados de diferentes plataformas multiespectrais 14. Além disso, já anteriormente demonstrado que os resultados da coloração são altamente reprodutíveis mesmo quando existe uma variabilidade do número de proteínas investigado 12. O uso de plataformas de patologia automatizados, tanto para a coloração e análise não eliminará todas as discrepâncias nos resultados, como aqueles decorrentes de anticorpos criados em direção epítopos diferentes, mas estas plataformas não reduzir substancialmente preconceito e irreprodutibilidade comumente associada à imuno-histoquímica.
Existem passos específicos no âmbito do protocolo que são essenciais para o regresso, reprodutibilidade dos resultados precisos. delineamento experimental adequado, através de selecção de proteínas a serem incluídos como tecido ou marcadores subcelulares é importante para a segmentação precisa. Ao realizar a análise positividade, a selecção de um limite inferior para a coloração positiva tem um grande efeito sobre os resultados finais. Embora a escolha de um limiar de "on / off" proteínas, tais como fatores de transcrição nuclear é bastante simples, encontrar um limite para proteínas mais heterogênea expressas é difícil. Isto deve idealmente ser realizada em colaboração com um patologista geniturinário placa-certificado ou como uma pontuação média entre vários observadores para encontrar o limite ideal para análise.
É importante reconhecer algumas limitações de versões atuais dessa tecnologia. quando se retiraclarificante compartimento do citoplasma, três abordagens podem ser utilizados: (1) a coloração com um marcador específico do citoplasma, (2) a coloração com um marcador específico da membrana e usando o núcleo-se membrana distância marcador como citoplasma, e (3) usando uma abordagem de desenho para definir manualmente os limites do citoplasma em relação ao núcleo. Pela nossa experiência, usando um marcador específico da membrana é a técnica mais precisa. A abordagem de desenho manual é normalmente preciso se núcleos estão localizados no centro ou se o biomarcador de interesse é uniformemente distribuída por todo o citoplasma. Definindo com precisão o citoplasma das células do estroma, como fibroblastos e células musculares lisas permanece difícil e deve ser tida em consideração na concepção de um experimento.
Outra limitação da tecnologia é a dependência de núcleos para a segmentação celular. Se plano de secção exclui o núcleo de uma célula em particular, esta célula não serão incluídos na análise. Se não hácitoplasma visível entre núcleos adjacentes ou aglomerados de núcleos, estas são muitas vezes reconhecido como um nódulo nuclear em grande, ao invés de núcleos distintos. De um modo geral, hematoxilina contrastante regra, é suficiente para a segmentação nuclear aceitável, e manipulação de configurações de software, tais como limite máximo para o tamanho do núcleo pode corrigir a maioria dos problemas com segmentação nuclear.
A última limitação de plataformas de patologia automatizados é a segmentação não confiável de tecidos resultantes do delineamento experimental pobres. A importância da escolha de tecidos e células biomarcadores apropriados para responder a questão dos juros não pode ser exagerada. Como demonstramos em nossos resultados representativos, um marcador epitelial ou do estroma que muda significativamente a expressão entre estados de doença pode causar problemas ao criar um algoritmo para segmentação de tecidos. Vale a pena notar que existem opções alternativas quando difícil analisa como este surgir. Por exemplo, imag indivíduoES podem ser analisados por desenho manualmente todos os compartimentos do tecido, em vez de através da aplicação de um algoritmo de um conjunto de formação de imagens. Isto proporciona a vantagem de segmentação, que é perfeitamente em linha com o que o utilizador deseja, mas também introduz subjectividade e pode aumentar significativamente o tempo necessário para terminar uma análise. delineamento experimental adequado é a maneira mais fácil de acelerar a análise e maximizar a precisão de tecido e segmentação celular.
Esta tecnologia e protocolo têm muitas aplicações futuras. Numerosos biomarcadores para determinados estados de doença foram identificados, mas não validado. Alta capacidade de análise objectiva com as plataformas multiespectrais facilita a validação desses biomarcadores. Além disso, a avaliação da expressão e co-localização de proteínas múltiplas podem proporcionar perspectivas sobre as vias de sinalização mal-entendidos. Sem dúvida, reduzindo a subjetividade inerente associada à análise da staini imuno-histoquímicang é valiosa para a compreensão da expressão e localização de uma vasta gama de marcadores de proteína.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Universidade de Wisconsin Translational iniciativas de investigação no laboratório de patologia, em parte apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial UW e concessão UWCCC P30 CA014520, para o uso de suas instalações e serviços.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating: Health – 0, Fire – 1 , Reactivity – 0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating: Health – 1, Fire – 0 , Reactivity – 0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating: Health – 2, Fire – 3 , Reactivity – 0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | Nuance EX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
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